Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile

Immunology and Infection
JoVE Journal
Immunology and Infection
AccessviaTrial
 

Summary

Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mauti, S., Léchenne, M., Naïssengar, S., Traoré, A., Kallo, V., Kouakou, C., Couacy-Hymann, E., Gourlaouen, M., Mbilo, C., Pyana, P. P., Madaye, E., Dicko, I., Cozette, P., De Benedictis, P., Bourhy, H., Zinsstag, J., Dacheux, L. Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications. J. Vis. Exp. (160), e60008, doi:10.3791/60008 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fonksiyonel kuduz gözetleme sistemleri güvenilir veri sağlamak ve hastalık kontrolü için gerekli siyasi bağlılığı artırmak için çok önemlidir. Bugüne kadar kuduz pozitif olduğundan şüphelenilen hayvanlar klasik veya moleküler laboratuvar yöntemleri kullanılarak postmortem onaya sunulmalıdır. Ancak, endemik alanların çoğu, hayvan kuduz tanısının merkezi veteriner laboratuvarları ile sınırlı olduğu düşük ve orta gelirli ülkelerde dir. Gözetim altyapısının yetersiz bulunması, uzak bölgelerden gelen yetersiz raporlamanın ciddi hastalıklara yol açtığına yol açmaktadır. Son zamanlarda düşük teknik uzmanlık gerektiren çeşitli tanı protokolleri geliştirilmiş tir ve bu da merkezi olmayan laboratuvarlarda kuduz tanısı konulama olanağı sağlamaktadır. Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromatografik tanı testi (RIDT) kullanarak hayvan kuduzlarının alan sonrası tanısı için tam bir protokol sunacağız. Cihazın moleküler analiz ve viral genotipleme için daha fazla kullanımını anlatarak protokolü tamamlıyoruz. RIDT beyin örneklerinde kuduz virüslerini ve diğer lyssavirüsleri kolayca tespit eder. Bu tür testlerin prensibi basittir: beyin materyali altın konjuge antikorlar kuduz antijenleri özellikle bağlamak bir test şeridi üzerinde uygulanır. Antijen-antikor kompleksleri test hattındaki sabit antikorlara daha fazla bağlanır ve bu da açıkça görülebilen mor bir çizgiyle sonuçlanır. Virüs test şeridinde inaktive edilir, ancak viral RNA daha sonra ayıklanabilir. Bu test şeridi, bulaşıcı beyin örneği yerine, güvenli ve kolay bir şekilde onay ve moleküler yazım için donanımlı bir laboratuvara gönderilmesini sağlar. Üreticiprotokolünün bir değişikliğine dayanarak, test hassasiyetinin arttığını ve altın standart referans yöntemi olan doğrudan immünoresans antikor testine kıyasla %98'e ulaştığını tespit ettik. Testin avantajları çoktur: hızlı, kullanımı kolay, düşük maliyetli ve mikroskopi veya soğuk zincir uyumluluğu gibi laboratuvar altyapısına gerek yoktur. RIDT'ler, başvuru tanılama yöntemlerinin kullanılamadığı alanlar için yararlı bir alternatifi temsil eder.

Introduction

Canine kuduz insan kuduz ana nedeni, küresel yılda yaklaşık 59.000 insan ölümleri sorumlu, neredeyse tüm asya ve Afrika'da düşük ve orta gelirli ülkelerde meydana gelen (LMICs)1. Ana etyolojik ajan bir nörotropik kan ilişkili klasik kuduz virüsü (RABV, aile Rhabdoviridae, cins Lyssavirus, tür Kuduz lyssavirus). Ancak, diğer kuduz ile ilgili lyssaviruses, çoğunlukla yarasa türlerinde dolaşan, aynı zamanda hastalığa neden2,3. Etkilenen bölgelerde, hastalık gözetim ve kontrol genellikle düşük düzeyde siyasi bağlılık büyük olasılıkla güvenilir veri eksikliği nedeniyle engellenir4,5,6. Hastalığın yetersiz raporlanmasının nedenlerinden biri, kısmen donanımlı laboratuvarlara ve eğitimli personele sınırlı erişimin yanı sıra numunelerin sevkiyatının zorlukları nedeniyle laboratuvar tanısının olmamasıdır. Laboratuvar tanısı kuduz olgularını doğrulamak için gereklidir ve ayrıca ilgili suşların genetik karakterizasyonu için izin verir, bölgesel düzeyde virüs iletimi hakkında fikir sağlayan4,5,7.

Hem Dünya Sağlık Örgütü (WHO) hem de Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE) tarafından onaylanan ölüm sonrası kuduz tanısı için mevcut altın standartlar, doğrudan floresan antikor testi (DFAT), direkt hızlı immünohistokimya testi (DRIT) ve moleküler yöntemler (örneğin, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR))4,,8. Ancak, LMICs uygun uygulama tutarsız güç kaynağı ile yetersiz laboratuvar tesisleri nedeniyle sınırlı kalır, soğutulmamış numune taşıma, ve bir kalite yönetim sistemi eksikliği. Hayvan kuduz tanısı genellikle sadece LMICs merkezi veteriner laboratuvarlarında yapılır çünkü, mevcut gözetim verileri esas olarak kentsel alanlarda kuduz durumu yansıtır.

Son zamanlarda geliştirilen düşük teknoloji tanı alternatifleri uzak bölgelerde kuduz tanısı ve ademi merkeziyetçi kuduz laboratuvarları,4,8,9kurmak için fırsatlar sunuyoruz. Hızlı immünokromtografik tanı testi (RIDT) altın konjuge dedektör antikorları kullanarak immünromatografi dayalı bir lateral akış testi ve çok umut verici kuduz tanı aracı10,11,12,13. Prensip basittir: seyreltme den sonra, beyin materyali sağlanan tampon karıştırılır ve altın konjuge monoklonal antikorlar kuduz antijenleri özellikle bağlanır test şeridi üzerinde birkaç damla uygulanır, özellikle nükleoproteinler(Şekil 1). Antijen-antikor kompleksleri daha sonra lateral akış göçünden geçer, test hattında (T-line) kuduz antijenlerine karşı sabit antikorlara bağlanır ve bu da açıkça görülebilen mor bir çizgiyle sonuçlanır. Kuduz antijenlerine bağlı olmayan kalan altın konjuge antikorlar göç etmeye devam eder ve ek hedefleme antikorları ile membrana doğru düzeltmeye devam eder ve bu da açıkça görülebilen mor bir kontrol hattı (C-line) ile sonuçlanır.

Tek adımlı, düşük maliyetli yöntem hızlı, son derece kolay ve pahalı ekipman veya özel depolama koşulları gerektirmez. Seyreltme adımını ortadan kaldırmak için üretici protokolünün değiştirilmesiyle, testi gerçekleştirmek için gereken hemen hemen tüm ekipman ve reaktifler14kitine dahildir. Sonuç mikroskop olmadan 5-10 dakika sonra okunur. Bu, bir floresan mikroskobu ve immünfloresans konjuge, soğutmalı taşıma ve örnek depolama ile birlikte gerektiren DFAT testi üzerinde büyük bir avantajdır. Işık mikroskobu kullanılarak yapılabilen DRIT testi bile, henüz ticari olarak mevcut olmayan anti-kuduz antikorlarını saklamak için sürekli bir soğuk zincir gerektirir. DRIT ile karşılaştırıldığında, RIDT hiçbir toksik kimyasallar, atık bertaraf kötü düzenlenmiş ülkelerde belirli bir avantaj gerektirir. Hızlı test altın standart testleri DFAT ve DRIT ile karşılaştırıldığında çok daha kolay yorumu ile daha az zaman alıcıdır. Bu, sınırlı teknik uzmanlığa sahip personel tarafından yerinde test yapılmasına olanak tanır.

Bu test özelliklerine dayanarak, uzak bölgelerde şüpheli hayvanların hızlı tanı mümkün hale gelir, en kısa sürede maruz insanlar için post exposure profilaksisi (PEP) uygulanmasını kolaylaştıran. Buna ek olarak, kuduz örneklerinin uzaktan taşınması gerekli değildir, bu da test sırasında daha iyi numune kalitesi sağlar. Ancak, RIDT testleriyle elde edilen sonuçlar şu anda DFAT veya DRIT gibi bir referans tanı testi kullanılarak doğrulanmalıdır.

RABV ve diğer lyssavirüslerin saptanması için RIDT teknikleri değerlendirildi. İlk çalışmalardan biri 2007 yılında Koreli araştırmacılar tarafından yapılmıştır10. DFAT yöntemi ile karşılaştırıldığında, 51 hayvan örneği ve 4 RABV izole sinde RIDT sırasıyla %91.7 ve %100 duyarlılık ve özgüllük gösterdi. Bu sonuçlar daha sonra Kore'den alınan 110 hayvan beyni örneği ile doğrulandı, duyarlılık ve özgüllük ile, DFAT ile karşılaştırıldığında, 95% ve 98.9% sırasıyla15. Daha yakın zamanlarda, diğer çalışmalar virüs izole ve / veya farklı coğrafi kökenlere sahip çeşitli hayvanlardan enfekte beyin örnekleri kullanarak bu RIDT performansını değerlendirdi. Afrika RABV ve diğer Afrika lyssavirüsler (Duvenhage virüs (DUVV), Lagos yarasa virüsü (LBV) ve Mokola virüsü (MOKV) dahil olmak üzere 21 örnekten oluşan bir panel, DFAT16ile karşılaştırıldığında% 100 hassasiyeti ile, başarıyla tespit edildi. Benzer yüksek duyarlılık (%96.5) ve özgüllük (%100) değerler Etiyopya17115 beyin örnekleri bir panel elde edildi. Başka bir çalışmada Avrupa RABV izole, diğer iki Avrupa lyssaviruses (Avrupa bat lyssavirus tip 1 (EBLV-1) ve tip 2 (EBLV-2)) ve Avustralya yarasa lyssavirus (ABLV)18değerlendirildi . 172 hayvan beyni örneğinin analizine göre RIDT kiti DFAT'a göre %88.3 duyarlılık ve %100 özgüllükteydi ve kuduzla ilişkili üç lyssavirüs başarılı bir şekilde saptandı. Bu çalışmada, bazı yanlış negatif sonuçlar gliserol tampon saklanan beyin örnekleri geldi, yanlış gliserol kaldırma kılcal akış veya antikor bağlama etkilediğini düşündüren. Avustralya yarasalar 43 klinik örneklerin yeni bir analiz dfat19tam uyum ile, önceki test sonuçlarını doğruladı. Hindistan'da ridt kullanılarak sınırlı sayıda klinik örnek (11 ve 34 örnek) üzerinde iki çalışma yapılmıştır. DFAT ile karşılaştırıldığında duyarlılık %85.7 ile %91.7 arasında, özgüllük ise %10020,21idi. Afrika, Avrupa ve Orta Doğu'dan 80 hayvan beyni örneği kullanılarak yapılan bu kitin bir başka değerlendirmesi de DFAT ile özgüllük açısından tam bir uyum elde etti (%100) ancak daha yüksek duyarlılık (%96.9) önceki çalışmalara göre22. 22 farklı laboratuvarda 10 numuneden oluşan bir panel kullanılarak gerçekleştirilen bu RIDT'nin laboratuvarlar arası karşılaştırmasında, genel konkordato %99,523olarak gerçekleşti.

Sadece bir yeni multicentric çalışma tatmin edici genel RIDT performansıgösterdi 24. Üç farklı veri kümesinden alınan örnekler test edildi ve DFAT ile karşılaştırıldığında değişken duyarlılık ve özgüllük değerleri sağlandı. Örneğin, ilk panel (n=51) ve deneysel enfekte hayvanlardan alınan örneklerin ikinci paneli (n=31) ile elde edilen duyarlılık ve özgüllük, hepsi Laboratuvar A'da test edilmiştir, sırasıyla %16 ve %43 duyarlılık sağlarken, her iki sinde de özgüllük %100 idi. Buna karşılık, B laboratuarı tarafından analiz edilen alan klinik örneklerinin üçüncü panelinin (n=30) sonuçları, A laboratuvarı (%85 duyarlılık ve %100 özgüllük) tarafından neredeyse tamamen doğrulanan DFAT sonuçlarıyla tam bir uyum sağlamıştır. RIDT24ile dalgalanan nispeten düşük duyarlılık için olası bir açıklama olarak toplu-toplu varyasyon önerildi.

Aynı zamanda, başka bir çalışmada üreticinin bir değişiklik protokolü14tavsiye ile, yukarıda açıklanan RIDT benzer bir doğrulama işlemi yapıldı. PBS'deki seyreltme öncesi adım (1:10) beyin materyalinin hazırlanması sırasında atlandı. Bu basit modifiye protokole dayanarak, yazarlar duyarlılık ve özgüllük elde 95.3 ve 93.3%, sırasıyla, Test ederek DFAT ile karşılaştırıldığında, laboratuvar koşulları altında, 73 hayvan beyin örnekleri bir veri seti, doğal veya deneysel çeşitli RABV suşları ile enfekte. Çalışma, bu RIDT'nin ilk değerlendirmesini bir alan ortamında (Çad, Afrika) sunmuştur. 48 klinik beyin örneğinde duyarlılık ve özgüllük sırasıyla %94.4 ve %100 idi. DFAT ve RIDT arasındaki tutarsızlıklar, RT-PCR ile teyit edildikten sonra belirlenen DFAT ile yanlış pozitif sonuçlardan kaynaklandı. Bu sonuçlar silindiğinde, tam bir uyum vardı ve RIDT'nin bu alan koşulları altında DFAT'ın daha güvenilir olduğunu gösterdi14. Değiştirilen protokol kullanılarak toplu işlem den toplu olarak varyasyon gözlenmedi. Değiştirilen protokol, Eggerbauer ve ark.24'ünçalışmasında az sayıda DFAT/ RIDT divergent numunesine (n=8) uygulandığında, hepsi uyumlu bulunmuştur (%100 duyarlılık).

RIDT'nin bir diğer önemli avantajı da moleküler teknikler (RT-PCR gibi) ve sonraki genotipleme14,24kullanılarak şeritüzerinde sabitlenmiş viral RNA'yı tespit etmek için ikincil kullanımdır. Bir çıkarma adımının ardından, Léchenne ve ark.14, 51 numuneden oluşan bir panelde %86,3 hassasiyetle (çad'dan test edilip ortam sıcaklığında gönderilen 18 numune dahil) RT-PCR kullanılarak Anigen cihaz membranına sabitlenmiş viral RNA gösterdi. Test edilen 14 numunenin %93'ünde daha sonraki genotipleme mümkün oldu. En az 500 nükleotit uzunluğunda PCR amfinlerinin sanger dizilimi kullanıldı. RABV izolasyonlarına ek olarak, test tesniye dört lyssavirus türü tespit, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 ve Bokeloh yarasa lyssavirus (BBLV), tam uyumlu uluslararası laboratuvarlar arası test sırasında14. Viral RNA saptama duyarlılığı daha da yüksekti (%100) Laboratuvar numuneleri muayene24dayalı Eggerbauer ve ark çalışmada, . İkinci çalışma da RIDT kiti inaktive virüs kullanılan tampon gösterdi. Bu nedenle, cihazlar moleküler onay ve genotipleme için, referans laboratuvarları için özel biyogüvenlik önlemleri olmadan, ortam sıcaklığında kolayca sevk edilebilir.

Önceki değerlendirmelere dayanarak RIDT araçları, özellikle referans tanılama teknikleri kullanılamıyorsa, alan ayarlarında kullanım için çok sayıda avantaj sunar. Ancak, bu test de bazı sınırlamalar vardır, özellikle, antijen tespiti düşük duyarlılık14,24. Test, beyin örnekleri gibi yüksek miktarlarda viral antijen içeren numuneler için geçerlidir. Ancak, tükürük veya diğer vücut sıvıları gibi diğer örnekler için uygun değildir. Başka bir dezavantajı dfat, RT-PCR veya DRIT performans maliyeti ile karşılaştırıldığında daha az pahalı olan cihazın maliyeti (Avrupa'da yaklaşık 5-10 Euro), ama hala LMICs için yüksek kalır. Ancak, gelecekte geliştirme ve diğer şirketlerden benzer RIDTs doğrulama bir fiyat düşüşüne yol açabilir. Bir çalışmada toplu-toplu varyasyonlar bildirdi. Başkaları tarafından rapor edilmese de, kalite yönetimi ortamında kullanılan herhangi bir reaktifiçin olduğu gibi, yeni bir toplu iş iş bucadıyla sıkı kalite kontrolleri yapılmalıdır. Değiştirilen protokolün kullanımı farklı toplu iş14kullanılırken değiştirilmedi. Bir çalışma dışında tüm RDIT duyarlılığı DFAT (%90-95 civarında) ile karşılaştırıldığında yüksek olduğunu gösterdi. Kuduz her zaman ölümcül olduğundan, DFAT, DRIT veya RT-PCR14gibi bir referans tanı testi kullanarak RDIT ile herhangi bir olumsuz sonuçları onaylamak için hala şiddetle tavsiye edilir.

Bu yazıda, beyin numunesi koleksiyonundan değiştirilmiş bir protokolün uygulanmasına kadar, üretici önerileri (daha önce14doğrulanmış olan) ve daha sonraki moleküler analize kadar, hayvan kuduzlarının alan sonrası tanısı için tam bir protokol sunmuş bulunmaktayız. Bu protokol, RIDT'nin DFAT testinin yanı sıra kuduz tanısı için rutin olarak kullanıldığı Batı ve Orta Afrika'da saha koşullarında birçok kez uygulandı ve doğrulandı. Ayrıca cihaz için ikinci bir uygulama göstermek, laboratuvar ayarlarında, ekstraksiyon ve algılama viral RNA RT-PCR kullanarak cihaz üzerinde sabit.

Protocol

1. Foramen magnum (oksipital rota)25 ile örnek toplama

NOT: Bu teknik laboratuvar koşullarında veya saha ayarlarında uygulanabilir. Numuneler, sonuçları etkileyebilecek çürümeyi önlemek için şüpheli hayvanın ölümünden sonra mümkün olan en kısa sürede işlenmeli veya soğuk sıcaklıkta (mümkünse soğutulmuş veya dondurulmuş) tutulmalıdır. DFAT ve DRIT gibi lyssavirus antijenlerin saptanması ile ilgili diğer referans tekniklerine benzer şekilde, çürümüş numuneler de sonucu etkileyebileceğinden (yanlış negatif sonuç riski) test edilmemelidir.

DİkKAT: Tüm örnekler potansiyel olarak bulaşıcı olarak düşünülmelidir. Güvenlik yönetmelikleri ve prosedürleri kesinlikle takip edilmelidir, alan ayarlarıbile 4. Özellikle maske, gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Malzeme ve numune dekontaminasyonları için uygun dezenfektan kullanın (örneğin, önerilen üretici seyreltmeleri ile sodyum hipoklorit, %70 alkol - etanol veya izopropanol, %1 sabun çözeltisi). Tüm personel kullanım örnekleri kuduz aşısı yapılmalıdır.

  1. Foramen magnum erişmek için ilk servikal vertebra (atlas vertebra) önce bir bıçak ile hayvan kafası çıkarın.
    NOT: Enfektif aerosolü en aza indirmek için manuel testere veya benzeri bir alet kullanmaktan kaçının.
  2. Tek kullanımlık plastik pipet(Şekil 2A),bir içme pipeti(Şekil 2B),bir kelepçe(Şekil 2C)veya damlalık (RIDT ile birlikte verilir)(Şekil 2D)kullanarak beyin sapı (medulla oblongata) numunesi toplayın.
    NOT: Sonuçların güvenilirliği için son derece önemli bir adım olduğundan, numune toplanırken özel dikkat edilmelidir. Nasıl ilgi beyin sapı parçası toplamak için basit bir şekilde gösterir ilişkili video ek olarak, bir eğitim adımı son derece doğru anatomik bölümü toplamak için emin olmak için tavsiye edilir.
  3. İsteğe bağlı olarak ve beyin sapı ek olarak (medulla oblongata), beyin sapı veya beynin diğer bölümlerini toplamak (beyincik, hipokampus, talamus ve korteks) iterek ve göz soketi doğru plastik pipet veya saman döndürerek aynı oksipital rota(Şekil 3).
  4. Bir saman veya pipet kullanıyorsanız, yavaşça sonraki analiz ve / veya biyobankacılık için bir tüp içinde beyin örneği (0,5-2 g) yatırmak için sıkmak.
    NOT: Gliserolde örnek depolama önerilmez, çünkü kılcal damar akışını veya RIDT18'inantikor bağlama adımını etkiler.

2. Değiştirilen RIDT protokolünün uygulanması14

NOT: Bu değişiklik, üretici protokolünde (tüm sürümlerde) belirtildiği gibi PBS'ye bir seyreltme adımını (1:10) atlar ve laboratuvar veya alan ayarları altında uygulanabilir.

  1. Yarım yer fıstığı veya bezelye (0.1-0.5 g) beyin materyalinin eşdeğerini toplamak ve tampon numune tüpüne yerleştirmek için bez/damlalık kullanın.
    NOT: Değiştirilen protokol için, tüm reaktifler/sarf malzemeleri kitte dahildir (PBS veya ek tüp gerekmez)(Şekil 4). Kitin toplu iş numarasını belgeleyin ve son kullanma tarihinin geçerliliğini denetleyin.
  2. Homojen bir süspansiyon elde edilene kadar beyin malzemesini bez veya damlalıkla doğrudan tüpte yaklaşık 30 s kadar dikkatlice ezin.
    NOT: Arabellek reaksiyonu üreticinin protokol24koşullarında virüsün enfekte liğini inaktive eder.
  3. Damlalık kullanarak, süspansiyonun dört damlasını (yaklaşık 100°L) test cihazındaki numune girişine yatırın.
  4. Test cihazını okumadan önce tam örnek geçişi (1-5 dk) bekleyin. Geçiş, numunenin birikmeden (1-5 dk) sonra hızla başlamalıdır.
  5. Gecikme durumunda (yüksek viskozite süspansiyon nedeniyle) veya göç başlangıcıhızlandırmak için, yavaşça damlalık ile cihazın mevduat sitenin alt çizik (1-5 kez) ve sonunda 1-2 daha fazla damla ekleyin. Geçiş hemen bundan sonra başlamalıdır.
  6. Geçiş in bitiminden sonra, 5-10 dk ve en fazla 20 dakika sonra algılama penceresinde test sonucunu okuyun.
  7. Sonucu, Şekil 5'egöre, algılama penceresindeki kontrol satırı (C-line) ve test satırının (T-line) (mor çizgiler) varlığına veya yokluğuna göre yorumlayın. İki çizgi görünürken örneği pozitif olarak düşünün(Şekil 5A), yalnızca C çizgisi varsa negatif(Şekil 5B) ve yalnızca T-çizgisi varsa veya hiçbir çizgi görünmüyorsa geçersizdir(Şekil 5C).
    NOT: Geçersiz sonuçlar en az bir kez tekrarlanmalıdır. Sonuçlar geçersiz kalırsa diğer teknikler yapılmalıdır. RIDT ile elde edilen negatif sonuçların dfat, DRIT ve moleküler yöntemler (polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR) gibi altın standart referans yöntemi kullanılarak doğrulanmalıdır. Bu testin hassasiyeti yüksek olmasına rağmen (temsili sonuçlara bakınız), %100 değildir.
  8. Kullanılmış cihazları oda sıcaklığında saklayın veya daha sonraki moleküler analizler için mümkünolduğunda buzdolabına koyun/dondurun (bkz. bölüm 4). Gerekirse testi tekrarlamak için tampon tüpte -20 °C/-80 °C'de kalan numune süspansiyonu dondurun veya daha sonra moleküler analiz için testi tekrarlayın.

3. RIDT cihazından RT-qPCR tarafından RNA çıkarılması ve tespiti

NOT: Bu adım sadece uyarlanmış ortam ve moleküler tanı için uygun ekipman ile laboratuvar koşullarında uygulanabilir. RIDT testinden kısa bir süre sonra veya geriye dönük olarak oda sıcaklığında (15-30 °C) saklanan, soğutulmuş veya dondurulmuş arşivlenmiş RIDT cihazlarında yapılabilir.

  1. RNA çıkarma
    NOT: Çıkarma adımını izlemek için, çıkarmanın ilk adımlarında numuneye doğrudan saplanmış endojen bir mRNA (ß-aktin gibi) veya eksojen kontrol (eGFP sentetik RNA gibi) olabilecek bir iç kontrol kullanılması tavsiye edilir26,27.
    1. Cihazı dikkatlice açın ve filtre kağıdını çıkarın.
    2. Numunenin depozito alanını kesin ve 1 mL Tri-Reaktif LS içeren bir tüpe yerleştirin. Nazik düzenli manuel ajitasyon ile 1 saat BOYUNCA RT inkübate.
    3. Daha önce27açıklandığı gibi, üretici önerileri uyarınca çıkarma gerçekleştirin. Bu adımda eksojen iç kontrol eklenebilir.
    4. İşlem sırasında, üreticinin tavsiyelerine göre RNA'nın çökmesini kolaylaştırmak için 2°L glikojen ekleyin.
    5. Genellikle kullanılan 50°L'lik bir hacimle çekirdeksiz suda RNA resuspension için son hacmi ayarlayın.
      NOT: Sulu ve organik faz ayrıştırma için santrifüj adımının sonunda (Tri-Reagent LS'ye 200 μL kloroform eklendikten sonra), cihazdan membran parçası tüpün alt kısmında olacak ve üst sulu fazın toplanmasına engel olmayacaktır. Alternatif olarak, diğer kolay ve hızlı protokoller kullanılabilir, örneğin, fenol bazlı reaktifler ve silika membranlar kullanılarak28.
  2. RT-qPCR26 tarafından algılama
    NOT: Çıkarılan numunelerde mevcut olan potansiyel viral RNA'nın saptanması ters transkripsiyon PCR, konvansiyonel (uç nokta) veya gerçek zamanlı PCR (qPCR) gibi farklı moleküler teknikler kullanılarak yapılabilir. Çeşitli yöntemler mevcuttur, konvansiyonel RT-PCR27gibi,29 veya RT-qPCR26,30 viral nükleoprotein veya polimeraz geni hedefleyen. Bir örnek viral polimeraz arasında korunmuş bir bölgeyi hedefleyen çift kombine pan-lyssavirus RT-qPCR'a göre aşağıda sunulacaktır. Bu RT-qPCR tekniği iki farklı RT-qPCR ilişkilendirer: biri TaqMan sonda teknolojisine (pan-RABV RT-qPCR) ve diğeri SyBR Yeşil algılamasını (pan-lyssa RT-qPCR) kullanarak. Buna ek olarak, ekstraksiyon işlemi sırasında doğrudan çivili bir eksojen iç kontrol (eGFP RNA) tespiti belirli bir TaqMan prob tabanlı RT-qPCR (eGFP RT-qPCR) tarafından yapılır. Viral RNA tespiti için seçilen moleküler tekniklerin dikkatli yerinde doğrulama, özellikle, bu astar ve gerçek zamanlı RT-PCR için problar doğrulamak için önemlidir, ilgi bölgesinde dolaşan suşları tespiti için uyarlanmıştır4.
    1. RNA örneğini nükleazsız suda 1:10'a seyreltin. 96 kuyulu bir reaksiyon plakası veya diğer biçimleri kullanarak her RNA örneğini yinelenen olarak test edin. Her bir test için pozitif ve negatif denetimler kullanın ve en azından yinelenen testi yapın.
    2. Tablo 1'egöre üç farklı RT-qPCR tahlilleri ve Tablo 2'debelirtilen astar/problar için ana karışım reaksiyon çözeltisini hazırlayın.
    3. Üç farklı tahlillerin her birine 5 μL seyreltilmiş RNA numunesi ve 15°L ana karışım ekleyin. Pan-RABV RT-qPCR teşp ve eGFP RT-qPCR titreşme aynı plaka içinde çevrim olabilir.
    4. Tablo 3'tebelirtilen termal bisiklet koşullarını izleyerek farklı tahlilleri çalıştırın. Sadece bir PCR termal çevrimci varsa, pan-RABV RT-qPCR ile başlayın ve pan-LYSSA RT-qPCR plakasını 4 °C'de pan-RABV RT-qPCR sonuna kadar saklayın.
    5. Tablo 4'egöre üç tahlil ile elde edilen sonuçları analiz edin.

4. RIDT cihazından RNA ekstraksiyonu sonrası genotipleme

  1. Ters transkripsiyon RT27,29
    1. 10 μL'lik son hacim için 6 μL RNA, 2 μL pd(N)6 rastgele astar (200 μg/μL) ve 2 μL nükleaz içermeyen su ile ana karışım hazırlayın.
    2. Bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın ve buz üzerinde saklayın.
    3. 6 μL 5x First-Strand Tampon ile ana karışım hazırlayın, 2 μL 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 μL (200 U) Superscript II ters transkriptaz, 2 μL (80 U) RNasin, 2 μL dNTP karışımı (10 μM) ve çekirdeksiz su ile tamamlanan her örnek için 20 μL son hacmi elde etmek için.
    4. Ana karışımı (20 μL) numuneye (10 μL) (son hacim 30°L) ekleyin ve 42 °C'de 90 dakika boyunca bir ısı bloğunda kuluçkaya yatırın.
    5. PCR amplifikasyonu ile bir sonraki adıma geçin veya cDNA'yı -20 °C'de saklayın.
  2. Konvansiyonel PCR27,29,31
    NOT: Genotipleme için geleneksel PCR'nin farklı teknikleri mevcuttur. İki nükleoprotein veya lyssavirus viral protein bir kısmını hedefleyen hemi yuvalı PCR sunulmaktadır. Protokol, astarlar ve bisiklet koşulları dışında, bu tahlillerin her biri için aynıdır. Pozitif (pozitif RNA) ve negatif (negatif cDNA ve/veya nükleaz içermeyen su) kontrolleri her seriye ve her pcr turuna dahil edilmelidir.
    1. Her numune için 0,2 mL mikrotüpte ilk PCR adımı için ana karışım reaksiyon uyrucumu yontucu hazırlayın. Bu karışım 5 μL 10x NH4 Reaksiyon Tamponu, 2,5 μL MgCl2 çözeltisi (50 mM), 1 μL dNTP Mix (10 μM), her astarın 1 000(10 μM), 0,2 μL (1 U) Biotaq DNA polimeraz ve 37,3 μL çekirdeksiz su (48 μL son hacmi) içerir. Astarlar Tablo 5'tebelirtilmiştir.
    2. Tablo 6'yagöre, her bir deney için ayrı bir konvansiyonel PCR termal çevrimine her tüpve döngüye 2 μL cDNA ekleyin.
    3. Hemi iç içe PCR reaksiyonu için uygun astarları(Tablo 5)kullanarak bir öncekiyle aynı ikinci bir ana karışım reaksiyon çözeltisi hazırlayın.
    4. Tablo 6'dabelirtilen bisiklet parametrelerini kullanarak geleneksel bir PCR termal döngüye ilk yuvarlak PCR ürününün 2 μL'sini ekleyin.
    5. Ethidyum bromür (yaklaşık% 0,01) ile farklı PCR ürünleri (birinci ve ikinci yuvarlak PCR) % 1 agarose jel (Tris-asetat EDTA tampon 1x - TAE 1x 100 mL) yükledikten sonra görselleştirin ve 120 V 30 dakika boyunca jel çalıştırın. Beklenen boyutta parlak bir bant şeklinde pozitif bir PCR sonucu gözlenir(Tablo 5).
  3. Sanger sıralama
    1. Pan-lyssavirus hemi iç içe PCR ile elde edilen amplicons bir Sanger sıralama yapmak ve genotipleme analizi tamamlamak.

Representative Results

Her tanı yönteminde olduğu gibi, numune toplama, özellikle alan ayarlarında gerçekleştirilen sonuçların güvenilirliği açısından son derece önemlidir. Yüksek kaliteli numunelerin toplanmasını garanti etmek için toplama işleminin mümkün olduğunca basit olması gerekir. Hayvan kuduz larının postmortem tanısı için foramen magnum yolu üzerinden beyin biyopsisi (medulla oblongata ile beyin sapı) toplanması, Şekil 2A-D25'tebelirtildiği gibi bu gereksinimi karşılar.

Toplama dan sonra, beyin örneği Şekil 6'daözetlenen RIDT'nin değiştirilmiş protokolüne gönderilir. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, üreticiden sağlanan protokolden gelen ana adaptasyon PBS'deki seyreltme adımının ihmal edilmesidir, bu da prosedürü ve gerekli sarf malzemelerini/reaktifleri basitleştirir, böylece tüm bunlar kitte kittirilir(Şekil 4).

Bu modifiye protokol, kuduz üzerine bir WHO işbirlikçi merkezi (Lab 1, Fransa), kuduz için bir FAO referans merkezi (Lab 5, İtalya) ve enzootik Afrika ülkelerinde bulunan üç referans laboratuvarı, Çad (Lab 2), Fildişi Sahili (Lab 3) ve Mali (Lab 4) dahil olmak üzere beş farklı laboratuvarda uygulandı ve değerlendirildi. Çad'da RIDT'nin değerlendirilmesi hem laboratuvar hem de saha ortamlarında yapılmıştır.

DFAT referans tekniğiile karşılaştırıldığında, rdit duyarlılığı ve özgüllüğü tüm laboratuvarlarda yüksekti, sırasıyla %96 ila %100 ve %93.7 ila %100(Tablo 7). Laboratuvar doğrulama adımında Laboratuvar 1 (Fransa) için RDIT'nin en düşük hassasiyeti ve özgüllüğü elde edilmiştir. Test edilen numunelerin kümülatif sayısına (n=162)(Ek Tablo 1)göre, DFAT'a göre genel duyarlılık ve özgüllük sırasıyla %98,2 ve %95,8 idi (Tablo 7). Ancak, bu ön ama umut verici sonuçlar sınırlı bir örnek veri setinde elde edildi ve mevcut heterojen veri kümeleri nedeniyle herhangi bir potansiyel küçümseme veya önyargı önlemek için, özellikle enzootik alanlarda test edilenler için, pozitif ve negatif örnekler çok sayıda daha doğrulanması gerekir.

RIDT testi, lyssavirüs antijenlerinin düzeyinin önemli olduğu enfekte hayvanların beyin biyopsilerinde lyssavirüs saptanabilir. Ancak, titre virüs süspansiyonu test ederken tespit test sınırı yüksek kalır(Tablo 8; Şekil 7).

Tablo 9 (Léchenne 201614)lyssavirus viral polimeraz hedefleyen çift kombine pan-lyssavirus RT-qPCR tarafından RNA tespiti nden sonra elde edilen sonuçların bir örneğini göstermektedir. Laboratuvar koşullarında (Lab 1, n=32) veya Çad'da (Lab 2, n=19) yapılan ve ortam sıcaklığında Laboratuvar 1'e sevk edilen 51 pozitif RIDT testinden oluşan bir panel test edildi. Pozitif saptandı 18 (%94.7), 26 (%81.2) ve 44 (%86,3) Lab 1, Lab 2 ve iki kombine örnekleri, sırasıyla. Buna ek olarak, kısmi nükleoprotein genini hedefleyen hemi iç içe PCR kullanılarak bu örneklerin 14'ü için (Lab 1'den 10 ve Laboratuvar 2'den 4) genotipleme yapıldı ve bunların 13'ü başarılı oldu (%93) (Léchenne ve ark. 201614'ten).

Figure 1
Şekil 1: Kuduz tanısı için RIDT yapısının şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Alanlardaki oksipital foramen (Mali) aracılığıyla hayvanlarda (burada gösterilen köpek) beyin örneklerinin (medulla oblongata ile beyin sapı) toplanması için hızlı basit teknikörnekleri. (A) Tek kullanımlık plastik pipet ile toplama (B) Plastik içme pipeti ile toplama (C) Bir kelepçe ile toplama (D) RIDT kitinde sağlanan bertaraf damlalık ile toplama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Köpek başının longitudinal anatomik bölümü, beynin farklı bölümlerini gösteren (beyin sapı, beyincik, hipokampus, talamus ve korteks) iterken toplanan, bir rotasyon hareketi, oksipital foramen rota ile tek kullanımlık plastik pipet. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: RIDT kitinin içeriğinin açıklaması, cihaz, tek kullanımlık plastik damlalık, tek kullanımlık bir bez ve tazyik lilüent dahil. Numunenin toplanıp depolanacak olduğu tüp sağlanmaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Anigen RIDT'nin yorumlanması için temsili sonuçlar. (A) Pozitif sonuçlar (iki çizginin görünür varlığı, C-line ve T-line) (B) Negatif sonuçlar (yalnızca C-line'ın görünür varlığı) (C) Geçersiz sonuçlar (görünür C-line yokluğu). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: RIDT protokolünün üretici talimatlarından uyarlanan şematik gösterimi. (A) Protokolün değiştirilmiş versiyonu, üretici tarafından önerilen seyreltme adımının silinmesi ile (B) Üretici tarafından önerilen ilk protokol, beyin örneklerinin PBS'sinde 1:10 öncesi seyreltme adımı ile. Protokolün değiştirilmiş sürümünde silinen adımlar (Şekil 6A'dasunulmuştur) kırmızı çizgiyle gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: RIDT14tespit sınırının belirlenmesi örneği. 9704ARG titremiş kuduz virüsünün seri 10:1 seyreltilmesi kullanıldı. Her cihazda biriken virüs miktarı FFU (floresan odak oluşturan üniteler) ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Pan-RABV RT-qPCR teşp
Reaktif μL/Reaksiyon
2X Reaksiyon Karışımı (her dNTP'den 0,4 mM ve 6 mM MgSO4 içeren bir tampon) 10
Nükleaziçermeyen su 1.5
Taq3long (İleri) [10 μM] 1
Taq17revlong (Ters) [10 μM] 1
RABV4 [10 μM] 0.3
RABV5 [10 μM] 0.3
MgSO4 [50-mM] (kitte temin) 0.25
ROX Referans Boya (25 μM) (kitte verilir) 0.05
RNasin (40U/μL) (Promega) 0.2
SuperScript III RT/Platin Taq Mix 0.4
Reaksiyon başına toplam 15
eGFP RT-qPCR teşp
Reaktif μL/Reaksiyon
2X Reaksiyon Karışımı (her dNTP'den 0,4 mM ve 6 mM MgSO4 içeren bir tampon) 10
Nükleaziçermeyen su 2.8
EGFP1F (İleri) [10 μM] 0.5
EGFP2R (Ters) [10 μM] 0.5
eGFP sondası [10 μM] 0.3
MgSO4 [50-mM] (kitte temin) 0.25
ROX Referans Boya (25 μM) (kitte verilir) 0.05
RNasin (40U/μL) (Promega) 0.2
SuperScript III RT/Platin Taq Mix 0.4
Reaksiyon başına toplam 15
Pan-lyssa RT-qPCR teşp
Reaktif μL/Reaksiyon
2x SYBR Yeşil Reaksiyon Karışımı 10
Nükleaziçermeyen su 2.1
Taq5long (İleri) [10 μM] 1
Taq16revlong (Ters) [10 μM] 1
MgSO4 [50-mM] (kitte temin) 0.25
ROX Referans Boya (25 μM) 0.05
RNasin (40U/μL) (Promega) 0.2
SuperScript III RT/Platin Taq Mix 0.4
Reaksiyon başına toplam 15

Tablo 1: Üç farklı RT-qPCR tahlilleri (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR ve eGFP RT-qPCR) için ana karışım reaksiyon çözeltisinin tanımı.

RT-qPCR teşp Adı Türü Uzun -luğu Sıra (5'-3') Anlamda Konum
pan-RABV RT-qPCR teşp Taq3long Astar 22 ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC A S 7273-7294a
Taq17revlong Astar 25 GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC ARAÇ G Olarak 7390-7414a
RABV4 Sonda (FAM/TAMRA) 29 AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC Olarak 7314-7342a
RABV5 Sonda (FAM/TAMRA) 32 AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA S 7353-7384a
Pan-lyssa RT-qPCR teşp Taq5long Astar 23 TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CA S 7272-7294a
Taq16revlong Astar 25 GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C Olarak 7366-7390a
eGFP RT-qPCR teşp EGFP1F Astar 20 GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC S 637-656b
EGFP2R Astar 19 GAA CTC CAG CAG GAC CAT G Olarak 768-750b
EGFP Sonda (FAM/TAMRA) 22 AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A S 703-724b

Tablo 2: Üç farklı RT-qPCR tahlilleri için astarların/probların tanımı (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR ve eGFP RT-qPCR). bir Pasteur virüsüne (PV) RABV genom dizisine göre (GenBank katılım numarası M13215). b Klonlama vektörü pEGFP-1 dizisine göre (GenBank katılım numarası U55761).

Pan-RABV RT-qPCR ve eGFP RT-qPCR tahlilleri
Adım Döngüsü Temp Zaman Veri Toplama
Ters Transkripsiyon 1 45 °C 15 dk
RT inaktivasyonu/ilk denatürasyonu 1 95 °C 3 dk
Amplifikasyon 40 95 °C 15 s
61 °C 1 dk Bitiş noktası
Pan-lyssa RT-qPCR teşp
Adım Döngüsü Temp Zaman Veri Toplama
Ters Transkripsiyon 1 45 °C 15 dk
RT inaktivasyonu/ilk denatürasyonu 1 95 °C 3 dk
Amplifikasyon 40 95 °C 15 s
55 °C 1 dk Bitiş noktası
Dissociation eğrisi 1 95 °C 15 s Artış 0.1 °C/s, 55-95 °C
55 °C 1 dk
95 °C 15 s
55 °C 15 s

Tablo 3: Üç farklı RT-qPCR tahlilleri (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR ve eGFP RT-qPCR) için termal bisiklet koşullarının tanımı.

Tahlil Analysis Sonuç -ları Yorumu
eGFP RT-qPCR Kabul aralığında Cq Çıkarma doğrulandı Diğer tahlillerin analizi yapılabilir
Kabul aralığının dışında Cq Çıkarma doğrulanmadı Numuneyi yeniden test edin (çalıştırmayı veya/ve ekstraksiyonu tekrarlayın), gerekirse başka bir örnek isteyin
pan-RABV RT-qPCR Cq <38 Pozitif Viral RNA pozitif tespiti
Cq ≥38 Negatif Analiz pan-lyssa RT-qPCR tahlil
pan-lyssa RT-qPCR Pozitif olarak kabul edilen erime eğrisi Pozitif Viral RNA pozitif tespiti
Negatif olarak kabul edilen erime eğrisi Negatif Viral RNA saptanama

Tablo 4: Çift kombine pan-lyssavirus RT-qPCR testinin genel yorumu.

Hemi iç içe geleneksel PCR teşp PCR turu Adı Uzun -luğu Sıra (5'-3') Anlamda Pozisyona Amplicon boyutu (bp)
Polimeraz genini hedefleyen hemi iç içe PCR 1. tur PVO5m 20 ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA S 7170-7189 320
PVO9 19 TGA CCA TTC ARAÇ GTN G Olarak 7471-7489
2. tur PVO5m 20 ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A S 7170-7189 250
PVO8 22 GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A Olarak 7398-7419
Nükleoprotein genini hedefleyen hemi iç içe PCR 1. tur N127 20 ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG S 55-74 1532
N8m 19 CAG TCT CYT CNG CCA TCT C Olarak 1568-1586
2. tur N127 20 ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG S 55-74 845
N829 19 GCC CTG GTT CGA ACA TTC T Olarak 881-899

Tablo 5: Konvansiyonel hemi iç içe PCR için kullanılan astarların açıklaması.

Polimeraz genini hedefleyen hemi iç içe PCR
Adım Döngüsü Sıcaklık Zaman
Birinci ve ikinci turlar İlk denatürasyon 1 94 °C 3 dk
Denatürasyon 35 94 °C 30 s
Melezleşme 56 °C 45 s
Uzama 72 °C 40 s
Son uzama 1 72 °C 3 dk
Nükleoprotein genini hedefleyen hemi iç içe PCR
Adım Döngüsü Sıcaklık Zaman
İlk tur İlk denatürasyon 1 94 °C 3 dk
Denatürasyon 35 94 °C 30 s
Melezleşme 56 °C 30 s
Uzama 72 °C 45 s
Son uzama 1 72 °C 3 dk
İkinci tur İlk denatürasyon 1 94 °C 3 dk
Denatürasyon 35 94 °C 30 s
Melezleşme 58 °C 30 s
Uzama 72 °C 30 s
Son uzama 1 72 °C 3 dk

Tablo 6: Konvansiyonel hemi iç içe PCR için termal bisiklet koşullarının tanımı.

Lab Ülke Değerlendirme dönemi Örneklerin Nb DFAT sonuçları RIDT sonuçları Duyarlılık Özgüllüğü
Pos Negatif Pos Negatif
Laboratuvar 1 Fransa 2015 82 50 32 50 32 96% 93.7%
Laboratuvar 2 Chad 2012-2015 44 33 11 33 11 100% 100%
Laboratuvar 3 Fildişi Sahili 2017 10 8 2 8 2 100% 100%
Laboratuvar 4 Mali 2017 18 15 3 15 3 100% 100%
Laboratuvar 6 İtalya 2016 8 8 0 8 0 100% -
Tüm 2015-2017 162 114 48 114 48 98.2% 95.8%

Tablo 7: RIDT testinin içsel parametrelerinin (duyarlılık, özgüllük) referans DFAT yöntemine göre, toplam 162 numunenin analizi ve 5 farklı laboratuvarın katılımı ile belirlenmesi.

Virüs suşbir Orijinal ana bilgisayar Konum Başlangıç konsantrasyonu (FFU/mL)b Algılama sınırı (FFU/mL)c
9147FRA Kızıl tilki Fransa 3.1 x 107 106.000
Cvs Laboratuvar izole - 1,6 x 107 106.000
8743THA Insan Tayland 8.1 x 107 > 8,1 x 106
9508CZK (SAD) Laboratuvar izole - 5,4 x 108 107 000
Pv Laboratuvar izole - 4,3 x 107 106.000
9001FRA Köpek Fransız Guyanası 2,4 x 106 > 2,4 x 105
9704ARG Yarasa Arjantin 9,5 x 107 105
04030PHI Insan Filipinler 2,5 x 107 105

Tablo 8: RIDT'nin 8 farklı titre kuduz virüsü süspansiyonu kullanarak algılanması nın sınırı (Léchenne ve ark. 201614). bir CVS: Challenge virüs suş, SAD: Sokak Alabama Dufferin, PV: Pasteur virüs. b ML başına floresan odak oluşturan birim (FFU) sayısı. c Şeritüzerinde biriken floresan odak oluşturan birim (FFU) sayısı.

RIDT içinde gerçekleştirilen
Laboratuvar 1 Laboratuvar 2 Kombine
Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam
Viral RNA tespiti Pozitif 18 1 19 26 0 32 44 7 51
Negatif 0 0 0 0 0 3 0 3 3
Toplam 18 1 19 26 0 35 44 10 54

Tablo 9: Laboratuvar koşullarında kullanılan Anigen test şeridinde RT-qPCR ile viral RNA'nın saptanması (Laboratuvar 1), saha koşullarında ve ortam sıcaklığında (Lab 2) veya kombine olarak sevk edilir (Léchenne ve ark. 201614).

Ek Tablo 1: Tablo 7'de sunulan içsel parametrelerinin belirlenmesi için RIDT testi ile test edilen 162 numunenin tanımı. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Discussion

RIDT, ölüm sonrası kuduz tanısı için basit, hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir ve laboratuvar testlerine umut verici bir alan alternatifidir. Özellikle düşük ve orta gelirli ülkelerin ademi merkeziyetçi bölgeleri için böyle bir testin uygulanması, kuduz virüsü yaygınlığının ve yerel ve potansiyel olarak ulusal ölçekte bulaşmasının anlaşılmasını iyileştirecektir. Hızlı beyin numune toplama yöntemi ile kombine edildiğinde (tam nekropsi olmadan), büyük bir avantaj test tamamen saha ortamında, laboratuvar tesislerinden uzakta yapılabilir olmasıdır. Foramen magnum ile toplanan beyin örnekleri test için kullanılabilir, bu nedenle hayvan kafatası tamamen açmak için gerekli değildir. Test gerçekleştirmek ve yorumlamak kolaydır ve özellikle saha gözetim faaliyetleri için uygundur14. RIDT'nin DFAT veya DRIT'e göre diğer avantajları, oda sıcaklığında pozitif ve negatif kontrolve kit depolamasına gerek yoktur. Buna ek olarak, pbs içine seyreltme adımı (1:10) atlanır değiştirilmiş protokol, testi gerçekleştirmek için ekstra reaktifler gerektirmez ve daha fazla alan koşulları altında prosedürü kolaylaştırır.

Önemli bir nokta beyin örneklerinin kalitesidir. Numuneler, şüpheli hayvanın ölümünden sonra mümkün olan en kısa sürede toplanmalı ve test edilmelidir veya bozulmayı önlemek için test ten önce soğuk sıcaklıkta tutulmalıdır. Çürümüş numuneler, sonucu etkileyebileceğinden (yanlış negatif sonuç riski) test edilmemelidir. Beyin örnekleri için zaman içinde RIDT duyarlılık kaybı ile ilgili henüz veri mevcut olmasına rağmen, biz dfat testi32ile karşılaştırıldığında benzer olduğunu varsayılmaktadır. Ancak, test hızlı ve doğrudan alanında yapılabilir gibi ancak, hayvanın ölümü ve test gerçekleştirmek arasındaki süre azaltılabilir. Bu nedenle, genel olarak çürümüş örneklerin daha düşük bir risk vardır.

Protokol içinde bir diğer kritik adım örnek süspansiyon geçişidir. Geçiş, numunenin yatırılmasından (1-5 dk) sonra doğrudan başlamalıdır. Süspansiyonun yüksek viskozitesi bu nedenle göçü olumsuz etkileyebilir. Yavaşça damlalık ile cihaz yatırma sitenin alt çizilme ve 1-2 daha fazla damla ekleyerek genellikle bu sorunu çözer ve geçiş hemen sonra başlar.

Afrika laboratuvarlarında (Çad, Fildişi Sahili ve Mali) yapılan RIDT testlerinin çoğu 30 °C'yi aşan ortam sıcaklığında yapılırken, üretici tarafından önerilen depolama ve kullanım sıcaklığı aralığı 15 °C - 30 °C'dir. Yüksek sıcaklığın RIDT test performansı üzerindeki etkisini tespit etmesek de, daha dikkatli bir şekilde değerlendirmek gerekir. Benzer şekilde, viral RNA tespiti ve genotipleme için kullanımdan sonra cihazın depolanması ve taşınması sırasında yüksek sıcaklığın etkisi ek değerlendirmeye ihtiyaç duyar. RIDT şeridinden RT-qPCR ile viral RNA tespitinin duyarlılığı, başlangıçta testte kullanılan beyin örneğinin kalitesinden değil, kullanımdan sonra RIDT testlerinin depolanması durumundan da etkilenebilir. Örneğin, ridt testleri kontrollü laboratuvar koşullarında depolandığında RNA tespiti duyarlılığı daha yüksekti (%94.7) alan koşulları (örneğin, Çad) (%81,2)14. Bu koşullar aynı zamanda şerit üzerinde sabit RNA bütünlüğünü (özellikle uzunluğu) etkileyebilir, muhtemelen daha uzun PCR amplicons dayalı genotipleme için ılımlı hassasiyeti açıklayan (örneğin, >500 nükleotidler)14. Test şeridinde yapılan RT-qPCR hassasiyeti FTA Whatman kartları (%80.6)14kullanılarak elde edilenden daha düşüktü. Diğer moleküler tekniklere benzer şekilde, viral yük de düşük viral yük14olan örnekler için potansiyel negatif sonuçlar ile, RDIT şeritler dayalı genotipleme başarısını etkileyebilir.

Test şu anda rutin tanı ve hastalık gözetimi için WHO ve OIE tarafından tavsiye edilmez ve bir sonuç PEP karar verme rehberlik etmek için kendi başına kullanılamaz. Daha fazla test doğrulama hala gereklidir. Ancak, doğru hızlı kuduz tanısı iyi işleyen sürekli kuduz gözetim sistemlerinin önemli bir unsurudur ve başarılı sürdürülebilir kuduz kontrolü için son derece önemli olan siyasi bağlılığı artırmak için araçtır33. RIDT testleri bu bağlamda yeni kuduz tanı olanakları sunmakta ve düşük veya orta gelirli enzootik alanlarda hayvan kuduz gözetimini genişletmek için yararlı bir araçtır.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Küresel Aşı ve Bağışıklama İttifakı (GAVI), Wolfermann Nägeli Vakfı, İsviçre Afrika Araştırma İşbirliği Vakfı (SARECO), SWF Stiftung für wissenschaftliche Forschung, Freiwillige Akademische Gesellschaft (FAG) Basel, Asya ile İsviçre İkili Bilim ve Teknoloji İşbirliği Programı ve Biyomedikal araştırmalar için Novartis Vakfı aracılığıyla desteklenmiştir.

Özellikle köpek sahiplerine, veteriner personeline ve laboratuvar personeline büyük bağlılıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca lisa Crump'a dil düzenlemesi için teşekkür etmek istiyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (lyophilizied, adsorbed) Bio-Rad, France 3572112 Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) conjugated polyclonal antibody against the nucleocapsid of rabies virus. Use for the DFAT reference tecnnique.
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems, France 4351104 Amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
Disposable plastic pipette, drinking straw, clamp, dropper - - Equipment used for the collection of the brain stem (medulla oblongata) via the foramen magnus (occipital route).
Evans Blue Solution 1% Bio-Rad, France 3574911 Counter-coloration used for the DFAT to facilite the reading under UV microscope.
Primer eGFPF1 Eurofins Genomics, Germany - Forward primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2 Eurofins Genomics, Germany - Reverse primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong Eurofins Genomics, Germany - Reverse primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-ATGAGAAGTGG
AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long Eurofins Genomics, Germany - Forward primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GATCTGTCTGAA
TAATAGAYCCARG-3'.
Probe eGFP FAM/TAMRA Eurofins Genomics, Germany - Forward primer for the amplification of the internal control by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGCACCCAGT
CCGCCCTGAGCA-3'.
Probe RABV4 FAM/TAMRA Eurofins Genomics, Germany - Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AACACYTGATCBA
GKACAGARAAYACATC-3'.
Probe RABV5 FAM/TAMRA Eurofins Genomics, Germany - Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGRGTGTTTTCYAG
RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Rapid Rabies Ag Test Kit BioNote Inc., Republic of Korea RG18-01DD Rapid immunochromatographic diagnostic test (RIDT, also named lateral flow device or LFD) for the post-mortem diagnosis of rabies.
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega, USA N2515 Enzyme used with the kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit Invitrogen, France 11732-020 Kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
TRIzol Reagent Invitrogen, France 15596026 Phenol/chloroforme based total RNA extraction using the cellulose membrane of the RIDT.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hampson, K., et al. Correction: Estimating the Global Burden of Endemic Canine Rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (5), e0003786 (2015).
  2. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
  3. Walker, P. J., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae. The Journal of General Virology. 99, (4), 447-448 (2018).
  4. World Health Organization (WHO). WHO Expert Consultation on Rabies, third report. HO Technical Report Series, No. 1012. Geneva. Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO (2018).
  5. Dacheux, L., et al. More Accurate Insight into the Incidence of Human Rabies in Developing Countries through Validated Laboratory Techniques. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4, (11), e765 (2010).
  6. Welburn, S. C., Beange, I., Ducrotoy, M. J., Okello, A. L. The Neglected Zoonoses - The Case for Integrated Control and Advocacy. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. (2015).
  7. Dacheux, L., Bourhy, H. Diagnostic tests for human rabies. Revue Scientifique Et Technique (International Office of Epizootics). 37, (2), 581-593 (2018).
  8. World Organisation for Animal Health. OIE Terrestrial Manual - Rabies (Infection with rabies virus and other Lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf (2018).
  9. Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Lumlertdacha, B., Sitprija, V. Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test. Journal of Clinical Microbiology. 38, (8), 3098-3099 (2000).
  10. Kang, B., et al. Evaluation of a rapid immunodiagnostic test kit for rabies virus. Journal of Virological Methods. 145, (1), 30-36 (2007).
  11. Nishizono, A., et al. A simple and rapid immunochromatographic test kit for rabies diagnosis. Microbiology and Immunology. 52, (4), 243-249 (2008).
  12. Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Huadsakul, S., Boonchang, S., Sitprija, V. Evaluation of a rapid immunochromatographic test strip for detection of Rabies virus in dog saliva samples. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 23, (6), 1197-1201 (2011).
  13. Ahmed, K., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based rapid immunochromatographic test for direct detection of rabies virus in the brain of humans and animals. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86, (4), 736-740 (2012).
  14. Léchenne, M., et al. Validation of a Rapid Rabies Diagnostic Tool for Field Surveillance in Developing Countries. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, (10), e0005010 (2016).
  15. Yang, D. K., et al. Comparison of four diagnostic methods for detecting rabies viruses circulating in Korea. Journal of Veterinary Science. 13, (1), 43-48 (2012).
  16. Markotter, W., et al. Evaluation of a rapid immunodiagnostic test kit for detection of African lyssaviruses from brain material. The Onderstepoort Journal of Veterinary Research. 76, (2), 257-262 (2009).
  17. Reta, T., et al. Evaluation of Rapid Immunodiagnostic Test for Rabies Diagnosis Using Clinical Brain Samples in Ethiopia. Journal of Veterinary Science & Medical Diagnosis. 2, (3), 1-3 (2013).
  18. Servat, A., Picard-Meyer, E., Robardet, E., Muzniece, Z., Must, K., Cliquet, F. Evaluation of a Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for the detection of rabies from brain material of European mammals. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 40, (1), 61-66 (2012).
  19. Certoma, A., et al. Assessment of a Rabies Virus Rapid Diagnostic Test for the Detection of Australian Bat Lyssavirus. Tropical Medicine and Infectious Disease. 3, (4), (2018).
  20. Ahmad, A., Singh, C. K. Comparison of rapid immunodiagnosis assay kit with molecular and immunopathological approaches for diagnosis of rabies in cattle. Veterinary World. 9, (1), 107-112 (2016).
  21. Sharma, P., Singh, C. K., Narang, D. Comparison of immunochromatographic diagnostic test with Hheminested Reverse transcriptase polymerase chain reaction for detection of rabies virus from brain samples of various species. Veterinary World. 8, (2), 135-138 (2015).
  22. Voehl, K. M., Saturday, G. A. Evaluation of a rapid immunodiagnostic rabies field surveillance test on samples collected from military operations in Africa, Europe, and the Middle East. U.S. Army Medical Department Journal. 27-32 (2014).
  23. Servat, A., Robardet, E., Cliquet, F. An inter-laboratory comparison to evaluate the technical performance of rabies diagnosis lateral flow assays. Journal of Virological Methods. 272, 113702 (2019).
  24. Eggerbauer, E., et al. Evaluation of Six Commercially Available Rapid Immunochromatographic Tests for the Diagnosis of Rabies in Brain Material. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, (6), e0004776 (2016).
  25. Barrat, J. Simple technique for the collection and shipment of brain specimens for rabies diagnosis. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. World Health Organization. 425-432 (1996).
  26. Dacheux, L., et al. Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, (7), e0004812 (2016).
  27. Dacheux, L., et al. A reliable diagnosis of human rabies based on analysis of skin biopsy specimens. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 47, (11), 1410-1417 (2008).
  28. Application of next generation sequencing to rabies virus and other lyssaviruses. Laboratory techniques in rabies. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 49-61 (2019).
  29. Conventional pan-lyssavirus reverse transcriptase polymerase chain reaction. Laboratory techniques in rabies. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 1-16 (2019).
  30. Rabies real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Laboratory techniques in rabies. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 17-34 (2019).
  31. Talbi, C., et al. Evolutionary history and dynamics of dog rabies virus in western and central Africa. The Journal of General Virology. 90, (Pt 4), 783-791 (2009).
  32. McElhinney, L. M., Marston, D. A., Brookes, S. M., Fooks, A. R. Effects of carcase decomposition on rabies virus infectivity and detection. Journal of Virological Methods. 207, 110-113 (2014).
  33. Vigilato, M. A. N., et al. Progress towards eliminating canine rabies: policies and perspectives from Latin America and the Caribbean. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 368, (1623), 20120143 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics