ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

השילוב של תיוג נוגדנים, ניקוי אופטי, ומיקרוסקופ אור מתקדם מאפשר ניתוח תלת מימדי של מבנים או איברים מושלמים. המתואר כאן היא שיטה פשוטה לשלב אימונויניום של פרוסות כליות עבות, ניקוי אופטי עם cinnamate אתיל, והדמיה מיקוד המאפשר הדמיה וכימות של מבנים תלת ממדיים כליה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue. J. Vis. Exp. (149), e60002, doi:10.3791/60002 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שיטות ניקוי אופטי להפוך את רקמת שקוף על ידי הפחתת מדד השבירה לאורך מדגם עבור הדמיה תלת מימדי בעקבות (3-D). הם זכו לתשומת לב רבה בכל תחומי המחקר של הפוטנציאל לנתח מבנים מיקרוסקופיים מרחבי האזור המתפרסים על פני מרחקים מאקרוסקופיים. בהינתן כי tubules כליה, ואצלב, עצבים, ופקולי להאריך בכיוונים רבים, אשר נתפסו רק חלקית על ידי טכניקות דו ממדיות מסורתיות עד כה, ניקוי רקמות גם פתח אזורים חדשים רבים של מחקר כליות. רשימת שיטות הסליקה האופטיות גדלה במהירות, אך היא נותרת קשה למתחילים בשדה זה כדי לבחור את השיטה הטובה ביותר לשאלת מחקר נתונה. בתנאי כאן היא שיטה פשוטה המשלבת התיוג נוגדנים של פרוסות כליה עבה העכבר; ניקוי אופטי עם זול, לא רעיל ומוכן לשימוש כימי אתיל cinnamate; והדמיה ממוחשבת. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפעיל את הכליות ולהשתמש בצעד לאחזור אנטיגן כדי להגדיל את הנוגדן מבלי לדרוש ציוד מיוחד. היישום שלה מוצג הדמיה של מבנים שונים מגוונים בתוך הכליה, וכיצד לפתור חדירה של נוגדנים עניים לתוך רקמות ממוען. אנחנו גם לדון בקשיים פוטנציאליים של הדמיה מיאלואידית fluorophores ורכישת דגימות גדולות מאוד ואיך להתגבר עליהם. פרוטוקול זה פשוט מספק כלי קל להתקנה ומקיף כדי ללמוד רקמות בשלושה מימדים.

Introduction

העניין הגובר בלימוד איברים שלמים או מבנים מרחבי היקף גדולים הובילו לפיתוח שיטות סליקה אופטיות המערבות הדמיה של רקמה שקופה בשלושה מימדים. עד לאחרונה, השיטות הטובות ביותר להערכת מספר התא, אורך, או כמות של מבנים שלמים היו סטריאולוגיה או שיקוף סדרתי ממצה, אשר מבוססת על דיגום מערכתי של רקמות לניתוח הבאים בשני ממדים1, מיכל השני , 3. עם זאת, שיטות אלה צורכת זמן רב וזקוקים לרמה גבוהה של אימון ומומחיות4. שיטות ניקוי אופטי להתגבר על בעיות אלה על ידי הפחתת מדד השבירה לאורך מדגם כדי להפוך את רקמת שקוף להדמיה תלת-ממדית5,6,7.

מספר שיטות ניקוי אופטי פותחו אשר ליפול שתי קטגוריות עיקריות: הממס מבוססי שיטות מבוססות מימית. שיטות מבוססות מים ניתן לחלק עוד לטבילה פשוטה8,9, היפרחות10,11, ו הידרוג'ל הטבעה12,13. שיטות מבוססות ממס מייבשים את הרקמה, מסירים שומנים ומנרמל את מדד השבירה לערך סביב 1.55. מגבלות של רוב השיטות המבוססות על הממס הם המקוטטים של קרינה אנדוגניים של חלבונים העיתונאי הנפוץ בשימוש כגון GFP, רעילות ממס, יכולת לפזר דבקים המשמשים כמה חדרי הדמיה או עדשות אובייקטיבי, ואת הצטמקות של רקמות במהלך , התייבשות14,15,16.17,18,19,20,21 עם זאת, שיטות מבוססות-ממס הן פשוטות, יעילות בזמן, ויכולות לעבוד במספר סוגי רקמות שונים.

שיטות מבוססות מים להסתמך על טבילה של הרקמה בפתרונות מימית כי יש מדדי השבירה בטווח של 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . שיטות אלה פותחו כדי לשמר את החלבון אנדוגני של כתבת פלורסנט ולמנוע הצטמקות המושרה, אבל מגבלות של רוב מימית מבוססי שיטות סליקה כוללים משך זמן ארוך יותר של הפרוטוקול, הרחבת רקמות, ו שינוי חלבון (כלומר דנטורציה חלקית של חלבונים על ידי אוריאה בפרוטוקולים היפרליחות כגון סקהלהA2)7,11,23,25. הרחבת הרקמה מפנה שתנן עם sorbitol, אשר מאזנת נגד ידי התייבשות הרחבת רקמות אוריאה-המושרה, ושימר את מבנה בדיקת הרקמה כפי שמוערך על ידי אלקטרון מיקרוסקופ10. הצטמקות רקמות או התרחבות משפיעים על הגדלים המוחלט של מבנים, מרחקים בין אובייקטים או צפיפות תא לכל אמצעי אחסון; כך, מדידת גודל שינויים על ניקוי של הרקמה עשויה לעזור לפרש את התוצאות המתקבלות7,26.

באופן כללי, פרוטוקול לניקוי אופטי מורכב ממספר שלבים, כולל טיפול מקדים, חדירות, אימונואולבלינג (במידת הצורך), התאמת מדד השבירה והדמיה עם מיקרוסקופ אור מתקדם (למשל, שני פוטון, מוקד, או מיקרוסקופ אור-זריחה מגיליון קל). רוב הגישות המסלקות פותחו כדי להמחיש את הרקמה העצבית, ומחקרים מתפתחים מאומתים את יישומם באיברים אחרים5. זה כלי מקיף כבר הפגינו בעבר כדי לאפשר ניתוח אמין ויעיל של מבנים כליות, כולל פקיולי27,28, החיסונית מחלחל28, ואסיקובלטורה28, ומגזרים כדורית 29, וזה גישה אידיאלית להבנה טובה יותר של תפקוד הפקפיות ושיפוץ כדורית בריאות ומחלות.

מסוכם כאן היא שיטה מבוססת ממס המשלבת כתמים חיסוני של tubules כליה; ניקוי אופטי עם זול, לא רעיל, ומוכן לשימוש כימי אתיל cinnamate (אי סי אי); והדמיה מיקרוסקופית הקונטוקלית המאפשרת הדמיה וכימות מלאה. שיטה זו היא פשוטה, משלבת אנטיגן-איחזור של פרוסות כליות עם כתמים של נוגדנים מסחריים, ואינו דורש ציוד מיוחד, מה שהופך אותו לנגיש לרוב המעבדות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אורגון בריאות ומדע אוניברסיטת, פורטלנד, אורגון, ארה ב, ורשויות מקומיות רלוונטיות באאכן, גרמניה.

1. הבטן רטרוזיזיה של אבי העורקים ואת קיבעון של כליות העכבר

  1. הכינו פתרונות באותו יום או ערב לפני והחנות במקרר למשך הלילה. פתרונות חמים לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
  2. הפוך את האצווה הטרייה של 3% פאראפורמלדהיד (PBS) בתמיסת מלח 1 x פוספט באגירה. כ 50-100 מ ל בכיוון הנכון של העכבר נדרש לכל העכברים.
    1. כדי להפוך 1 L של 3% בתחתית: שוקל 30 גרם של המשחק החצי הראשון ולהוסיף 800 mL של מים מזוקקים במנוע. מערבבים ומחממים עד 50-60 ° c. אין לחמם מעל 70 ° c.
      התראה: הכיוון הכדורגלן רעיל. . הכן את הכדורגלן בתוך המנוע
    2. הוסף באיטיות מספר טיפות של 2N NaOH. המתן כמה דקות עד שה "נכנס לפיתרון או יוסיף עוד כמה טיפות. כמה גושים קטנים לא להמיס.
    3. הסר את הפתרון מהחום. הוסף 50 mL של 20x PBS. להירגע על הקרח כדי RT.
    4. התאם את ה-pH ל-7.3-7.4 עם HCl. הוסיפו מים מזוקקים ל-1 ל.
    5. הסר את כל החלקיקים שאינם מומס על ידי סינון 1x PBS ו 3% בכיוון הערוץ עם פילטר יקרומטר 0.22.
  3. הוסיפו 1,000 יחידות של הפארין ל-1 ליטר של 1x PBS. העברת 1x PBS המכיל הפארין ו 3% בכיוון ההפוך ב-1x PBS לתוך הנפרד 50 mL מזרקים פלסטיים.
    הערה: אם הוא זמין, משאבת לחץ המופעל על 80-100 mmhg או לחץ הידרוסטטי (שיטת הטפטוף, הגובה של פתרונות זלוף: 160-200 ס"מ על בעל חיים) ניתן להשתמש עבור זלוף כליה.
  4. חבר את ה-PBS, המשחק החצי השלישי והמחט פרפר בצורת שלושה כיוון. ודא שאין בועות אוויר במערכת כולה.
  5. התווית צינורית של 15 מ ל ומחלק 10 מ ל לתוך זה.
  6. מורדם עמוקות זכר או נקבה C57BL/6 עכבר 12-24 שבועות של גיל באמצעות 120 מ"ג/ק"ג משקל הגוף קטמין 16 מ"ג/ק"ג משקל הגוף xylazine. יש לבדוק את בעל החיים על העדר היענות מלאה על-ידי צבירות הרפלקסים לפני שממשיכים לניתוח (למשל, רפלקס הבוהן).
  7. ברגע שהחיה הגיעה למישור כירורגי של הרדמה, הניחו אותו על גבו מתחת למיקרוסקופ הבתר. בניתוח לפתוח את הבטן עם חתך בטן באמצע באמצעות מספריים הפעלה לחשוף את אבי העורקים הבטן.
  8. הצמד את אבי העורקים הבטני מעל ההסתעפות לעורק הראשי באמצעות דימום מעוקל. לאחר מכן הצמד את אבי העורקים הבטני ממש מתחת לעורקים הכליות עם מיקרו שיפור. לעשות חתך קטן (1 מ"מ) על אבי העורקים הבטן בין שני מלחציים עם vannas מספריים. הכנס את המחט פרפר לתוך החתך לאט ולהיזהר לא לקרוע את אבי העורקים הבטן פתוח.
  9. ליגייט עורק הכליה הימני עם תפר משי 5-0 ולהסיר את הכליה הנכונה לניתוח אחר אם רק אחת כליה נדרשת עבור זלוף ו קיבעון.
  10. הסר את מיקרו העידון, החלפת וריד השער עם מספריים vannas, ומיד מיד עם 50 mL של PBS המכיל הפארין, ולאחר מכן לעבור ומבשם עם 50 mL של 3% בתחתית.
    הערה: לחץ היתוך גבוה דרך אבי העורקים הבטן נדרש כדי לפתוח tubules כליות עבור דיפוזיה נוגדן טוב יותר דרך הרקמה. הפרזיה דרך הלב לא יכולה לפתוח את הכליות.
  11. לאסוף את הכליה בזהירות ולהימנע מפני לסחוט את הרקמה.
  12. להסיר את הקפסולה ולחתוך את הכליה לתוך 1 מ"מ פרוסות ילתית עבה. השתמש במטריצה מבצעה (טבלת חומרים) כדי לתקנן את עובי הפרוסה.
    הערה: לחילופין, שקול להשתמש בשיטת רטט.
  13. הישאב את פרוסות הכליות לתחתית מוכנה באמצעות שפופרת חרוט בעלת תווית של 15 מ"ל.
  14. מחלק 10 מ ל של הרכבת התחתית לכיוון אחר המסומן ב-15 מ"ל. ריקון התרנגול שלוש כיוון ומחט פרפר עם PBS לפני המעבר לעכבר הבא.
  15. ביצוע הפוסט-קיבוע בלילה בשעה RT מוגן מפני אור.

2. הכנת רקמה ומכתים

  1. לאחר קיבעון, לשטוף את פרוסת הכליה פעמיים עם מאגר לשטוף 1 x (טבלת חומרים) עבור 1 h על הנדנדה אופקי ב RT.
  2. בצע אחזור אנטיגן. לחמם את 300 mL של הפתרון הבלתי מיסוך של 1x אנטיגן (Tמסוגל של חומרים) ב-500 ml בגביע ל 92-98 ° c. הקף את הפרוסה בהטבעת חדירות הקלטות למאגר המחומם באמצעות ערבוב של 1 h ב-92-98 ° c. להסיר את הגביע מהחום ולהשאיר אותו קריר כדי RT.
    הערה: חלק מהספקים בודקים את הנוגדנים שלהם עבור יישום אימונוהיסטוכימיה ויכלול שיטת אחזור אנטיגן המוצע בגליון הנתונים. לכן, מספר אפיסקופים עשויים לדרוש מאגר בסיסי יותר (לדוגמה, pH 9).
  3. העבר את הפרוסה לתוך 10 מ ל של מאגר שטיפת 1 X עם 0.1% טריטון X-100 ורוק לילה ב RT. שטוף את הפרוסות 2x עם 10 מ ל של מאגר שטיפת חדש 1x עבור 1 h למחרת.
  4. לדלל את הנוגדן העיקרי ב 500 μL של נוגדן נורמלי מדלל (טבלת חומרים). . התחילו בריכוז של 1:50-1:100 בעדינות לנדנד את פרוסת הכליה בנוגדן ראשוני מדולל עבור 4 ד ב 37 ° c.
    הערה: מאז כל נוגדן יש תכונות ייחודיות, טמפרטורה במהלך דגירה הנוגדן ו דילול של נוגדן צריך להיות ממוטב עבור בדיקה בודדים. עבור נוגדנים משני בלבד שולטת, מודטת רקמת כליה בדילול ללא נוגדן ראשוני. במקום נוגדן מסחרי דילול, 1x PBS עם 0.1% טריטון X-100 ו 0.01% נתרן אזיד ניתן להשתמש.
  5. לשטוף את הפרוסה כליה ב 10 מ ל של 1x מאגר לשטוף לילה ב RT עם שינוי אחד של מאגר לשטוף אחרי 8 h.
  6. דלל את הנוגדנים המשניים (למשל, 1:100 עבור אלקסה Fluor מצומדת נוגדנים משני) ב 500 μL של נוגדן רגיל מדלל. מודלת את פרוסות הכליה בנוגדן משני מדולל במשך 4 ימים ב 37 ° c. משלב זה והלאה, הגנו על פרוסות הכליות מהאור.
  7. לשטוף את פרוסות כליה ב 10 מ ל של 1x מאגר לשטוף לילה ב RT עם שינוי אחד של מאגר לשטוף אחרי 8 h.

3. ניקוי רקמות

  1. העבר פרוסה כליה ל 5 מ ל של כיתה גבוהה 100% אתנול (טבלת חומרים) עבור 2 h ב RT עם נדנדה עדין (עם שינוי אחד לאתנול טרי אחרי 1 h). . השלב הזה הוא להתייבשות ברקמות
    הערה: אתנול בדרגה גבוהה נדרש כדי להשיג ברקמות גבוהות הרי בשלב הבא. מתנול או טטרהידרופורזה הם התייבשות אלטרנטיבית ריאגנטים עם פוטנציאל מדליפיזציה גבוהה.
  2. לטבול את פרוסת הכליה ב 2 מ ל של אי סי איי (טבלה של חומרים) עם נדנדה עדין ב RT (עם שינוי אחד טרי אי סי לאחר 2 h) לילה.
    הערה: נקודת ההקפאה/ההיתוך של אי סי איי היא 6-8 ° c. לכן, אין לאחסן דגימות במקרר. התנהלות הטבילה בתוך מאוורר כראוי המאוורר ולהימנע מגע ישיר עם בגדים ועור (אי סי איי הוא מזון לא רעיל מינהל התרופות מאושר מתחם אבל יש ריח חזק). השתמש בצינורות או בכלי זכוכית רגילים (ללא כלי פוליסטירן).
  3. ניתן להשיג את הרקמה הטרנסלוסנסי לאחר הטבילה וכאשר פרוסות הכליות מוכנות לדימות.

4. ניתוח תמונה

הערה: עבור הדמיה, טכניקות מיקרוסקופ אחרות ניתן להשתמש כל עוד מדד השבירה התאמת פתרון תואם את העדשה האובייקטיבית. הפרוטוקול הזה משתמש. במיקרוסקופ מיקוד הפוך

  1. הוסף 600-1000 μL של אי-סי-איי לתוך המנה התחתונה בזכוכית (טבלת חומרים).
    הערה: הימנע משימוש במאכלים רגילים של תרבות התא, משום שאיי סי אי הוא מממס אורגני שימוסס את מנות הפלסטיק. באופן דומה, איי. סי. אי עלולים לתקוף חלקי פלסטיק/בידוד טבעות על עדשות אובייקטיבי. עיין בדוחות המתאימים לקבלת סקירה של מנות הדמיה תואמות30 ותאי מודפס תלת-ממדיים בעלי הדפסה עצמית28.
  2. העבר את פרוסת הכליה השקופים לתוך המנה. הניחו שמיכות עגולות על פרוסת הכליה כדי להחיל לחץ קל כלפי תחתית הזכוכית. חותם את הצלחת עם סרט פרפין (לוח חומרים) כדי למנוע דליפה של אי סי אי.
    הערה: איברים שלמים או מספר פרוסות רקמה בעובי מילימטר עשויים לדרוש גבול (מלט שיניים או אלסטומר סיליקון; ראה לוח חומרים) סביב הרקמה כדי להפוך את הבריכה אי-סי עבור המדגם.
  3. מניחים את הצלחת על פלטפורמת הדמיה מיקרוסקופ.
  4. לקחת כמה z-ערימות ולבצע תפרים. התחל בגודל z-step של 5 μm.
    הערה: שקול להשתמש במרחק עבודה ארוך (> 5 מ"מ) ו צמצם מספרי גבוה (> 0.9) מטרות עבור הדמיה של פרוסות רקמה עבה מאוד או איברים. לאחר הדמיה, להעביר את הרקמה חזרה אתנול ולאחסן מאגר לשטוף או PBS עם 0.02% נתרן azide.
  5. לנתח את התמונה באמצעות עיבוד תלת-ממדי עם תוכנה (רשימת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכליות הן איברים מורכבים המורכב של 43 סוגים שונים של תאים31. רוב התאים הללו יוצרים מבנים גדולים בעלי מבנה משני, כגון גלואראולי וטובוקלס, ותפקידם תלוי מאוד באינטראקציות עם הזולת. טכניקות היסטולוגית קלאסיות לכידה חלקית של מבנים גדולים אלה עשויים להחמיץ שינויים מוקד בתוך מבנים שלמים31. כך, ניתוח תלת-ממדי באמצעות טכניקות ניקוי אופטי מסייע להבין כיצד הם פועלים בבריאות ובמחלות.

רוב שיטות הסליקה האופטיות המבוססות על הממס לפחות יאריכו באופן חלקי את אות החלבון האנסוגני. קוצ'ינג של YFP-tagged Parvalbumin נצפתה על התייבשות וניקוי אופטי עם אי סי איי (איור 1). עם זאת, חלבונים פלורסנט חזקים אחרים עלולים להתנגד האות-קונצ'ינג, והתאמה של pH לרמות בסיסיות (ph 8-11) יכול לייצב חלבונים פלורסנט אנדודוגני14,20,28,30. בנוסף, שיטות מבוססות מים צריך להיחשב אם השתמרות פליטת חלבון פלורסנט היא הרצויה. בדוח זה הנוכחי, הוא הוכיח כי זה הממס מבוסס הפרוטוקול סליקה תואם תיוג נוגדנים; למרות, הוא נשאר מאתגר להשיג אימונויניום העמוק של רקמות, במיוחד באיבר צפוף-תא עשיר כמו הכליה.

פרזיה אבי העורקים הבטני של הכליות התבצע לאחר מכן כדי להסיר בתאי דם ולפתוח tubules (איור 2א, ב). גישה זו מפחיתה את הקרינה האוטומטית ולשפר את הדיפוזיה נוגדנים. ריכוז הנוגדן תלוי בגודל של רקמות ושפע של האנטיגן. לכן, האות השטחית יכולה להתייחס לחדירה של נוגדנים עניים או כמות מספקת של נוגדן (איור 3A, B, ראה גם סרט 1). עבור דגימות גדולות או סמנים שופע מאוד, ריכוזים גבוהים יותר של נוגדן ואת חידוש המידע של נוגדנים לאחר 1-2 ימים עשויים להידרש. אם האנטיגן של עניין מתבטא בתוך הכליות כליות, משלוח intravascular של הנוגדן צריך להיחשב (איור 3C). עם זאת, נוגדנים מיקוד חלבונים בקרום פסגה של התאים האפיתל כדורית לא לחצות את המכשול סינון פקפורי בגלל גודל מולקולרי, ובכך גורם אותות לא ספציפיים כלי דם, פקולי (איור 3d).

פרוטוקול זה ניתן להחיל על פרוסות כליות או כליות שלמות (איור 4א, ב). כדי לבדוק נוגדנים-ספציפיות, רק הפקדים היו חשופים נוגדן משני (איור 4C). ניתן לתייג את הרקמה עם נוגדנים כדי לזהות אוכלוסיית תאים מסוימת (למשל, תאים מתרבים, איור 4D) או להמחיש מגזרים כדורית שלמים באמצעות נוגדנים ספציפיים לפלח (איור 4d). יתר על כן, השילוב של נוגדנים מרובים מספק את ההזדמנות להתאים חלבונים שונים בתלת-ממד (למשל, כדי לזהות את היפרפלזיה מחלקה ספציפית כדורית כפי שהוא מתרחש כדורית על גירויים שונים) (איור 4F, g; ראו גם סרט 2).

Figure 1
איור 1: קוצ'ינג של כתבת פלורסנט מאנסוגני. (א) חלבון כתבת פלורסנט אנדוגני שנגזר parvalbuminyfp +העכבר הטרנסגניים הוא לזיהוי ב 5 יקרומטר דק כליה בחצי מקטעים כליות קפואים. החיצים מציינים חלק parvalbumin המסומן על-ידי פלורסנט ממוקם בחלק המוקדם של כדורית המרוחק. (ב) אין אות פלורסנט ברור לאחר הניקוי האופטי של רקמת הכליה נצפתה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הערכת איכות מיזוג הכליה. (א) חומצה מחזורית שיף (PAS)-ויטראז ' מוטבע רקמה (5 יקרומטר סעיפים דקים) מראה מעטים tubules עם לומן פתוח מעט (בדרך כלל tubules האבובית אשר בעלי גבול מברשת; ראה חיצים). (ב) כל tubules נפתחים לאחר perfusion כליה טובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בעיות בפתרון שלמות של האימונווללינג. (א,ב) פרוסה כליה עבה היה מוכתם בנוגדן נגד נתרן-כלוריד coטרנספור2 (NKCC2), אשר מתבטא באיבר העולה העבה של הלולאה של Henle. האות מזיהוי על פני הרקמה (ב). עם זאת, הנוגדן לא חדרו לתוך הרקמה [ראה ראש חץ (ב)]. (ג) Intravascular הזרקת נוגדן מיקוד חלבונים המתבטאת בכלי (g., CD31) מאפשר כתמים כלי דם הומוגנית ומהירה. המבנים העגולים בעלי אות חזק הם פקאולי. (ד) לעומת זאת, נוגדנים המכוונים לחלבונים המובטאים בקרום האפיפיורי של כדורית (למשל, מנשא נתרן-כלוריד (פוספהו-ncc) אשר מתבטא בחוסר הסדר המפותל, לא יחצה את הפקתית מחסום סינון, ובכך גורם לאותות לא ספציפיים ב-יום לראות ראש חץ הצבעה על העורקי העורקים וכלים אחרים) ו פקולי (ראה חיצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התוצאות הייצוגיות של רקמת הכליה הייתה מנוקה מבחינה חיסונית. (א,ב) פרוטוקול זה מאפשר ניקוי אופטי של כל הכליה. (ג) נציג z-מחסנית כדי להראות העדר איגוד מסוים של נוגדן משני כשליטה ללא הדגירה הקודמת. (ד) הדמיה תלת-ממדית של מחסנית ייצוגית מראה ברומודיט (brdu)+ תאים בלשד הכליות. (ה) מדולרי איסוף תעלות הם דמיינו באמצעות נוגדן נגד אקופורטל-2 (AQP2). (F,G) ניתוח וקוונפיקציה של BrdU+ תאים בתוך AQP2+ מדולרי איסוף צינורות. עבור (F, G), ראה גם סרט 2. דמות זו השתנתה מסרטאס ואח '29. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט 1 (הקשור לאיור 3): הדמיה תלת-ממדית של NKCC2+איבר בסדר עולה של לולאה של henle. הסרט מדגים חדירה לנוגדן המסכן בפרוסת כליה שנוקתה בצורה אופטית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הווידאו.

סרט 2 (הקשורים לאיור 4): ויזואליזציה תלת-ממדית של brdu+תאים ו AQP2+מדולרי איסוף צינורות בפרוסת כליה בלתי מסומנת. BrdU+ תאים (באדום) ו AQP2+ מדולרי איסוף צינורות (בירוק) מוצגים. השימוש באלגוריתמים ספוט ובפני שטח שימשו לקביעת התאים BrdU+ בחוץ (כתמי טורקיז) או בתוך (כתמים ורודים) AQP2+tubules (ירוק משטחים). סרט זה הופיע במקור בסארטאס ואח '. 29. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הווידאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכניקות ניקוי אופטי זכו לתשומת לב רבה להדמיה תלת-ממדית ולקוונפיקציה של מיקרואנטומיה באיברים שונים. כאן, שיטת סליקה מבוססת ממס (אי סי אי) היתה משולבת עם אימונויניום עבור הדמיה תלת-ממדית של הפקעת שלמות בפרוסות כליה. שיטה זו פשוטה, זולה ומהירה. עם זאת, שאלות מחקר אחרות עשויות לענות באופן הטוב ביותר עם פרוטוקולי סליקה אחרים5. חשוב גם לזכור כי שיטות מבוססות ממס לגרום להתכווצות רקמות במעלות משתנה, בעיקר בשל התייבשות שלב14,18. רוב השיטות המבוססות על הממס (למשל, אי סי אי14) גם לפחות באופן חלקי מאוד לכיבוי כתבים כגון Gfp או tdtomato; לכן, FDISCO32, בהירות12, או מעוקב11 יכול לשמש כפרוטוקולים חלופיים. עם זאת, האפקט הקונצ'ינג של אי סי אי הוא משתנה תלוי במבנים בודדים של כל כתבת העכבר28. בנוסף, השימוש 1) נוגדן פלורסנט נגד gfp וכתבים אחרים או 2) שונה פרוטוקולים מבוססי הממס לשמר אותות זריחה אנדוגניים30,32 יכול להיות גם גישה חלופית בהקשר זה. ראוי לציין כי מספר קבוצות בדקו את התאימות של פרוטוקולים ממים מימית24,33,34 להמחיש RNA ב תלת-ממד, בעוד שיטות סליקה מבוססי ממס עדיין לא נבדקו. לפיכך, שיטות ניקוי מבוססות מים כגון הגרסה המתוקנת של בהירות33 צריך להיות מועדף כאשר ניתוח RNA נחשב.

תאים או מוצרי גן של עניין יכול להיות דמיינו באמצעות עכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלורסנט אנדודוגני, אבל הדור של קווי העכבר מהונדסים גנטית הוא זמן רב ויקר. לכן, תיוג נוגדנים הוא פרקטי יותר ומספק גמישות יותר, למרות האימונויניום של רקמות גדולות הוא מאתגר. בניגוד לפרוטוקול המקורי של איי סי אי14, הגישה שלנו משלבת שיטת אי-סי-איי שונה לניקוי אופטי ואימונואולבלינג, המשתמשת בצעד לאחזור אנטיגן. מחממים המושרה אנטיגן-אחזור יהיה מאוד חלבונים, אבל עוזר לשחזר את האובדן של אנטיגנוזה במהלך המחצית התחתית קיבעון35 ומשפר נוגדנים-מחייב.

קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, חשוב לבצע את הפרזיה הטובה של הכליה. המוגלובין המכיל כדוריות הדם האדומות מגביל את עומק ההדמיה7 ומורחבת tubules עם פתוח לומן לשפר את חדירת הנוגדן. הפתיחה של tubules גם מאפשר הבחנה טובה יותר של חלבונים המתבטאת קרום האפיתל האפיפיורי מן החלבון הביע אחרים הביעו חלבונים על הצד הקונאלצידי. עם זאת, tubules הרחיב באופן מלאכותי עלול להשפיע באופן שלילי מבנה כדורית ומסכה תגובה מסוימת פתופסולוגית של הכליה (למשל התרחבות של tubules פצועים האבוניים,) אבל לא של tubules בריאים36. שנית, הדגירה של נוגדנים ב 37 ° צ' במקום 4 ° צ' או RT משפר את חדירת הנוגדן27. עם זאת, לכל נוגדן יש תכונות ייחודיות; כך, טמפרטורה במהלך דגירה הנוגדן צריך להיות ממוטבת עבור בדיקה אינדיבידואלית. שלישית, השימוש של אלקסה Fluor-647 (הספקטרום האדום) נוגדנים משניים מסייעת להגדיל את היחס אות לרעש, במיוחד מאז הכליות פולט כמות גדולה של פלואורסצנטית אוטומטי בספקטרום כחול ירוק37.

רטרו-מסלולית הזרקה14 או זלוף של כליה38 עם fluorophore-נוגדנים מצוכשים נגד חלבונים המתבטאת בכלי דם היא דרך אלגנטית ומהירה כדי לתייג את הכליות כליות. עם זאת, חלבונים בקרום פסגה של tubules להישאר נגיש על ידי הזרקת intravascular מאז נוגדנים לא יכול לחצות את מכשול סינון פקפורי עם משקל מולקולרי שלה לגזור על סינון חלבונים בטווח של 60-65 kda. לכן, שימוש שברי נוגדנים קטנים ומהונדסים וריאציות כגון שברי Fab (~ 55 kDa), diabodies (~ 50 kDa), טנדם scFv (~ 28 kDa) או הגרעין-חומצה aptamers (~ 6-30 kDa) עם מאפייני זיהוי מולקולרי שנשמרו של נוגדנים עשוי לספק הזדמנות לגשת לקרום פסגה של tubules38,39. בנוסף, שילוב של שברי נוגדנים קטנים עם שדות חשמליים40 או לחץ13 או השימוש נתרן dodecyl סולפט (sds) מבוססי הפרוטוקולים ניקוי להסיר שומנים24,41,42 עשוי לאפשר חדירת נוגדן מהירה ויעילה של רקמות.

כמה קבוצות הפגינו כי זלוף עם מגיב ניקוי לא רק מפחית את זמן הפרוטוקול, אלא גם מגביר את שקיפות הרקמה19,24,43,44. לכן, הצינורית של אבי העורקים הבטני או עורק הכליה עם הפרזיה הבאה של הכליה עם הסרת החות והשבירה פתרונות התאמת המדד צריך להיחשב להשגת ניקוי רקמות טוב יותר ומהר יותר. עם זאת, לא הבאנו את הכליה כולה בניקוי ריאגנטים והשתמשנו בכליות פרוסות מכמה סיבות. ראשית, אנטיגנים שונים יכולים להיות מדמיינו על-ידי תיוג נוגדנים של פרוסות כליות מרובות מכליה אחת. שנית, פחות זמן ונוגדן נחוצים כדי לבצע החיסונית של פרוסת כליה בהשוואה לכליה שלמה. שלישית, הדמיה תלת-ממדית של דגימות גדולות יוצרת מערכות נתונים עד למספר טרה-ב, אשר יכולה להיות מאתגרת לניהול עבור רוב תחנות העבודה. לכן, נתונים מפרוסות רקמה או מערכות מידע של קבצים גדולים יותר נוחים יותר לביצוע פעולות מורכבות כגון מדידות ספירה או מרחק אוטומטיות.

בפרוטוקול זה, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לביצוע הדמיה ברזולוציה של תא בודד, הרלוונטית במיוחד ללימודי לוקליזציה. עם זאת, הדמיה קונפוקלית וקד דורש סריקת לייזר, מאז מהירות ההדמיה שלה מעשית רק עבור פיסות קטנות של רקמה נקיה. כדי לבצע ניתוח מורמטרי תלת-ממדי של מבנים רב-תאיים כגון מגזרים כדורית ארוכים או אפילו איברים שלמים, טכניקות מיקרוסקופ מהר יותר כגון מיקרוסקופ פלורסנט גיליון אור (LSFM) הכרחי. LSFM מאפשר הדמיה מהירה כאשר הרזולוציה התאית הגבוהה ביותר אינה חיונית. לדוגמה, האורכים של הטובולים המפותלים העריכו לאחרונה על ידי שילוב של האימונואולבלינג, ניקוי אופטי המבוסס על בהירות12, ו lsfm29. למרבה הצער, LSFM מסחרי הוא יקר ולא תמיד תואם לפרוטוקולים מבוססי הממס מבוסס. למעשה, בהירות נבחרה למחקר זה, מכיוון ש-LSFM המסוים שלנו עם יעד המותאם אישית לבהירות לא היה תואם לאיי-סי-אי29. עם זאת, קלינגברג ואח ' הפגינו כי איי סי איי מתאימים באופן עקרוני ל-LSFM14.

לסיכום, שיטת הניקוי האופטי פשוטה מבוססי-סי-אי, אשר ניתן להחיל על כל פרויקט מחקר באמצעות פרוסות רקמה קבועה החל מ-~ 100 יקרומטר עד כמה מילימטרים בעובי. זה גם מאפשר ניתוחים אפשריים כי דרש קודם לכן כמעט מאמצים ממצה להשלים, ומבטלת את ההנחות הנדרשות ואת מסקנות הקשורות ניתוח דו מימדי של מורפולוגיה. השילוב של מיקרוסקופ האור המלא, הניקוי האופטי והמיקרוסקופיה המתקדמת יסייע לקדם את הבנת התפקוד התאי בבריאות ובמחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

T. S. נתמך על ידי מענקים מן הקרן DFG המחקר הגרמני (332853055), אחר Krner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), ואת הפקולטה לרפואה של אאכן (RWTH התוכנית ריטרנר). V. ג. פ. נתמך על ידי מלגות מחקר מתוך הפרווה הלאומית של דויטשה גיישכטר, קרן אלכסנדר פון הומבולדט, והמועצה לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה. ד. ה. ה. נתמך על ידי פונפה לדקיו. ר. ק. נתמך על ידי מענקים של DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), המדינה של Norhinewestfalia (MIWF-NRW) ואת המרכז הבינתחומי למחקר קליני ב RWTH האוניברסיטה של אאכן (O3-11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Fisher Scientific 09-761-112
15 mL conical tube Fisher Scientific 339650
21 G butterfly needle Braun Venofix
3-way stopcock Fisher Scientific K420163-4503
3D analyis software Bitplane AG IMARIS
3D analyis software Cellprofiler free open-source software
5-0 silk suture Fine Science Tools 18020-50
50 mL plastic syringes Fisher Scientific 14-817-57
Anti-BrdU monoclonal antibody Roche 11296736001
Antibody diluent Dako S0809
CD31-647 BioLegend 102516
Citrate-based antigen retrieval solution Vector Laboratories H-3300
Curved hemostat Fisher Scientific 13-812-14
Dako Wash Buffer Agilent S3006
Dissecting microscope Motic DSK-500
Embedding cassettes Carl Roth E478.1
Ethanol Merck 100983
Ethyl cinnamate Sigma-Aldrich 112372
Flexible film/Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Goat anti-AQP2 Santa Cruz Biotechnology sc-9882
Guinea pig anti-NKCC2 N/A N/A DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HCl Carl Roth P074.1
Heparin Sagent Pharmaceuticals 401-02
Hemostat Agnthos 312-471-140
Horizontal rocker Labnet S2035-E
Imaging dish Ibidi 81218
Ketamine MWI Animal Health 501090
Micro serrefine Fine Science Tools 18052-03
NaOH Fisher Scientific S318-500
Operating scissors Merit 97-272
Paraformaldehyde Thermo Fischer Scientific O4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC PhosphoSolutions p1311-53
Silicone elastomer World Precision Instruments Kwik-Sil KWIK-SIL
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Tissue slicer Zivic Instruments HSRA001-1
Triton X-100 Acros Organics AC215682500
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-00
Vibratome Lancer Series 1000
Xylazine MWI Animal Health AnaSed Inj SA (Xylazine)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508, (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17, (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10, (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369, (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26, (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16, (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18, (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28, (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4, (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7, (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7, (3), e33916 (2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10, (5), e0124650 (2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28, (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70, (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5, (3), 035007 (2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25, (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95, (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, (1), eaau8355 (2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143, (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8, (8), e72039 (2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9, (1), 4596 (2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23, (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4, (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43, (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7, (1), 9895 (2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11, (5), e201700248 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics