Undersöka dynamiken i cellulära vidhäftning och spridning av epitelceller på fibronectin under oxidativ stress

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna metod är användbar för att kvantifiera den tidiga dynamiken i cellulär vidhäftning och spridning av förankrings beroende celler på fibronectin. Vidare, denna analys kan användas för att undersöka effekterna av förändrade redox homeostas på cell spridning och/eller cell adhesion-relaterade intracellulära signalering vägar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tolbert, C. E., Palmquist, L., Dixon, H. L., Srougi, M. C. Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (152), e59989, doi:10.3791/59989 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vidhäftning och spridning av celler på den extracellulära matrisen (ECM) är viktiga cellulära processer under organismers utveckling och för homeostas av vuxna vävnader. Intressant, oxidativ stress kan förändra dessa processer, vilket bidrar till patofysiologin av sjukdomar som metastaserande cancer. Därför förstå mekanismen (er) av hur celler fäster och sprids på ECM under störningar i redox status kan ge insikt i normala och sjukdomstillstånd. Beskrivs nedan är ett stegvist protokoll som utnyttjar en immunofluorescensbaserad analys för att specifikt kvantifiera cellernas vidhäftning och spridning av förevigade fibroblastceller på Fibronektin (FN) in vitro-. Kortfattat, Anchorage-beroende celler hålls i suspension och utsätts för ATM kinashämmare Ku55933 att inducera oxidativ stress. Cellerna är sedan pläterade på FN-belagda ytan och får fästa för förutbestämda tidsperioder. Celler som förblir fästa är fasta och märkta med fluorescensbaserade antikropps markörer för vidhäftning (t. ex. paxillin) och spridning (t. ex., F-Actin). Data insamling och analys utförs med hjälp av allmänt tillgänglig laboratorieutrustning, inklusive ett epifluorescensmikroskop och fritt tillgänglig Fiji-programvara. Detta förfarande är mycket mångsidig och kan ändras för en mängd olika cellinjer, ECM proteiner, eller inhibitorer för att undersöka ett brett spektrum av biologiska frågor.

Introduction

Cell-Matrix adhesioner (dvs. fokala sammanväxningar) är stora och dynamiska multimolekyl ära proteinkomplex som förmedlar cellernas vidhäftning och spridning. Dessa processer är avgörande för vävnads utveckling, underhåll, och fysiologiska funktion. Focal sammanväxningar består av membran-bundna receptorer, såsom integriner, samt byggnadsställningar proteiner som länkar cytoskeletala aktin till extracellulära matrix (ECM)1. Dessa komplex är kapabla att reagera på fysiokemiska ledtrådar som finns i den extracellulära miljön genom aktivering av olika signaltransduktionvägar. Som sådan, Focal sammanväxningar fungera som signalering centra för att propagera extracellulära mekaniska ledtrådar i ett antal cellulära processer inklusive riktad migration, Cellcykelreglering, differentiering, och överlevnad1,2. En grupp av signalmolekyler som reglerar och interagerar med fokala sammanväxningar inkluderar medlemmar i Rho-familjen av små GTPases. Rho GTPases är viktiga proteiner som reglerar cell migration och vidhäftnings dynamik genom deras specifika spatiotemporal aktivering3. Inte överraskande, dysreglering av Rho proteinfunktion har varit inblandad i ett antal mänskliga patologier såsom metastaser, angiogenes, och andra. Av särskilt intresse, cellulära redox status spelar en dominerande roll i modulering av cell migration och vidhäftning. Förändringar i redox homeostas, såsom ökningar av reaktiva syreradikaler (ros), har visat sig reglera Rho protein aktivitet, samt vidhäftning, i ett antal celltyper och mänskliga sjukdomar4,5,6 ,7,8. Till exempel, individer som lider av den neurologiska sjukdomen ataxi-telangiectasia (A-T), som orsakas av en mutation i DNA-skadan reparation serin/Threonine Kinas A-T-muterade (ATM), har en ökad risk för metastaserad cancer9, 10. Förlust av ATM Kinas aktivitet hos dessa patienter och cellinjer, antingen genom genetisk mutation eller kemisk hämning, resulterar i höga nivåer av oxidativ stress på grund av dysfunktion av pentofosfatvägen7,11, 12. Dessutom, nyare studier från laboratoriet har belyst en patofysiologisk roll för ROS i A-T genom att förändra cytoskelettets dynamik (dvs. adhesion och spridning) som en direkt följd av aktivering av Rho familjen GTPases in vitro-5. Islutändan kan dessa förändringar i cytoskeletala dynamik orsakade av Rho familj aktivering leda till den ökade risken för metastaserad cancer noteras i A-T patienter5,13. Därför, förstå samspelet mellan cell-matris interaktioner under oxidativ stress kan ge insikter i regleringen av adhesion och spridning. Dessa studier kan också sätta scenen för ytterligare utredningar av en möjlig roll för Rho-familjen GTPases i dessa signaleringsprocesser.

Beskrivs häri är ett protokoll för att studera den tidiga cellulära dynamiken i adhesion församling och sprider sig under oxidativ stress orsakad av hämning av ATM Kinas aktivitet. Denna analys är baserad på den väl karakteriserade mekanismen för Anchorage-beroende celler vidhäftning till ECM-proteinet Fibronektin (FN). När celler som upprätthålls i suspensionen är pläterade på FN, flera Rho gtpases samordna kontrollen av aktin cytoskeletala remodeling3,14. Morfologiska förändringar observeras som celler skiftar från runda och cirkulära utseende till tillplattad och expanderad. Samtidig med dessa observationer är utvecklingen av många Matrix sammanväxningar med ECM. Dessa förändringar tillskrivs bifasisk aktivering av RhoA med Rac1 under den första timmen som celler fäster och sprider 15,16.

En mängd olika metoder har utnyttjats för att undersöka vidhäftnings morfologi och dynamik samt cell spridning. Men dessa metoder förlitar sig på sofistikerade långsiktig, Live-avbildning totalt inre reflektion fluorescens (TIRF) eller konfokala mikroskopi system. Därför måste användarna ha tillgång till specialiserad utrustning och programvara. Dessutom gör den inställda tid som krävs av dessa bio-Imaging system fånga tidiga vidhäftnings händelser utmanande, särskilt när man testar flera inhibitorer eller behandlings villkor samtidigt.

Metoderna detaljerade, häri, ger ett enkelt, ekonomiskt, men ändå kvantitativt sätt att bedöma parametrar som styr vidhäftning församlingen och sprider in vitro-. Protokollet utförs med hjälp av allmänt tillgänglig laboratorieutrustning, såsom ett epifluorescensmikroskop och CCD-kamera. Denna analys innebär att tillämpa Anchorage-beroende celler till en FN-belagd yta efter en period av oxidativ stress orsakad av kemisk hämning av ATM Kinas aktivitet, som har visats tidigare5. Efter plätering, celler får fästa och fästa för specificerade längder av tid. Okopplade celler tvättas bort, medan bifogade celler är fasta och märkta med fluorescensbaserade antikroppar mot markörer för vidhäftning (t. ex. paxillin) och spridning (t. ex., F-Actin)2,5. Dessa proteiner visualiseras och registreras med hjälp av ett epifluorescensmikroskop. Efterföljande dataanalys utförs med hjälp av fritt tillgängliga Fiji programvara. Dessutom kan denna metod anpassas för att undersöka vidhäftnings dynamik under ett brett spektrum av förhållanden, inklusive olika ECM-proteiner, behandling med olika oxidanter/cell odlingsförhållanden eller en mängd olika förankrings beroende cellinjer för att ta itu med ett brett spektrum av biologiska frågor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. förberedelser

Anmärkning: det protokoll som beskrivs nedan har optimerats för användning med REF52 celler och ATM+/+ eller ATM-/- Human fibroblaster. Andra celltyper kan kräva ytterligare optimering som beskrivs i avsnitten anteckningar och felsökning nedan.

  1. Gör 500 mL komplett cell odlingssubstrat för REF52 celler. Till 500 mL av hög glukosinnehållande Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) tillsätt 10% FBS, 2 mM L-glutamin, och 100 enheter/mL penicillin-streptomycin.
  2. Bered en 25 μg/ml lösning av Fibronektin (FN) genom att tillsätta 300 μl 1 mg/ml FN-lösning till 12 ml steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4. Blanda väl.
  3. Förbered en 0,5% (w/v) delipidated (dvs, fettsyra gratis) bovint serum albumin (dlBSA) lösning i serumfritt DMEM cellkulturmedium. Tillsätt 0,5 g dlBSA till 100 mL serumfritt DMEM-medium. Blanda lösningen väl, men inte Vortex. Sterilt filter lösningen i en ny steril behållare, med ett 0,22 μM sprutfilter före användning. Förvaras vid 4 ° c.
  4. Gör 3,7% paraformaldehydlösning genom att lösa upp 3,7 g PARAFORMALDEHYD i 100 mL 1x PBS. Använd mild värme och omrörning för att få PARAFORMALDEHYD i lösning.
    Obs: paraformaldehydlösningen är ljuskänslig och bör skyddas mot ljus. Det är bra i upp till en vecka vid förvaring vid 4 ° c.
    FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD är giftig, brandfarlig, frätande och en hälsorisk. Granska materialsäkerhetsdatabladet för PARAFORMALDEHYD före användning. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering inklusive Eye Shield, Face Shield, full-Face partikel respirator, handskar och Lab Coat.
  5. Bered permeabiliseringslösningen med 0,2% nonjontensid i 1x PBS (v/v). För 100 mL, Tillsätt långsamt 0,2 mL av Triton X-100 till 100 mL 1x PBS, under omrörning.
  6. Gör immunofluorescensblockeringsbufferten med 2,5% BSA, 5% get serum och 0,05% nonjontensid (w/v/v) upplöst i 1x PBS-lösning. För 100 mL, tillsätt 5 mL get serum, 2,5 g BSA och 0,05 mL av Triton X-100 i ~ 95 mL 1x PBS, under omrörning.
  7. Odla REF52 celler i DMEM komplett odlingssubstrat i en 10 cm2 (eller någon annan fartygsstorlek) cellkultur-behandlad platta i en cellkultur inkubator vid 37 ° c och 5% Co2.

2. beläggning cellkultur plattor med det extracellulära matrix proteinet Fibronektin

Anmärkning: utför detta avsnitt med aseptisk teknik och sterila reagenser i ett BSL-2-certifierat laminärt flödes skydd. Se figur 1a för en översikt över viktiga steg före början.

  1. Med hjälp av en vävnadskultur certifierad 24-brunn tallrik, placera en glastäckslip (12-CIR-1) i varje brunn. Märk plattan enligt figur 1b.
  2. Pipettera över 500 μL av 25 μg/mL FN-lösning till varje brunn på en 24-brunn-platta.
  3. Pipettera lösningen över varje täckslip några gånger för att säkerställa jämn beläggning och fullständig nedsänkning. Sätt tillbaka locket på plattan.
  4. Inkubera plattan i en cellkultur inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 för 1 h.
    Obs: alternativt Inkubera över natten vid 4 ° c.
  5. Efter 1 h, ta bort plattan från inkubatorn och aspirera FN-lösningen från brunnarna.
  6. Tvätta brunnarna tre gånger med 500 μL 1x PBS. Aspirera den sista tvätten av 1x PBS.
  7. Blockera brunnar med 500 μL 0,5% dlBSA-lösning i minst 15 min vid 37 ° c och 5% CO2.
  8. Aspirera på dlBSA-lösningen före pläteringscellerna i steg 3 nedan.
    Obs: om plattorna förvaras, tillsätt 500 μL 1x PBS till varje täckslip efter aspiration av dlBSA-lösningen. Plattorna kan sedan förvaras vid 4 ° c i upp till en vecka.

3. förberedelse av förankrings beroende celler för adhesionstest

Anmärkning: utför detta avsnitt med aseptisk teknik och sterila reagenser i ett BSL-2-certifierat laminärt flödes skydd.

  1. Minst 30 min före cellpläteringen, Värm upp följande lösningar: DMEM komplett medium, dlBSA lösning, 1x PBS, 0,5% trypsin-EDTA lösning, och trypsin neutraliserande serum (TNS) i en 37 ° c vattenbad.
  2. Börja med en konfluenta enskiktslager av REF52 celler i en 10 cm2 skålen, tvätta celler två gånger med 6 ml varm 1x PBS. Serum svälter cellerna i minst 1 h (beroende på celltyp) i 6 mL varm dlBSA-lösning vid 37 ° c och 5% CO2.
  3. Tvätta celler med 6 mL värmd 1x PBS, aspirera PBS och tillsätt 1,5 mL varm 0,5% trypsin-EDTA-lösning.
  4. Placera celler i en cellkultur inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 för ~ 2 min.
  5. Observera celler under ett lätt Mikroskop för att säkerställa att avlossning är slutförd. Om cellerna fortfarande är anhängare efter att ha knackat på plattan på bänkskiva, återgå till 37 ° c inkubator i ytterligare 2 min. Trypsinize cellerna för så lite tid som behövs.
  6. Pipettera 1,5 mL varm trypsin neutraliserande lösning (TNS) till skålen för att stoppa trypsinization och samla in fristående celler. Pipettera lösningen upp och ner över botten av plattan många gånger för att ta bort alla kvarvarande anhängare celler. Om celler verkar clumpy, ytterligare hackad cellsuspensionen genom att försiktigt Pipettera upp och ner över bak på skålen.
  7. Räkna celler med trypan blå uteslutning och en hemocytometern under ett lätt Mikroskop. Du kan också använda en automatiserad cell räknare.
  8. Ta bort en lämplig mängd celler för att skapa en 1,0-3,0 x 104 celler/ml cellsuspension i 5 ml dlbsa i ett 15 ml koniskt rör.
  9. Centrifugera celler på ~ 300 x g i 5 min med en fast vinkel rotor i en bordsskiva centrifug.
  10. Aspirera supernatanten från cellpelleten och Omsuspendera cellerna i totalt 7 mL varm dlBSA-lösning. Låt inte cellerna att vara alltför konfluenta på täckslip plätering, men jämnt fördelade med få celler vidrör varandra.
  11. Jämnt dela cellsuspensionen i 2 15 mL koniska rör, en för fordonet ensam kontroll (DMSO) och en för Ku55933 (ATM kinashämmare, oxidant)5. Se till att varje tub innehåller 3,5 mL av cellsuspensionen.
  12. Med hjälp av en slang rotator, revolvera rören vid 37 ° c för 90-120 min i en cellkultur inkubator.
  13. 30 min före plätering, tillsätt en slutlig koncentration av 10 μM Ku55933 och DMSO (1:1000) till varje respektive rör. Placera cell upphängningen tillbaka på rotatorn för den återstående tiden.
  14. Omedelbart före plätering cellerna, Hämta 24-brunnen plattan från inkubator och aspirera dlBSA lösning.
  15. Efter roterande cellsuspensionen för 90-120 min, ta bort 500 μL cellsuspension från varje behandlingsgrupp och Lägg till en FN-belagd täckslip i 24-brunnen plattan från steg 2 som illustreras (figur 1b). Returnera plattan till 37 ° c och 5% CO2 cell Culture inkubator och cellsuspensionen tillbaka till rotationen.
  16. Efter plätering cellsuspensionen på FN omfattas-täckglas, tillåta celler att hålla sig till önskad tid (t. ex., 10 min, 15 min, 20 min, 30 min) och sedan omedelbart gå vidare till steg 4.

4. cellfixering och antikropps färgning för immunofluorescens

Anmärkning: följande steg utförs under icke-sterila förhållanden och vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Efter den önskade tiden för vidhäftning har passerat, aspirera cell lösningen från varje täckslip i plattan.
  2. Använd sidorna av brunnen och fördela försiktigt 500 μL av 3,7% paraformaldehydlösning på varje täckslip och vänta 10-15 min.
  3. Ta bort paraformaldehydlösningen och tvätta varje täckslip med 500 μL 1x PBS i totalt två gånger.
    Anmärkning: kassera paraformaldehydavfall på ett ansvarsfullt sätt enligt institutionens miljöskydds plan.
  4. Aspirera PBS, och permeabilize celler på varje täckslip med 500 μL av 0,2% Triton X-100 i 1x PBS (v/v) för 10-15 min vid rumstemperatur.
  5. Tvätta varje täckslip med 500 μL 1x PBS tre gånger.
  6. Blockera celler på varje täckslip med 500 μL av immunofluorescensblockeringsbuffert som innehåller 5% get serum, 2,5% BSA och 0,05% Triton X-100 upplöst i en 1 X PBS-lösning för 30-60 minuter.
  7. Späd den primära anti-paxillin-antikroppen (1:250) i blockeringsbufferten. Blanda väl och tillsätt 200 μL av antikroppslösningen till varje täckslip. Inkubera vid rumstemperatur i minst 1 h.
    Obs: Alternativt kan den primära antikroppslösningen inkuberas över natten vid 4 ° c. Det finns många gemensamma Focal vidhäftnings markörer som kan användas för färgning vidhäftning komplex och efterföljande FA-analys. Dessa inkluderar antikroppar mot följande proteiner: integrin subenheter (β1, Α5, eller αv), Talin eller vinculin2.
  8. Aspirera antikroppslösningen och tvätta varje täckslip med 500 μL 1x PBS tre gånger för 10 min vardera. Skydda proverna från ljus från denna punkt framåt.
  9. Späd phalloidin F-Actin sond konjugerad till den röda fluorescerande Alexa 594 Dye (1:1000) och get-anti Mouse 488 fluorescerande sekundär antikropp (1:400) i samma blockeringsbuffert lösning. Blanda väl och tillsätt 200 μL av antikroppslösningen till varje täckslip i 30 min.
    Anmärkning: Fluorescently konjugerade sekundära antikroppar från andra arter kan också användas. Användning av antikroppar från andra arter kommer dock att kräva modifiering av blockerande buffertserum.
  10. Aspirera antikroppslösningen och tvätta varje täckslip med 500 μL 1x PBS tre gånger för 10 min vardera.
  11. Sug upp 1x PBS och skölj en gång med 500 μL dIH2O.
  12. Montera täckglas på Mikroskop diabilder med hjälp av anti-Fade monteringsmedel som innehåller DAPI.
  13. Låt Mikroskop bilderna ställas in över natten i mörker vid rumstemperatur.
  14. Förvara Mikroskop glas i mörker vid 4 ° c för långtidsförvaring och fram till avbildning.
    Anmärkning: bild med hjälp av standardiserade immunofluorescensteknik. Det rekommenderas att använda en hög-powered oljeimmersion 60x objektiv för att säkerställa tillräcklig upplösning för att notera de fokala sammanväxningar och perifera volanger på cellkanter. Hämta bilder av 20-30 celler i flera olika visningsområden för varje täckslip under varje behandlings tillstånd och tid. Från kombinerade replikat, detta bör ge minst 60 celler för att utföra statistisk analys. Spara och exportera fluorescensbilder som en. TIFF-fil med en upplösning på minst 300 dpi.

5. kvantifiera stress fibrer, cell cirkularitet och fokal vidhäftnings bildning

Anmärkning: följande bildanalyser utförs med den senaste versionen av öppen källkod Imaging Processing Package Fiji är bara bild J (Fiji), som kan laddas ner gratis på (http://fiji.sc/).

  1. Allmän bildbehandling
    Obs: alla bilder måste förberedas för beräknings analyser genom att utföra steg 5.1.1-5.1.5 nedan (figur 2). Efteråt kan eventuella eller alla efterföljande kvantifieringsförfaranden väljas.
    1. Öppna. TIFF fluorescens-bild med Fiji. Se till att bilderna är 8-bitars och gråskala.
    2. Välj bild-justera-fönster/nivå och välj Auto (figur 2A).
    3. Välj process-subtrahera bakgrund för att subtrahera bakgrundfluorescensen. Kontrollera glidande Paraboloid och välj alternativet för en rullande bollradie på 50 pixlar (figur 2b).
      ANMÄRKNINGAR: för att kontrollera rätt storlek för den rullande bollradien, Välj linjeverktyget och rita en radie på den största vidhäftningen i bilden. Välj Mät för att kontrollera längden på den dragna linjen. Om värdet för radien är för stor, funktioner inklusive sammanväxningar kommer att förloras i bilden. Om radien är för liten, kommer det att ge upphov till artefakter i den bearbetade bilden på grund av bakgrundsbrus.
    4. Välj bild-justera-ljusstyrka/kontrast för att kontrollera intensiteten av vidhäftning över bakgrunden. Justera vid behov.
      Anm: för att optimera ljusstyrkan/kontrasten och undvika att mätta signalen, Använd uppslags verktyget för bilden för att undersöka dess histogram för att justera ljusstyrkan/kontrasten.
    5. Välj följande parametrar under analysera-ange mått: område, medelvärde gråvärde, form beskrivningar och integrerad densitet.
  2. Stress fiber formation analys
    Obs: stress fibrer kan kvantifieras flera sätt beroende på fenotyp.
    1. Räkna antalet celler med stress fibrer som en procentsats över det totala antalet celler. Denna analys är bäst om det finns visuella skillnader i antalet stress fibrer som bildas under olika experimentella förhållanden.
    2. Räkna antalet stress fibrer som tvärgående cellen. Denna analys möjliggör en jämförelse av antalet spännings fibrer som bildas per cell.
    3. Mät den totala fluorescensintensiteten som ges av phalloidin (t. ex. F-Actin) färgning per cell17,18. Denna metod kommer att belysa drastiska ökningar/minskningar i fluorescensintensitet på grund av F-Actin färgning.
      1. Ställ in mätnings parametrarna i steg 5.1.5 ovan.
      2. Välj verktyget FreeHand i Fiji verktygsfält och manuellt spåra cellen (s) av intresse. Välj analysera-mått. Ett nytt fönster visas som visar de valda mätnings parametrarna.
      3. Välj verktyget FreeHand i Fiji verktygsfält och manuellt spåra ett tomt utrymme utan celler närvarande. Välj analysera-mått. Denna mätning kommer att fungera som bakgrundsfluorescens.
      4. Använd ekvationen nedan för att bestämma den totala F-Actin-fluorescensen per cell:
        Equation 1
        Anmärkning: den resulterande mätningen kan normaliseras och jämföras med andra celler för att ge F-Actin fluorescens per cell.
  3. Analys av cell cirkularitet
    Anmärkning: information om cellområde (en indikator för cell spridning över tid), liksom, kan cirkularitet också registreras. Denna mätning ges som ett förhållande mellan 0 till 1 som ett sätt att kvantifiera celler som är långsträckta till runda, respektive.
    1. Välj verktyget FreeHand i Fiji verktygsfält och spåra en enskild cell. Välj bild-Mät och spela in cellområdet och perimetermätningarna för varje cell. Upprepa proceduren för varje cell.
      Anmärkning: under funktionen ange mätningar tillhandahålls loopkontroll som form beskrivare mätning (steg 5.1.5).
    2. Räkna manuellt Actin-berikad arruffano eller utskjutande delar per cell som avbildas i figur 3 och figur 4.
  4. Focal vidhäftning analys
    Obs: innan du utför Focal vidhäftnings analys, installera den mexikanska hatt filter plugin på den senaste versionen av Fiji. Följande protokoll har modifierats från tidigare studier19,20,21.
    1. Välj process-förbättra lokal kontrast (Clahe) med en blockstorlek på 19, histogram papperskorgar 256, och en maximal lutning på 6, utan mask och inte snabbt. (Figur 2C)
    2. Välj process-filter-Gaussian Blur med en Sigma (radie) av 2,0 för att filtrera bilden (figur 2D).
    3. Välj plugins-Mexican hat filter (MHF) med en radie på 2,0 (figur 2e).
    4. Kör tröskel och välj mörk bakgrund och över/under med hjälp av antingen Huang eller ISOdata som thresholsmetod. Välj Automatisk tröskel.
      Anmärkning: det här steget säkerställer att sammanväxningar markeras, men också skiljer sig från varandra.
    5. Välj analysera-analysera partiklar med följande parametrar markerade: size = 20, pixlar-oändlighet och cirkularitet = 0,00-0,99. Kontrollera konturerna för att säkerställa korrekt detektering och separation av fokala adhesioner.
      Anmärkning: dessa resultat ger nummer, område och form Beskrivning av enskilda fokala sammanväxningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett allmänt schema för den experimentella uppsättningen

Figur 1 representerar det generella schemat för cellernas vidhäftning och spridnings protokoll som börjar med serum SVÄLT av REF52 celler och slutar med beräknings analys av förvärvade fluorescensbilder. Viktiga steg i protokollet illustreras i tidslinjen. Av anmärkning, steg 2 i protokollet beskriver beredningen av FN-belagda täckglas, som bör utföras samtidigt med steg 3: serum svältande REF52 celler innan de släpps ut i suspensionen (figur 1a). Ett exempel på en mock-märkt 24-brunn skylt som anger behandlingsgrupper och varaktigheten av cellernas vidhäftning före fixering av prover för fluorescens mikroskopi (figur 1b).

Immunofluorescensbildbehandling för kvantifiering av fokala adhesionen

REF52 celler hölls i suspension för 90 minuter, pläterade på FN, och får hålla sig i ytterligare 15 minuter. Efter fixering och färgning med en anti-paxillin antikropp, var fluorescerande 8-bitars gråskalebilder av cellerna förvärvades. Bildbehandlings analys utfördes enligt det protokoll som var avgränat i steg 5. Visas är representativa bilder av varje distinkt bearbetningssteg inklusive originalbilden (figur 2A) och bilder efter bakgrunds subtraktion (efter rullande boll) (figur 2b), Clahe (figur 2C), Gaussisk oskärpa ( Figur 2D) och mexikansk hatt filter (post-MHF) (figur 2e) filtrerings steg. Efter att ha avslutat alla bildbehandling steg, enskilda fokala sammanväxningar bör vara framträdande, i fokus, och lätt att skilja från varandra (figur 2e). När bilderna har filtrerats kan de fokala sammanväxningarna kvantifieras och deras område mätas (steg 5,1 och 5,4).

Visualisering av cellernas vidhäftning och spridning på FN efter oxidativ stress

En representativ grå Skale fluorescens bild av anti-paxillin (Focal vidhäftning markör) (figur 3, övre panelen) och phalloidin F-Actin sond färgning (figur 3, bottenplatta) av REF52 celler efter plätering på FN med eller utan Ku55933 ( Med ROS-inducerande medel). Före analysen, REF52 celler var serum svalt för 1 h. Efter serum svält, celler hölls i suspension medan de behandlades med antingen fordonet ensamt eller 10 μM Ku55933 att inducera oxidativ stress. Celler var pläterade på FN-belagda täckband för de angivna tider, fast, och sedan färgas med en antikropp till fokala adhesioner och phalloidin att upptäcka F-Actin proteiner. Framstående fokala sammanväxningar och stress fibrer bör vara lätt synlig i REF52 celler efter att ha rätt att hålla sig för 20-30 min på FN. pläterade celler bör inte överlappa varandra för att tillåta full cellulära spridning efter vidhäftning. Lägg märke till de tydliga, distinkta cellkanterna samt utrymme för enskilda celler att sprida sig (figur 3). F-Actin berikade volanger i framkant cellmembran är synliga och indikeras med en pil (figur 3, botten panel).

Grafisk representation av kvantifierade fluorescensbilder av spännings fibrer och graden av cell spridning

Exempel på kvantifierade bilder som visas i stapeldiagram form representerar andelen celler med stress fibrer och graden av cell sprider sig med och utan Ku55933 behandling vid olika tidpunkter efter vidhäftning. Fluorescerande bilder av phalloidin F-Actin sond och anti-paxillin färgning, liknande bilder som visas i figur 3, analyserades för andelen stress fibrer och cell spridning (dvs cirkularitet index) med hjälp av bildanalys förfaranden beskrivs i steg 5 i protokollet. I synnerhet orsakade oxidations behandling en signifikant ökning av stress fiber bildningen vid alla tidpunkter för vidhäftning som undersökts (figur 4a) och en minskning av cell spridningen efter 15 minuters celladhesion till FN (figur 4b).

Icke kvantifierbara immunofluorescenskonbilder på grund av cellulär över sammanlänkning

Serum-svalt REF52 celler hölls i suspension för 90 minuter, under vilken tid de behandlades med 10 μM Ku55933 att inducera ROS formation. Celler sedan pläteras på FN och tillåtas att hålla sig i 20 minuter, varefter de var fasta och färgade med anti-paxillin eller phalloidin-Alexa 594 F-Actin sond. Plätering vid högre cell tätheter leder till cellulära trängsel, som förbjuder celler från att fullt ut spridas på grund av över confluency. Observera att cellkanterna är omöjliga att skilja från intilliggande celler (gula pilar) (figur 5a). Som ett resultat, kvantifiering av enskilda celler är utesluten, och spridning omkrets inte kan bestämmas exakt. I figur 5B, en separat cell linje, mus embryonala fibroblaster (MEF), hölls i suspension och sedan pläterad på FN i 30 minuter. Celler fixades sedan och färgas med en anti-paxillin-antikropp. Av fokus celler betecknas med röda pilar (Figur 5b). Dessutom kommer kors Reaktiviteten hos anti-paxillin-antikroppen med cellulärt skräp (blå pil) att förändra tröskelmängden under kvantitativ bildanalys (del 5) och bör inte inkluderas i analysen (Figur 5b).

Figure 1
Bild 1: tidslinje för protokoll och exempel 24-brunn plattset-up.
A) tidslinjen belyser viktiga steg i förfarandet för vidhäftning och spridning av celler. B) representativ märkt 24-Plate, som illustrerar behandlingsgrupper och tider för celladhesion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: exempel på representativa immunofluorescensbilder efter bildbehandling.
REF52 celler hölls i suspension för 90 min, pläterade på FN, och får hålla sig i 15 min. celler fastställdes och färgas med en anti-paxillin antikropp. (A) original bild och bilder efter (B) bakgrunds subtraktion (post-rullande boll), (C) clahe, (D) Gaussian Blur och (E) Mexican hat filter (post-MHF) filtrering steg. Stång, 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa immunofluorescensbilder av anti-paxillin och phalloidin F-Actin PROBE färgade REF52 celler pläterade på FN.
Före analysen, REF52 celler var serum svalt för 1 h. Efter serum svält, celler hölls i suspension under behandling med antingen fordonet ensamt eller 10 μM Ku55933 att orsaka oxidativ stress. Celler var pläterade på FN-belagda täckband för de angivna tider, fast och färgade med en antikropp till fokala sammanväxningar och phalloidin att upptäcka F-Actin proteiner. F-Actin berikade volanger i framkant av cellmembranen indikeras med en pil. Stång, 40 μm. Denna siffra har modifierats från Tolbert et al.5vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: kvantifiering av immunofluorescensbilder.
Grafer som illustrerar (a) andelen celler som uppvisar stress fibrer och (B) mätningar av cell cirkularitet. Cell cirkularitet definierades som cellområdet dividerat med cellperimetern. Värden varierade från 0-1,0 indikerar en långsträckt eller rundad morfologi, respektive. Felstaplar indikerar S.E.M. Students t-test för Parade prover * p < 0,01 från experiment utförda i tre exemplar. Denna siffra har modifierats från Tolbert et al.5vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: icke kvantifierbara immunofluorescensbilder.
(A) serum-svalt REF52 celler hölls i suspension för 90 min, medan behandlade med 10 μm Ku55933. Celler var pläterade på FN och får följa 20 min. celler fixades och färgas med anti-paxillin eller phalloidin-Alexa 594 F-Actin sond. Cell kanterna visas med gula pilar. BMEF-celler hölls i suspension och sedan pläterade på FN i 30 min. celler fixerades och färgas med en anti-paxillin-antikropp. Av fokus celler betecknas med röda pilar och Cross-reaktivitet av anti-paxillin antikropp med cellulära skräp betecknas med blå pilar. Stång, 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det protokoll som beskrivs här är ett mångsidigt och ekonomiskt sätt att snabbt skärmen ett antal förankrings beroende celltyper för dynamisk cytoskelettet remodeling under cell spridning. I synnerhet, denna metod undersöker kvantitativt stress fiber och fokal vidhäftnings bildning under oxidativ stress när cellerna följer FN (figur 1a). Dessutom kan dessa cellulära fenotyper föreslå en reglerande roll för medlemmar i Rho familj av små gtpases eftersom de har dokumenterade roller under cell kvarstad och spridning15,16,22. Ytterligare biokemiska tekniker skulle dock krävas för att identifiera det möjliga engagemanget av GTP-bundet, aktivt Rho-familjproteiner.

Det presenterade protokollet utnyttjar immunofluorescensdetektion av F-Actin och paxillin för att specifikt undersöka cellernas vidhäftning och spridning av förevigade fibroblastceller på FN efter oxidativ stress orsakad av ATM-Kinas-hämning (figur 2, Figur 3 och figur 4). Emellertid, detta förfarande kan också anpassas för användning på andra ECM proteiner och/eller för andra anhängare celltyper. Vid anpassning till andra cellinjer, det är viktigt att optimera experimentella förhållanden, särskilt: cell nummer/densitet, tid av serum svält, ECM proteinkoncentration, och oxidativ stress behandling villkor. När man testar effekterna av en okänd stimulans på adhesion och sprider dynamik, är det nödvändigt att inkludera både negativa och positiva kontrollprover för att kontrollera att analysen fungerar korrekt. Negativa kontrollprover kan inkludera ett obehandlat eller endast vehikel-prov, medan en positiv kontroll bör framkalla oxidativ stress (t. ex., H2O2). Dessutom, även om det inte diskuteras här, är det också viktigt att använda rätt antikropps kontroller. Det rekommenderas att tre separata kontroller används för varje antikropp för att kontrollera dess specificitet och för att identifiera potentiella fluorescensblödning-genom23,24. Dessa inkluderar: 1) en primär antikropps kontroll för att säkerställa specifik bindning av den primära antikroppen till antigenet och för att bekräfta att antigen bindningen sker under de fixeringsförhållanden som används, 2) en sekundär antikropps kontroll (för icke-sekundära konjugerade antikroppar ) som visar specificitet för den primära antikroppen, och 3) fluorophore-kontroller som säkerställer att den tillförda fluorophore inte är resultatet av endogen fluorescens eller blödning genom en annan antikropp.

Även om denna analys är användbar för att analysera de tidiga kinetiska händelserna i adhesion församling och spridning, är det inte lämpligt för detaljerad undersökning av adhesion demontering eller vidhäftning styrka och cellulära förstärkning. Det sistnämnda förutsätter användning av bio stationer för långsiktig avbildning eller spektroskopi av encellsstyrningsteknik. De senare teknikerna omfattar Atom krafts Mikroskop, optiska pincetter, spännings sensorer för vidhäftnings proteiner som vinculin25 eller Talin26,27och 3D-Force mikroskopi28.

Kritiska steg i protokollet inkluderar grundligt beläggning täckband med FN. Detta är nödvändigt för en enhetlig spridning och vidhäftning av celler. Det är därför viktigt att Pipettera FN-lösningen uppåt och nedåt över täckglaserna flera gånger före inkubering. Täckglas måste förbli helt nedsänkt i FN-lösningen under inkubationstiden. FN-belagda täckglas kan förvaras i upp till 2 veckor vid 4 ° c.

Cell täthet är också viktigt, som celler som är pläterade för tätt kommer inte att uppnå maximal spridning omkrets. Dessutom skulle det inte vara möjligt att skilja enskilda fokala sammanväxningar eller cellulära volanger för varje enskild cell. Det är därför nödvändigt att räkna cellerna med hjälp av en hemocytometern eller automatiserad cell räknare innan du placerar cellerna i suspensionen. Medan en uppskattning av celltäthet ges för REF52 celler, detta kommer att behöva empiriskt bestämmas för andra celler under studie. Celler bör pläteras glest nog att få celler överlappar varandra, så att de kan spridas fullt ut (figur 5).

Andra kritiska steg i protokollet att överväga är överföras konjugerat phalloidin-Alexa 594 F-Actin sond och sekundära antikroppar är ljuskänsliga. Därför bör proverna vara minimalt utsatta för ljus efter applicering av dessa reagenser. Dessutom, ett antal agenter som inducerar oxidativ stress har korta halveringstid. Det är därför nödvändigt att testa den valda oxidationsmedel för optimal dos och exponeringstid för att uppnå maximal aktivitet.

Följande avsnitt innehåller problem skytte tips med avseende på FN koncentration, serum svält villkor, och metoder cell avlossning. Dessa tips är användbara när du anpassar protokollet för andra celler linjer och/eller behandlingsförhållanden.

För jämn FA-analys är optimala infästnings-och spridningsförhållanden nödvändiga, vilket kommer att variera beroende på ECM-ligand. För FN, börja använda ett dynamiskt omfång på 10-30 μg/mL. Vid högre koncentrationer av FN, det finns liten skillnad i cell attachment. Vissa celltyper sprids dock inte effektivt vid högre koncentrationer av ECM.

Varje celltyp reagerar olika på villkoren för serum svält. REF52 celler kan lätt svältas över natten utan förlust av lönsamhet, men detta är inte sant för alla cellinjer. Därför är det nödvändigt att bestämma i vilken grad cell linjen under studien tål serum svält.

För att sprida analyser, celler måste trypsinized för så lite tid som möjligt för reproducerbara resultat29. Efter cell avlossning av trypsinization, cellytan receptorer, deras besläktat ligands, och Rho gtpase aktivitet kräver en återhämtningsperiod att återvända till steady-state nivåer14,15. Den trypsinization förfarande som beskrivs i detta protokoll bör göra det möjligt för celler att behålla de flesta av deras cellytan FN-bindande receptorer29. Emellertid, vissa celltyper kan kräva alternativa metoder för cell avlossning för att helt förhindra nedbrytning av cellytan receptorer. Dessa metoder inkluderar kelaterande celler med EDTA-baserade lösningar (t. ex., Versene) eller mildare enzymatiska dissociation lösningar (t. ex., Accutase). Användning av dessa dissociation lösningar kan lämna cell-cell adhesioner intakt vilket resulterar i cell klumpar. Det är därför viktigt att helt Omsuspendera enskilda celler för att säkerställa experimentell reproducerbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar DRS. Scott R. Hutton och Meghan S. Blackledge för den kritiska granskningen av manuskriptet. Detta arbete finansierades av High Point University ' s Research and sponsrade program (MCS) och bioteknikprogrammet vid North Carolina State University (MCS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life Technologies 25300-054 cell dissociation
10 cm2 dishes Cell Treat 229620 sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile
1X Phosphate Buffered Saline Corning Cellgro 21-031-CV PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates Fisher Scientific 07-200-740 sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) BD Transduction Laboratories 610620 marker of focal adhesions
Aspirator Argos EV310
Biosafety cabinet Nuair NU-477-400 Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder Fisher Scientific BP9704-100 dlBSA
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100 organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose Fisher Scientific 11965092 REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum Fisher Scientific 16000044 certified, cell culture medium supplement
Fiji National Institutes of Health http://fiji.sc/ image analysis program
Filter syringe Fisher Scientific 6900-2502 0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5) Fisher Scientific 12-545-81 autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum Gibco by Life Technologies 16210-064 component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 for cell counting
Human Plasma Fibronectin Gibco by Life Technologies 33016-015 FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope Olympus microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933 Sigma-Aldrich SML1109-25MG ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera Optimos
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) Invitrogen A12381 marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36941 cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control Corning Incorporated PC-420D
Syringe BD Biosciences 309653 60 mL syringe
Tissue culture incubator Nuair
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution Fisher Scientific 15-250-061 for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x) Gibco by Life Technologies R-002-100 TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator Fisher Scientific 11-676-341
water bath Fisher Scientific FSGPD02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2, (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508, (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11, (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14, (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51, (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20, (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472, (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115, (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10, (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12, (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28, (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6, (7), e22025 (2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9, (9), e107393 (2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121, (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69, (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59, (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214, (2), 231 (2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213, (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5, (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28, (27), 3928-3935 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics