Оптическая очистка и визуализация иммуномаркированных тканей почек

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Сочетание маркировки антител, оптической очистки и передовой световой микроскопии позволяет трехмерный анализ полных структур или органов. Описанный здесь простой метод для объединения иммуномаркировки толстых ломтиков почек, оптическая очистка с этиловый циннамат, и конфокальная визуализация, которая позволяет визуализации и количественной оценки трехмерных структур почек.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue. J. Vis. Exp. (149), e60002, doi:10.3791/60002 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Методы оптической очистки делают ткань прозрачной, уравновешись рефракционным индексом во всем образце для последующего трехмерного (3-D) изображения. Они получили большое внимание во всех областях исследований для потенциального анализа микроскопических многоклеточных структур, которые простираются на макроскопические расстояния. Учитывая, что почечные трубочки, сосуды, нервы и гломерули распространяются во многих направлениях, которые были лишь частично захвачены традиционными двумерными методами до сих пор, очистка тканей также открыла много новых областей исследований почек. Список методов оптической очистки быстро растет, но новичкам в этой области по-прежнему трудно выбрать наилучший метод для заданного исследовательского вопроса. При условии, здесь простой метод, который сочетает в себе антитела маркировки толстых ломтиков мыши почки; оптическая очистка с дешевым, нетоксичным и готовым к использованию химическим этилцином; и конфокальной визуализации. Этот протокол описывает, как пронзать почки и использовать антиген-поиск шаг для увеличения антитела-связывания, не требуя специализированного оборудования. Его применение представлено в визуализации различных многоклеточных структур в почках, и как устранить неполадки плохое проникновение антител в ткани рассматривается. Мы также обсуждаем потенциальные трудности визуализации эндогенных флюорофоров и приобретения очень больших образцов и как их преодолеть. Этот простой протокол обеспечивает простой в настройке и всеобъемлющий инструмент для изучения тканей в трех измерениях.

Introduction

Растущий интерес к изучению целых органов или крупных многоклеточных структур привел к разработке методов оптической очистки, которые включают визуализацию прозрачной ткани в трех измерениях. До недавнего времени лучшими методами оценки количества клеток, длины или объема целых структур были стереология или исчерпывающее последовательное секционирование, которое основано на системной выборке ткани для последующего анализа в двух измерениях1, 2 , 3. Однако эти методы отнимают много времении нуждаются в высоком уровне подготовки и опыта 4. Методы оптической очистки преодолевают эти проблемы, уравновешивает рефракционный индекспо всему образцу, чтобы сделать ткани полупрозрачными для 3-D изображения 5,6,7.

Разработано несколько методов оптической очистки, которые подпадают под две основные категории: методы на основе растворителя и aqueous. Методы на основе aqueous можно далееразделить на простое погружение 8,9,гипергидратацию10,11и гидрогель встраивание12,13. Методы на основе растворов обезвоживают ткани, удаляют липиды и нормализуют рефракционный индекс до значения около 1,55. Ограничения большинства методов на основе растворителя являются уторение эндогенной флуоресценции широко используемых белков репортера, таких как GFP, токсичность растворителя, способность растворять клеи, используемые в некоторых камерах изображения или объективных линзах, и усадка тканей во время обезвоживание14,15,16,17,18,19,20,21. Тем не менее, методы на основе растворителя просты, экономичны по времени и могут работать в различных типах тканей.

Aqueous-основанные методы полагаются на погружении ткани в aqueous разрешения которые имеют рефракционные indicesв ряде 1.38-1.52 8,11,12,22,23,24 . Эти методы были разработаны для сохранения эндогенных флуоресцентных белков ырепортера и предотвращения усадки, вызванной обезвоживанием, но ограничения большинства вспомогательных методов очистки включают более длительную продолжительность протокола, расширение тканей и белковая модификация (т.е. частичная денатурация белков мочевиной в протоколах гипергидратации, таких как ScaleA2) 7,11,23,25. ScaleS обратился к расширению тканей путем объединения мочевины с сорбитол, который уравновешивает путем обезвоживания мочевины индуцированной ткани расширения, и сохранил ткани ультраструктуры, как оценивается электронной микроскопии10. Усадка или расширение тканей влияет на абсолютные размеры структур, расстояния между объектами или плотность клеток на объем; Таким образом, измерение изменений размера при очисткеткани может помочь интерпретировать полученные результаты 7,26.

В целом, протокол оптической очистки состоит из нескольких этапов, включая предварительную обработку, permeabilization, иммуномаркировку (при необходимости), соответствие рефракционного индекса и визуализацию с продвинутой световой микроскопией (например, двухфотон, confocal, или светлистой флуоресценции микроскопии). Большинство подходов к очистке были разработаны для визуализации нейронной ткани, и новые исследования подтвердили их применение в других органах5. Этот комплексный инструмент был ранее продемонстрирован, чтобы обеспечить надежный и эффективный анализ структур почек, в том числе glomeruli27,28, иммунные инфильтраты28, сосуды28, и тулупер сегментов 29, и это идеальный подход к лучшему пониманию гломерулярной функции и переделки трубок в области здоровья и болезней.

Обобщен здесь метод на основе растворителя, который сочетает в себе иммуностогирование почечных труб; оптическая очистка с дешевым, нетоксичным и готовым к использованию химическим этилцином (ECi); и конфокальная микроскопическая визуализация, которая позволяет полную визуализацию и количественную оценку труб. Этот метод прост, сочетает в себе антиген-извлечение ломтиков почек с окрашиванием коммерческих антител, и не требует специализированного оборудования, что делает его доступным для большинства лабораторий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Орегонского университета здравоохранения и науки, Портленд, Орегон, США, и соответствующими местными органами власти в Ахене, Германия.

1. Ретроградная брюшная аортальная перфузия и фиксация почек мыши

  1. Подготовьте решения в тот же день или вечер перед и хранить в холодильнике на ночь. Теплые растворы для комнатной температуры (RT) перед использованием.
  2. Сделать свежую партию 3% параформальдегида (PFA) в 1x фосфат-буферный солен (PBS). Около 50-100 мл PFA необходимо на мышь.
    1. Чтобы сделать 1 l 3% PFA: Взвесить 30 г PFA и добавить 800 мл дистиллированной воды в дым капот. Перемешать и нагреть до 50-60 градусов по Цельсию. Не нагревайте выше 70 градусов по Цельсию.
      ВНИМАНИЕ: ПФА является токсичным. Подготовка PFA в дым капот.
    2. Медленно добавьте несколько капель 2N NaOH. Подождите несколько минут, пока PFA идет в решение или добавить еще несколько капель. Некоторые мелкие куски не растворяются.
    3. Снимите раствор с огня. Добавьте 50 мл 20x PBS. Холод на льду для RT.
    4. Отрегулируйте рН до 7.3-7.4 с HCl. Добавить дистиллированную воду до 1 л.
    5. Удалите любые нерастворенные частицы, фильтруя 1x PBS и 3% PFA с 0,22 мкм фильтра.
  3. Добавьте 1000 единиц гепарина в 1 l 1x PBS. Передача 1x PBS, содержащий гепарин и 3% PFA в 1x PBS в отдельные 50 мл пластиковых шприцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии насоса, управляемого давлением, установленного на уровне 80-100 мм рт. ст. или гидростатического давления (метод капельного пром., высота перфузийных растворов: 160-200 см над животным) можно использовать при перфузии почек.
  4. Подключите PBS, PFA и притупленный 21 G бабочка иглы на трехсторонний стоп-стоп. Убедитесь, что во всей системе нет пузырьков воздуха.
  5. Пометьте коническую трубку 15 мл и разделите в нее 10 мл PFA.
  6. Глубоко обезвищивает самца или самку c57BL/6 мыши 12-24 недель, используя 120 мг/кг кетамина для тела и 16 мг/кг ксилазина. Перед операцией необходимо проверить животное на полное отсутствие отзывчивости, защипыв аяк и рефлексы( например, ущипнуть.
  7. Как только животное достигло хирургической плоскости анестезии, поместите его на спину под рассекающимся микроскопом. Хирургически открыть брюшной полости с разрезом живота средней линии с помощью операционных ножниц и разоблачить брюшной аорты.
  8. Зажим брюшной аорты прямо над ветвящейся к подвздошной артерии с изогнутым гемостатом. Затем зажим брюшной аорты прямо под почечными артериями с микро серрефин. Сделайте небольшой разрез (1 мм) на брюшной аорте между двумя зажимами ножницами vannas. Вставьте иглу бабочки в разрез медленно и будьте осторожны, чтобы не рип брюшной аорты открытым.
  9. Свагите правую почечную артерию с 5-0 шелковым швом и удалите правую почку для другого анализа, если для перфузии и фиксации необходима только одна почка.
  10. Удалить микро серрефин, трансквировать вену портала с vannas ножницы, и сразу же пронзить с 50 мл PBS, содержащий гепарин, затем переключитьиск и пронзить с 50 мл 3% PFA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокое давление перфузии через брюшную аорту требуется, чтобы открыть почечные трубки для лучшего диффузии антител через ткани. Перфузия через сердце не может открыть почечные трубки.
  11. Соберите пронизанные почки тщательно и избежать прокола или сжатия ткани.
  12. Удалить капсулу и разрезать почки на 1 мм толщиной корональных ломтиков. Используйте матрицу слайсера(Таблицаматериалов) для стандартизации толщины срезов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, рассмотреть возможность использования вибратом.
  13. Погрузите ломтики почек с подготовленным PFA в коническую трубку с маркировкой 15 мл.
  14. Распределите 10 мл PFA к другой помечены 15 мл конической трубки. Промыть трехсторонний стопкок и бабочка иглы с PBS перед переходом к следующей мыши.
  15. Провести пост-фиксации на ночь на RT защищены от света.

2. Подготовка тканей и иммуностоирование

  1. После пост-фиксации, мыть ломтик почки дважды с 1x мыть буфера (Таблица материалов) на 1 ч на горизонтальной рокер на RT.
  2. Выполните поиск антигена. Нагрейте 300 мл 1x антигена разоблачения раствора (T в состоянииматериалов) в 500 мл стакан атакжем до 92-98 градусов по Цельсию. Приложить ломтик в встраивая кассету проницаемой для нагретого буфера с перемешиванием в течение 1 ч при 92-98 градусах По Цельсию. Снимите стакан с огня и оставьте его для охлаждения RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые поставщики проверяют свои антитела для применения иммуногистохимии и включают в таблицу данных предлагаемый метод поиска антигена. Таким образом, некоторые эпитопы могут потребовать более базового буфера (например, pH 9).
  3. Передача ломтик в 10 мл 1x мыть буфер с 0,1% Тритон X-100 и рок на ночь на RT. Вымойте ломтики 2x с 10 мл свежего 1x мыть буфер адля 1 ч на следующий день.
  4. Разбавить первичные антитела в 500 л нормального разбавитель антитела(Таблица материалов). Начните с концентрации 1:50-1:100. Аккуратно покачать ломтик почки в разбавленных первичных антител в течение 4 d при 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку каждое антитело обладает уникальными свойствами, температура при инкубации антител и разбавления холовства антитела должна быть оптимизирована для отдельных зондов. Для вторичного контроля только антитела, инкубировать ткани почек в разбавителе без первичных антител. Вместо коммерческих разбавителей антител, 1x PBS с 0,1% Тритон X-100 и 0,01% азида натрия может быть использован.
  5. Вымойте кусок почки в 10 мл 1x мыть буфер ананочь на RT с одной сменой мыть буфера после 8 ч.
  6. Разбавить вторичные антитела (например, 1:100 для Алекса Флюор-конъюгированных вторичных антител) в 500 л нормального разбавителя антител. Инкубировать кусочки почек в разбавленных вторичных антител в течение 4 дней при 37 градусах Цельсия. С этого шага и далее, защитить кусочки почек от света.
  7. Вымойте почки ломтиками в 10 мл 1x мыть буфер ананочь на RT с одной смены мытья буфера после 8 ч.

3. Очистка тканей

  1. Передача ломтика почки до 5 мл высококачественного 100% этанола(Таблицаматериалов) на 2 ч при RT с нежным раскачиванием (с одним изменением на свежий этанол после 1 ч). Этот шаг предназначен для обезвоживания тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокосортный этанол необходим для достижения высокой прозрачности тканей на следующем этапе. Метанол или тетрагидрофуран являются альтернативными реагентами обезвоживания с высоким потенциалом делипидации.
  2. Погрузите ломтик почки в 2 мл ECi(Таблица материалов) с нежным качания на RT (с одним изменением на свежий ECi после 2 ч) на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точка замерзания/плавления ECi составляет 6-8 градусов по Цельсию. Поэтому не храните образцы в холодильнике. Провести погружение в правильно вентилируемый дым капот и избежать прямого контакта с одеждой и кожей (ECi является нетоксичным пищевых продуктов и медикаментов утвержденных соединения, но имеет сильный запах). Используйте обычные трубки Eppendorf или стеклянные сосуды (без полистирола сосудов).
  3. Прозрачность тканей может быть достигнута после погружения ECi и когда кусочки почек будут готовы к визуализации.

4. ConfocalImaging и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации можно использовать другие методы микроскопии до тех пор, пока решение для сопоставления рефракционного индекса совместимо с объективным объективом. Этот протокол использует перевернутый конфокальный микроскоп.

  1. Добавьте 600-1000 л ECi в стеклянное нижнее блюдо(Таблицаматериалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования регулярных блюд клеточной культуры, потому что ECi является органическим растворителем, который растворит пластиковые блюда. Аналогичным образом, ECi может атаковать пластиковые детали/изоляционные кольца на объективных линзах. Обратитесь к соответствующим отчетам для обзора совместимых изображений блюд30 и самодельных 3-D печатных камер28.
  2. Перенесите полупрозрачный кусочек почки в блюдо. Поместите круглый покрывало на срез почки, чтобы применить легкое давление к стекольному дну. Печать блюдо с парафина пленки (Таблица материалов), чтобы избежать утечки ECi.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целые органы или несколько миллиметров толщиной ткани ломтиками может потребовать границы (зубной цемент или силиконовый эластомер; см. Таблица материалов) вокруг ткани, чтобы сделать ECi-бассейн для образца.
  3. Поместите блюдо на платформу визуализации микроскопа.
  4. Возьмите несколько z-стеков и выполните прошивание. Начните с z-шаг размером 5 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность использования длинных рабочих расстояний (5 мм) и высокочисленной диафрагмы (0,9) для визуализации очень толстых ломтиков или органов ткани. После визуализации, передать ткани обратно в этанол и хранить в мытье буфера или PBS с 0,02% азидея натрия.
  5. Проанализируйте изображение с помощью трех-D рендеринга с помощью программного обеспечения(Таблица материалов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Почки являются сложными органами, состоящими из 43 различных типов клеток31. Большинство из этих клеток образуют большие многоклеточные структуры, такие как гломерули и трубочки, и их функция в значительной степени зависит от взаимодействия друг с другом. Классические 2-D гистологические методы частично захватывают эти крупные структуры и могут пропустить фокусные изменения в нетронутых структурах31. Таким образом, трех-D анализ с использованием оптических методов очистки помогает понять, как они функционируют в области здоровья и болезней.

Большинство растворителей на основе оптических методов очистки будет по крайней мере частично утолить эндогенный флуоресцентный сигнал белка репортера. Утоления YFP помечены Парвальбумин наблюдался при обезвоживании и оптической очистки с ECi (Рисунок 1). Однако, другие сильные флуоресцентные белки могут сопротивляться сигнал-утоления, и регулировка рН к основным уровням (pH 8-11) может стабилизировать эндогенные флуоресцентные белки14,20,28,30. Кроме того, методы на основе вака должны быть рассмотрены, если желательно сохранение люминесцентных белков. В настоящем докладе показано, что этот протокол очистки на основе растворителя совместим с маркировкой антител; хотя, это остается сложной задачей для достижения глубокой иммуномаркировки тканей, особенно в плотной богатых клетками органов, таких как почки.

Ретроградная перфузия брюшной аорты почек была проведена для удаления клеток крови и открытия трубок(рисунок 2A,B). Такой подход уменьшает аутофлуоресценцию и улучшает диффузию антител. Концентрация антител зависит от размера ткани и обилия антигена. Таким образом, поверхностный сигнал может относиться либо к плохому проникновению антител, либо к недостаточному количеству антител(Рисунок 3A,B, см. также фильм1). Для больших образцов или чрезвычайно обильные маркеры, более высокие концентрации антител и пополнение антител через 1-2 дней может потребоваться. Если антиген интереса выражается в сосудистой почки, следует рассмотреть внутрисосудистую доставку антитела(рисунок 3С). Однако антитела, нацеленные на белки в апикальной мембране клеточных клеток туляков, не пересекают гломерулярный фильтрационный барьер из-за молекулярного размера, тем самым вызывая неспецифические сигналы в кровеносных сосудах и гломерули(Рисунок 3D).

Этот протокол может быть применен к ломтикам почек или целые почки(Рисунок 4A, B). Для проверки антител-специфическости, только элементы управления были подвергнуты вторичному антител(Рисунок 4C). Ткань может быть помечена антителами для обнаружения определенной популяции клеток (например, размножающихся клеток, Рисунок 4D) или для визуализации целых сегментов трубок с помощью сегмента конкретных антител (Рисунок4E). Кроме того, сочетание нескольких антител дает возможность колокализации различных белков в 3-D (например, для обнаружения сегмента конкретных тубулы гиперплазии, как это происходит в трубе ремоделирования на различных стимулов) (Рисунок 4F, G; также смотрите фильм 2).

Figure 1
Рисунок 1: Утоления эндогенного флуоресцентного сигнала белка репортера. (A) Эндогенный флуоресцентный белок репортера, полученных из Трансгенной мыши ПарвальбуминаYFP,обнаруживается в 5 мкм тонких замороженных почек PFA. Стрелки отмечают некоторые флуоресцентные маркировки парвальбумини клетки, расположенные в ранней части дистальной запутанной трубки. (B) Нет очевидного флуоресцентного сигнала после оптической очистки почечной ткани наблюдается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка качества перфузии почек. (A) Периодическая кислота Шифф (PAS) окрашенные парафин встроенной ткани (5 мкм тонких секций) показывает несколько труб с слегка открытый просвет (как правило, проксимальные трубочки, которые обладают кистью границы; см. стрелки). (B) Все трубки открываются после хорошей перфузии почек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Устранение целостной иммуномаркировки. (A,B) Толстый ломтик почки был окрашен антителами против натрия хлорида котранспортер-2 (NKCC2), который выражается в толстой восходящей конечности петли Хенле. Сигнал обнаруживается на поверхности ткани (стрелки в (B)). Тем не менее, антитела не проникали в ткань (см. наконечник стрелы в (B)». (C) Инъекции внутрисосудистых антител, нацеленные на белки, выраженные в сосудах (например, CD31), позволяют быстро и однородное окрашивание кровеносных сосудов. Круглые структуры с сильным сигналом являются glomeruli. (D) Однако, антитела ориентации белков, выраженных в апикальной мембране тулупов эпителии (например, фосфорилированный натрий-хлорид котранспортер (фосфо-NCC), который выражается в дистальной запутанной тулупок) не будет пересекать glomerular фильтрационный барьер, вызывая тем самым неспецифические сигналы в сосуды (см. стрелку, указывающую на афферентные артериолы и другие сосуды) и гломерули (см. стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты иммуномаркировки оптически очищенной ткани почек. (A,B) Этот протокол позволяет оптическое очищение всей почки. (C) Представитель z-стек, чтобы показать отсутствие неспецифической связывания вторичных антител в качестве контроля без предварительной инкубации. (D) 3-D визуализация репрезентативного z-стека показывает, что размножающийся бромодеоксюридин (BrdU)- клетки в почках медуллы. (E) Медуллярные коллекторские протоки визуализировать с помощью антитела против аквапорина-2 (АЗП2). (F,G) Анализ и количественная оценка клеток BrdUв азп2и медуллярных коллекторских протоках. Для (F,G), см. также Фильм 2. Эта цифра была изменена с Saritas et al.29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Фильм 1 (Связанные с рисунком 3): 3-D визуализации NKCC2-толстая восходящая конечность петли Хенле. Фильм демонстрирует плохое проникновение антител в оптически очищенный кусочек почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео.

Фильм 2 (Связанные с рисунком 4):3-D визуализация BrdU-клеткии АЗП2-медуллярный сбор протоков в оптически очищенный срез почек. Показаны клетки BrdU (красным цветом) и АЗП2и медуллярные коллекторские протоки (зеленым цветом). Imaris пятна и поверхности алгоритмы были использованы для определения BrdUи клетки снаружи (бирюзовые пятна) или внутри (розовые пятна) АЗП2итрубочки (зеленые поверхности). Этот фильм первоначально появился в Saritas и др. 29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы оптической очистки получили широкое внимание для трехмерной визуализации и количественной оценки микроанатомии в различных органах. Здесь метод очистки на основе растворителя (ECi) сочетался с иммуномаркировкой для трех-D-изображения целых трубок в почках. Этот метод прост, недорог и быстр. Тем не менее, на другие исследовательские вопросы лучше всего ответить с другими клиринговыми протоколами5. Важно также иметь в виду, что методы на основе растворителя вызывают усадку тканей в переменных степенях, в основном из-за обезвоживания шаг14,18. Большинство методов на основе растворителей (например, ECi14)также по крайней мере частично утоляют эндогенную флуоресценцию репортеров, таких как GFP или tdTomato; Таким образом, FDISCO32, CLARITY12, или CUBIC11 может служить в качестве альтернативных протоколов. Тем не менее, закалка эффект ECi является переменной и зависит от отдельных конструкций каждого репортера мыши28. Кроме того, использование 1) флуоресцентных антител против GFP и других репортеров или 2) модифицированных протоколов на основе растворителей, которые сохраняют эндогенные сигналы флуоресценции30,32 также может быть альтернативным подходом в этом контексте. Стоит отметить, что несколько групп проверили совместимость aqueous-основанных протоколов24,33,34 для визуализации РНК в 3-D, в то время как методы очистки на основе растворителя еще не были протестированы. Таким образом, при рассмотрении анализа РНК следует предпочесть методы очистки на основе вака, такие как модифицированная версия CLARITY33.

Клетки или генные продукты, представляющие интерес, могут быть визуализированы с помощью трансгенных мышей с эндогенной флуоресцентной экспрессией белка, но генерация генетически модифицированных линий мыши занимает много времени и дорого. Таким образом, маркировка антител является более практичным и обеспечивает большую гибкость, хотя иммуномаркировка больших тканей является сложной задачей. В отличие от оригинального протокола ECi14,наш подход сочетает в себе модифицированный метод оптической очистки ECi и иммуномаркировку, которая использует антиген-поисковый шаг. Тепло-индуцированной антиген-поиск будет денатурировать белки, но помогает восстановить потерю антигенности во время PFA-фиксации35 и улучшает антитела-связывания.

В этом протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, важно хорошо провести перфузию почек. Гемоглобин, содержащий красные кровяные тельца, ограничивает глубину изображения7 и расширенные трубки с открытым просветом усиливают проникновение антител. Открытие трубтакжежей также позволяет лучше различать белки, выраженные в эпителиальной апической мембране, от других апически выраженных белков на контралатеральной стороне. Однако искусственно расширенные трубки могут негативно влиять на структуру труби и маскировать специфическую патофизиологическую реакцию почек (например,расширение поврежденных проксимальных трубников), но не здоровых труб36. Во-вторых, инкубация антител при 37 градусах Цельсия, а не на 4 градуса х кЕй или РТ улучшает проникновение антител27. Однако каждое антитело обладает уникальными свойствами; таким образом, температура при инкубации антител должна быть оптимизирована для отдельных зондов. В-третьих, использование вторичных антител Alexa Fluor-647 (дальнекрасный спектр) помогает увеличить соотношение сигнала к шуму, тем более что почки излучают большое количество аутфлюоресценции в сине-зеленом спектре37.

Ретро-орбитальная инъекция14 или перфузия почек38 с флюорофором-конъюгированными антителами против белков, выраженных в кровеносных сосудах, является элегантным и быстрым способом маркировки сосудок почек. Однако белки в апикальной мембране трубок остаются недоступными при внутрисосудистой инъекции, так как антитела не могут пересечь гломерулярный фильтруальный барьер с его отсеченным молекулярным весом для фильтрации белков в диапазоне 60-65 кДА. Таким образом, использование небольших фрагментов антител и инженерных вариантов, таких как фрагменты Fab (No55 kDa), диатели (No50 kDa), тандем scFv (No 28 kDa) или нуклеикокислотные аптамеры (No 6-30 kDa) с сохраненными молекулярными свойствами антител может обеспечить возможность доступа к апиической мембране трубок38,39. Кроме того, сочетание мелких фрагментов антител с электрическими полями40 или давление13 или использование натрия додецил сульфат (SDS) на основе клиринговых протоколов для удаления липидов24,41,42 может обеспечить быстрое и эффективное проникновение антител в ткани.

Несколько групп продемонстрировали, что перфузия с клиринговым реагентом не только сокращает время протокола, но и повышает прозрачность тканей19,24,43,44. Таким образом, кануляция брюшной аорты или почечной артерии с последующей перфузией почек с обезвоживанием и рефракционным индексом соответствующих решений следует учитывать для достижения лучшей и быстрой очистки тканей. Тем не менее, мы не пронизать всю почку с очисткой реагентов и использовать нарезанные почки по нескольким причинам. Во-первых, различные антигены могут быть визуализированы путем маркировки антител нескольких ломтиков почек из одной почки. Во-вторых, меньше времени и антитела необходимы для выполнения иммуномаркировки ломтик акпчек по сравнению с целой почки. В-третьих, трех-D-изображение больших образцов генерирует наборы данных до нескольких терабайт, которые могут быть сложными для управления для большинства рабочих станций. Таким образом, данные из срезов тканей или подмножества больших файлов более удобны для выполнения сложных операций, таких как автоматизированный подсчет или измерения расстояния.

В этом протоколе конфокальная микроскопия используется для проведения визуализации с одноклеточным разрешением, что особенно актуально в исследованиях по локализации. Тем не менее, конфокальная визуализация требует лазерного сканирования, так как его скорость изображения является практичным только для небольших кусочков очищенной ткани. Для выполнения трехмерного морфометрического анализа многоклеточных структур, таких как длинные сегменты трубчатых или даже целых органов, необходимы более быстрые методы микроскопа, такие как флуоресцентные микроскопы светового листа (LSFM). LSFM позволяет быстрое изображение, когда самое высокое разрешение клеток не является существенным. Например, длина дистальных запутанных труб были недавно оценены путем объединения цельномонтажной иммуномаркировки, оптической очистки на основе CLARITY12и LSFM29. К сожалению, коммерческий LSFM является дорогостоящим и не всегда совместим с протоколами очистки на основе растворителя. В самом деле, CLARITY был выбран для этого исследования, так как наш конкретный LSFM с целью настроить для CLARITY не совместимс с ECi29. Тем не менее, Klingberg et al. продемонстрировали, что ECi в принципе совместим ас-ФСКН14.

В заключение, простой метод оптической очистки на основе ECi продемонстрирован, который может быть применен к любому исследовательскому проекту с использованием фиксированных срезов ткани в диапазоне от 100 мкм до нескольких миллиметров толщиной. Он также позволяет проводить практически осуществимые анализы, которые ранее требовали почти исчерпывающих усилий, и устраняет необходимые предположения и выводы, связанные с двумерным анализом морфологии. Сочетание полной иммуномаркировки, оптической очистки и передовой световой микроскопии поможет продвинуть понимание клеточной функции в области здравоохранения и болезней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Т. С. поддерживается грантами немецкого исследовательского фонда DFG (332853055), Else Kr'ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197) и медицинским факультетом RWTH Aachen (Программа RWTH Returner). V. G. P. поддерживается научными стипендиями от Deutsche Gesellschaft меха Nephrologie, Александр фон Гумбольдт Фонда, и Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии. D. H. E поддерживается Фондом LeDucq. Р. К. поддерживается грантами DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), штата СеверныйВестфалия (MIWF-NRW) и Междисциплинарного центра клинических исследований при Университете RWTH Aachen (O3-11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Fisher Scientific 09-761-112
15 mL conical tube Fisher Scientific 339650
21 G butterfly needle Braun Venofix
3-way stopcock Fisher Scientific K420163-4503
3D analyis software Bitplane AG IMARIS
3D analyis software Cellprofiler free open-source software
5-0 silk suture Fine Science Tools 18020-50
50 mL plastic syringes Fisher Scientific 14-817-57
Anti-BrdU monoclonal antibody Roche 11296736001
Antibody diluent Dako S0809
CD31-647 BioLegend 102516
Citrate-based antigen retrieval solution Vector Laboratories H-3300
Curved hemostat Fisher Scientific 13-812-14
Dako Wash Buffer Agilent S3006
Dissecting microscope Motic DSK-500
Embedding cassettes Carl Roth E478.1
Ethanol Merck 100983
Ethyl cinnamate Sigma-Aldrich 112372
Flexible film/Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Goat anti-AQP2 Santa Cruz Biotechnology sc-9882
Guinea pig anti-NKCC2 N/A N/A DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HCl Carl Roth P074.1
Heparin Sagent Pharmaceuticals 401-02
Hemostat Agnthos 312-471-140
Horizontal rocker Labnet S2035-E
Imaging dish Ibidi 81218
Ketamine MWI Animal Health 501090
Micro serrefine Fine Science Tools 18052-03
NaOH Fisher Scientific S318-500
Operating scissors Merit 97-272
Paraformaldehyde Thermo Fischer Scientific O4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC PhosphoSolutions p1311-53
Silicone elastomer World Precision Instruments Kwik-Sil KWIK-SIL
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Tissue slicer Zivic Instruments HSRA001-1
Triton X-100 Acros Organics AC215682500
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-00
Vibratome Lancer Series 1000
Xylazine MWI Animal Health AnaSed Inj SA (Xylazine)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508, (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17, (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10, (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369, (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26, (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16, (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18, (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28, (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4, (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7, (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7, (3), e33916 (2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10, (5), e0124650 (2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28, (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70, (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5, (3), 035007 (2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25, (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95, (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, (1), eaau8355 (2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143, (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8, (8), e72039 (2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9, (1), 4596 (2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23, (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4, (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43, (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7, (1), 9895 (2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11, (5), e201700248 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics