軽度の外傷性脳損傷を有するラットの海馬における高度な拡散イメージング

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Summary

この手順の全体的な目標は、軽度の外傷性脳損傷を持つラットにおける海馬の定量的微細構造情報を得ることである。これは、高度な拡散加重磁気共鳴イメージングプロトコルとパラメトリック拡散マップの関心領域ベースの解析を使用して行われます。

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Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

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Abstract

軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、後天性脳損傷の最も一般的なタイプである。外傷性脳損傷の患者は、大きな変動性と不均一性(年齢、性別、外傷の種類、その他の可能な病理など)を示すので、動物モデルは臨床研究の限界である要因を解明する上で重要な役割を果たします。それらはTBIに続く傷害および修理の生物学的メカニズムを調査するために標準化され、制御された設定を提供する。しかし、すべての動物モデルがmTBIの拡散と微妙な性質を効果的に模倣しているわけではありません。例えば、一般的に使用される制御皮質衝撃(CCI)および横液パーカッション損傷(LFPI)モデルは、脳を露出させ、mTBIで一般的に見られない広範な焦点外傷を誘発するために頭蓋切開術を利用する。したがって、これらの実験モデルはmTBIを模倣するために有効ではない。したがって、mTBI を調査するために適切なモデルを使用する必要があります。ラットのMarmarou体重減少モデルは、軽度の外傷を持続する患者に見られるように、同様の微小構造変化および認知障害を誘発する;したがって、このモデルはこのプロトコルに対して選択されました。従来のコンピュータ断層撮影および磁気共鳴イメージング(MRI)スキャンは、mTBIはしばしば微妙で拡散性の傷害のみを誘発するので、一般的に軽度の傷害に続く損傷を示さない。拡散加重MRIにより、脳組織の微細構造特性を調べることができ、軽度の外傷後の顕微鏡的変化に関するより多くの洞察を提供することができる。したがって、本研究の目的は、軽度および拡散性脳損傷を得た後に疾患の進行をフォローアップするために、選択された関心領域(すなわち海馬)の定量的情報を得ることである。

Introduction

外傷性脳損傷(TBI)は、これらの脳損傷が生涯の認知、身体的、感情的、社会的結果をもたらすことが明らかになったので、近年、より注目を集めています。この意識の高まりにもかかわらず、軽度のTBI(mTBI、または脳震盪)は依然として過小報告され、未診断である。MTBIはサイレント・オプシの流行と呼ばれ、mTBIの歴史を持つ個人は、薬物乱用や精神医学的問題の割合が高いことを示しています2.mTBIを有する複数の患者は、従来のコンピュータ断層撮影(CT)または磁気共鳴画像(MRI)スキャンでは見られない傷害の拡散および微妙な性質のために毎年診断されない。脳損傷の放射線証拠の欠如は、微細構造変化に対してより敏感である拡散MRIなどのより高度なイメージング技術の開発につながっている3.

拡散MRIは、微細構造の生体内マッピングを可能にし、このMRI技術は、TBI研究4、5、6で広く使用されている。拡散テンソルから、分画異方性(FA)および平均二分性(MD)が計算され、傷害後の微細構造組織における変化を定量化する。mTBI患者の最近のレビューは、FAの増加と損傷後のMDの減少を報告します, これは、軸生腫脹7を示すことができます.反対に、MDの増加およびFAの減少も見出され、上皮形成、軸質変性、または繊維のずれ/破壊8に続く無根構造の破壊の根には示唆されている。これらの混合所見は、異なるタイプの衝撃および重症度(例えば、回転加速、鈍力外傷、爆発傷害または前者の組み合わせ)によって引き起こされるmTBIの有意な臨床的不均一性によって部分的に説明することができる。しかし、現在のところ、微細構造組織の変化を支える根本的な病理と生物学的/細胞基盤に関する明確なコンセンサスはありません。

動物モデルは、より詳細にTBIに続く傷害および修復の生物学的メカニズムを調査するために標準化され、制御された設定を提供する。TBIのためのいくつかの実験モデルが開発され、ヒトTBIの異なる側面を表している(例えば、焦点対拡散外傷または回転力によって引き起こされる外傷)9、10。一般的に使用される動物モデルは、制御された皮質衝撃(CCI)および横液パーカッション傷害(LFPI)モデル11、12を含む。実験パラメータは十分に制御できますが、これらのモデルは頭蓋を利用して脳を露出させる。頭蓋骨や頭蓋骨骨折はmTBIで一般的に見られない;したがって、これらの実験モデルはmTBIを模倣するために有効ではありません。Marmarou et al.13が開発した衝撃加速モデルは、ヘルメットで保護されているラットの頭部に一定の高さから落とされた重量を利用しています。この動物モデルは、軽度の外傷を持続する患者に見られるように、同様の微小構造変化および認知障害を誘発する。したがって、このマルマロウ重量降下モデルは、拡散mTBI14、15のイメージングバイオマーカーを調べるのに適している。

この報告は、Marmarou重量降下モデルを用いてmTBIラットモデルにおける高度拡散MRIの応用を示す。まず、軽度および拡散性外傷を誘導する方法を示し、拡散テンソルイメージング(DTI)モデルを用いて分析を行う。特定の生物学的情報は、より高度な拡散モデル[すなわち、拡散尖度イメージング(DKI)および白色物質管完全性(WMTI)モデル]を使用して得られる。具体的には、軽度の外傷が生じ、従来のT2加重MRIと高度な拡散イメージングプロトコルを用いて海馬における微小構造変化が評価される。

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Protocol

このプロトコルは、ヘント大学動物倫理委員会(ECD 15/44Aanv)によって承認されており、すべての実験は欧州委員会のガイドライン(指令2010/63/EU)に従って行われました。

1.動物の準備とヘルメットの付属品

  1. 雌のウィスターHラット(±250gまたは12週齢)を計量し、イソルラン(5%)の混合物で満たされた小さな誘導室で麻酔するO2を少なくとも 1 分間使用します。
  2. ラットに0.05mg/kgのブプレノルフィンを首に皮下注射し、ホームケージに戻し、少なくとも30分間は先制鎮鎮薬を行い、効果を発揮します。
    注:30分の待ち時間の間に、外科部位は準備することができる。
  3. 外科場の下に37 °Cに保たれた暖房パッドを置く。70%のエタノールで消毒された外科分野に殺菌された外科用器具を置く。
  4. ラットを誘導室に戻し、足や尾のピンチに反応しないまでラットを麻酔します。
  5. ラットを外科場に置き、横尾静脈にカテーテルを挿入する。次に、ラットの頭部を剃り、余分な毛皮を取り除き、頭皮と残りの外科領域をクロロエキシジンで消毒する。
  6. 頭皮に局所的に2%リドカインの100 μLを注入します。
  7. メスサイズ11を使用して頭蓋骨を露出させ、小さなはさみで余分な膜を除去する中間線切開を行います。最大1cmの眼鏡を使用して皮膚を引き込みます。 さらに、骨膜が存在しなくなるまで、生殖不能の綿棒を頭蓋骨全体にそっとこすって骨膜を取り除く。
  8. 頭蓋骨にティッシュの接着剤を1滴、殺菌された金属ディスク(直径10mmと3mmの厚さ)に1滴を置き、ヘルメットとして機能します。ブレグマの約3分の1と3分の2の後ろにディスクを接着します。接着剤を1分間乾燥させます。

2. 外傷性脳損傷(TBI)の誘導

  1. 特定の春定数の泡マットレスでカスタムメイドのベッドにラットを置きます(材料の表を参照してください)。ラットを透明なプラスチックチューブの下に直接置き、ヘルメットをできるだけ水平にして450gの真鍮の重量を持つ。ラットを麻酔から切り離す。
  2. 1 mまで重量を引き上げ、準備ができたら解放します。2番目の実験者が存在し、2番目の衝撃を防ぐために、衝撃の直後にラットをプラスチックチューブから離すことを確認してください。
    注:シャム傷ついたラットは、ステップ2.2を除き、同じ実験手順(ステップ1.1~2.7)を受け取ります。
  3. ラットを麻酔に再付着させ、カテーテルを介して1mLの生理液(0.9%NaCl)を注入して、ヘモダイナミクスショックを軽減する。
    注:ラットは、衝撃のために一時的に呼吸を停止する可能性があります。ラットが呼吸反射を促すために2sの後に自発的に呼吸しない場合は、胸郭を穏やかに圧縮します。
  4. 頭蓋骨からそっと引っ張ってヘルメットを取り外します。頭蓋骨と皮膚から残りの接着剤を取り除き、外科縫合糸で切開部を閉じます。無菌アプリケーターの先端を使用して局所鎮痛ゲルを適用します。
  5. ラットをCTスキャナのベッドの上に置きます。スカウトスキャンを使用して正しい位置を確認します。視野を調整して、1つのベッド位置内で頭全体のイメージングを可能にします。頭蓋骨骨折を排除するために、汎用的な低用量CTスキャンを投与する。
    注:頭蓋骨骨折は安楽死のクライトである。
  6. ラットを暖房パッド(37°C)のきれいなケージに入します。意識を取り戻す時間を監視します。ラットが直立して座ることができれば、ラットはホームケージに戻すことができます。
  7. TBI誘導の1日後に0.05 mg/kgブプレノルフィンの第2用量を投与する。

3. 拡散磁気共鳴イメージング(MRI)

注:拡散加重イメージングは、外傷誘発の前と1日後に行われる。

  1. イソファルラン(5%)の混合物で満たされた小さな誘導室でラットを麻酔すると O2.ラットが足や尾のピンチに反応しない場合は、500 mL/minの流量で麻酔を2%に減らします。
  2. ラットを歯の棒と鼻コーンでヘッドホルダーに置き、麻酔を行い、脳の中心が直腸容積MRIコイルの中心のレベルになるまで頭を前方にスライドさせます。角膜への損傷を防ぐために少量で目に潤滑のointmentを適用します。スキャン中の動きを避けるために、小さなテープで頭部を固定します。
  3. ラットの胸郭の下に圧力パッドを置いて呼吸を監視し、循環する温水加熱毛布とバブルラップでラットを覆い、ラットを暖かく保ちます。スキャンの前に、呼吸モニターをチェックして、信号がノイズなしで明確で、呼吸周期が一貫していることを確認します。必要に応じて、圧力パッドを再配置します。
    注:呼吸数は1%~2%の間で麻酔のレベルを調整することにより、1,200〜1,700ミリ秒あたり1呼吸の間に保たれるべきである。
  4. 直交体ボリュームコイルをヘッド上にスライドさせます。コイルベンダーの指示に従って、コイルのチューニングとマッチングコンデンサを適切な周波数とインピーダンスに調整します。スキャナーベッドをスキャナーボアに進めてスキャンを開始します。
  5. 正しい位置を確保するために、デフォルトの3平面スカウトスキャン(「トライパイロット」)を取得します。
    1. [新しいスキャン]をクリックし、プロトコル リストからトライパイロット シーケンスを選択して、トライパイロット シーケンスをスキャン コントロールに読み込みます。次に、信号ボタンをクリックしてスキャンを開始します。
    2. スキャンが完了したら、画像表示にスキャンをロードし、1)頭部がまっすぐ横たわっていることを確認し、2)脳が磁石とコイルの中央に配置されていることを確認します。必要に応じて、ヘッドまたはスキャナーベッドの位置を調整し、新しいトライパイロットスキャンを取得します。
  6. 自動 2 次シミング プロトコルを使用してローカル磁場を調整する: 手順 3.5.1 で説明するように、2 次シム プロトコルをスキャン コントロールにロードします。次に、[Acq]タブをクリックします |現在の調整|自動シミングを開始するために、分光計制御ツールウィンドウのローカルフィールド均質性の方法固有の調整。
  7. ステップ 3.5.1 で説明したように、再フォーカスエコー(RARE)シーケンスを使用して新しい T2 Rapid イメージングをスキャン コントロールにロードします。
    1. 次のパラメーターを除き、既定の設定を使用して T2 加重イメージを取得します。
    2. [スキャンの編集] タブを開き、繰り返し時間 (TR) とエコー時間 (TE) をそれぞれ 5,500 ミリ秒と 37 ミリ秒に調整します。また、視野とマトリックス サイズを変更して、109 μm x 109 μm (既定の解像度 = 156 μm x 156 μm) の高い面内分解能を可能にします。スライスの厚さが 600 μm、スライス数が 45 に設定され、RARE 係数が 8 に設定されていることを確認します。
    3. ジオメトリエディタを開き、脳の球根と小脳を含む正しい位置にスライス パッケージを配置します。
  8. ステップ 3.5.1 で説明したように、B_DIFFUSION フォルダーから 3 つの新しいエコー平面拡散加重スピン エコー シーケンス (DtiEpi) をスキャン制御プロトコルにロードします。
    注:3つの異なる拡散「シェル」を用いて、拡散テンソルイメージング(DTI)モデル4、16、拡散核症イメージング(DKI)モデル17、および白色物質管完全性(WMTI)モデル18はすべて推定することができる。イメージング シェル17ごとに少なくとも 15 等間隔の方向を持つ最大 3000 s/mm2を持つ最大 b 値で、少なくとも 3 つの異なる b 値を使用することをお勧めします。
    1. 次の設定とは別に、既定の設定を使用して拡散重み付けイメージ (DWI) を取得します。
    2. [スキャンの編集]タブを開き、[ジオメトリ]タブの下のジオメトリパラメータを調整します。
    3. スライスの向きを軸方向に設定し、スライス数を 25 に設定すると、スライスの厚さは 500 μm、インタースライス距離は 600 μm になります。読み出し方向を左から右に修正します。
    4. [コントラスト]タブをクリックして、エコー時間を 24 ミリ秒、繰り返し時間を 6,250 ミリ秒に調整します。
    5. 帯域幅を 250,000 Hz に設定し、脂肪抑制をオンにします。平均数を 1 に調整します。
    6. [リサーチ]タブをクリックし、平均数 (EPI セグメント) を 4 に変更します。
    7. [リサーチ] タブ内の[拡散]タブをクリックします。
      1. 拡散方向の数を、最初のシェルの場合は 32、2 番目のシェルでは 46、3 番目のシェルでは 64 に調整します。
      2. カスタムグラデーション方向ファイルを使用してグラデーションの方向を調整します。
      3. 最初のシェルでは B0 イメージの数を 5 に、2 番目のシェルに 5、3 番目のシェルに 7 を変更します。
      4. 方向ごとの b 値を、最初のシェルの場合は800 s/mm 2、2 番目のシェルでは 1500 s/mm 2、3 番目のシェルでは 2000 s/mm2に調整します。
        注: カスタムグラデーション方向ファイルを使用してグラデーションの方向を調整するには、DTI_SET_DIRECTIONS マクロを使用して[拡散方向を「はい」または「自動的に」に設定することで手動で行うことができます。
    8. ジオメトリエディタを開き、大脳のみを含む球根と小脳の間に視野を配置して、アーティファクトとスキャン時間を短縮します。脳の外側に5mmの6つの彩度バンドを配置し、彩度をクリックし、スクロールバーを使用して好ましい位置にバンドをスライドさせることでアーティファクトを減らします。
      注:球根および小脳は解剖学的ランドマークおよびトライパイロットスキャンの3つのイメージに基づいて識別することができる。
  9. トラフィック ライトシンボルをクリックして、インポートされたシーケンスを取得します。上記のパラメータの設定を使用して、T2-RAREスキャンの取得時間は12分、最初のDWIシェルは15分、第2のDWIシェルは21分、第3シェルは30分です。総取得時間は約80分(単一の受信機チャネルシステム上)です。
  10. スキャンプロトコルの完了時に、スキャナーベッドから動物を取り出し、37°Cの加熱パッドできれいなケージに動物を置きます。意識を取り戻したら、動物をホームケージに戻す。

4. 画像処理

注:以下のセクションでは、拡散イメージの処理については、オープンアクセスツールボックスであるMRtrix3、ExploreDTI19およびアミドソフトウェア20で説明されています。ただし、前処理ステップは、他のツールボックス (FSL、MedInria、DTIStudio など) で実行できます。

  1. 取得したデータを 2dseq ファイルをエクスポートして、取得したデータを取得コンソールから転送します。
  2. 2dseq ファイル (未加工の DWI ファイル) を MRtrix3 の標準フォーマットである .mif 形式に変換して、MRtrix3 でさらに前処理ステップを実行できるようにします。さらに、シェル内の次のコマンドを使用して、3 つの拡散シェルを連結します。
    変換_bruker pdata/1/2dseq ratID_T2.mih (T2 重み付け画像の場合)
    変換_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi1.mih (最初の拡散シェルの場合)
    変換_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi2.mih (2 番目の拡散シェルの場合)
    変換_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi3.mih (3 番目の拡散シェルの場合)
    mrcat ratID_dwi1.mif ratID_dwi2.mif ratID_dwi3.mif ratID_dwi.mif
  3. MRtrix321,22の DWIs でノイズ補正とギブスの呼び出し補正を実行します。また、次のコマンドを使用して、修正された DWI イメージおよび T2 イメージを NIFTI 形式に変換します。
    dwidenoise ratID_dwi.mif ラットID_dwi_deノイズ.mif
    mrdegibbs ratID_dwi_denoised.mif ラットID_dwi_deノイズド_gr.mif
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr.mif ratID.nii
    mrconvert ratID_T2.mif ratID_T2.nii
  4. ExploreDTI で EPI、モーション、エディ電流歪みに対して補正を実行します。
    1. [DTI*.matファイルの計算] をクリックして、NIFTI イメージを .mat ファイルに変換します。生データを DTI*.mat ファイルに変換します。拡散テンソル推定値を重み付け線形に変更し、b値を NaN に変更します。ボクセルサイズを 0.333 0.333 0.6、非 DWI イメージ数を 17、DWI イメージ数を 142、マトリックス サイズを 105 105 25 に調整します。
      注: b 値を NaN に設定すると、ExploreDTI はデータセットを尖度データセットと見なします。
    2. [設定]タブをクリックして、EPI 補正の設定を調整します (既定ではオフになっています)。SM/EC/EPI 補正を選択し、他のデータにも登録し、[はい] をクリックして EPI 補正 (非リジッド) を実行します。拡散データ・セットに対応する解剖学的T2イメージのサフィックスを指定します。
      注: ExploreDTI は、歪んでいない解剖学的イメージと拡散イメージの間の画像登録を使用して、EPI の歪みを補正します。
    3. [プラグイン]タブをクリックし、被写体の動きとEC/EPIの歪みの補正を選択し、ステップ2.3から前処理された拡散データファイルを選択します。T2 イメージが同じフォルダ内にあり、拡散データ ファイル名と同じベースを持っていることを確認します (たとえば、DWI の場合は rat1.nii、解剖学的イメージの rat1_T2.nii)。このステップでは、「ネイティブ」(*native.mat)と「変換済み」ファイル(*trafo.mat)が生成されます。
  5. プラグインをクリックして*.niiにエクスポートし、DTIモデルのパラメトリックマップを選択して、各ラットのDTIメトリックを計算します:分画異方性(FA)、平均拡散率(MD)、放射状拡散率(RD)、軸方向拡散率(AD)。 「最大の元数値L1」として表されます)
  6. さらに、尖度モデル(MK、AK、および RK)および WMTI モデル(AWF、AxEAD、RadEAD、および TORT)のパラメトリック マップをエクスポートします。拡散画像の処理により、さらに微細構造解析に使用できる12のパラメトリックマップ(図1、図2、図3)が得られます。
  7. MRtrix3を使用して、各ラットの海馬用のマスクファイルを作成します。
    1. ツールとROIエディタをクリックして、MRtrixビューアにラットのFA画像をロードします。
    2. 「+」ボタンをクリックして新しいROIを作成し、編集を押して海馬を含む各スライスにROIを描画します(図4)。描画されたROIから不要な領域を消去するには、マウスの右ボタンを押します。
    3. ROIの描画が完了したら、[保存]ボタンをクリックしてマスク画像を保存します。
      注: このマスク ファイルは、海馬組織を含む値 1 のボクセルを持つバイナリ NIFTI イメージ ファイルになり、残りのボクセルの値は 0 になります。ラット間で海馬の領域を標準化するために、パラメトリックマップは、23またはラットの脳アトラスを記述した関心の所定の領域を持つ研究固有のテンプレートと共に登録することができる。
  8. ラットの海馬の拡散メトリックを抽出するには、ステップ4.6の作成されたマスクファイルを使用し、アミドソフトウェアを開きます。
    1. ラットのパラメトリックマップとマスク画像を開きます。
    2. マスクファイルのROIをアミドに追加するには、マスクファイルイメージを選択し、[編集] |ROI の追加 |3D アイソコンターをクリックし、マスクイメージに表示される ROI をクリックします。ROI に意味のある名前を付け、このボリュームに値が 1 のボクセルのみを含む必要があることを確認します。
    3. 海馬の拡散指標の平均値を計算するには、[ツール] をクリックします。 ROI 統計を計算し、含めるべき画像と ROI を示します。[実行]をクリックすると、さらに統計分析に使用できる計算値が別の画面に表示されます。このファイルは、保存するか、優先データ形式 (.xlsx ファイルや .csv ファイルなど) にコピーできます。

5. 統計分析

注: 以下のセクションでは、SPSS 統計 24 の拡散イメージの処理について説明します。ただし、統計分析は他の統計ツールボックスで実行できます。

  1. SPSS *.sav ファイルにワイド形式のデータを読み込みます。
  2. 各タイムポイント(ベースラインまたは1日の傷害後)の2つのグループ間の統計的な差をテストするには、[分析] をクリックします。ノンパラメトリック検定 |レガシーダイアログ |2 独立したサンプルテスト.テストする必要がある変数をロードし、グループ (TBI およびシャム グループ) を指定します。テストタイプとしてマン・ホイットニーUを示します。
  3. 各グループ内の 2 つの時点点間の統計的な差をテストするには、データ ファイルを分割する必要があります。[データに移動]、[ファイルの分割]に移動し、[グループの比較] を表示します。次に、[分析]、ノンパラメトリックテスト、レガシーダイアログ、2関連サンプルテストをクリックし、比較する必要がある変数を読み込み、Wilcoxonをテストタイプとして示します。
    注:複数の比較を補正するために、Bonferroni補正(すなわち、p値を比較パラメータ数で割った(DTI 4、DKI3、およびWMTI 4)]を使用して拡散モデルごとにp値を調整します。具体的には、p < 0.0125 は DTI モデルと WMTI モデルでは重要であると考えられ、p < 0.016 は DKI モデルにとって重要であると考えられます。

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Representative Results

研究では、すべてのTBIラット(n=10)が衝撃を生き延び、麻酔23から剥離した後15分以内に衝撃および麻酔から回復することができた。CT画像では、頭蓋骨骨折の証拠はなく、T2画像は外傷の1日後の挫傷部位で出血、拡大した心室、または水腫形成などの異常を示さなかった(図5)。したがって、解剖画像のこれらの目視検査に基づいて、大きな焦点病変は検出されず、傷害の拡散および軽度の性質を確認した。

T2画像と拡散データセット(ステップ4.4)との間の共登録(非剛性)ステップの品質を、色分けされたFAマップにT2画像のオーバーレイを追加して調べた(図6)。次に、FA、MD、AD、およびRDパラメトリックマップを計算し(図1)、アミドソフトウェアにロードした。FAマップに基づいて、海馬構造を含むROIが描かれました(図4)。拡散メトリックの統計値は、対象領域内のすべてのボクセルにわたって平均化され、各DTIメトリックの平均値は、さらなる分析のためにエクスポートされました。拡散データの別の品質チェックは、DTI メトリックの外れ値を検査することによって実行できます。たとえば、海馬の FA 値は約 0.15 である必要があります。したがって、<0.10(等方性拡散を示す)または>0.30(白質で見られる値)の値は生物学的に不可解な値とみなすことができます。これらのデータポイントは、それ以降の分析から拒否する必要があります。また、WMTIモデルのAWF、AxEAD、RadEAD、およびTORTと同様に拡散尖度モデルのAK、RK、およびMKの平均値を算出した(図2、図3)。

我々の研究では、DTIメトリックの分析により、mTBI群の影響に続いてFA値(p= 0.007)が有意に増加し、拡散性値(MDおよびRD)が減少した(p= 0.007およびp=0.007)。RD および MD のこれらの減少は、シャム 群と有意に異なっていました (p = 0.005 および p = 0.004 それぞれ)。拡散尖度測定法は、影響後のRK(p=0.005)の有意な減少を示したが、AKまたはMKの変化は認められない(図8)。WMTIモデルを用いて、RadEAD(p=0.007)およびTORT(p=0.007)は、衝撃の1日後にmTBI群においてそれぞれ有意な減少と増加を示した(図9C、D)。シャムグループの値は、有意な変化を示さなかった。

Figure 1
図1:分画異効率(FA)、平均拡散率(MD)、軸方向二反性(AD)、および放射状拡散率(RD)の代表的なパラメトリックマップ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:平均尖度(MK)、軸尖度(AK)、および放射状尖度(RK)の代表的なパラメトリックマップ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:軸方向水分率(AWF)、軸方向および放射状の余分軸方向拡散率(AxEAD、RadEAD)、および拷問性(TORT)の代表的なパラメトリックマップ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: MRtrix3 でマスクを作成します。海馬の体積を含むすべてのスライスに海馬の周りにROIが描かれ、体積はマスクファイルとして保存されます。これは、ラットごとに個別に行うか、各パラメトリック マップを共同登録できるスタディ固有のテンプレート マスク ファイルを使用して行うことができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:衝撃の1日後に代表的なmTBI動物のCTおよびT2加重画像を撮影した。CT画像(上段)には頭蓋骨骨折は表示されません。T2加重画像(下列)では出血、拡大心室、または上脳形成が実証されなかった。なお、浮腫形成は、外科的介入から創傷領域の周囲の過強部として明らかに見える。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:ExploreDTIにおけるEPI、モーション、およびエディ電流補正の補正後に解剖学的画像と重なった拡散データセットの色エンコードFAマップ。左の悪い訂正と共同登録と右側の良い例を示しています。色エンコーディングが正しいことを確認する必要があります:赤の左右方向(例えば、コーパスカロスム)、緑色の前部後方向、青色の劣った優れた方向(例えば、cingulum)。さらに、色エンコードされた FA イメージは、解剖学的イメージと完全に整列する必要があります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:シャム(n=10)およびmTBI動物(n=10)の海馬の拡散テンソルメトリックの変化。影響後、mTBI動物(B,D)ではFA(A)が有意に増加し、平均拡散率(B)および放射状拡散率(D)が有意に減少した。mTBIラットの軸方向二分性(C)に有意な差は認められなかった。シャム動物は有意なDTI変化を示さなかった(*p < 0.0125)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:シャム(n=10)およびmTBI動物(n=10)の海馬の拡散核症指標の変化。影響後、mTBI動物のRK(C)は有意に減少したが、AK(B)またはMK(A)では変化はなかった。シャム動物は何の変化も示さなかった(*p < 0.0166)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:シャム(n=10)およびmTBI動物(n=10)の海馬の白色物質管完全性指標の変化。影響後、RadEAD(C)の有意な減少とmTBI動物のTORT(D)の有意な増加があったが、AWFまたはAxEAD(A,B)の変化はなかった。シャム動物は何の変化も示さなかった(*p < 0.0125)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

mTBIは、CTおよび従来のMRIスキャンに異常を示さない拡散および微妙な損傷の結果であることが多いため、軽度の外傷後の微小構造損傷の評価は依然として課題である。したがって、外傷の全範囲を可視化するためには、より高度なイメージング技術が必要である。TBI研究における拡散磁気共鳴イメージングの応用は、拡散テンソルイメージングが最も頻繁に使用される過去10年間に、より多くの関心を集めています 5.DTIモデルの限界は、脳の微細構造(障壁として機能する膜を有する軸と細胞の複雑なネットワークからなる)の正確な仮定ではないガウス拡散プロセスの仮定であり、DTIメトリックは非特異的である。基礎となる生物学的微細構造24.拡散核症イメージングは、DTIモデルの延長であり、非ガウス拡散17の程度を特徴付けようとする試みである。これは、組織の不均一性または複雑さに関する追加情報を提供する可能性があります。

しかし、DTIおよびDKIモデルの欠点は、確率的な水変位プロファイルを特徴付けるが、微細構造6に特異的ではない拡散信号の表現に過ぎないことです。一方、尖度テンソルに基づく白色物質管完全性モデルは、モデル18先行生物学的情報(仮定)を組み込んだ微細構造マッピング技術である。それは組織の区画に拡散信号を起因し、生物学的属性をより直接的に評価できる。これらの生物物理学モデルは、mTBI後の異常を記述するための新しい情報を提供し、この非特異性の問題6を克服する可能性があります。これらの3つの異なるモデルを使用して、微小構造変化および生物学的プロセスは、特にMarmarou重量降下モデルを使用して、より詳細にmTBIに続いて視覚化することができました。

Marmarou重量降下モデルは使いやすく、わずかな手術だけを必要とします。しかし、2番目の実験者は、2番目の実験者を避けるために、最初の衝撃の直後にラットをガラス管から離すことをお勧めします。さらに、ラットが衝撃に続いて呼吸反射を取り戻すのを助ける必要がある場合があります。かなり長いMRIプロトコルは、約80分の総取得時間で、シャムラットとmTBIラットの両方によって十分に許容される。しかし、スキャン中に、呼吸周期を監視し、動物があまりにも深くまたは軽く眠っている場合は麻酔を調整することが重要です。低体温症を避けるために、ラットが完全に目を覚ますまで、取得中と取得後の両方で動物を暖かく保つことも重要です。

高度な拡散MRIでは、運動アーティファクトは可能な限り避けるべきである。スキャン中の動きを減らす簡単な解決策は、歯の棒を利用し、可能な場合は、テープまたは2つの耳棒の小さな部分で頭部を固定することです。これにより、ラットが息をするたびに頭が上下に動かないようにします。

高度な拡散MRIプロトコルを使用して、取得した画像は、さらなる分析に使用する前に、主に異なるソフトウェアツールを使用して、いくつかの(前の)処理ステップを通過する必要があります。異なるソフトウェア ツールを使用して拡散重み付けされたイメージを処理する場合の欠点は、(多くの場合)各ツールが独自のデータ形式を使用してグラデーション方向テーブルをエンコードすることです。MRtrix3 はグラデーション情報を拡散重み付けイメージと共に .mif ファイルに格納し、ExploreDTI は別のファイル (B 行列) を使用してグラデーションの方向を格納します。したがって、グラデーションの方向が MRtrix3 から ExploreDTI に正しく転送されていることを確認することが重要です。これは、色エンコーディングが色エンコードされたFA画像(例えば、赤で左右方向(例えば、コーパスカロスム)、緑色の前部後方向、青色の劣った優れた方向(例えば、cingulum)で正しいことを確認することによって行うことができます。色エンコードされたFA画像は、拡散加重画像と構造T2重み付け画像との間の非剛性共登録プロセスの品質を確認するためにも使用できます。

ExploreDTI を使用して、DTI、DKI、および WMTI モデルを使用してパラメトリック マップを抽出しました。DTI モデルは MD、AD、RD、および FA のパラメトリック マップを提供し、DKI モデルは MK、AK、および RK のパラメトリック マップを提供します。WMTIモデルの4つのメトリック(AWF、AxEAD、RadEAD、TORT)を計算しましたが、ExploreDTI内で軸内二重性(IAD)を抽出することはできませんでした。IAD は、WMTI モデル25の開発者が提供する MATLAB ツールを使用して取得できます。これを行うには、拡散加重画像とグラデーション情報を ExploreDTI から Matlab に再度転送する必要があります。この手順では、グラデーション情報のエンコードに関するエラーが発生しやすくなります。さらに、尖度テンソルとWMTIパラメータを推定し、再計算する必要があります。

取得した画像の前処理、テンソルの推定、パラメトリック マップの計算には、長期間の計算時間が必要です。8 コアと 16 GB の RAM を持つサーバー上のデータ セットあたり、EPI、モーション、および渦電流の修正に必要な 1 0 分です。ROI分析を用いて、海馬内の平均値は衝撃の前と1日後に計算された。DTI、DKI、および WMTI メトリックの変更は、mTBI グループで定量化されました。しかし、WMTIモデルのDKIメトリックとAWFでは、被験者間の変動が大きく認められており、シャム基とmTBI基のベースライン値に予想外の差が生じました。これは、調査された領域内の生物学的に不可解な値(外れ値)を含むボクセルの結果である可能性が最も高く、アミドの平均値を計算する前に、将来の研究で除外される可能性があります。

結論として、このプロトコルは、mTBIのラットモデルにおける海馬における微小構造変化を調査および定量化するための高度な拡散MRIの実現可能性を実証する。3つの異なる拡散モデルを使用して、mTBI後の条件に寄与する基礎となる生物学的プロセスに関する補完的な情報を得ることができます。これは、軽度の影響後の初期段階で特定の微細構造変化を特定するのに十分な感度を持つmTBI用バイオマーカーの開発における一歩前進を表します。

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Disclosures

著者は、開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgments

著者らは、この作品を支援してくれた研究財団フランダース(FWO)に感謝したいと思います(助成番号:G027815N)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

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References

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