रोग से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में ताऊ उपसेलुलर स्थानीयकरण का मॉड्यूलेशन

Genetics

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Summary

ताऊ एक न्यूरोनल प्रोटीन है जो साइटोप्लाज्म दोनों में मौजूद है, जहां यह माइक्रोट्यूबल को बांधता है, और नाभिक में, जहां यह अल्जाइमर रोग से संबंधित जीन के मॉड्यूलेशन सहित अपरंपरागत कार्य ों को डालती है। यहां, हम साइटोप्लाज्मिक ताऊ से आने वाले किसी भी हस्तक्षेप को छोड़कर परमाणु ताऊ के कार्य की जांच करने की विधि का वर्णन करते हैं ।

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Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

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Abstract

ताऊ न्यूरॉन्स में व्यक्त एक माइक्रोट्यूबबुल बाध्यकारी प्रोटीन है और इसका मुख्य ज्ञात कार्य साइटोस्केलेटल स्थिरता के रखरखाव से संबंधित है। हालांकि, हाल के सबूतों से संकेत मिला है कि ताऊ नाभिक सहित अन्य उपकोशिकीय डिब्बों में भी मौजूद है जहां इसे डीएनए संरक्षण में, आरएनए प्रतिलेखन में, रेट्रोट्रांसपोसंस की गतिशीलता में और के संरचनात्मक संगठन में फंसाया जाता है नाभिक। हमने हाल ही में यह प्रदशत किया है कि परमाणु ताऊ VGluT1 जीन की अभिव्यक्ति में शामिल है, एक आणविक तंत्र का सुझाव है जो अल्जाइमर रोग के प्रारंभिक दौर में ग्लूटामेट रिलीज की रोग वृद्धि की व्याख्या कर सकता है । हाल ही में जब तक, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति मॉड्यूलिंग में परमाणु ताऊ की भागीदारी अपेक्षाकृत अनिश्चित और तकनीकी सीमाओं के कारण अस्पष्ट है कि साइटोप्लाज्मिक ताऊ के योगदान या अंय के प्रभाव के बहिष्कार को रोका गया है डाउनस्ट्रीम कारक परमाणु ताऊ से संबंधित नहीं हैं। इस अनिश्चितता को दूर करने के लिए, हमने विशेष रूप से परमाणु ताऊ प्रोटीन द्वारा संग्राहक लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक विधि विकसित की । हमने एक प्रोटोकॉल नियोजित किया जो स्थानीयकरण संकेतों और उप-कोशिकीय अंशता के उपयोग को जोड़ता है, जिससे साइटोप्लाज्मिक ताऊ अणुओं से हस्तक्षेप के बहिष्कार की अनुमति होती है। सबसे विशेष रूप से, प्रोटोकॉल आसान है और क्लासिक और विश्वसनीय तरीकों से बना है जो मोटे तौर पर अन्य सेल प्रकारों और सेलुलर स्थितियों में ताऊ के परमाणु कार्य का अध्ययन करने के लिए लागू होते हैं।

Introduction

नाभिक में ताऊ प्रोटीन के कार्यों ने हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण रुचि दिखाई है, क्योंकि इसे न्यूक्लिक एसिड1,2,3,4,5,6से निकटता से जुड़ा हुआ दिखाया गया है । दरअसल, हाल ही में जीनोम-वाइड अध्ययन से पता चला है कि ताऊ वीवो7में जेनिक और इंटरजेनिक डीएनए दृश्यों को बांधता है । न्यूक्लियोलर संगठन में8 ,9,10,11की भूमिकाकासुझाव दिया गया है . इसके अलावा ताऊ को ऑक्सीडेटिव और हाइपरथर्मिक स्ट्रेस5,10 ,12,13से डीएनए प्रोटेक्शन में शामिल करने का प्रस्ताव किया गया है, जबकि उत्परिवर्तित ताऊ को गुणसूत्र अस्थिरता और एन्यूप्लाइडी14,15,16से जोड़ा गया है ।

अब तक, परमाणु डिब्बे में ताऊ के कार्यों का अध्ययन करने में चुनौतियां साइटोप्लाज्मिक ताऊ के योगदान से परमाणु ताऊ के विशिष्ट योगदान को विच्छेदन करने में कठिनाइयों के कारण लगभग अनसुलझी रहीं । इसके अलावा, परमाणु डिब्बे में ताऊ अणुओं को जिम्मेदार ठहराया कार्य, अब तक, केवल सहसापेक्ष हैं क्योंकि उनके पास परमाणु ताऊ प्रोटीन की सीधी भागीदारी के स्पष्ट प्रदर्शन की कमी है । वास्तव में, रेट्रोट्रांसपोसंस की गतिशीलता में ताऊ की भागीदारी या rRNA प्रतिलेखन में या डीएनए संरक्षण में11,12,17,18,19 को साइटोप्लाज्मिक ताऊ के योगदान या परमाणु ताऊ से संबंधित अन्य डाउनस्ट्रीम कारकों के प्रभाव से भी समझाया जा सकता है ।

यहां, हम एक विधि प्रदान करते हैं जो परमाणु स्थानीयकरण (एनएलएस) या परमाणु निर्यात संकेतों (एनईएस) के साथ टैग किए गए 0N4R के उपयोग के साथ संयुक्त परमाणु डिब्बे को अलग करने के लिए एक शास्त्रीय प्रक्रिया का शोषण करके इस मुद्दे को हल कर सकती है। यह दृष्टिकोण साइटोप्लाज्मिक डिब्बे से ताऊ अणुओं के spillover के कारण संभावित कलाकृतियों से संबंधित जटिल मुद्दों को समाप्त करता है । इसके अलावा, ताऊ-एनएलएस और ताऊ-एनईएस का निर्माण परमाणु डिब्बे से ताऊ अणुओं के संवर्धन या बहिष्कार को क्रमशः प्रेरित करता है, जो एक विशिष्ट कार्य में परमाणु ताऊ अणुओं की भागीदारी के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता है । प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से आसान है और यह क्लासिक और विश्वसनीय तरीकों से बना है जो मोटे तौर पर अन्य सेल प्रकारों में ताऊ के परमाणु कार्य का अध्ययन करने के लिए लागू होते हैं, विभेदित या नहीं, जैसे कि कैंसर कोशिकाएं जो ताऊ अभिव्यक्ति20,21को फिर से सक्रिय करती हैं। इसके अलावा, इसे अन्य प्रोटीनों पर भी लागू किया जा सकता है जो विभिन्न डिब्बों से संबंधित जैविक कार्यों को विच्छेदन करने के लिए साइटोप्लाज्म और नाभिक दोनों में मौजूद हैं।

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Protocol

1. सेल कल्चर

  1. संस्कृति एसएच-SY5Y कोशिकाओं (मानव न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन, CRL-२२६६) पूर्ण माध्यम में (Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम: पोषक तत्व मिश्रण F12 [DMEM/F-12] 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS], 2 m L-ग्लूटामाइन, १०० U/mL पेनिसिलिन और 100 μto कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेटर में बनाए रखें। 10 सेमी प्लेटों में कोशिकाओं को उगाएं और अनुकूल होने पर विभाजित करें।

2. सेल भेदभाव

  1. एसएच-SY5Y कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, चढ़ाना के बाद दिन, 5 दिनों के लिए मध्यम पूरा करने के लिए 10 μM रेटिनोइक एसिड (आरए) जोड़ें ।
  2. छठे दिन भेदभाव माध्यम के साथ मध्यम की जगह: DMEM/F-12 ५० एनजी/mL BDNF, 2 mM एल ग्लूटामाइन के साथ पूरक । एफबीएस या एंटीबायोटिक ्स न डालें।
  3. कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए भेदभाव माध्यम में बढ़ाएं।

3. चिमेरिक क्लोनिंग का निर्माण करता है

  1. ताऊ अनुक्रम 0N4R (383aa) के 3 छोर पर फ्रेम में प्रतिबंध एंजाइम पाचन द्वारा क्लोनिंग द्वारा ताऊ-NLS का निर्माण उत्पन्न करें 3xNLS (SV40NLS): 5'-CCAAAAAAGAAAAAAAGAAAAGAATAAAGAAAGAATAGATCCAAAAAAAAgaAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAA-3'।
    नोट: ताऊ के 3 ' अंत में 3xNLS मल्टीक्लोनिंग साइट (एमसीएस) में Xhoi और BamHI प्रतिबंध साइटों का शोषण स्तनधारी अभिव्यक्ति के लिए pCMV-ताऊ प्लाज्मिड में क्लोन किया गया है ।
  2. ताऊ अनुक्रम 0N4R (383aa) एनईएस अनुक्रम के 3 के अंत में फ्रेम में प्रतिबंध एंजाइम पाचन द्वारा क्लोनिंग द्वारा ताऊ-NES निर्माण उत्पन्न करें: 5'-AGTCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGATATCTATATA-3'।
    नोट: ताऊ के 3 ' अंत में NES MCS में EcoRI और BamHI प्रतिबंध साइटों का शोषण स्तनधारी अभिव्यक्ति के लिए pCMV-ताऊ प्लाज्मिड में क्लोन है ।
  3. चरण ३.१ या ३.२ से डीएनए के १०० एनजी और १०० मिलीग्राम/mL ampicillin के साथ पौंड-एगर प्लेटों पर प्लेट कोशिकाओं के साथ DH5alpha ई. कोलाई तनाव बदलें । चलो 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें।
  4. एक ही कॉलोनी चुनें और कोशिकाओं को एपिसिलिन के साथ एलबी के 5 mL में स्पाइक करें। रात भर आंदोलन में प्रकोष्ठ37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ ते हैं।
  5. निर्माण को सत्यापित करने के लिए डीएनए मिनीप्रेप(सामग्री की तालिका)और अनुक्रम के साथ प्लाज्मिड निकालें।
  6. एपिसिलिन के साथ एलबी-एगर प्लेटों पर अनुक्रम सत्यापित निर्माण और प्लेट कोशिकाओं के साथ DH5alpha ई. कोलाई तनाव को बदलें। चलो 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें।
  7. एक ही कॉलोनी चुनें और कोशिकाओं को एपिसिलिन के साथ एलबी के 5 mL में स्पाइक करें। 2 घंटे तक आंदोलन में प्रकोष्ठ37 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ जाते हैं।
  8. एपिसिलिन के साथ एलबी के 200 मिलील में चरण 3.7 से कोशिकाओं को रखो। चलो 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 3,500 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली।
  10. डीएनए मैक्सीप्रेप(सामग्री की तालिका)के साथ प्लाज्मिड निकालें।

4. सेल ट्रांसफेक्शन

  1. बीज 6-अच्छी तरह प्लेटों या 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में 20,000 कोशिकाओं में चरण 1.1 से 400,000 कोशिकाओं। प्लेट चार नमूने: नियंत्रण कोशिकाओं को एक खाली वेक्टर से ट्रांसकिया जा करने के लिए, कोशिकाओं को अनटैग ताऊ से ट्रांससंक्रमित किया जाना है, कोशिकाओं ताऊ-NLS और कोशिकाओं से ट्रांससंक्रमित करने के लिए ताऊ-NES से ट्रांस किया जाएगा ।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 6-अच्छी प्लेटोंमें6-अच्छी प्लेटों या डीएनए के 200 एनजी में 6-अच्छी तरह से प्लेटों या डीएनए के 200 एनजी का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से डीएनए के 400 एनजी को सीडिंग करने के बाद दिन।
    1. डीएनए और सीनिक लिपिड को 250 माइक्रोन (6-वेल प्लेटों के लिए) या 25 माइक्रोन (8-वेल चैंबर स्लाइड के लिए) में अलग से इनक्यूबेट करें, आरटी में 5 मिन के लिए कम सीरम माध्यम। फिर उन्हें डीएनए लिपिड परिसर उत्पन्न करने और 20 सीन के लिए इनक्यूबेट करने के लिए मिलाएं।
    2. ताजा पूर्ण संस्कृति माध्यम के 2 मिलीएल (6-अच्छी प्लेटों के लिए) या 250 माइक्रोन (8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के लिए) के साथ संस्कृति माध्यम को बदलें। कोशिकाओं में डीएनए लिपिड परिसर डालें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. वैकल्पिक रूप से, कास्टिक रिएजेंट पॉलीथीनमाइन (पी) के साथ डीएनए को ट्रांसफेट करें।
    1. डीएनए के 2 μg और पूर्ण संस्कृति माध्यम के 200 μL के साथ पी के 6 μL मिश्रण (6 अच्छी तरह से प्लेटों में प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए), या डीएनए के 1 μg और पूर्ण संस्कृति माध्यम के 100 μL के साथ पी के 3 μL (8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए) , भंवर और आरटी में 10 मेंस के लिए इनक्यूबेट ।
    2. कोशिकाओं के लिए मिश्रण जोड़ें और 6 में अच्छी तरह से पूरा संस्कृति माध्यम के १.८ मिलील जोड़ें अच्छी तरह से प्लेटिंग मात्रा तक पहुंचने के लिए 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में प्रति अच्छी तरह से पूर्ण संस्कृति माध्यम के १५० μL ।
  4. ट्रांसफेक्शन के बाद दिन मध्यम बदलें और चरण 2.2 में वर्णित विभेदन मीडिया जोड़ें।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. संस्कृति माध्यम निकालें और 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला। बिना मिलाते हुए 3 मिन के लिए 100% बर्फ ठंड मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। फिक्सिंग समाधान निकालें और 1x पीबीएस के साथ संक्षेप में धो लें।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 न्यूनतम के लिए 1x पीबीएस में 0.1% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के साथ Permeabilize। संक्षेप में, 1x पीबीएस के साथ धोएं, 3 बार।
  3. एक कक्षीय शेखर पर आरटी में 30 मिन के लिए बफर (0.1% ट्वीन 20 और पीबीएस में 1% बीएसए) को अवरुद्ध करने के साथ इनक्यूबेट कोशिकाएं।
  4. उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, माउस मोनोक्लोनल एंटी-तौ13 एंटीबॉडी) के साथ इनक्यूबेट ने कक्षीय शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बफर को अवरुद्ध करने में 1:500 को पतला कर दिया। एंटीबॉडी समाधान निकालें और 1x पीबीएस के साथ संक्षेप में धो लें।
  5. फ्लोरोफोर (उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर 633) के लिए संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट ने आरटी में 1 एच के लिए बफर को अवरुद्ध करने में 1:500 को पतला किया। एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और 1x पीबीएस 3 बार के साथ संक्षेप में धोएं।
  6. नाभिक दाग करने के लिए, DAPI के साथ इनक्यूबेट आरटी में 10 00 के लिए बफर को अवरुद्ध करने में 1:20,000 पतला। 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। एंटीफीका बढ़ते माध्यम का उपयोग करके स्लाइड पर माउंट कवरस्लिप।

6. वेस्टर्न ब्लॉट

  1. चरण 4.4 से सेल पैलेट एकत्र करने के लिए, माध्यम को हटा दें, और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिन के लिए 0.1% ट्राइप्सिन के 500 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेट। पूर्ण माध्यम की एक समान मात्रा जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  2. 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर एक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। केंद्रीकरण के अंत में ध्यान से अधिव्रत को हटा दें। पीबीएस के 1 mL जोड़ें, 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और ध्यान से supernatant हटा दें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर तत्काल उपयोग या फ्रीज करने के लिए बर्फ पर सेल छर्रों को स्टोर करें।
  3. कुल प्रोटीन अर्क के लिए, लाइसिस बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8, 20 एमएम एनएसीएल, 10% ग्लाइसेरोल, 1% ऑक्थिलफेनक्सी पॉली (एथिलेनेक्सी) इथेनॉल, ब्रांच्ड(टेबल ऑफ मैटेरियल्स),10 एमएम ईडीटीए) में बर्फ पर 30 मिन के लिए सेल पैलेट को इनक्यूबेट करें। पैलेट की प्रचुरता के अनुसार, लिसिस बफर के 100 माइक्रोन का उपयोग करें।
    1. 15 000 x ग्राम पर 15 000 x पर निकालने का केंद्रीकरण करें। सुपरनेटेंट को इकट्ठा करें और किसी भी मानक क्वाटिफिकेशन परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें। एसडीएस-पेज के लिए प्रोटीन के नमूने तैयार करें कुल 20 माइक्रोन में 4x लैमली बफर के 5 माइक्रोन के साथ 20 माइक्रोन प्रोटीन मिलाकर 5 मिन के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उबाल लें।
      नोट: सैंपल को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
  4. उपसेलुलर अंशों के लिए, कोशिकाओं को चरण 6.2 से पूर्ण माध्यम में फिर से निलंबित करें, और प्रत्येक नमूने के प्रति 1 x 106 कोशिकाओं को इकट्ठा करें। निम्नलिखित चरणों के लिए सेल छर्रों को प्राप्त करने के लिए 10 वर्ष के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    1. उपकोशिकीय डिब्बों को अलग करने के लिए, किट विनिर्देशों के अनुसार आंशिक। प्रत्येक अंश को अलग करने के लिए, संबंधित बफर, अपकेंद्री के साथ चरण 6.4 से सेल पैलेट को इनक्यूबेट करें, सुपरनेटेंट एकत्र करें और 6.4.1.1-6.4.1.5 में वर्णित गोली में अगला बफर जोड़ें। आदेश में साइटोप्लाज्मिक निष्कर्षण बफर, झिल्ली निष्कर्षण बफर, परमाणु निष्कर्षण बफर, परमाणु निष्कर्षण बफर 5 mM CaCl2 और 3 U/μl माइक्रोकोकल nuclease और साइटोस्केलेटल निष्कर्षण बफर के साथ पूरक जोड़ें ।
      नोट: सभी बफ़र्स को प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ पूरक किया जाना चाहिए। सेल गोली की मात्रा के अनुसार स्केल बफर वॉल्यूम।
      1. साइटोसोलिक अंश को अलग करने के लिए, बर्फ के 100 माइक्रोन में इनक्यूबेट सेल छर्रों-ठंडे साइटोप्लाज्मिक निष्कर्षण बफर को 10 मिनट के लिए कोमल मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ पूरक किया जाता है। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और सुपरनेटेंट को प्री-चिल्ड ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      2. बर्फ के 100 माइक्रोन-कोल्ड झिल्ली निष्कर्षण बफर को चरण 6.4.1.1 से पैलेट में प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ पूरक जोड़ें, और 10 मिन के लिए कोमल मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेटेंट एकत्र करें।
      3. घुलनशील परमाणु अंश के लिए, परमाणु निष्कर्षण बफर के 50 μL जोड़ें कदम 6.4.1.2, और भंवर से गोली के लिए प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ पूरक। 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, और supernatant इकट्ठा।
      4. अघुलनशील परमाणु अंश के लिए, परमाणु निष्कर्षण बफर के 50 μL प्रोटीज़ अवरोधकों, CaCl2 और माइक्रोकोकल nuclease के साथ पूरक चरण 6.4.1.3, और भंवर से गोली के लिए जोड़ें। 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, और फिर भंवर फिर से। 5 मिन के लिए आरटी पर 16,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और supernatant इकट्ठा।
      5. साइटोस्केलेटल अंश के लिए, चरण 6.4.1.4 और भंवर से गोली के लिए प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ पूरक साइटोस्केलेटल निष्कर्षण बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें। आरटी में 10 मिन इनक्यूबेट करें सेंट्रलाइज ट्यूब 5 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर, सुपरनेट को इकट्ठा करें और पैलेट को डिस्कार्ड करें।
        नोट: सेल वॉल्यूम के अनुसार स्केल बफर वॉल्यूम, जैसा कि किट प्रोटोकॉल में इंगित किया गया है। ऊष्मायन और सेंट्रलाइज्ड टाइम और तापमान22, 23 ,24,25,26,27,28,29के बारे में अधिक जानकारी के लिए किट प्रोटोकॉल का उल्लेख करें . वैकल्पिक रूप से, डिटर्जेंट का उपयोग करके और आयनिक शक्ति और केंद्रीकरण की गति को बढ़ाकर किसी भी मानक विधियोंका उपयोग करें, साइटोसोलिक, झिल्ली से बंधे, साइटोस्केलेटल और परमाणु अंशों को अलग करता है। मानक परमाणु निष्कर्षण बफ़र्स का शोषण करके घुलनशील परमाणु अंश और अघुलनशील परमाणु अंश को अलग करें । सैंपल को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    2. एसडीएस-पेज के लिए, चरण 6.4.1.1−6.4.1.5 से प्राप्त उपकोशिकी अंशों के 20 माइक्रोन में 4x लैमली बफर के 7 माइक्रोन जोड़ें, 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उबालें।
  5. एक्रिलैमाइड जेल पर नमूने लोड करें और 90 मिन के लिए 250 एमए पर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में 120 वी ट्रांसफर प्रोटीन के लगातार वोल्टेज पर इलेक्ट्रोफोरेसिस करें।
  6. पोंसेऊ धुंधला समाधान में 5 मिन के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करके उचित प्रोटीन जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और सफल ब्लॉटिंग की जांच करें। आसुत पानी में झिल्ली कुल्ला जब तक पृष्ठभूमि साफ है। एक शेखर पर 10 मिन के लिए ट्वीन 20 (TBST) के साथ Tris बफर खारा के साथ जारी धोने से दाग निकालें ।
  7. शेकर पर आरटी में 1 घंटे के लिए ब्लॉकिंग समाधान (TBST में 5% दूध) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें। 5 मिन के लिए TBST के साथ 3 बार धोएं।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर समाधान (TBST में 1% दूध) को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को संकरण करें। 5 मिन के लिए TBST के साथ 3 बार धोएं।
  9. आरटी में 1 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध करने में एचआरपी-कंजुगेड सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को संकरण करें। 5 मिन के लिए TBST के साथ 3 बार धोएं।
  10. केमिलुमिनेसेंस का उपयोग करप्रोटीन बैंड का पता लगाएं। इमेजजे द्वारा वेस्टर्न ब्लॉट बैंड की तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें। एक हाउसकीपिंग जीन के उत्पाद पर प्रोटीन अभिव्यक्ति को सामान्य करें: परमाणु घुलनशील और अघुलनशील अंश के लिए हिस्टोन H2B, साइटोप्लाज्मिक अंश के लिए और कुल अर्क के लिए GAPDH।

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Representative Results

जीन अभिव्यक्ति में परमाणु ताऊ के प्रभाव को विच्छेदन करने के लिए उपयोग की जाने वाली रणनीति को चित्रा 1में दर्शाया गया है । संक्षेप में, एनएलएस या एनईएस के साथ टैग किए गए ताऊ प्रोटीन क्रमशः परमाणु डिब्बे में जमा या बाहर किए जाते हैं। इस बेबाकी का कार्यात्मक प्रभाव वीग्लूट 1 जीन के उत्पाद के रूप में मापा जाने वाला जीन अभिव्यक्ति का परिवर्तन है।

प्रोटोकॉल विवरण के बाद, एसएच-SY5Y कोशिकाओं को 5 दिनों के लिए आरए के साथ और फिर 3 दिनों के लिए बीडीएनएफ के साथ इलाज किया गया ताकि पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं(चित्रा 2)प्राप्त किया जा सकता है। आरए और BDNF की अनुपस्थिति में, अविभेदित एसएच-SY5Y कोशिकाओं को एक राउंडर आकृति विज्ञान और फार्म सेल झुरमुट मान । जैसा कि अपेक्षित था, भेदभाव प्रोटोकॉल शुरू करते हुए, झुरमुट खोलना और कोशिकाएं न्यूराइट्स फैलाती हैं; भेदभाव के अंत में, कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जाता है और शाखाओं में बंटी न्यूराइट्स के नेटवर्क के माध्यम से परस्पर जुड़ा हुआ है।

सीडिंग के बाद दिन, कोशिकाओं को ताऊ-एनएसएस या ताऊ-एनईएस प्लाज्मिड (धारा 4.2) से सीपिक लिपिड के साथ ट्रांस्पर किया गया है। ताऊ-एनएलएस या ताऊ-एनईएस निर्माण व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए, ताऊ उपसेलर स्थानीयकरण का पता एंटी-ताऊ एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षण द्वारा लगाया जा सकता है। ट्रांसफेक्शन की दक्षता के आधार पर, कोशिकाएं डीपीआई सिग्नल के साथ एक मजबूत परमाणु धुंधला विलय या खाली नाभिक के साथ एक साइटोप्लाज्मिक धुंधला प्रदर्शित करती हैं, यदि वे क्रमशः ताऊ-एनएलएस या ताऊ-एनईएस से सफलतापूर्वक ट्रांस्ट्रल होते हैं(चित्रा 3)। इन विशिष्ट संकेतों की कमी एक अक्षम ट्रांसफेक्शन को इंगित करती है।

विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बे में समृद्ध प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए, कोशिकाओं को एकत्र किया गया और प्रति नमूने की कोशिकाओं की समान मात्रा को संसाधित करने के लिए गिना गया । किसी भी मानक अंश विधि है कि डिटर्जेंट और आयनिक शक्ति में वृद्धि और बढ़ती केंद्रीकरण गति का शोषण एक दूसरे से सेलुलर डिब्बों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह साइटोसोलिक, झिल्ली से बंधे, साइटोस्केलेटल अलग और परमाणु अंश।

एक बार नाभिक अलग हो जाने के बाद, परमाणु घुलनशील अंश और क्रोमेटिन बाउंड अंश को माइक्रोकोकल न्यूकैप्लीज और 5 एम एम सीएसीएल2के 3 यू/माइक्रोन जोड़कर अलग कर दिया गया था ।

पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए, साइटोप्लाज्मिक और झिल्ली अंशों की समान मात्रा और अन्य अंशों की आधी मात्रा को एक ढाल पूर्वकास्ट एक्रिलामाइड जेल पर लोड किया गया है, ताकि प्रत्येक चरण में जोड़े गए बफर की विभिन्न मात्रा के लिए सही किया जा सके।

विभिन्न अंशों के कुशल अलगाव को सत्यापित करने के लिए, निम्नलिखित एंटीबॉडी का शोषण करने वाला पश्चिमी दाग किया गया है: एंटी-गाडपीएच (साइटोस्केलेटन को छोड़कर सभी अंशों में मौजूद है और साइटोप्लाज्मिक अंश में विशेष रूप से समृद्ध); एंटी-ऐक्टिन (साइटोस्केलेटल अंश में विशेष रूप से समृद्ध); एंटी-ट्यूबलिन (विशेष रूप से साइटोप्लाज्मिक और साइटोस्केलेटल अंशों में समृद्ध); विरोधी H2B (परमाणु अंशों में समृद्ध)(चित्रा 4)

विभिन्न उप-कोशिकीय अंशों में इन मार्कर का संवर्धन इंगित करता है कि अंशीकरण अच्छी तरह से नहीं किया जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उप-कोशिकीय अंशके लिए कोई भी प्रोटोकॉल अंशों के बीच संदूषण का 10-15% पेश कर सकता है।

एक बार नमूने के सफल अंशीकरण को सत्यापित करने के बाद, परमाणु डिब्बे में ताऊ के संकेत और कुल निकालने में VGluT1 सिग्नल(चित्रा 5)की जांच करने के लिए पश्चिमी दाग किया गया है। जबकि अटैगता ताऊ सभी अंशों में पता लगाने योग्य है, ताऊ-एनएलएस परमाणु डिब्बे में दृढ़ता से समृद्ध है और यह साइटोप्लाज्मिक अंश में खराब पता लगाने योग्य है । इसके विपरीत, ताऊ-NES साइटोप्लाज्मिक अंश में समृद्ध है और यह परमाणु अंश में कम पता लगाने योग्य है । घुलनशील परमाणु अंश में ताऊ-NES की एक छोटी राशि की उपस्थिति के बाद से उंमीद की जानी चाहिए, अंतर्जात ताऊ की तरह, यह नाभिक में स्थानांतरित कर दिया है और एक बार परमाणु डिब्बे में परमाणु निर्यात संकेत साइटोप्लाज्म के लिए अपने स्थानांतरण की अनुमति देता है । इन दो संलयन प्रोटीन के लिए एक अलग संवर्धन का पता लगाने से ट्रांसफेक्शन की दक्षता में या निर्माण की क्लोनिंग या आंशिकता में समस्या का संकेत मिल सकता है।

इमेजजे का उपयोग करके पश्चिमी दाग का मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है। प्रत्येक अंश के लिए विशिष्ट हाउसकीपिंग जीन (साइटोप्लाज्मिक अंश के लिए GAPDH; घुलनशील परमाणु और क्रोमेटिन-बाउंड अंशों के लिए हिस्टोन एच2बी) के लिए मूल्यों को सामान्यीकृत किया जाता है।

चित्रा 5बी में ग्राफ घुलनशील परमाणु अंश और साइटोप्लाज्मिक अंश में ताऊ के अनुपात की रिपोर्ट को उजागर करने के लिए कि ताऊ-एनएलएस घुलनशील परमाणु अंश (एसएनएफ) में अत्यधिक समृद्ध है, जबकि ताऊ-NES में कमी आई है । इसके अलावा, ताऊ-एनएलएस साइटोप्लाज्मिक अंश (सीएफ) के संबंध में क्रोमेटिन-बाउंड अंश (सीबीएफ) में समृद्ध है जबकि ताऊ-एनईएस में कमी आई है। एसएनएफ/सीएफ = 1 और सीबीएफ/सीएफ = 1 नियंत्रण कोशिकाओं में ताऊ अनुपात के अनुरूप है । अंतःता सभी अंशों में अपेक्षा के अनुसार कमजोर रूप से पता लगाने योग्य है। चित्रा 5सी में ग्राफ परमाणु ताऊ की विभिन्न राशि व्यक्त नमूनों के कुल अर्क में VGluT1 अभिव्यक्ति की मात्रा की रिपोर्ट । ताऊ-एनईएस व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में, VGluT1 अभिव्यक्ति नियंत्रण कोशिकाओं में आधारभूत अभिव्यक्ति के बराबर है। इसके विपरीत, अटैगता हुआ ताऊ या ताऊ-एनएलएस व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में, VGluT1 की अभिव्यक्ति दोगुनी से अधिक है।

Figure 1
चित्रा 1: ताऊ के परमाणु या साइटोप्लाज्मिक संचय की अनुमति देने के लिए उपयोग की जाने वाली रणनीति का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। ताऊ-एनएसएस परमाणु डिब्बे में जमा है जबकि ताऊ-एनईएस को बाहर रखा गया है । प्रायोगिक रीडआउट VGluT1 अभिव्यक्ति का मॉड्यूलेशन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि अविभेदित और विभेदित सेल संस्कृति । अविभेदित एसएच-SY5Y (बाएं), आरए (मध्य) द्वारा विभेदित कोशिकाओं की छवि और आरए और बीडीएनएफ (दाएं) द्वारा विभेदित। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिकार द्वारा ताऊ उपसेलर संवर्धन की प्रतिनिधि छवि। कोशिकाओं की छवि ट्रांसट्रांस संक्रमित या अटैग ताऊ, ताऊ-NES या ताऊ-एनएलएस निर्माण व्यक्त करते हैं। ताऊ संकेत इम्यूनोफ्लोरेसेंस (लाल) द्वारा प्राप्त किया गया है, नाभिक संकेत DAPI धुंधला (नीला) द्वारा प्राप्त किया गया है, विलय छवियों की सूचना दी जाती है । स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पश्चिमी दाग द्वारा उपकोशिकीय अंशों में समृद्ध प्रोटीन का प्रतिनिधि पता लगाना। एसएच-SY5Y कोशिकाओं से उपकोशिकीय अंशों का पश्चिमी दाग। CF = साइटोप्लाज्मिक अंश; एमएफ = झिल्ली अंश; एसएनएफ = घुलनशील परमाणु अंश; सीबीएफ = क्रोमेटिन बाउंड अंश; सीकेएफ = साइटोस्केलेटल अंश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: परमाणु ताऊ और VGluT1 प्रोटीन का प्रतिनिधि पता लगाने । (A)परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों में पाए गए ताऊ प्रोटीन का पश्चिमी दाग। (ख)ग्राफ में परमाणु अंशों और साइटोप्लाज्मिक अंश में ताऊ के अनुपात की रिपोर्ट की गई है । अंताजनता पर मानसामान्य कर दिए गए हैं। एसएनएफ/सीएफ = 1 और सीबीएफ/सीएफ = 1 नियंत्रण कोशिकाओं में एंडोजेनियस ताऊ अनुपात से मेल खाती है । (C)VGluT1 प्रोटीन का पश्चिमी दाग। (D)ग्राफ में परमाणु ताऊ की विभिन्न मात्रा व्यक्त करते हुए नमूनों के कुल अर्क में वीग्लूट 1 अभिव्यक्ति की मात्रा की रिपोर्ट की गई है । क्रुस्कल-वालिस नोवा और मान-व्हिटनी टेस्ट; पी एंड एलटी; 0.001, **** पी एंड एलटी; 0.0001, एन.एस. पी एंड जीटी 0.05। सभी परिणामों को कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब ± एसईएम के रूप में दिखाया गया है। इस प्रतिनिधि आंकड़ा Siano एट अल31से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हम जीन अभिव्यक्ति पर परमाणु ताऊ प्रोटीन के प्रभाव को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं । इस प्रोटोकॉल के साथ साइटोप्लाज्मिक ताऊ का योगदान दृढ़ता से सीमित है। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम निम्नलिखित हैं: मानव न्यूरोब्लास्टोमा एसएच-SY5Y कोशिकाओं का भेदभाव, उपकोशिकीय अंशीकरण और परमाणु डिब्बे में ताऊ प्रोटीन का स्थानीयकरण।

सबसे पहले, जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है, आरए और बीडीएनएफ जोड़कर एसएच-SY5Y कोशिकाओं का भेदभाव संस्कृति में न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं की अच्छी तैयारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। वरीयता प्राप्त कोशिकाओं का घनत्व विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि कम घनत्व कोशिका प्रसार को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, उन प्रयोगों के लिए जिन्हें सेलुलर अंशीकरण और पश्चिमी दाग जैसी कोशिकाओं की उच्च संख्या की आवश्यकता होती है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि बीडीएनएफ भेदभाव कदम सेलुलर प्रसार को टर्मिनल भेदभाव की अनुमति देने के लिए रोकता है, इस प्रकार संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या को सीमित करता है। वैकल्पिक विभेदन प्रोटोकॉल बीडीएनएफ के बजाय केवल आरए या एनजीएफ का उपयोग करते हैं। हालांकि, आरए के बाद बीडीएनएफ को जोड़ते समय एक बेहतर रूपात्मक विभेदन32,33तक पहुंचने की अनुमति देता है, एनजीएफ एसएच-SY5Y कोशिकाओं34में कमजोर न्यूराइट आउटग्रोथ को प्रेरित करता है। इसके अलावा, यह बड़े पैमाने पर प्रदर्शित किया गया है कि आरए और बीडीएनएफ का संयोजन न्यूरोनल मार्कर की अभिव्यक्ति और प्रसार35में कमी के साथ एक सजातीय न्यूरोनल आबादी प्राप्त करने की अनुमति देता है। इस कारण से, यहां शोषण किया गया भेदभाव प्रोटोकॉल आरए और बीडीएनएफ को जोड़ती है।

हालांकि, विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में ताऊ की भूमिका को विच्छेदन करने के लिए रिपोर्ट की गई प्रक्रिया का उपयोग अविभेदित कोशिकाओं के लिए या विभिन्न सेल प्रकारों के लिए भी किया जा सकता है।

उपसेलुलर अंशीकरण एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है और यह पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री के लिए महत्वपूर्ण है: एक वाणिज्यिक किट केवल 1 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता है, जबकि अन्य प्रक्रियाओं को बहुत अधिक प्रारंभिक मात्रा की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, मानक बफ़र्स और चरणों के साथ किट का उपयोग प्रयोग की प्रजनन क्षमता की गारंटी देता है जो अपरिहार्य और आवश्यक है। हालांकि, चूंकि बफ़र्स की संरचना अक्सर मालिकाना होती है, इसलिए उनमें डिटर्जेंट हो सकते हैं जो ब्याज के प्रोटीन के कार्य को बदल सकते हैं और अंशों के अलगाव को अनुकूलित करना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, यहां तक कि सबसे अच्छी स्थिति में, अंशों के बीच संदूषण का 10-15% हो सकता है। प्रत्येक अंश से एक गरीब उपज विशिष्ट अंशों के निष्कर्षण बफ़र्स में ऊष्मायन समय में वृद्धि करके दूर किया जा सकता है।

चूंकि परमाणु ताऊ के कार्यों ने हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण रुचि प्राप्त की है, इसलिए विभिन्न सेलुलर डिब्बों में ताऊ के कार्य को विच्छेदन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । उप-कोशिकीय अंशीकरण, ताऊ की अभिव्यक्ति के साथ विशेष रूप से निर्देशित या नाभिक से बाहर रखा गया है, एक को विभिन्न डिब्बों में ताऊ की मात्रा को बारीक धुन करने की अनुमति देता है।

प्रोटोकॉल के इस हिस्से में एक महत्वपूर्ण कदम परमाणु स्थानीयकरण संकेत के साथ टैग ताऊ की क्लोनिंग या परमाणु निर्यात संकेत के साथ है । एनएलएस की दक्षता SV40 वायरस से 3XNLS आम सहमति अनुक्रम की उपस्थिति से गारंटी है। प्रोटीन के परमाणु स्थानांतरण को प्रतिरक्षण द्वारा आसानी से जांचा जा सकता है, और नाभिक में संकेत की कमी गलत क्लोनिंग या अक्षम ट्रांसफेक्शन के कारण हो सकती है। इसके विपरीत, परमाणु निर्यात की गारंटी एनईएस आम सहमति अनुक्रम द्वारा की जाती है । इस मामले में, इम्यूनोफ्लोरेसेंसना नाभिक से ताऊ के निर्यात की जांच की अनुमति देता है। हालांकि, एक कमजोर परमाणु संकेत को बाहर नहीं रखा जाना है क्योंकि ताऊ-एनईएस प्रोटीन नाभिक में प्रवेश करता है और फिर, एनईएस अनुक्रम के कारण, इसे साइटोसोल में निर्यात किया जाता है।

अब तक, परमाणु ताऊ के कार्य का अध्ययन केवल सहसापेक्ष दृष्टिकोणों द्वारा किया गया है जो इसकी सीधी भागीदारी का आश्वासन नहीं देते हैं । यहां प्रोटोकॉल का वर्णन किया, पहले स्पष्ट रूप से परमाणु डिब्बे में ताऊ के विशिष्ट समारोह भेदभाव की अनुमति दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । जैसा कि पहले प्रदर्शन किया गया था, एंडोजेनियस ताऊ इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त परिणामों को प्रभावित नहीं करता है। दरअसल, एक ही प्रयोग गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं में किया जाता है जो एंडोजेनस ताऊ को व्यक्त नहीं करते हैं, VGluT1 परिवर्तित अभिव्यक्ति की ओर जाता है। हमने रोग से संबंधित जीन31की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए यह प्रोटोकॉल लागू किया । किसी भी तरह, डीएनए क्षति पर भागीदारी, परमाणु कोफैक्टर्स के साथ बातचीत या क्रोमेटिन के साथ अन्य परमाणु ताऊ कार्यों की जांच करने के लिए भी इसका फायदा उठाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को स्क्यूला नॉर्मल सुपीरियर (SNS14_B_DIPRIMIO) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; SNS16_B_DIPRIMIO) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10,000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10,000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15,000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5,000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH = 8, 0.5 M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1,000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1,000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL, 100 mL
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

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