Undersøke dynamikken i Cellular vedheft og spredning av epitelceller på Fibronektin under oksidativt stress

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne metoden er nyttig for kvantifisere tidlig dynamikk av cellulær vedheft og spredning av forankring-avhengige celler på fibronektin. Videre kan denne analysen brukes til å undersøke virkningene av endrede Redox homeostase på celle spredning og/eller celle vedheft-relaterte intracellulære signalering trasé.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tolbert, C. E., Palmquist, L., Dixon, H. L., Srougi, M. C. Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (152), e59989, doi:10.3791/59989 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vedheft og spredning av celler på ekstracellulære matrise (ECM) er essensielle cellulære prosesser under organismal utvikling og for homeostase av voksen vev. Interessant, kan oksidativt stress endre disse prosessene, og dermed bidra til patofysiologi av sykdommer som metastatisk kreft. Derfor forstå mekanismen (e) av hvordan cellene feste og spre på ECM under forstyrrelser i Redox status kan gi innsikt i normal og sykdom tilstander. Beskrevet nedenfor er en trinn-klok protokoll som utnytter en immunofluorescence-basert analysen til spesifikt kvantifisere celle vedheft og spredning av udødeliggjort Fibroblast celler på fibronektin (FN) in vitro. Kort, er anker avhengige celler holdt i suspensjon og eksponert for ATM kinase inhibitor Ku55933 å indusere oksidativt stress. Celler blir deretter belagt på FN-belagt overflate og lov til å feste for forhåndsbestemte perioder av gangen. Celler som forblir vedlagt, er faste og merket med fluorescens antistoff markører for vedheft (f.eks. paxillin) og spredning (F-utgangen). Data innsamling og analyse utføres ved hjelp av allment tilgjengelig laboratorieutstyr, inkludert et epifluorescence mikroskop og fritt tilgjengelig Fiji-programvare. Denne prosedyren er svært allsidig og kan endres for en rekke cellelinjer, ECM proteiner, eller hemmere for å undersøke et bredt spekter av biologiske spørsmål.

Introduction

Cell-Matrix adhesjon (dvs. fokal adhesjon) er store og dynamiske multimolecular protein komplekser som megle celle vedheft og spredning. Disse prosessene er avgjørende for vevs utvikling, vedlikehold og fysiologisk funksjon. Fokal adhesjon er sammensatt av membran-bundet reseptorer, slik som integrins, samt stillas proteiner som knytter cytoskjelettkomponenter utgangen til ekstracellulære matrise (ECM)1. Disse komplekser er i stand til å reagere på fysiokjemiske stikkordene til stede i ekstracellulære miljøet gjennom aktivering av ulike signalering Transduction trasé. Som sådan, fokal adhesjon tjene som signalering sentre å spre ekstracellulære mekaniske stikkordene inn i en rekke cellulære prosesser inkludert styrt migrasjon, celle syklus regulering, differensiering, og overlevelse1,2. En gruppe av signalering molekyler som regulerer og samhandler med fokal adhesjon inkluderer medlemmer av Rho familien av små GTPases. Rho GTPases er viktige proteiner som regulerer celle migrasjon og vedheft dynamikk gjennom deres spesifikke spatiotemporal aktivering3. Ikke overraskende har feilregulering av Rho protein funksjon vært innblandet i en rekke menneskelige patologi som metastasering, angiogenese og andre. Av spesiell interesse, spiller mobilnettet Redox status en dominerende rolle i modulering av celle migrasjon og vedheft. Endringer i Redox homeostase, slik som økninger i reaktive oksygen arter (ros), har vist å regulere Rho protein aktivitet, samt vedheft, i en rekke celletyper og menneskelige sykdommer4,5,6 ,7,8. For eksempel, personer som lider av nevrologisk lidelse ataksi-telangiectasia (A-T), som er forårsaket av en mutasjon i DNA skade reparasjon Serine/threonin kinase A-T-mutert (ATM), har en økt risiko for metastatisk kreft9, 10i. Tap av ATM kinase aktivitet hos disse pasientene og cellelinjer, enten gjennom genetisk mutasjon eller kjemisk hemming, resulterer i høye nivåer av oksidativt stress på grunn av dysfunksjon av pentose fosfat sti7,11, det er 12. Videre har nyere studier fra laboratoriet fremhevet en patofysiologiske rolle for ROS i A-T ved å endre cytoskjelettkomponenter dynamikk (dvs. vedheft og spredning) som et direkte resultat av aktivering av Rho-familien GTPases in vitro5. Til syvendeog sist, disse endringene i cytoskjelettkomponenter dynamikk forårsaket av Rho familie aktivering kan føre til økt risiko for metastatisk kreft bemerket i A-T pasienter5,13. Derfor kan det å forstå samspillet mellom celle-matrise interaksjoner under oksidativt stress gi innsikt i regulering av vedheft og spredning. Disse studiene kan også sette scenen for videre undersøkelser i en mulig rolle for Rho familien GTPases i disse signalering prosesser.

Beskrevet her er en protokoll for å studere tidlig Cellular dynamikk av vedheft montering og spredning under oksidativt stress forårsaket av hemming av ATM kinase aktivitet. Denne analysen er basert på den godt preget mekanisme av forankring-avhengige celler vedheft til ECM protein fibronektin (FN). Når cellene opprettholdt i suspensjon er belagt på FN, flere Rho GTPases koordinere kontroll av utgangen cytoskjelettkomponenter remodeling3,14. Morfologiske endringer er observert som celler Skift fra runde og sirkulære i utseende til flatet og utvides. Samtidig med disse observasjonene er utviklingen av en rekke Matrix adhesjon med ECM. Disse endringene tilskrives bifasisk aktivering av RhoA med Rac1 i løpet av den første timen når cellene overholder og sprer 15,16.

En rekke metoder har blitt benyttet for å undersøke vedheft morfologi og dynamikk, samt celle spredning. Men disse metodene er avhengige av sofistikerte langsiktige, Live-Imaging totale interne refleksjon fluorescens (TIRF) eller konfokalmikroskopi mikroskopi systemer. Dermed må brukerne ha tilgang til spesialisert utstyr og programvare. Videre er den innstilte tiden som kreves av disse bio-Imaging systemer gjør fange tidlig vedheft hendelser utfordrende, spesielt når du tester flere hemmere eller behandling forhold samtidig.

Metodene detaljert, her, gir en grei, økonomisk, men likevel kvantitativ måte å vurdere parametre som regulerer vedheft forsamlingen og sprer in vitro. Protokollen utføres ved hjelp av allment tilgjengelig laboratorieutstyr, for eksempel et epifluorescence mikroskop og CCD-kamera. Denne analysen innebærer å anvende anker avhengige celler til en FN-belagt overflate etter en periode med oksidativt stress forårsaket av kjemisk hemming av ATM kinase aktivitet, som har blitt demonstrert tidligere5. Etter plating, har celler lov til å feste og overholde for spesifiserte lengder tid. Ledige celler vaskes bort, mens vedlagte celler er faste og merket med fluorescens-baserte antistoffer mot markører for vedheft (f. eks paxillin) og sprer seg (f. eksutgangen)2,5. Disse proteinene er så visualisere og tatt opp ved hjelp av et epifluorescence mikroskop. Påfølgende dataanalyse utføres ved hjelp av fritt tilgjengelig Fiji-programvare. Videre kan denne metoden tilpasses for å undersøke vedheft dynamikk under et bredt spekter av forhold, inkludert ulike ECM-proteiner, behandling med ulike oksidanter/cellekultur forhold eller en rekke forankring-avhengige cellelinjer for å løse et bredt spekter av biologiske spørsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelser

Merk: protokollen som er beskrevet nedenfor er optimalisert for bruk med REF52 celler og ATM+/+ eller ATM-/- humant fibroblaster. Andre celletyper kan kreve ytterligere optimalisering som beskrevet i notatene og feilsøkings delene nedenfor.

  1. Lag 500 mL komplett cellekultur medium for REF52 celler. Til 500 mL med høy glukose som inneholder Dulbecco er modifisert Eagle ' s medium (DMEM) tilsett 10% FBS, 2 mM L-glutamin, og 100 enheter/mL penicillin-Streptomycin.
  2. Forbered en 25 μg/mL oppløsning av fibronektin (FN) ved å tilsette 300 μL av 1 mg/mL FN-løsning til 12 mL sterilt 1x fosfat bufret saltvann (PBS), pH 7,4. Bland godt.
  3. Forbered en 0,5% (w/v) delipidated (dvs. fettsyrer gratis) storfe serum albumin (dlBSA) løsning i serum gratis DMEM cellekultur medium. Tilsett 0,5 g dlBSA til 100 mL serum fri DMEM medium. Bland løsningen godt, men ikke Vortex. Sterilt filter løsningen inn i en ny steril beholder ved hjelp av et sprøyte filter på 0,22 μM før bruk. Oppbevares ved 4 ° c.
  4. Lag 3,7% paraformaldehyde oppløsning ved å oppløse 3,7 g av paraformaldehyde i 100 mL 1x PBS. Bruk skånsom varme og omrøring for å få paraformaldehyde inn i løsningen.
    Merk: den paraformaldehyde løsningen er lysfølsom og bør beskyttes mot lys. Den er god i opptil en uke når den oppbevares ved 4 ° c.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftig, brannfarlig, etsende og helsefare. Gå gjennom dataarket for materialsikkerhet for paraformaldehyde før bruk. Bruk egnet personlig verneutstyr ved håndtering, inkludert øye skjold, ansiktsskjerm, partikkel maske med hel overflate, hansker og Laboratoriefrakk.
  5. Klargjør den permeabilization løsningen som inneholder 0,2% ikke-ioniske overflateaktivt middel i 1x PBS (v/v). For 100 mL, tilsett sakte 0,2 mL Triton X-100 til 100 mL av 1x PBS, under omrøring.
  6. Gjør immunofluorescence blokkerende buffer som inneholder 2,5% BSA, 5% geit serum, og 0,05% ikke-ioniske overflateaktivt middel (w/v/v) oppløst i 1x PBS løsning. For 100 mL, tilsett 5 mL geit serum, 2,5 g av BSA og 0,05 mL Triton X-100 i ~ 95 mL 1x PBS, under omrøring.
  7. Grow REF52 celler i DMEM komplett kultur medium i en 10 cm2 (eller andre fartøy størrelse) cellekultur-behandlet plate i en cellekultur inkubator ved 37 ° c og 5% co2.

2. coating cellekultur plater med ekstracellulære matrise protein fibronektin

Merk: Utfør denne delen ved hjelp av aseptisk teknikk og sterile reagenser i en BSL-2-sertifisert laminær Flow hette. Se figur 1a for en oversikt over viktige trinn før start.

  1. Ved hjelp av en vev kultur sertifisert 24-brønn plate, plassere ett glass dekkglass (12-CIR-1) i hver brønn. Merk platen i henhold til figur 1B.
  2. Pipetter 500 μL av 25 μg/mL FN-løsningen til hver brønn på en 24-brønn plate.
  3. Pipetter løsningen over hver dekkglass et par ganger for å sikre jevnt belegg og fullstendig nedsenking. Sett lokket tilbake på platen.
  4. Ruge platen i en cellekultur inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for 1 time.
    Merk: Alternativt ruge over natten ved 4 ° c.
  5. Etter 1 time, Fjern platen fra inkubator og aspirer FN-løsningen fra brønnene.
  6. Vask brønner tre ganger med 500 μL av 1x PBS. Aspirer siste vask av 1x PBS.
  7. Blokker brønner med 500 μL av 0,5% dlBSA-oppløsning i minst 15 minutter ved 37 ° c og 5% CO2.
  8. Aspirer dlBSA-løsningen før du plating cellene i trinn 3 nedenfor.
    Merk: Hvis du oppbevarer plater, må du legge til 500 μL av 1x PBS i hver dekkglass etter aspirasjon av dlBSA-løsningen. Platene kan deretter oppbevares ved 4 ° c i opptil en uke.

3. forbereder forankring-avhengige celler for vedheft analysen

Merk: Utfør denne delen ved hjelp av aseptisk teknikk og sterile reagenser i en BSL-2-sertifisert laminær Flow hette.

  1. Minst 30 min før celle plating, pre-varme følgende løsninger: DMEM komplett medium, dlBSA løsning, 1x PBS, 0,5% Trypsin-EDTA løsning, og Trypsin nøytralisere serum (TNS) i et 37 ° c vannbad.
  2. Starter med en confluent monolag av REF52 celler i en 10 cm2 parabol, vask celler to ganger med 6 ml varm 1x PBS. Serum sulter cellene i minst 1 time (avhengig av celle type) i 6 mL varm dlBSA-oppløsning ved 37 ° c og 5% CO2.
  3. Vask celler med 6 mL varmet 1x PBS, aspirer PBS og tilsett 1,5 mL varm 0,5% Trypsin-EDTA-løsning.
  4. Plasser celler i en cellekultur inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for ~ 2 min.
  5. Observer celler under et lett mikroskop for å sikre at avløsning er fullført. Hvis cellene fortsatt er tilhenger etter at du har trykket på platen på benkeplata, går du tilbake til 37 ° c inkubator i ytterligere 2 min. Trypsinize cellene for så lite tid som er nødvendig.
  6. Pipette 1,5 mL varm Trypsin nøytralisere løsning (TNS) til parabolen å stoppe trypsinization og samle frittliggende celler. Pipetter løsningen opp og ned over bunnen av platen flere ganger for å fjerne alle gjenværende tilhenger celler. Hvis cellene vises klumpete, triturate ytterligere celle fjæringen ved forsiktig pipettering opp og ned over baksiden av fatet.
  7. Telle celler ved hjelp trypan blå eksklusjon og en hemocytometer under et lett mikroskop. Alternativt kan du bruke en automatisert celle teller.
  8. Fjern en passende mengde celler for å opprette en 1,0-3,0 x 104 celler/ml celle fjæring i 5 ml dlBSA i et 15 ml konisk rør.
  9. Sentrifuger celler på ~ 300 x g i 5 min ved hjelp av en fast vinkel rotor i en bord-topp sentrifuger.
  10. Aspirer supernatanten fra celle pellet, og resuspend celler i totalt 7 mL varm dlBSA løsning. Ikke la cellene være altfor confluent upon dekkglass plating, men jevnt fordelt med få celler berøre hverandre.
  11. Jevnt dele cellen suspensjonen i 2 15 mL koniske rør, en for kjøretøyet alene kontroll (DMSO) og en for Ku55933 (ATM kinase inhibitor, oksiderende)5. Sørg for at hvert rør inneholder 3,5 mL av celle fjæringen.
  12. Ved hjelp av en tube Rotator, dreier rørene ved 37 ° c for 90-120 min i en cellekultur inkubator.
  13. 30 min før plating, tilsett en endelig konsentrasjon på 10 μM Ku55933 og DMSO (1:1000) til hver respektive rør. Plasser celle fjæringen tilbake på Rotator for gjenværende tid.
  14. Umiddelbart før plating cellene, hente 24-brønn plate fra inkubator og aspirer den dlBSA løsningen.
  15. Etter at du har roterende celle fjæringen i 90-120 min., fjerner du 500 μL av celle fjæring fra hver behandlingsgruppe og legger til ett FN-belagt dekkglass i 24-brønn platen fra trinn 2 som illustrert (figur 1B). Returner platen til 37 ° c og 5% CO2 cellekultur inkubator og celle fjæringen tilbake til rotasjonen.
  16. Etter plating cellen suspensjon på FN dekket-coverslips, tillate celler til å overholde ønsket tidsrom (for eksempel 10 min, 15 min, 20 min, 30 min) og deretter umiddelbart gå videre til trinn 4.

4. celle fiksering og antistoff farging for immunofluorescence

Merk: følgende trinn utføres under ikke-sterile forhold og ved romtemperatur med mindre annet er angitt.

  1. Etter at ønsket tid for vedheft er passert, aspirer celle løsningen fra hver dekkglass i platen.
  2. Ved hjelp av sidene av brønnen, forsiktig dispensere 500 μL av 3,7% paraformaldehyde løsning på hver dekkglass og vent 10-15 min.
  3. Fjern den paraformaldehyde løsningen og vask hver dekkglass med 500 μL av 1x PBS for totalt to ganger.
    Merk: Kast paraformaldehyde avfall på en ansvarlig måte, i henhold til institusjonens miljø helse og sikkerhetsplan.
  4. Aspirer PBS, og permeabilize celler på hver dekkglass med 500 μL av 0,2% Triton X-100 i 1x PBS (v/v) for 10-15 min ved romtemperatur.
  5. Vask hver dekkglass med 500 μL av 1x PBS tre ganger.
  6. Blokker celler på hver dekkglass med 500 μL av immunofluorescence blokkerende buffer som inneholder 5% geit serum, 2,5% BSA og 0,05% Triton X-100 oppløst i en 1 X PBS løsning for 30-60 minutter.
  7. Fortynne det primære anti-paxillin antistoff (1:250) i blokkerings bufferen. Bland godt og tilsett 200 μL av antistoff løsningen på hver dekkglass. Ruge ved romtemperatur i minst 1 time.
    Merk: Alternativt kan den primære antistoff oppløsningen inkubert over natten ved 4 ° c. Det er mange felles fokus vedheft markører som kan brukes til farging vedheft komplekser og påfølgende FA analyse. Disse inkluderer antistoffer mot følgende proteiner: integrin under enheter (β1, α5, eller αV), Talin, eller vinculin2.
  8. Aspirer antistoff løsningen og vask hver dekkglass med 500 μL av 1x PBS tre ganger i 10 minutter hver. Beskytt prøvene fra lys fra dette punktet fremover.
  9. Fortynne phalloidin F-utgangen sonde bøyd til den røde fluorescerende Alexa 594 fargestoff (1:1000) og geit-anti-mus 488 fluorescerende sekundært antistoff (1:400) i samme blokkerende buffer løsning. Bland godt og tilsett 200 μL av antistoff oppløsningen til hver dekkglass i 30 min.
    Merk: Fluorescensmerkete bøyd sekundære antistoffer fra andre arter kan brukes også. Imidlertid vil bruk av antistoffer fra andre arter krever modifisering av blokkering buffer serum.
  10. Aspirer antistoff løsningen og vask hver dekkglass med 500 μL av 1x PBS tre ganger i 10 minutter hver.
  11. Aspirer 1x PBS og skyll den ene gangen med 500 μL av di2O.
  12. Monter coverslips på mikroskop lysbildene ved hjelp av anti-fade montering medium som inneholder DAPI.
  13. La mikroskop lysbildene stå i mørket ved romtemperatur.
  14. Lagre objektglass i mørket ved 4 ° c for langtidsoppbevaring og til bildebehandling.
    Merk: bilde ved hjelp av standard immunofluorescence teknikker. Det anbefales å bruke en høy-drevet olje nedsenking 60x objektiv linse for å sikre nok oppløsning til å merke seg fokal adhesjon og perifere ruffles på celle kanter. Tilegne seg bilder av 20-30 celler i flere visningsfelt for hver dekkglass under hver behandling tilstand og tid. Fra kombinerte replikerer, bør dette gi minst 60 celler for å utføre statistisk analyse. Lagre og Eksporter fluorescens bilder som en. TIFF-fil med minimum 300 dpi oppløsning.

5. kvantifisere stress fibre, celle sirkularitet, og fokal adhesjon formasjon

Merk: følgende bildeanalyser utføres ved hjelp av den nyeste versjonen av den åpne kilde bildebehandlings pakken Fiji er Just image J (Fiji), som kan lastes ned gratis på (http://fiji.sc/).

  1. Generell bildebehandling
    Merk: alle bilder må være klargjort for beregningsorientert analyse ved å utføre trinn 5.1.1-5.1.5 nedenfor (figur 2). Etterpå kan noen eller alle etterfølgende kvantifisering prosedyrer velges.
    1. Åpne. TIFF-fluorescens bilde ved hjelp av Fiji. Sørg for at bildene er 8-biters og gråtoner.
    2. Velg bilde-Juster-vindu/nivå og velg Auto (figur 2a).
    3. Velg prosess-trekk fra bakgrunn for å trekke fra bakgrunns fluorescens. Sjekk Sliding paraboloide og velg alternativet for en rullende Ball radius på 50 piksler (figur 2b).
      Merk: Hvis du vil kontrollere riktig størrelse for den rullende ballen radius, velger du linjeverktøyet og tegner en radius på den største vedheft i bildet. Velg mål for å kontrollere lengden på linjen som trekkes. Hvis verdien av radiusen er for stor, vil funksjoner inkludert adhesjon gå tapt i bildet. Hvis radiusen er for liten, vil det gi opphav til gjenstander i det behandlede bildet på grunn av bakgrunnsstøy.
    4. Velg bilde-juster-lysstyrke/kontrast for å kontrollere intensiteten av vedheft over bakgrunnen. Juster om nødvendig.
      Merk: hvis du vil optimalisere lysstyrken/kontrasten og unngå å mette signalet, bruker du oppslags verktøyet i bildet til å undersøke histogrammet for å justere lysstyrken/kontrasten.
    5. Velg følgende parametere under analyser-sett mål: areal, gjennomsnittlig grå verdi, figur beskrivelser og integrert tetthet.
  2. Analyse av stress fiber formasjon
    Merk: stress Fibre kan kvantifisert på flere måter, avhengig av fenotype.
    1. Telle antall celler med stress fibre som en prosentandel over det totale antall celler. Denne analysen er best hvis det er visuelle forskjeller i antall stress fibre dannet under ulike eksperimentelle forhold.
    2. Telle antall stress fibre som tverrgående cellen. Denne analysen gjør det mulig for sammenligning av antall stress fibre dannet per celle.
    3. Mål den totale fluorescens intensiteten som gis av phalloidin (f.eks. f-utgangen) farging per celle17,18. Denne metoden vil markere drastiske økninger/reduksjoner i fluorescens intensitet på grunn av F-utgangen farging.
      1. Angi måle parametrene i trinn 5.1.5 ovenfor.
      2. Velg frihåndsverktøyet på Fiji-verktøylinjen, og spor manuelt cellen (e) som interesserer. Velg analyser-mål. Det vises et nytt vindu som viser de valgte målings parametrene.
      3. Velg frihåndsverktøyet på Fiji-verktøylinjen, og spor manuelt et tomt område uten at det finnes celler. Velg analyser-mål. Denne målingen vil fungere som bakgrunns fluorescens.
      4. Bruk ligningen nedenfor til å bestemme den totale F-utgangen fluorescens per celle:
        Equation 1
        Merk: den resulterende målingen kan bli normalisert og sammenlignet med andre celler for å gi F-utgangen fluorescens per celle.
  3. Cell sirkularitet analyse
    Merk: informasjon om celleområdet (en indikator på celle spredning over tid), så vel som, kan sirkularitet også tas opp. Denne målingen er gitt som et forhold mellom 0 og 1 som en måte å kvantifisere celler som er langstrakt til runde, henholdsvis.
    1. Velg frihåndsverktøyet på Fiji-verktøylinjen, og spor en enkelt celle. Velg Image-mål og Registrer celle areal og perimeter målinger for hver celle. Gjenta denne fremgangsmåten for hver celle.
      Merk: under Set mål -funksjonen angis sirkularitet som figur beskrivelser måling (trinn 5.1.5).
    2. Telle utgangen-beriket ruffling eller utstikkende per celle manuelt som avbildet i Figur 3 og Figur 4.
  4. Fokus vedheft analyse
    Merk: før du utfører fokal vedheft analyse, installere meksikanske hat filter plugin på den nyeste versjonen av Fiji. Følgende protokoll er endret fra tidligere studier19,20,21.
    1. Velg prosess-forbedre lokal kontrast (Clahe) ved hjelp av en blokkstørrelse på 19, histogram binger 256, og en maksimal helling på 6, uten maske og ikke rask. (Figur 2C)
    2. Velg prosess-filtre-Gaussian Blur med en Sigma (radius) på 2,0 for å filtrere bildet (figur 2D).
    3. Velg plugins-meksikanske hat filter (MHF) med en Radius på 2,0 (figur 2e).
    4. Kjør terskel og velg mørk bakgrunn og over/under med enten Huang eller Isodata som terskelverdi metode. Velg automatisk terskelverdi.
      Merk: dette trinnet sikrer at adhesjon er uthevet, men også forskjellig fra hverandre.
    5. Velg analyser-analyser partikler med følgende parametere valgt: størrelse = 20, piksler-uendelig og sirkularitet = 0,00-0.99. Kontroller konturene for å sikre riktig påvisning og separasjon av fokal adhesjon.
      Merk: disse resultatene gir tall, areal og form beskrivelse av individuelle fokal adhesjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et generelt skjema for det eksperimentelle oppsettet

Figur 1 representerer den generelle skjema for cellen vedheft og spre protokollen begynner med serum SULT av REF52 celler og slutter med beregningsorientert analyse av ervervet fluorescens bilder. Viktige trinn i protokollen illustreres på tidslinjen. Av notatet, trinn 2 av protokollen beskriver utarbeidelse av FN-belagt coverslips, som bør utføres samtidig med trinn 3: serum sultende REF52 celler før du plasserer dem i suspensjon (figur 1a). Et eksempel på en uekte-merket 24-brønn plate som indikerer behandlingsgrupper og varighet av celle vedheft før fiksering av prøver for fluorescens mikroskopi (figur 1B).

Immunofluorescence bildebehandling for fokal vedheft kvantifisering

REF52 celler ble holdt i suspensjon i 90 minutter, belagt på FN, og lov til å holde i ytterligere 15 minutter. Etter fiksering og farging med et anti-paxillin antistoff, ble fluorescerende 8-biters gråtonebilder av cellene anskaffet. Bildebehandlings analyse ble utført i henhold til protokollen som er avgrenset i trinn 5. Vist er representative bilder av hvert distinkt behandlingstrinn inkludert det opprinnelige bildet (figur 2a), og bilder etter bakgrunn subtraksjon (post-Rolling ball) (figur 2b), CLAHE (figur 2C), Gaussian Blur ( Figur 2D) og meksikanske hat filter (post-MHF) (figur 2e) filtrerings trinn. Etter å ha fullført alle bildebehandlings trinn, bør individuelle fokal adhesjon være fremtredende, i fokus, og lett kan skilles fra hverandre (figur 2e). Når bildene er filtrert, kan fokal adhesjon være kvantifisert og deres areal målt (trinn 5,1 og 5,4).

Visualisering av celle vedheft og spredning på FN etter oksidativt stress

En representativ gråtoner fluorescens bilde av anti-paxillin (fokus vedheft markør) (Figur 3, top panel) og phalloidin F-utgangen sonde farging (Figur 3, nederste panel) av REF52 celler etter plating på FN med eller uten Ku55933 ( ROS-inducing agent) behandling. Før analysen, REF52 celler var serum sultet for 1 t. Etter serum sult, ble celler holdt i suspensjon mens behandles med enten kjøretøy alene eller 10 μM Ku55933 å indusere oksidativt stress. Celler ble belagt på FN-belagt coverslips for de angitte tider, fast, og deretter farget med et antistoff til fokal adhesjon og phalloidin å oppdage F-utgangen proteiner. Prominent fokal adhesjon og stress fibre bør være lett synlig i REF52 celler etter å ha fått lov til å overholde 20-30 min på FN. belagte celler bør ikke overlappe med hverandre for å tillate full mobilnettet sprer seg etter vedheft. Legg merke til de klare, distinkte celle kantene samt plass for enkeltceller å spre seg (Figur 3). F-utgangen beriket ruffles på forkanten av cellemembraner er synlige og indikert med en pil (Figur 3, nederste panel).

Grafisk representasjon av kvantifisert fluorescens bilder av stress fibre og graden av celle spredning

Eksempler på kvantifisert bilder vises i søylediagram form som representerer prosentandelen av celler med stress fibre og graden av celle sprer seg med og uten Ku55933 behandling på ulike tidspunkter etter vedheft. Fluorescerende bilder av phalloidin F-utgangen sonde og anti-paxillin farging, ligner på bilder som vises i Figur 3, ble analysert for prosentandelen av stress fibre og celle spredning (dvs. sirkularitet Index) ved hjelp av bildeanalyse prosedyrer beskrevet i trinn 5 i protokollen. Spesielt, oksiderende behandling forårsaket en betydelig økning i stress fiber formasjon på alle vedheft tid poeng undersøkt (figur 4a) og en nedgang i celle sprer seg etter 15 minutter av celle VEDHEFT til FN (figur 4b).

Ikke-målbare immunofluorescence bilder på grunn av mobilnettet over confluency

Serum-sultet REF52 celler ble holdt i suspensjon i 90 minutter, i løpet av hvilken tid de ble behandlet med 10 μM Ku55933 å indusere ROS formasjon. Celler ble deretter belagt på FN og lov til å holde seg i 20 minutter, hvoretter de var faste og beiset med anti-paxillin eller phalloidin-Alexa 594 F-utgangen sonde. Plating ved høyere celle tetthet fører til cellulær trengsel, som forbyr celler fra full spredning på grunn av over confluency. Legg merke til at celle kanter ikke kan skilles fra tilstøtende celler (gule piler) (figur 5a). Som et resultat, er kvantifisering av individuelle celler utelukket, og spredning av omkretsen kan ikke fastslås nøyaktig. I figur 5B, ble en egen cellelinje, mus embryonale fibroblaster (MEF), holdt i suspensjon og deretter belagt på FN i 30 minutter. Celler ble deretter fikset og farget med et anti-paxillin antistoff. Ut av fokus celler er merket med røde piler (figur 5B). Videre vil kryss-reaktivitet av anti-paxillin antistoff med celleavfall (blå pil) endre terskelverdi under kvantitativ bildeanalyse (del 5) og bør ikke inkluderes i analysen (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: Time-Line of Protocol og eksempel 24-brønn plate satt opp.
(A) tidslinjen fremhever viktige trinn i celle vedheft og spre prosedyren. (B) representant merket 24-plate, som illustrerer behandlingsgrupper og tider for celle vedheft. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempler på representative immunofluorescence bilder etter bildebehandling.
REF52 celler ble holdt i suspensjon for 90 min, belagt på FN, og lov til å holde seg i 15 min. celler ble fikset og farget med anti-paxillin antistoff. (A) Original bilde og bilder følgende (B) bakgrunn subtraksjon (post-Rolling ball), (C) CLAHE, (D) Gaussian Blur og (E) Mexican hat filter (post-MHF) filtrerings trinn. Bar, 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative immunofluorescence bilder av anti-paxillin og phalloidin F-utgangen probe beiset REF52 celler belagt på FN.
Før analysen, REF52 celler var serum sultet for 1 t. Etter serum sult, ble celler holdt i suspensjon mens behandlet med enten kjøretøy alene eller 10 μM Ku55933 å forårsake oksidativt stress. Celler ble belagt på FN-belagt coverslips for de angitte tider, fast og farget med et antistoff til fokal adhesjon og phalloidin å oppdage F-utgangen proteiner. F-utgangen beriket ruffles i forkant av cellemembraner er indikert med en pil. Bar, 40 μm. Dette tallet er endret fra Tolbert et al.5Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: kvantifisering av immunofluorescence bilder.
Grafer som illustrerer (A) prosentandelen av celler som viser stress fibre og (B) celle sirkularitet målinger. Celle sirkularitet ble definert som celleområde delt på celle omkretsen. Verdier varierte fra 0-1,0 indikerer en langstrakt eller avrundet morfologi, henholdsvis. Feilfelt indikerer S.E.M. student t-test for sammenkoblede prøver * p < 0,01 fra eksperimenter utført i tre eksemplarer. Dette tallet er endret fra Tolbert et al.5Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: ikke-målbare immunofluorescence bilder.
(A) serum-sultet REF52 celler ble holdt i suspensjon for 90 min, mens behandlet med 10 μM Ku55933. Cellene var belagt på FN og lov til å holde seg i 20 min. celler ble fikset og farget med anti-paxillin eller phalloidin-Alexa 594 F-utgangen sonde. Celle kanter vises med gule piler. (B) MEF celler ble holdt i suspensjon og deretter BELAGT på FN i 30 min. celler ble fikset og farget med anti-paxillin antistoff. Ut av fokus celler er merket med røde piler og kryss-reaktivitet av anti-paxillin antistoff med cellulære rusk er merket med blå piler. Bar, 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen er beskrevet her er en allsidig og økonomisk måte å raskt skjermen en rekke forankring-avhengige celletyper for dynamisk cytoskeleton remodeling under celle spredning. Spesielt undersøker denne metoden kvantitativt stress fiber og fokal vedheft dannelse under oksidativt stress når cellene holder seg til FN (figur 1a). Videre kan disse cellulære fenotyper foreslå en regulerende rolle for medlemmer av Rho-familien av små GTPases siden de har dokumentert roller under celle vedlegget og sprer15,16,22. Ytterligere biokjemiske teknikker ville imidlertid være nødvendig for å identifisere den mulige involvering av GTP-bundne, aktive Rho-familiens proteiner.

Den presenterte protokollen utnytter immunofluorescence deteksjon av F-utgangen og paxillin til spesielt undersøke celle vedheft og spredning av udødeliggjort Fibroblast celler på FN etter oksidativt stress indusert av ATM kinase hemming (figur 2, Figur 3 og Figur 4). Denne fremgangsmåten kan imidlertid også tilpasses for bruk på andre ECM-proteiner og/eller for andre tilhenger celletyper. Når du tilpasser til andre cellelinjer, er det viktig å optimalisere de eksperimentelle forholdene, spesielt: celle nummer/tetthet, tid for serum sult, ECM proteinkonsentrasjon og oksidativt stress behandlings forhold. Når du tester virkningene av en ukjent stimulans på vedheft og spre dynamikk, er det nødvendig å inkludere både negative og positive kontroll prøver for å kontrollere at analysen fungerer som den skal. Negative kontroll prøver kan omfatte en ubehandlet eller bare kjøretøy prøve, mens en positiv kontroll bør indusere oksidativt stress (f.eks. H2O2). Videre, selv om det ikke diskuteres her, er det også viktig å bruke riktig antistoff kontroller. Det anbefales at tre separate kontroller brukes for hvert antistoff å verifisere spesifisitet og å identifisere eventuelle potensielle fluorescens blø-gjennom23,24. Disse inkluderer: 1) en primær antistoff kontroll for å sikre spesifikk binding av primær antistoff til antigen og for å bekrefte at antigen-binding oppstår under fikserings forholdene som brukes, 2) en sekundær antistoff kontroll (for ikke-sekundære bøyd-antistoffer ) som viser spesifisitet til den primære antistoff, og 3) fluoroforen kontroller som sikrer fluoroforen lagt er ikke et resultat av endogene fluorescens eller blø fra et annet antistoff.

Mens denne analysen er nyttig for å analysere tidlig kinetisk hendelser av vedheft montering og spredning, er det ikke egnet for detaljert undersøkelse av vedheft demontering eller vedheft styrke og cellulær forsterkning. Sistnevnte krever bruk av langsiktige Imaging bio-stasjoner eller single-Cell Force spektroskopi teknikker. Sistnevnte teknikker inkluderer Atomic-Force mikroskopi, optiske pinsett, spenning sensorer av vedheft proteiner som vinculin25 eller Talin26,27, og 3D-Force mikroskopi28.

Kritiske trinn i protokollen inkluderer grundig belegg coverslips med FN. Dette er nødvendig for jevn spredning og vedheft av celler. Det er derfor viktig å Pipetter FN-løsningen opp og ned over coverslips flere ganger før inkubasjons. Coverslips må være fullstendig neddykket i FN-løsningen i løpet av inkubasjonstiden. FN-belagt coverslips kan oppbevares i opptil 2 uker ved 4 ° c.

Celle tetthet er også viktig, som celler som er belagt for tett vil ikke oppnå maksimal spredning omkrets. Videre ville det ikke være mulig å skille individuelle fokal adhesjon eller cellulære ruffles for hver enkelt celle. Det er derfor nødvendig å telle cellene ved hjelp av en hemocytometer eller automatiserte celle telleren før du plasserer cellene i suspensjon. Mens et estimat av celle tetthet er gitt for REF52 celler, vil dette må empirisk bestemmes for andre celler under studien. Celler bør være belagt tynt nok til at noen celler overlapper hverandre, slik at de kan spre seg fullt ut (figur 5).

Andre kritiske skritt i protokollen for å vurdere er fluorescensmerkete bøyd phalloidin-Alexa 594 F-utgangen sonde og sekundære antistoffer er lysfølsomme. Derfor bør prøvene være minimalt eksponert for lys etter anvendelsen av disse reagensene. Videre har en rekke agenter som induserer oksidativt stress kort halv-liv. Det er derfor nødvendig å teste valgt oksiderende for optimal dose og eksponeringstid for å oppnå topp aktivitet.

Følgende deler inneholder problemer med å skyte tips med hensyn til FN konsentrasjon, serum sult forhold, og celle avløsning metoder. Disse tipsene er nyttige når du skal tilpasse protokollen for andre cellelinjer og/eller behandlings forhold.

For konsekvent FA-analyse er det nødvendig med optimale feste-og spre betingelser, som vil variere avhengig av ECM-ligand. For FN, begynn å bruke et dynamisk område på 10-30 μg/mL. Ved høyere konsentrasjoner av FN, er det liten forskjell i celle vedlegg. Noen celletyper spres imidlertid ikke effektivt ved høyere konsentrasjoner av ECM.

Hver celle type reagerer forskjellig på forholdene i serum sult. REF52 celler kan lett bli sultet over natten uten tap av levedyktighet, men dette er ikke sant for alle cellelinjer. Derfor er det nødvendig å bestemme i hvilken grad cellelinjen under studien tåler serum sult.

For å spre analysene må cellene være trypsinized for så lite tid som mulig for reproduserbar resultater29. Følgende celle avløsning av trypsinization, Cell Surface reseptorer, deres beslektet ligander og Rho GTPase aktivitet krever en utvinning periode for å gå tilbake til steady-state nivå14,15. Trypsinization prosedyren som er beskrevet i denne protokollen, bør gjøre det mulig for celler å beholde de fleste av sine celle overflater FN-bindende reseptorer29. Men visse celletyper kan kreve alternative metoder for celle avløsning for å fullstendig forhindre fordøyelsen av celle overflate reseptorer. Disse metodene omfatter chelaterande celler ved hjelp av EDTA-baserte løsninger (f. eks versene) eller mildere enzymatisk dissosiasjon løsninger (f. eks, Accutase). Bruk av disse dissosiasjon løsningene kan etterlate celle celle adhesjon intakt, noe som resulterer i celle klumper. Det er derfor viktig å resuspend helt enkeltceller for å sikre eksperimentell reproduserbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker DRS. Scott R. Hutton og Meghan S. Blackledge for den kritiske gjennomgangen av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av high point University ' s Research and sponsede programmer (MCS) og bioteknologi program ved North Carolina State University (MCS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life Technologies 25300-054 cell dissociation
10 cm2 dishes Cell Treat 229620 sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile
1X Phosphate Buffered Saline Corning Cellgro 21-031-CV PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates Fisher Scientific 07-200-740 sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) BD Transduction Laboratories 610620 marker of focal adhesions
Aspirator Argos EV310
Biosafety cabinet Nuair NU-477-400 Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder Fisher Scientific BP9704-100 dlBSA
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100 organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose Fisher Scientific 11965092 REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum Fisher Scientific 16000044 certified, cell culture medium supplement
Fiji National Institutes of Health http://fiji.sc/ image analysis program
Filter syringe Fisher Scientific 6900-2502 0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5) Fisher Scientific 12-545-81 autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum Gibco by Life Technologies 16210-064 component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 for cell counting
Human Plasma Fibronectin Gibco by Life Technologies 33016-015 FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope Olympus microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933 Sigma-Aldrich SML1109-25MG ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera Optimos
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) Invitrogen A12381 marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36941 cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control Corning Incorporated PC-420D
Syringe BD Biosciences 309653 60 mL syringe
Tissue culture incubator Nuair
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution Fisher Scientific 15-250-061 for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x) Gibco by Life Technologies R-002-100 TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator Fisher Scientific 11-676-341
water bath Fisher Scientific FSGPD02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2, (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508, (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11, (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14, (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51, (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20, (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472, (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115, (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10, (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12, (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28, (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6, (7), e22025 (2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9, (9), e107393 (2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121, (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69, (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59, (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214, (2), 231 (2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213, (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5, (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28, (27), 3928-3935 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics