Teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido pós-morte de campo para configurações limitadas de recursos com outras aplicações moleculares

Immunology and Infection
JoVE Journal
Immunology and Infection
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Summary

Apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte da raiva animal em condições de campo usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Também descrevemos outras aplicações usando o dispositivo para análise molecular e genotipagem viral.

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Mauti, S., Léchenne, M., Naïssengar, S., Traoré, A., Kallo, V., Kouakou, C., Couacy-Hymann, E., Gourlaouen, M., Mbilo, C., Pyana, P. P., Madaye, E., Dicko, I., Cozette, P., De Benedictis, P., Bourhy, H., Zinsstag, J., Dacheux, L. Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications. J. Vis. Exp. (160), e60008, doi:10.3791/60008 (2020).

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Abstract

Os sistemas funcionais de vigilância da raiva são cruciais para fornecer dados confiáveis e aumentar o compromisso político necessário para o controle de doenças. Até o momento, animais suspeitos de raiva positivo devem ser submetidos a uma confirmação pós-morte usando métodos de laboratório clássicos ou moleculares. No entanto, a maioria das áreas endêmicas está em países de baixa e média renda, onde o diagnóstico de raiva animal é restrito a laboratórios veterinários centrais. A baixa disponibilidade de infraestrutura de vigilância leva a subnotificações de doenças graves de áreas remotas. Vários protocolos diagnósticos que exigem baixa experiência técnica foram desenvolvidos recentemente, proporcionando oportunidade de estabelecer o diagnóstico de raiva em laboratórios descentralizados. Apresentamos aqui um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte de campo da raiva animal usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Completamos o protocolo descrevendo um novo uso do dispositivo para análise molecular e genotipagem viral. RIDT detecta facilmente vírus da raiva e outros lyssavírus em amostras cerebrais. O princípio desses testes é simples: o material cerebral é aplicado em uma tira de teste onde anticorpos conjugados de ouro se ligam especificamente aos antígenos da raiva. Os complexos de anticorpos de antígeno se ligam ainda mais a anticorpos fixos na linha de teste, resultando em uma linha roxa claramente visível. O vírus é inativado na tira de teste, mas o RNA viral pode ser posteriormente extraído. Isso permite que a tira de teste, em vez da amostra cerebral infecciosa, seja enviada com segurança e facilidade para um laboratório equipado para confirmação e digitação molecular. Com base em uma modificação do protocolo do fabricante, encontramos maior sensibilidade ao teste, atingindo 98% em comparação com o método de referência padrão ouro, o teste de anticorpos de imunofluorescência direta. As vantagens do teste são inúmeras: rápida, fácil de usar, baixo custo e sem necessidade de infraestrutura laboratorial, como microscopia ou conformidade em cadeia fria. Os RIDTs representam uma alternativa útil para áreas onde os métodos de diagnóstico de referência não estão disponíveis.

Introduction

A raiva canina é a principal causa da raiva humana, responsável globalmente por aproximadamente 59.000 mortes humanas por ano, quase todas ocorrendo em países de baixa e média renda (LMICs) na Ásia e África1. O principal agente etiológico é um vírus da raiva clássica associado ao canino neurotrópico (RABV, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus, espécie lyssavirus antirraiva). No entanto, outros lyssavírus relacionados à raiva, em sua maioria circulando em espécies de morcegos, também causam a doença2,3. Nas regiões afetadas, a vigilância e o controle de doenças são frequentemente dificultados pelo baixo compromisso político, provavelmente devido à falta de dados confiáveis4,,5,6. Uma das razões para a subnotificação da doença é a ausência de diagnóstico laboratorial, devido, em parte, ao acesso limitado a laboratórios equipados e equipe treinada, bem como as dificuldades de envio dos espécimes. O diagnóstico laboratorial é necessário para confirmar os casos de raiva e, além disso, permite a caracterização genética das cepas envolvidas, fornecendo insights sobre a transmissão do vírus no nível regional4,,5,7.

Os padrões atuais de ouro para o diagnóstico de raiva pós-morte, aprovados tanto pela Organização Mundial da Saúde (OMS) quanto pela Organização Mundial para a Saúde Animal (OIE), são o teste de anticorpos fluorescentes diretos (DFAT), o teste de imunohistoquímica rápida direta (DRIT) e métodos moleculares (por exemplo, reação em cadeia de transcriptação reversa (RT-PCR))4,8. No entanto, a aplicação adequada em LMICs permanece limitada devido a instalações laboratoriais inadequadas com fornecimento de energia inconsistente, transporte amostral não legal e falta de um sistema de gestão da qualidade. Como o diagnóstico de raiva animal é normalmente realizado apenas em laboratórios veterinários centrais em LMICs, os dados de vigilância existentes refletem principalmente a situação da raiva em áreas urbanas.

Alternativas diagnósticas de baixa tecnologia recentemente desenvolvidas oferecem oportunidades para estabelecer o diagnóstico da raiva em áreas remotas e laboratórios de raiva descentralizados4,,8,9. O teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT) é um teste de fluxo lateral baseado na imunocromatografia utilizando anticorpos detectores conjugados de ouro e é uma ferramenta de diagnóstico antirrábica muito promissora10,,11,,12,13. O princípio é simples: após a diluição, o material cerebral é misturado no tampão fornecido, e algumas gotas são aplicadas na tira de teste onde anticorpos monoclonais conjugados de ouro se ligam especificamente aos antígenos da raiva, principalmente as nucleoproteínas(Figura 1). Os complexos de anticorpos de antígeno passam então por migração lateral de fluxo, vinculando-se na linha de teste (linha T) a anticorpos fixos contra antígenos da raiva, resultando em uma linha roxa claramente visível. Os anticorpos conjugados de ouro restantes não ligados aos antígenos da raiva continuam migrando e se fixando na membrana através de anticorpos de alvo adicionais, resultando em uma linha de controle roxo claramente visível (linha C).

O método de um passo e baixo custo é rápido, extremamente fácil e não requer equipamentos caros ou condições especiais de armazenamento. Com a modificação do protocolo do fabricante para eliminar a etapa de diluição, quase todos os equipamentos e reagentes necessários para realizar o teste estão incluídos no kit14. O resultado é lido após 5-10 minutos sem um microscópio. Esta é uma grande vantagem sobre o teste DFAT, que requer um microscópio de fluorescência e conjugado de imunofluorescência, juntamente com transporte refrigerado e armazenamento de amostras. Mesmo o teste DRIT, que pode ser realizado usando um microscópio leve, requer uma cadeia de frio contínua para armazenar os anticorpos antirraiva, que também ainda não estão disponíveis comercialmente. Em comparação com o DRIT, o RIDT não requer produtos químicos tóxicos, uma vantagem particular em países onde o descarte de resíduos é mal regulado. O teste rápido é menos demorado com interpretação muito mais fácil em comparação com os testes padrão-ouro DFAT e DRIT. Isso permite testes no local por pessoal com conhecimento técnico limitado.

Com base nessas propriedades de teste, torna-se viável o diagnóstico imediato de animais suspeitos em áreas remotas, facilitando a implementação de profilaxia pós-exposição (PEP) para pessoas expostas o mais rápido possível. Além disso, o transporte à distância de amostras de raiva não é necessário, resultando em melhor qualidade amostral no momento do teste. No entanto, os resultados obtidos com os testes RIDT devem ser confirmados atualmente por meio de um teste de diagnóstico de referência, como DFAT ou DRIT.

Foram avaliadas técnicas de RIDT para detecção de RABV e outros lyssavírus. Um dos primeiros estudos foi conduzido por pesquisadores coreanos em 200710. Em comparação com o método DFAT, em 51 amostras de animais e 4 isolados de RABV, o RIDT apresentou sensibilidade e especificidade de 91,7% e 100%, respectivamente. Esses resultados foram posteriormente confirmados com 110 amostras cerebrais animais da Coreia, com sensibilidade e especificidade, em comparação com a DFAT, de 95% e 98,9%,respectivamente 15. Mais recentemente, outros estudos avaliaram o desempenho deste RIDT usando isolados de vírus e/ou amostras cerebrais infectadas de vários animais com diferentes origens geográficas. Um painel de 21 amostras, incluindo rabv africano e outros lyssavírus africanos (vírus Duvenhage (DUVV), vírus morcego de Lagos (LBV) e vírus Mokola (MOKV)), foram detectados com sucesso, com sensibilidade de 100% em comparação com o DFAT16. Sensibilidade alta similar (96,5%) e especificidade (100%) os valores foram obtidos a partir de um painel de 115 amostras cerebrais da Etiópia17. Outro estudo avaliou isolados europeus de RABV, dois outros lyssavírus europeus (europeus bat lyssavirus tipo 1 (EBLV-1) e tipo 2 (EBLV-2)) e o lyssavírus de morcego australiano (ABLV)18. Com base na análise de 172 amostras cerebrais animais, o kit RIDT teve 88,3% de sensibilidade e 100% de especificidade em relação ao DFAT, e os três lyssavírus relacionados à raiva foram detectados com sucesso. Neste estudo, alguns dos resultados falsos negativos vieram de amostras cerebrais armazenadas no tampão de glicerol, sugerindo que a remoção inadequada do glicerol influenciou o fluxo capilar ou a ligação de anticorpos. Uma análise recente de 43 amostras clínicas de morcegos australianos confirmou resultados anteriores de testes, com total concordância com DFAT19. Dois estudos foram realizados na Índia utilizando o RIDT em um número limitado de amostras clínicas (11 e 34 amostras). Em relação ao DFAT, a sensibilidade ficou entre 85,7% e 91,7% e a especificidade foi de 100%20,21. Outra avaliação deste kit utilizando 80 amostras cerebrais animais da África, Europa e Oriente Médio obteve total concordância com a DFAT para especificidade (100%) mas maior sensibilidade (96,9%) em comparação com os estudos anteriores22. Em recente comparação inter-laboratorial deste RIDT realizado em 22 laboratórios diferentes utilizando um painel de 10 amostras, a concordância global foi de 99,5%23.

Apenas um estudo multicêntrico recente mostrou desempenho total de RIDT insatisfatório24. Amostras de três diferentes conjuntos de dados foram testadas e forneceram sensibilidade variável e valores de especificidade em comparação com a DFAT. Por exemplo, sensibilidade e especificidade obtidas com o primeiro painel (n=51) e o segundo painel (n=31) de amostras de animais infectados experimentais, todas testadas em laboratório A, deram sensibilidade de 16% e 43%, respectivamente, enquanto a especificidade foi de 100% para ambos. Por outro lado, os resultados do terceiro painel (n=30) de amostras clínicas de campo analisadas pelo laboratório B proporcionaram uma concordância completa com os resultados da DFAT, que foi quase completamente confirmada pelo laboratório A (85% de sensibilidade e 100% de especificidade). A variação em lote a lote foi sugerida como uma possível explicação para a sensibilidade relativamente baixa flutuante com ridt24.

Ao mesmo tempo, outro estudo realizou um processo de validação semelhante do ridt descrito acima, com uma modificação do protocolo recomendado pelo fabricante14. A etapa de pré-diluição (1:10) na PBS foi omitida durante a preparação do material cerebral. Com base neste protocolo modificado mais simples, os autores obtiveram sensibilidade e especificidade de 95,3% e 93,3%, respectivamente, em comparação com o DFAT por meio de testes, em condições laboratoriais, um conjunto de dados de 73 amostras cerebrais animais, infectadas de forma natural ou experimental com várias cepas de RABV. O estudo apresentou a primeira avaliação deste RIDT em um ambiente de campo (Chade, África). Em 48 amostras clínicas do cérebro, sensibilidade e especificidade foram de 94,4% e 100%, respectivamente. As discrepâncias entre DFAT e RIDT foram decorrentes de resultados falsos positivos com DFAT, determinados após confirmação com RT-PCR. Quando esses resultados foram excluídos, houve total concordância, e demonstrou que o RIDT era mais confiável que o DFAT nessas condições de campo14. Não foi observada variação em lote a lote utilizando-se o protocolo modificado. Quando o protocolo modificado foi aplicado a um pequeno número de amostras divergentes DFAT/RIDT (n=8) no estudo de Eggerbauer et al.24, todos foram encontrados concordantes (100% de sensibilidade).

Outra grande vantagem do RIDT é o uso secundário para detectar RNA viral fixado na tira usando técnicas moleculares (como RT-PCR) e genotipagem subsequente14,24. Após uma etapa de extração, Léchenne et al.14 demonstraram RNA viral fixado na membrana do dispositivo Anigen usando RT-PCR com sensibilidade de 86,3% em um painel de 51 amostras (incluindo 18 amostras testadas e enviadas do Chade à temperatura ambiente). A genotipagem subsequente foi possível em 93% das 14 amostras testadas. Foram utilizados sequenciamento sanger de amplicons PCR de pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento. Além dos isolados do RABV, o teste detectou outras quatro espécies de lyssavirus, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 e Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), durante um teste intersetório internacional totalmente concordante14. A sensibilidade da detecção viral de RNA foi ainda maior (100%) no estudo de Eggerbauer et al., com base no exame de amostras laboratoriais24. Este último estudo também demonstrou que o buffer usado no kit RIDT inativado vírus. Assim, os dispositivos podem ser enviados facilmente, à temperatura ambiente sem precauções específicas de biossegurança para laboratórios de referência, para confirmação molecular e genotipagem.

Com base nas avaliações anteriores, as ferramentas RIDT oferecem inúmeras vantagens para uso em configurações de campo, especialmente quando as técnicas de diagnóstico de referência não estão disponíveis. No entanto, este teste também tem algumas limitações, em particular, baixa sensibilidade da detecção de antígeno14,24. O teste é aplicável para amostras contendo altas quantidades de antígenos virais, como amostras cerebrais. No entanto, não é apropriado para outras amostras, como saliva ou outros fluidos corporais. Outra desvantagem é o custo do dispositivo (cerca de 5-10 Euros na Europa), que é menos caro em comparação com o custo de execução de DFAT, RT-PCR ou DRIT, mas que ainda permanece alto para LMICs. No entanto, o desenvolvimento futuro e a validação de RIDTs semelhantes de outras empresas podem levar a uma queda de preços. Um estudo relatou variações em lote. Embora não relatados por outros, controles rigorosos de qualidade devem, no entanto, ser realizados ao testar um novo lote, como para qualquer reagente utilizado em um ambiente de gestão da qualidade. O uso do protocolo modificado não foi alterado ao utilizar diferentes lotes14. Todos, exceto um estudo, demonstraram que a sensibilidade do RDIT foi elevada em relação ao DFAT (em torno de 90%-95%). Como a raiva é sempre fatal, ainda é fortemente recomendado confirmar quaisquer resultados negativos com RDIT usando um teste de diagnóstico de referência como DFAT, DRIT ou RT-PCR14.

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte de campo da raiva animal com base em um exemplo de RIDT comercializado, desde a coleta de amostras cerebrais até a aplicação de um protocolo modificado em comparação com as recomendações do fabricante (que foram previamente validadas14) e análise molecular subsequente. Este protocolo foi aplicado e validado muitas vezes sob condições de campo na África Ocidental e Central, onde o RIDT era usado rotineiramente para o diagnóstico de raiva ao lado do teste DFAT. Além disso, demonstramos uma segunda aplicação para o dispositivo, em configurações laboratoriais, para extração e detecção usando RT-PCR de RNA viral fixado no dispositivo.

Protocol

1. Coleta de amostras através do foramen magnum (rota occipital)25

NOTA: Esta técnica pode ser implementada em condições laboratoriais ou em ambientes de campo. As amostras devem ser processadas o mais rápido possível após a morte do animal suspeito ou mantidas em temperatura fria (refrigerada ou congelada, se possível) para evitar a decomposição que possa afetar os resultados. Semelhante a outras técnicas de referência baseadas na detecção de antígenos lyssavírus, como DFAT e DRIT, amostras decompostas não devem ser testadas porque podem afetar o resultado (risco de resultado falso negativo).

ATENÇÃO: Todas as amostras devem ser consideradas potencialmente infecciosas. As normas e procedimentos de segurança devem ser rigorosamente seguidos, mesmo nos ajustes de campo4. Em particular, use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo máscara, óculos, luvas e um jaleco. Use desinfetante adequado para descontaminaçãos materiais e amostrais (por exemplo, hipoclorito de sódio com diluições recomendadas do fabricante, 70% de álcool - etanol ou isopropanol, solução de sabão de 1%). Todas as amostras de manuseio de pessoal devem ser vacinadas contra raiva.

  1. Remova a cabeça do animal com uma faca antes da primeira vértebra cervical (vértebra atlas) para acessar o foramen magnum.
    NOTA: Para minimizar o aerossol infeccioso, evite usar uma serra manual ou uma ferramenta semelhante.
  2. Coletar amostra de brainstem (medulla oblongata) utilizando uma pipeta de plástico descartável(Figura 2A),um canudo de beber(Figura 2B),um grampo(Figura 2C) ou um conta-gotas (fornecido com o RIDT)(Figura 2D).
    NOTA: Deve-se prestar atenção especial na coleta da amostra, pois é um passo muito importante para a confiabilidade dos resultados. Além do vídeo associado que mostra de forma simples como coletar a parte do tronco cerebral de interesse, uma etapa de treinamento é altamente recomendada para ter certeza de coletar a seção anatômica correta.
  3. Opcionalmente e além do tronco cerebral (medulla oblongata), coletar outras partes do tronco cerebral ou do cérebro (cerebelo, hipocampo, tálamo e córtex) pela mesma rota occipital empurrando e girando a pipeta de plástico ou palha em direção à órbita ocular(Figura 3).
  4. Se usar um canudo ou pipeta, esprema-a suavemente para depositar a amostra cerebral (0,5-2 g) em um tubo para análise subsequente e/ou biobanco.
    NOTA: O armazenamento de amostras em glicerol não é recomendado, pois parece afetar o fluxo capilar ou a etapa de ligação de anticorpos do RIDT18.

2. Execução do protocolo RIDTmodificado 14

NOTA: Esta modificação omite uma etapa de diluição (1:10) em PBS, conforme especificado no protocolo do fabricante (todas as versões), e pode ser implementada em configurações laboratoriais ou de campo.

  1. Use o cotonete/conta-gotas para coletar o equivalente a meio amendoim ou ervilha (0,1-0,5 g) do material cerebral e coloque-o no tubo de amostra tampão.
    NOTA: Para o protocolo modificado, todos os reagentes/consumíveis estão incluídos no kit (não é necessário PBS ou tubo adicional)(Figura 4). Documente o número do lote do kit e verifique a validade da data de validade.
  2. Esmague cuidadosamente o material cerebral diretamente no tubo com o cotonete ou o caixa de dados por cerca de 30 s até que uma suspensão homogênea seja obtida.
    NOTA: A reação do buffer inativa a infectividade do vírus nas condições do protocolo24do fabricante .
  3. Usando o conta-gotas, deposite quatro gotas (aproximadamente 100 μL) da suspensão na entrada da amostra no dispositivo de teste.
  4. Aguarde a migração completa da amostra (1-5 min) antes de ler o dispositivo de teste. A migração deve começar rapidamente após o depósito da amostra (1-5 min).
  5. Em caso de atraso (devido à suspensão de alta viscosidade) ou para acelerar o início da migração, arranhe suavemente a parte inferior do local de depósito do dispositivo com o conta-gotas (1-5 vezes) e eventualmente adicione mais 1-2 gotas. A migração deve começar imediatamente depois disso.
  6. Leia o resultado do teste na janela de detecção após 5-10 min, e não mais do que 20 min, após o fim da migração.
  7. Interprete o resultado com base na presença ou ausência da linha de controle (linha C) e da linha de teste (linha T) (linhas roxas) na janela de detecção, de acordo com a Figura 5. Considere a amostra positiva quando duas linhas estiverem visíveis(Figura 5A),negativas se apenas a linha C estiver presente(Figura 5B) e inválidas se apenas a linha T estiver presente ou se nenhuma linha estiver visível(Figura 5C).
    NOTA: Os resultados inválidos devem ser repetidos pelo menos uma vez. Outras técnicas devem ser realizadas se os resultados permanecerem inválidos. Os resultados negativos obtidos com ridt precisam ser confirmados posteriormente usando um método de referência padrão ouro, como DFAT, DRIT e métodos moleculares (reação em cadeia de polimerase ou PCR). Embora a sensibilidade deste teste seja alta (veja resultados representativos), não é 100%.
  8. Armazene dispositivos usados à temperatura ambiente ou leve à geladeira/congele quando possível, para análise molecular subsequente (ver seção 4). Congele a suspensão restante da amostra a -20 °C/-80 °C no tubo tampão para repetir o teste, se necessário ou para análise molecular subsequente.

3. Extração e detecção de RNA por RT-qPCR do dispositivo RIDT

NOTA: Esta etapa só pode ser implementada em condições laboratoriais com ambiente adaptado e equipamentos adequados para diagnóstico molecular. Pode ser feito logo após o teste RIDT ou retrospectivamente em dispositivos RIDT arquivados, armazenados à temperatura ambiente (15-30 °C), refrigerados ou congelados.

  1. Extração de RNA
    NOTA: Para monitorar a etapa de extração, recomenda-se usar um controle interno que pode ser um mRNA endógeno (como ß-actin) ou um controle exógeno (como o RNA sintético eGFP) cravado diretamente na amostra durante os primeiros passos da extração26,,27.
    1. Abra cuidadosamente o dispositivo e remova o papel do filtro.
    2. Corte a área de depósito da amostra e coloque-a em um tubo contendo 1 mL de Tri-Reagente LS. Incubar em RT por 1 hora com suave agitação manual regular.
    3. Realizar a extração de acordo com as recomendações do fabricante, conforme descrito anteriormente27. Nesta etapa, o controle interno exógeno pode ser adicionado.
    4. Durante o processo, adicione 2 μL de glicogênio para facilitar a precipitação do RNA, de acordo com as recomendações do fabricante.
    5. Ajuste o volume final para ressuspensão de RNA em água sem nuclease, com um volume de 50 μL geralmente utilizado.
      NOTA: Ao final da etapa de centrifugação para separação de fase aquosa e orgânica (após a adição de 200 μL de clorofórmio no Tri-Reagente LS), a peça de membrana do dispositivo estará na parte inferior do tubo e não interferirá na coleta da fase aquosa superior. Alternativamente, outros protocolos fáceis e rápidos podem ser usados, por exemplo, usando reagentes à base de fenol e membranas de sílica28.
  2. Detecção por RT-qPCR26
    NOTA: A detecção de RNA viral potencial presente em amostras extraídas pode ser feita usando diferentes técnicas moleculares, como PCR de transcrição reversa, PCR convencional (ponto final) ou PCR em tempo real (qPCR). Vários métodos estão disponíveis, tais como RT-PCR27,,29 ou RT-qPCR26,,30 visando o gene nucleoproteína viral ou polimerase. Um exemplo será apresentado abaixo com base em um pan-lyssavirus RT-qPCR combinado duplo visando uma região conservada entre a polimerase viral. Esta técnica RT-qPCR associa dois RT-qPCR diferentes: um baseado na tecnologia de sonda TaqMan (pan-RABV RT-qPCR) e o outro usando a detecção SyBR Green (pan-lyssa RT-qPCR). Além disso, a detecção de um controle interno exógeno (eGFP RNA) diretamente cravado durante o processo de extração é feita por um RT-qPCR baseado em sonda TaqMan específico (eGFP RT-qPCR). A validação cuidadosa no local das técnicas moleculares selecionadas para detecção de RNA viral é importante, em particular, verificar se os primers e os testes para RT-PCR em tempo real são adaptados para detecção das cepas que circulam na região de interesse4.
    1. Diluir a amostra de RNA para 1:10 em água livre nuclease. Teste cada amostra de RNA em duplicata, usando uma placa de reação de 96 poços ou outros formatos. Use controles positivos e negativos para cada ensaio e teste pelo menos em duplicata.
    2. Prepare a solução de reação de mix mestre para os três ensaios rt-qPCR diferentes de acordo com a Tabela 1, e com os primers/sondas indicados na Tabela 2.
    3. Adicione 5 μL de amostras de RNA diluídas e 15 μL de mistura mestre a cada um dos três ensaios diferentes. O ensaio pan-RABV RT-qPCR e o ensaio eGFP RT-qPCR podem pedalar na mesma placa.
    4. Execute os diferentes ensaios seguindo as condições de ciclismo térmico indicadas na Tabela 3. Se apenas um ciclofairicamente PCR estiver disponível, comece com o pan-RABV RT-qPCR e mantenha a placa para a pan-lyssa RT-qPCR a 4 °C até o final do pan-RABV RT-qPCR.
    5. Analisar os resultados obtidos com os três ensaios de acordo com a Tabela 4.

4. Genotipagem após extração de RNA do dispositivo RIDT

  1. Transcrição reversa RT27,29
    1. Prepare uma mistura mestre com 6 μL de RNA, 2 μL de primers aleatórios pd(N)6 (200 μg/μL) e 2 μL de água sem nuclease para um volume final de 10 μL.
    2. Incubar a 65 °C por 10 minutos em um bloco de calor e depois armazenar no gelo.
    3. Prepare uma mistura mestre com 6 μL de 5x First-Strand Buffer, 2 μL de 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 μL (200 U) de transcriptase reversa Superscript II, 2 μL (80 U) de RNasin, 2 μL de mix dNTP (10 μM) e completa com água sem nuclease para obter um volume final de 20 μL para cada amostra.
    4. Adicione a mistura mestre (20 μL) à amostra (10 μL) (volume final de 30 μL) e incubar a 42 °C por 90 min em um bloco de calor.
    5. Prossiga para a próxima etapa com amplificação PCR ou armazene o cDNA a -20 °C.
  2. PCR convencional27,,29,31
    NOTA: Diferentes técnicas de PCR convencional estão disponíveis para genotipagem. Dois são apresentados, ambos hemi-aninhados PCR, visando uma parte da nucleoproteína ou uma parte da proteína viral do lyssavirus. O protocolo é o mesmo para cada um desses ensaios, exceto para os primers e condições de ciclismo. Controles positivos (RNA positivos) e negativos (cDNA negativo e/ou água sem nuclease) devem ser incluídos em cada série e em cada rodada de PCR.
    1. Prepare-se para cada amostra em um microtubo de 0,2 mL uma solução de reação de mix mestre para a primeira etapa pcr. Esta mistura contém 5 μL de 10x NH4 Reaction Buffer, 2,5 μL de solução MgCl2 (50 mM), 1 μL de dNTP Mix (10 μM), 1 μL de cada primer (10 μM), 0,2 μL (1 U) de polimerase de DNA biotaq e 37,3 μL de água sem nuclease (volume final de 48 L). Os primers estão indicados na Tabela 5.
    2. Adicione 2 μL de cDNA em cada tubo e ciclo em um ciclo térmico PCR convencional separado para cada ensaio, de acordo com a Tabela 6.
    3. Prepare uma segunda solução de reação de mix mestre idêntica à anterior com o uso dos primers apropriados(Tabela 5) para a reação pcr de hemi-aninhada.
    4. Adicione 2 μL do produto PCR da primeira rodada e ciclo em um ciclo térmico PCR convencional usando os parâmetros de ciclismo indicados na Tabela 6.
    5. Visualize os diferentes produtos PCR (PCR primeira e segunda rodada) depois de carregá-los em um gel de 1% de agarose (100 mL de tampão EDTA tris-acetato 1x - TAE 1x) com brometo de etídio (concentração final em torno de 0,01%) e executar o gel durante 30 min a 120 V. Um resultado positivo de PCR é observado na forma de uma faixa brilhante do tamanho esperado(Tabela 5).
  3. Sequenciamento de sanger
    1. Realize um sequenciamento Sanger dos amplicons obtidos com o PCR de hemi-aninhado pan-lyssavirus e complete a análise de genotipagem.

Representative Results

Como em qualquer método de diagnóstico, a coleta de amostras é de suma importância para a confiabilidade dos resultados, especialmente quando realizada em ambientes de campo. O processo de coleta precisa ser o mais simples possível para garantir a coleta de amostras de alta qualidade. A coleta de uma biópsia cerebral (tronco cerebral com medulla oblongata) através da rota foramen magnum para diagnóstico pós-morte da raiva animal cumpre esse requisito, conforme indicado na Figura 2A-D25.

Após a coleta, a amostra cerebral é submetida ao protocolo modificado do RIDT, resumido na Figura 6. Conforme indicado na seção Protocolo, a maior adaptação do fabricante desde que o protocolo seja a omissão da etapa de diluição na PBS, que simplifica o procedimento e os materiais/reagentes necessários, todos incluídos no kit (Figura 4).

Este protocolo modificado foi implementado e avaliado em cinco laboratórios diferentes, incluindo um centro colaborativo da OMS sobre raiva (Lab 1, França), um centro de referência da FAO para raiva (Lab 5, Itália) e três laboratórios de referência localizados em países africanos enzoóticos, Chad (Lab 2), Costa do Marfim (Lab 3) e Mali (Lab 4). No Chade, foi feita uma avaliação do RIDT tanto em ambientes de laboratório quanto de campo.

Em comparação com a técnica de referência DFAT, a sensibilidade e a especificidade do RDIT foram elevadas para todos os laboratórios, com 96% a 100% e 93,7% a 100%, respectivamente (Tabela 7). A menor sensibilidade e especificidade do RDIT foi obtida para o Laboratório 1 (França) durante a etapa de validação laboratorial. Com base no número acumulado de amostras testadas (n=162) (Tabela Suplementar 1),a sensibilidade e especificidade globais em relação à DFAT foram de 98,2% e 95,8%, respectivamente(Tabela 7). No entanto, esses resultados preliminares, mas promissores, foram obtidos em um conjunto de dados de amostra limitada e precisam ser confirmados em um grande número de amostras positivas e negativas, especialmente para aquelas testadas em áreas enzoóticas, para evitar qualquer potencial subestimação ou viés devido aos conjuntos de dados heterogêneos atuais.

O teste RIDT é adequado para detectar lyssavírus em biópsias cerebrais de animais infectados, onde o nível de antígenos lyssavírus é importante. No entanto, o limite de teste de detecção permanece alto ao testar a suspensão do vírus titulado(Tabela 8; Figura 7).

A Tabela 9 (de Léchenne 201614) mostra um exemplo de resultados obtidos após a detecção do RNA pelo duplo pan-lyssavirus RT-qPCR, visando a polimerase viral do lyssavirus. Um painel de 51 testes ridt positivos realizados em condições laboratoriais (Laboratório 1, n=32) ou no Chade (Lab 2, n=19) e depois enviados à temperatura ambiente para o Laboratório 1, foi testado. A detecção positiva foi obtida para 18 (94,7%), 26 (81,2%) e 44 (86,3%) amostras do Laboratório 1, Laboratório 2 e os dois combinados, respectivamente. Além disso, foi realizado genotipagem para 14 dessas amostras (10 do Laboratório 1 e 4 do Laboratório 2) utilizando o PCR hemi-aninhado visando o gene de nucleoproteína parcial e foi bem sucedido para 13 delas (93%) (de Léchenne et al. 201614).

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática da estrutura de um RIDT para diagnóstico de raiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Exemplos de técnicas rápidas e simples para coleta de amostras cerebrais (tronco cerebral com medulla oblongata) em animais (cão mostrado aqui) através do foramen occipital em ambientes de campo (Mali). (A) Coleção com uma pipeta de plástico descartável (B) Coleção com um canudo de plástico(C) Coleção com um grampo (D) Coleção com o conta-gotas de descarte fornecido no kit RIDT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Seção anatômica longitudinal da cabeça do cão, mostrando as diferentes partes do cérebro (tronco cerebral, cerebelo, hipocampo, tálamo e córtex) coletadas ao empurrar, em um movimento rotacional, uma pipeta de plástico descartável através da rota de foramen occipital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Descrição do conteúdo do kit RIDT, incluindo o dispositivo, um conta-gotas de plástico descartável, um cotonete descartável e o diluente de ensaio. O tubo onde a amostra será coletada e armazenada não é fornecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos para interpretação do Anigen RIDT. (A) Resultados positivos (presença visível de duas linhas, linha C e linha T) (B) Resultados negativos (presença visível apenas da linha C) (C) Resultados inválidos (ausência de linha C visível). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Representação esquemática do protocolo RIDT, adaptado das instruções do fabricante. (A) Versão modificada do protocolo, com exclusão da etapa de diluição recomendada pelo fabricante (B) Protocolo inicial recomendado pelo fabricante, com etapa de diluição pré 1:10 em PBS das amostras cerebrais. As etapas excluídas na versão modificada do protocolo (apresentada na Figura 6A) são indicadas com uma linha vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Exemplo de determinação do limite de detecção do RIDT14. Foi utilizada uma diluição em série 10:1 de um vírus da raiva titulada da cepa 9704ARG. A quantidade de vírus depositado em cada dispositivo é indicada em FFU (unidades fluorescentes de formação de foco). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ensaio Pan-RABV RT-qPCR
Reagente μL/Reação
2X Reaction Mix (um buffer contendo 0,4 mM de cada dNTP e 6 mM MgSO4) 10
Água livre de nuclease 1.5
Taq3long (Para a frente) [10 μM] 1
Taq17revlong (Reverso) [10 μM] 1
RABV4 [10 μM] 0.3
RABV5 [10 μM] 0.3
MgSO4 [50-mM] (fornecido no kit) 0.25
Corante de referência ROX (25 μM) (fornecido no kit) 0.05
RNasin (40U/μL) (Promega) 0.2
Mix de Taq RT/Platinum SuperScript III/Platinum 0.4
Total por reação 15
eGFP RT-qPCR ensaio
Reagente μL/Reação
2X Reaction Mix (um buffer contendo 0,4 mM de cada dNTP e 6 mM MgSO4) 10
Água livre de nuclease 2.8
EGFP1F (Para a frente) [10 μM] 0.5
EGFP2R (Reverso) [10 μM] 0.5
sonda eGFP [10 μM] 0.3
MgSO4 [50-mM] (fornecido no kit) 0.25
Corante de referência ROX (25 μM) (fornecido no kit) 0.05
RNasin (40U/μL) (Promega) 0.2
Mix de Taq RT/Platinum SuperScript III/Platinum 0.4
Total por reação 15
Ensaio Pan-lyssa RT-qPCR
Reagente μL/Reação
2x Mistura de Reação Verde SYBR 10
Água livre de nuclease 2.1
Taq5long (Para a frente) [10 μM] 1
Taq16revlong (Reverso) [10 μM] 1
MgSO4 [50-mM] (fornecido no kit) 0.25
Corante de referência ROX (25 μM) 0.05
RNasin (40U/μL) (Promega) 0.2
Mix de Taq RT/Platinum SuperScript III/Platinum 0.4
Total por reação 15

Tabela 1: Descrição da solução de reação de mix mestre para os três diferentes ensaios RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR).

Ensaio RT-qPCR Nome Tipo Comprimento Sequência (5'-3') Sentido Posição
ensaio pan-RABV RT-qPCR Taq3long Primer 22 ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC A S 7273-7294a
Taq17revlong Primer 25 GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC CAR G Como 7390-7414a
RABV4 Sonda (FAM/TAMRA) 29 AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC Como 7314-7342a
RABV5 Sonda (FAM/TAMRA) 32 AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA S 7353-7384a
Ensaio Pan-lyssa RT-qPCR Taq5long Primer 23 TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CA S 7272-7294a
Taq16revlong Primer 25 GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C Como 7366-7390a
eGFP RT-qPCR ensaio EGFP1F Primer 20 GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC S 637-656b
EGFP2R Primer 19 GAA CTC CAG CAG GAC CAT G Como 768-750b
EGFP Sonda (FAM/TAMRA) 22 AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A S 703-724b

Tabela 2: Descrição dos primers/sondas para os três diferentes ensaios RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR). um De acordo com a sequência de genomas RABV do vírus Pasteur (PV) (número de adesão do GenBank M13215). b De acordo com a sequência de vetor de clonagem pEGFP-1 (número de adesão do GenBank U55761).

Ensaios Pan-RABV RT-qPCR e eGFP RT-qPCR
Passo Ciclo Temp Tempo Coleta de Dados
Transcrição reversa 1 45 °C 15 min.
Inativação/desinaturação inicial de RT 1 95 °C 3 min.
Amplificação 40 95 °C 15 s
61 °C 1 min Ponto final
Ensaio Pan-lyssa RT-qPCR
Passo Ciclo Temp Tempo Coleta de Dados
Transcrição reversa 1 45 °C 15 min.
Inativação/desinaturação inicial de RT 1 95 °C 3 min.
Amplificação 40 95 °C 15 s
55 °C 1 min Ponto final
Curva de dissociação 1 95 °C 15 s Aumento de 0,1 °C/s, 55-95 °C
55 °C 1 min
95 °C 15 s
55 °C 15 s

Tabela 3: Descrição das condições de ciclismo térmico para os três diferentes ensaios RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR).

Ensaio Análise Resultados Interpretação
eGFP RT-qPCR Cq no intervalo de aceitação Extração validada Análise de outros ensaios pode ser feita
Cq fora do intervalo de aceitação Extração não validada Teste novamente a amostra (repita a execução ou/e a extração), solicite outra amostra, se necessário, se necessário
pan-RABV RT-qPCR Cq <38 Positivo Detecção positiva de RNA viral
Cq ≥38 Negativo Análise do ensaio pan-lyssa RT-qPCR
pan-lyssa RT-qPCR Curva de fusão considerada positiva Positivo Detecção positiva de RNA viral
Curva de fusão considerada negativa Negativo Ausência de detecção de RNA viral

Tabela 4: Interpretação geral do ensaio pan-lyssavirus RT-qPCR combinado duplo.

Ensaio PCR convencional de hemi-aninhado Rodada pcr Nome Comprimento Sequência (5'-3') Sentido Posicionea Tamanho de amplicon (bp)
PCR aninhado de hemi visando o gene da polimerase 1ª rodada PVO5m 20 ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA S 7170-7189 320
PVO9 19 TGA CCA TTC CAR CAR GTN G Como 7471-7489
2ª rodada PVO5m 20 ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A S 7170-7189 250
PVO8 22 GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A Como 7398-7419
PCR aninhado de hemi visando o gene da nucleoproteína 1ª rodada N127 20 ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG S 55-74 1532
N8m 19 CAG TCT CYT CNG CCA TCT C Como 1568-1586
2ª rodada N127 20 ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG S 55-74 845
N829 19 GCC CTG GTT CGA ACA TTC T Como 881-899

Tabela 5: Descrição dos primers utilizados para o PCR convencional de hemi-aninhado.

PCR aninhado de hemi visando o gene da polimerase
Passo Ciclo Temperatura Tempo
Primeira e segunda rodadas Desnaturação inicial 1 94 °C 3 min.
Desnaturação 35 94 °C 30 s
Hibridização 56 °C 45 s
Alongamento 72 °C 40 s
Alongamento final 1 72 °C 3 min.
PCR aninhado de hemi visando o gene da nucleoproteína
Passo Ciclo Temperatura Tempo
Primeira rodada Desnaturação inicial 1 94 °C 3 min.
Desnaturação 35 94 °C 30 s
Hibridização 56 °C 30 s
Alongamento 72 °C 45 s
Alongamento final 1 72 °C 3 min.
Segunda rodada Desnaturação inicial 1 94 °C 3 min.
Desnaturação 35 94 °C 30 s
Hibridização 58 °C 30 s
Alongamento 72 °C 30 s
Alongamento final 1 72 °C 3 min.

Tabela 6: Descrição das condições térmicas de ciclismo para o PCR convencional de hemi-aninhado.

Laboratório País Período de avaliação Nb de amostras Resultados do DFAT Resultados do RIDT Sensibilidade Especificidade
Pos Negativo Pos Negativo
Laboratório 1 França 2015 82 50 32 50 32 96% 93.7%
Laboratório 2 Chad 2012-2015 44 33 11 33 11 100% 100%
Laboratório 3 Costa do Marfim 2017 10 8 2 8 2 100% 100%
Laboratório 4 Mali 2017 18 15 3 15 3 100% 100%
Laboratório 6 Itália 2016 8 8 0 8 0 100% -
Todos 2015-2017 162 114 48 114 48 98.2% 95.8%

Tabela 7: Determinação dos parâmetros intrínsecos (sensibilidade, especificidade) do teste RIDT em relação ao método de referência DFAT, com base na análise de um total de 162 amostras e com a participação de 5 laboratórios diferentes.

Cepade vírus a Host original Localização Concentração inicial (FFU/mL)b Limite de detecção (FFU/mL)c
9147FRA Raposa-vermelha França 3.1 x 107 106
Cvs Isolado de laboratório - 1,6 x 107 106
8743THA Humano Tailândia 8.1 x 107 > 8.1 x 106
9508CZK (SAD) Isolado de laboratório - 5.4 x 108 107
Pv Isolado de laboratório - 4.3 x 107 106
9001FRA Cão Guiana Francesa 2.4 x 106 > 2.4 x 105
9704ARG Morcego Argentina 9,5 x 107 105
04030PHI Humano Filipinas 2,5 x 107 105

Tabela 8: Limite de detecção do RIDT utilizando 8 diferentes suspensões de vírus da raiva tituladas (de Léchenne et al. 201614). um CVS: Desafio da cepa de vírus, SAD: Street Alabama Dufferin, PV: Vírus Pasteur. b Número de unidades fluorescentes de formação de foco (FFU) por mL. c Número de unidades fluorescentes de formação de foco (FFU) depositadas na faixa.

RIDT realizado em
Laboratório 1 Laboratório 2 Combinado
Positivo Negativo Total Positivo Negativo Total Positivo Negativo Total
Detecção viral de RNA Positivo 18 1 19 26 0 32 44 7 51
Negativo 0 0 0 0 0 3 0 3 3
Total 18 1 19 26 0 35 44 10 54

Tabela 9: Detecção de RNA viral com RT-qPCR na tira de teste Anigen usada em condições laboratoriais (Lab 1), em condições de campo e enviada à temperatura ambiente (Lab 2) ou combinada (de Léchenne et al. 201614).

Tabela suplementar 1: Descrição das 162 amostras testadas com o teste RIDT para determinação de seus parâmetros intrínsecos apresentados na Tabela 7. Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).

Discussion

O RIDT é um método simples, rápido e de baixo custo para o diagnóstico de raiva pós-morte e uma alternativa de campo promissora para testes laboratoriais. A aplicação desse teste, especialmente para áreas descentralizadas de países de baixa e média renda, melhoraria a compreensão da prevalência e transmissão do vírus da raiva em escala local e potencialmente nacional. Quando combinado com o método rápido de coleta de amostras cerebrais (sem necropsia completa), uma grande vantagem é que o teste pode ser inteiramente realizado no ambiente de campo, longe das instalações laboratoriais. Amostras cerebrais coletadas através do foramen magnum podem ser usadas para testes, portanto não é necessário abrir completamente o crânio animal. O teste é simples de realizar e interpretar e é particularmente adequado para atividades de vigilância de campo14. Outras vantagens do RIDT sobre o DFAT ou DRIT não são a necessidade de controles positivos e negativos e armazenamento de kits à temperatura ambiente. Além disso, o protocolo modificado, onde a etapa de diluição (1:10) em PBS é omitida, não requer reagentes extras para realizar o teste e simplifica ainda mais o procedimento em condições de campo.

Um ponto chave é a qualidade das amostras cerebrais. As amostras devem ser coletadas e testadas o mais rápido possível após a morte do animal suspeito, ou mantidas em temperatura fria antes do teste, para evitar a degradação. Amostras decompostas não devem ser testadas porque podem afetar o resultado (risco de resultado falso negativo). Embora ainda não existam dados sobre a perda de sensibilidade do RIDT ao longo do tempo para amostras cerebrais, nós imaginamos que ele é semelhante em comparação com o teste DFAT32. No entanto, o tempo entre a morte do animal e a realização do teste pode ser reduzido, pois o teste pode ser feito de forma rápida e direta no campo. Assim, há, em geral, menor risco de amostras decompostas.

Outro passo crítico dentro do protocolo é a migração da suspensão da amostra. A migração deve começar diretamente após o depósito da amostra (1-5 min). A alta viscosidade da suspensão poderia, portanto, influenciar negativamente a migração. Coçar suavemente a parte inferior do local de depósito do dispositivo com o conta-gotas e adicionar mais 1-2 gotas muitas vezes resolve esse problema, e a migração começa imediatamente depois.

A maioria dos testes ridt realizados em laboratórios africanos (Chade, Costa do Marfim e Mali) foram realizados a temperatura ambiente que pode exceder 30 °C, enquanto a faixa de temperatura para armazenamento e uso recomendada pelo fabricante é de 15 °C - 30 °C. Embora não tenhamos identificado nenhum impacto de alta temperatura no desempenho do teste RIDT, é necessário avaliá-lo com mais cuidado. Da mesma forma, o impacto da alta temperatura durante o armazenamento e transporte do dispositivo após o uso para detecção e genotipagem viral precisa de avaliação adicional. A sensibilidade da detecção de RNA viral por RT-qPCR da tira RIDT pode ser afetada pela qualidade da amostra cerebral inicialmente usada no teste, mas também pela condição de armazenamento dos testes RIDT após o uso. Por exemplo, a sensibilidade da detecção de RNA foi maior quando os testes RIDT utilizados foram armazenados em condições laboratoriais controladas (94,7%) em comparação com as condições de campo (por exemplo, Chade) (81,2%)14. Essas condições também podem afetar a integridade (especialmente o comprimento) do RNA fixado na tira, possivelmente explicando a sensibilidade moderada para genotipagem com base em amplicons PCR mais longos (por exemplo, >500 nucleotídeos)14. A sensibilidade do RT-qPCR realizada na tira de teste foi menor do que a obtida utilizando cartões FTA Whatman (80,6%)14. Semelhante a outras técnicas moleculares, a carga viral também pode impactar o sucesso do genotipagem com base em tiras RDIT, com resultados negativos potenciais para amostras com baixa carga viral14.

O teste não é recomendado atualmente pela OMS e OIE para diagnóstico de rotina e vigilância de doenças, e um resultado não pode ser usado por conta própria para orientar a tomada de decisão da PEP. Ainda é necessária mais validação do teste. No entanto, o diagnóstico rápido e preciso da raiva é um elemento crucial dos sistemas contínuos de vigilância da raiva e é fundamental para aumentar o compromisso político, que é eminentemente importante para o sucesso do controle da raiva sustentável33. Os testes RIDT oferecem novas oportunidades de diagnóstico da raiva neste contexto e são uma ferramenta útil para expandir a vigilância da raiva animal no campo em áreas enzoóticas de baixa ou média renda.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado através da Aliança Global para Vacinas e Imunização (GAVI), a Fundação Wolfermann Nägeli, a Cooperação Suíça de Pesquisa Africana (SARECO), o SWF Stiftung für wissenschaftliche Forschung, o Freiwillige Akademische Gesellschaft (FAG) Basel, o Programa Bilateral de Cooperação em Ciência e Tecnologia da Suíça com a Ásia e a Fundação Novartis para pesquisa biomédica.

Agradecemos especialmente aos donos de cães, ao pessoal veterinário e à equipe do laboratório pelo grande comprometimento. Também queremos reconhecer Lisa Crump pela edição de idiomas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (lyophilizied, adsorbed) Bio-Rad, France 3572112 Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) conjugated polyclonal antibody against the nucleocapsid of rabies virus. Use for the DFAT reference tecnnique.
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems, France 4351104 Amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
Disposable plastic pipette, drinking straw, clamp, dropper - - Equipment used for the collection of the brain stem (medulla oblongata) via the foramen magnus (occipital route).
Evans Blue Solution 1% Bio-Rad, France 3574911 Counter-coloration used for the DFAT to facilite the reading under UV microscope.
Primer eGFPF1 Eurofins Genomics, Germany - Forward primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2 Eurofins Genomics, Germany - Reverse primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong Eurofins Genomics, Germany - Reverse primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-ATGAGAAGTGG
AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long Eurofins Genomics, Germany - Forward primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GATCTGTCTGAA
TAATAGAYCCARG-3'.
Probe eGFP FAM/TAMRA Eurofins Genomics, Germany - Forward primer for the amplification of the internal control by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGCACCCAGT
CCGCCCTGAGCA-3'.
Probe RABV4 FAM/TAMRA Eurofins Genomics, Germany - Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AACACYTGATCBA
GKACAGARAAYACATC-3'.
Probe RABV5 FAM/TAMRA Eurofins Genomics, Germany - Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGRGTGTTTTCYAG
RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Rapid Rabies Ag Test Kit BioNote Inc., Republic of Korea RG18-01DD Rapid immunochromatographic diagnostic test (RIDT, also named lateral flow device or LFD) for the post-mortem diagnosis of rabies.
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega, USA N2515 Enzyme used with the kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit Invitrogen, France 11732-020 Kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
TRIzol Reagent Invitrogen, France 15596026 Phenol/chloroforme based total RNA extraction using the cellulose membrane of the RIDT.

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