Advanced Diffusion Imaging im Hippocampus von Ratten mit leichter traumatischer Hirnverletzung

Neuroscience

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Summary

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, quantitative mikrostrukturelle Informationen über den Hippocampus bei einer Ratte mit leichter traumatischer Hirnverletzung zu erhalten. Dies geschieht mit einem fortschrittlichen diffusionsgewichteten Magnetresonanztomographieprotokoll und einer regionsbezogenen Analyse parametrischer Diffusionskarten.

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Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

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Abstract

Leichte traumatische Hirnverletzung (mTBI) ist die häufigste Art der erworbenen Hirnverletzung. Da Patienten mit traumatischen Hirnverletzungen eine enorme Variabilität und Heterogenität aufweisen (Alter, Geschlecht, Art des Traumas, andere mögliche Pathologien usw.), spielen Tiermodelle eine Schlüsselrolle bei der Entschlüsselung von Faktoren, die in der klinischen Forschung begrenzt sind. Sie bieten eine standardisierte und kontrollierte Einstellung, um die biologischen Mechanismen von Verletzungen und Reparaturen nach TBI zu untersuchen. Allerdings imitieren nicht alle Tiermodelle die diffuse und subtile Natur von mTBI effektiv. Beispielsweise nutzen die häufig verwendeten Modelle der kontrollierten kortikalen Schlagkraft (CCI) und der lateralen Fluid Percussion Injury (LFPI) eine Kraniotomie, um das Gehirn zu entlarven und ein weit verbreitetes fokales Trauma auszulösen, das in mTBI nicht häufig zu beobachten ist. Daher sind diese experimentellen Modelle nicht gültig, um mTBI nachzuahmen. Daher sollte ein geeignetes Modell verwendet werden, um mTBI zu untersuchen. Das Marmarou-Gewichtsabnahmemodell für Ratten induziert ähnliche mikrostrukturelle Veränderungen und kognitive Beeinträchtigungen wie bei Patienten, die ein leichtes Trauma erleiden; Daher wurde dieses Modell für dieses Protokoll ausgewählt. Herkömmliche Computertomographie- und Magnetresonanztomographie-Scans (MRT) zeigen in der Regel keine Schäden nach einer leichten Verletzung, da mTBI oft nur subtile und diffuse Verletzungen indukt. Mit diffusionsgewichteter MRT ist es möglich, mikrostrukturelle Eigenschaften von Hirngewebe zu untersuchen, die mehr Einblick in die mikroskopischen Veränderungen nach einem leichten Trauma geben können. Daher besteht das Ziel dieser Studie darin, quantitative Informationen über eine ausgewählte Region von Interesse (d. h. Hippocampus) zu erhalten, um das Fortschreiten der Krankheit nach einer leichten und diffusen Hirnverletzung zu verfolgen.

Introduction

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) haben in den letzten Jahren mehr Aufmerksamkeit gewonnen, da deutlich geworden ist, dass diese Hirnverletzungen zu lebenslangen kognitiven, körperlichen, emotionalen und sozialen Folgen führen können1. Trotz dieses zunehmenden Bewusstseins ist mildes TBI (mTBI, oder Gehirnerschütterung) immer noch oft untergemeldet und nicht diagnostiziert. MTBI wurde als stille Epidemie bezeichnet, und Personen mit einer Geschichte von mTBI zeigen höhere Raten von Substanzmissbrauch oder psychiatrische nümlichen Problemen2. Mehrere Patienten mit mTBI werden jedes Jahr aufgrund der diffusen und subtilen Natur der Verletzungen nicht diagnostiziert, die bei herkömmlichen Computertomographie- (CT) oder Magnetresonanztomographie-Scans (MRT) oft nicht sichtbar sind. Dieser Mangel an radiologischen Beweisen für Hirnverletzungen hat zur Entwicklung fortgeschrittenerer bildgebender Verfahren wie Diffusions-MRT geführt, die empfindlicher auf mikrostrukturelle Veränderungen reagieren3.

Diffusion SMRT ermöglicht in vivo Kartierung der Mikrostruktur, und diese MRT-Technik wurde ausgiebig in TBI-Studien4,5,6verwendet. Aus dem Diffusionstensor werden die fraktionierte Anisotropie (FA) und die mittlere Diffusivität (MD) berechnet, um veränderungen in der mikrostrukturellen Organisation nach einer Verletzung zu quantifizieren. Jüngste Bewertungen bei mTBI-Patienten berichten von einem Anstieg der FA und einem Rückgang der MD nach Verletzungen, die auf axonale Schwellungen hinweisen können7. Im Gegensatz dazu werden auch Zunahmen der MD und Abnahmen der FA festgestellt und es wurde vorgeschlagen, Störungen in der parenchymalen Struktur nach Ödembildung, axonaler Degeneration oder Faserfehlausrichtung/-störung zu unterziehen8. Diese gemischten Befunde lassen sich teilweise durch die signifikante klinische Heterogenität von mTBI erklären, die durch verschiedene Arten von Aufprall und Schweregrad verursacht wird (z. B. Rotationsbeschleunigung, stumpfes Krafttrauma, Explosionsverletzungen oder Kombination ersterer). Derzeit gibt es jedoch keinen klaren Konsens über die zugrunde liegende Pathologie und biologische/zelluläre Grundlage, die Veränderungen in der mikrostrukturellen Organisation untermauert.

Tiermodelle bieten eine standardisierte und kontrollierte Einstellung, um biologische Mechanismen von Verletzungen und Reparaturen nach TBI genauer zu untersuchen. Mehrere experimentelle Modelle für TBI wurden entwickelt und stellen verschiedene Aspekte des menschlichen TBI dar (z.B. fokalvs. diffuses Trauma oder Trauma durch Rotationskräfte)9,10. Häufig verwendete Tiermodelle umfassen die modelle11,12. Obwohl die experimentellen Parameter gut kontrolliert werden können, nutzen diese Modelle eine Kraniotomie, um das Gehirn zu belichten. Craniotomien oder Schädelfrakturen sind in mTBI nicht häufig zu sehen; Daher sind diese experimentellen Modelle nicht für die Nachahmung von mTBI gültig. Das von Marmarou et al.13 entwickelte Schlagbeschleunigungsmodell nutzt ein Gewicht, das aus einer bestimmten Höhe auf den Kopf der Ratte fällt, der durch einen Helm geschützt ist. Dieses Tiermodell induziert ähnliche mikrostrukturelle Veränderungen und kognitive Beeinträchtigungen wie bei Patienten, die ein leichtes Trauma erleiden. Daher eignet sich dieses Marmarou-Gewichtsabfallmodell zur Untersuchung bildgebender Biomarker für diffuse mTBI14,15.

Dieser Bericht veranschaulicht die Anwendung von advanced diffusion MRT in einem mTBI Rattenmodell mit dem Marmarou Gewichtsabnahmemodell. Zuerst wird gezeigt, wie man ein leichtes und diffuses Trauma induziert, und dann wird eine Analyse mit dem Diffusions-Tensor-Bildgebungsmodell (DTI) bereitgestellt. Spezifische biologische Informationen werden mit der Verwendung von fortgeschritteneren Diffusionsmodellen [d. h. Diffusionskurtosis-Bildgebung (DKI) und WMTI-Modell (White Matter Tract Integrity) gewonnen.] Insbesondere werden leichte Traumata zugefügt und mikrostrukturelle Veränderungen werden dann im Hippocampus mit konventionellen T2-gewichteten MRTs und einem fortschrittlichen Diffusions-Bildgebungsprotokoll bewertet.

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Protocol

Das Protokoll wurde von der Tierethikkommission der Universität Gent (EKD 15/44Aanv) genehmigt, und alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Leitlinien der Europäischen Kommission (Richtlinie 2010/63/EU) durchgeführt.

1. Tiervorbereitung und Helmbefestigung

  1. Wiegen Sie eine weibliche Wistar H Ratte (ca. 250 g oder 12 Wochen alt) und anästhesieren sie in einer kleinen Induktionskammer, die mit einer Mischung aus Isofluran (5%) gefüllt ist. und O2 für mindestens 1 min.
  2. Die Ratte mit 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan in den Hals injizieren, in den Hauskäfig zurückbringen und präventive Analgesie für mindestens 30 min wirksam machen lassen.
    HINWEIS: Während der 30 min Wartezeit kann die chirurgische Stelle vorbereitet werden.
  3. Legen Sie ein Heizkissen bei 37 °C unter dem Operationsfeld. Legen Sie die sterilisierten chirurgischen Instrumente auf das operationsorige Feld, das mit 70% Ethanol desinfiziert wurde.
  4. Legen Sie die Ratte wieder in die Induktionskammer und befeuchten Sie die Ratte, bis sie nicht auf eine Pfote oder Schwanzklemme reagiert.
  5. Legen Sie die Ratte auf das Operationsfeld und legen Sie einen Katheter in die seitliche Schwanzvene ein. Als nächstes rasieren Sie den Kopf der Ratte, entfernen Sie überschüssiges Fell und desinfizieren Sie die Kopfhaut und den Rest des Operationsbereichs mit Chlorohexidin.
  6. Injizieren Sie 100 l von 2% Lidocain lokal in die Kopfhaut.
  7. Machen Sie einen Mittellinienschnitt mit einem Skalpell Größe 11, um den Schädel zu belichten, entfernen Sie überschüssige Membranen mit einer kleinen Schere. Ziehen Sie die Haut mit einem Augenspekulum mit einer maximalen Ausbreitung von 1 cm zurück.  Entfernen Sie außerdem das Periost, indem Sie eine sterile Baumwollknospe sanft über den Schädel reiben, bis das Periost nicht mehr vorhanden ist.
  8. Legen Sie einen Tropfen Gewebekleber auf den Schädel und einen auf die sterilisierte metallische Scheibe (Durchmesser 10 mm und 3 mm Dicke), die als Helm fungiert. Kleben Sie die Scheibe etwa ein Drittel vor und zwei Drittel hinter dem Bregma. Lassen Sie den Kleber für 1 min trocknen.

2. Induktion traumatischer Hirnverletzungen (TBI)

  1. Legen Sie die Ratte auf das maßgeschneiderte Bett mit einer Schaumstoffmatratze von einer bestimmten Federkonstante (siehe Tabelle der Materialien). Positionieren Sie die Ratte direkt unter einem transparenten Kunststoffrohr mit einem Gewicht von 450 g Messing, wobei der Helm so horizontal wie möglich ist. Lösen Sie die Ratte von der Anästhesie.
  2. Ziehen Sie das Gewicht bis zu 1 m und lassen Sie es los, wenn es fertig ist. Stellen Sie sicher, dass ein zweiter Experimentator vorhanden ist, um die Ratte unmittelbar nach dem Aufprall vom Kunststoffrohr wegzubewegen, um einen zweiten Aufprall zu verhindern.
    HINWEIS: Die scheinverletzten Ratten erhalten das gleiche experimentelle Verfahren (Schritte 1.1–2.7), mit Ausnahme von Schritt 2.2.
  3. Befestigen Sie die Ratte wieder an der Anästhesie und injizieren Sie 1 ml physiologische Lösung (0,9% NaCl) über den Katheter, um den hämodynamischen Schock zu reduzieren.
    HINWEIS: Es ist möglich, dass die Ratte wegen des Aufpralls kurz aufhört zu atmen. Komprimieren Sie den Thorax vorsichtig, wenn die Ratte nicht spontan nach 2 s atmet, um den Atemreflex zu fördern.
  4. Entfernen Sie den Helm, indem Sie ihn vorsichtig aus dem Schädel ziehen. Entfernen Sie den verbleibenden Kleber aus dem Schädel und der Haut und schließen Sie den Schnitt mit chirurgischer Naht. Lokale Analgesie Gel mit einem sterilen Applikator Spitze.
  5. Legen Sie die Ratte auf das Bett des CT-Scanners. Bestätigen Sie die richtige Position mit einem Scout-Scan. Passen Sie das Sichtfeld an, um die Abbildung des gesamten Kopfes innerhalb einer Bettposition zu ermöglichen. Verabreichen Sie einen allgemeinen, niedrig dosierten CT-Scan, um Schädelfrakturen auszuschließen.
    HINWEIS: Schädelfraktur ist ein Kriterium für Euthanasie.
  6. Legen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen (37 °C). Überwachen Sie die Zeit, um das Bewusstsein wiederzuerlangen. Sobald die Ratte aufrecht sitzen kann, kann die Ratte in den heimischen Käfig zurückgebracht werden.
  7. Verabreichen Sie eine zweite Dosis von 0,05 mg/kg Buprenorphin einen Tag nach Derinduktion.

3. Diffusions-Magnetresonanztomographie (MRT)

HINWEIS: Diffusionsgewichtete Bildgebung wird vor und 1 Tag nach der Traumainduktion durchgeführt.

  1. Anästhetisieren Sie die Ratte in einer kleinen Induktionskammer, die mit einer Mischung aus Isofluran (5%) gefüllt ist und O2. Wenn die Ratte nicht auf eine Pfote oder Schwanzklemme reagiert, reduzieren Sie die Anästhesie auf 2% mit einer Durchflussrate von 500 ml/min. Übertragen Sie das Tier in kopf-erster anfälliger Position auf das Scannerbett.
  2. Positionieren Sie die Ratte im Kopfhalter mit dem Zahnstab und Nasenkegel, liefern die Anästhesie, und schieben Sie den Kopf nach vorne, bis die Mitte des Gehirns ist auf der Ebene der Mitte der Quadratur Volumen MRT-Spule. Schmiersalbe in kleinen Mengen auf die Augen auftragen, um Schäden an der Hornhaut zu verhindern. Fixieren Sie den Kopf mit einem kleinen Stück Klebeband, um Bewegungen während des Scannens zu vermeiden.
  3. Legen Sie ein Druckkissen unter den Brustkorb der Ratte, um die Atmung zu überwachen und bedecken Sie die Ratte mit einer zirkulierenden warmwasserer Heizdecke und Blasenwickel, um die Ratte warm zu halten. Überprüfen Sie vor dem Scannen den Atemschutzmonitor, um sicherzustellen, dass das Signal geräuschlos frei ist und der Atemzyklus konsistent ist. Verschieben Sie ggf. das Druckpolster.
    HINWEIS: Die Atemfrequenz sollte zwischen 1 Atemweg pro 1.200–1.700 ms gehalten werden, indem der Anästhesiespiegel zwischen 1%und 2% angepasst wird.
  4. Schieben Sie die Quadraturvolumenspule über den Kopf. Stellen Sie die Stimm- und Matching-Kondensatoren der Spule gemäß den Anweisungen des Spulenherstellers auf die richtige Frequenz und Impedanz ein. Rücken Sie das Scannerbett in die Scannerbohrung, um mit dem Scannen zu beginnen.
  5. Erhalten Sie einen standardmäßigen Drei-Ebenen-Scout-Scan ("Tripilot"), um eine korrekte Positionierung zu gewährleisten.
    1. Laden Sie die Tripilot-Sequenz in das Scan-Steuerelement, indem Sie auf Neu scannen klicken und die Tripilot-Sequenz aus der Protokollliste auswählen. Klicken Sie als Nächstes auf die Ampeltaste, um den Scan zu starten.
    2. Wenn der Scan abgeschlossen ist, laden Sie den Scan in die Bildanzeige und stellen Sie sicher, dass 1) der Kopf gerade liegt und 2) das Gehirn in der Mitte des Magneten und der Spule positioniert ist. Stellen Sie ggf. die Position des Kopfes und/oder des Scannerbetts ein und erstellen Sie einen neuen Tripilot-Scan.
  6. Passen Sie das lokale Magnetfeld mit einem automatisierten Shimming-Protokoll zweiter Ordnung an: Laden Sie das Shim-Protokoll zweiter Ordnung in die Scan-Steuerung, wie in Schritt 3.5.1 beschrieben. Als nächstes klicken Sie auf die Registerkarte Acq | Aktuelle Anpassungen | Methodenspezifische Anpassung für die lokale Feldhomogenität im Fenster Spectrometer Control Tool, um automatisiertes Shimming zu starten.
  7. Laden Sie eine neue T2 Rapid-Bildgebung mit refokussierter Echos-Sequenz (RARE) in das Scan-Steuerelement, wie in Schritt 3.5.1 beschrieben.
    1. Erfassen Sie t2 gewichtete Bilder mit den Standardeinstellungen, mit Ausnahme der folgenden Parameter:
    2. Öffnen Sie die Registerkarte Scan bearbeiten, und passen Sie die Wiederholungszeit (TR) und Echozeit (TE) auf 5.500 ms bzw. 37 ms an. Ändern Sie auch das Sichtfeld und die Matrixgröße, um eine höhere In-Plane-Auflösung von 109 x 109 m zu ermöglichen (Standardauflösung = 156 x 156 m). Stellen Sie sicher, dass die Schnittdicke 600 m beträgt, die Anzahl der Slices auf 45 und der SELTEN-Faktor auf 8 festgelegt ist.
    3. Öffnen Sie den Geometrie-Editor und platzieren Sie das Slice-Paket in der richtigen Position, einschließlich des Bulbus des Gehirns und des Kleinhirns.
  8. Laden Sie drei neue echo-planare diffusionsgewichtete Spin-Echo-Sequenz (DtiEpi) aus dem Ordner B_DIFFUSION in das Scan Control-Protokoll, wie in Schritt 3.5.1 beschrieben.
    HINWEIS: Mit drei verschiedenen Diffusions-"Schalen", der Diffusions-Tensor-Bildgebung (DTI) Modell4,16, Diffusion kurtosis Imaging (DKI) Modell17, und White Matter Tract Integrität (WMTI) Modell18 kann alle geschätzt werden. Es wird empfohlen, mindestens drei verschiedene B-Werte zu verwenden, wobei der höchste b-Wert maximal 3000 s/mm2 mit mindestens 15 gleichmäßig verteilten Richtungen pro Bildgebungsschale17aufweisen muss.
    1. Erfassen Sie diffusionsgewichtete Bilder (DWIs) mit Standardeinstellungen, abgesehen von den folgenden Einstellungen:
    2. Öffnen Sie die Registerkarte Scan bearbeiten und passen Sie die geometrischen Parameter unter der Registerkarte Geometrie an. Passen Sie das Sichtfeld und die Matrixgröße auf 105 x 105 an, um eine Auflösung von 333 x 333 m zu gewährleisten.
    3. Legen Sie die Segmentausrichtung auf axial und die Anzahl der Slices auf 25 fest, was zu einer Schnittdicke von 500 m und einem Schnittabstand von 600 m führt. Ändern Sie die Ausleserichtung nach links nach rechts.
    4. Klicken Sie auf die Registerkarte Kontrast, um die Echozeit auf 24 ms und die Wiederholungszeit auf 6.250 ms anzupassen.
    5. Stellen Sie die Bandbreite auf 250.000 Hz ein und schalten Sie die Fettunterdrückung ein. Passen Sie die Anzahl der Durchschnittswerte auf einen wert.
    6. Klicken Sie auf die Registerkarte Forschung und ändern Sie die Anzahl der Durchschnittswerte (EPI-Segmente) auf 4.
    7. Klicken Sie auf die Registerkarte Diffusion in der Registerkarte Forschung. Führen Sie diesen Schritt separat für jede der drei Diffusionsschalen aus.
      1. Passen Sie die Anzahl der Diffusionsrichtungen auf 32 für die erste Schale, 46 für die zweite Schale und 64 für die dritte Schale an.
      2. Passen Sie die Verlaufsrichtungen mit benutzerdefinierten Farbverlaufsrichtungsdateien an.
      3. Ändern Sie die Anzahl der B0-Bilder in 5 für die erste Shell, 5 für die zweite Shell und 7 für die dritte Shell.
      4. Passen Sie den b-Wert pro Richtung auf 800 s/mm2 für die erste Schale, 1500 s/mm2 für die zweite Schale und 2000 s/mm2 für die dritte Schale an.
        HINWEIS: Das Anpassen der Verlaufsrichtungen mit einer benutzerdefinierten Farbverlaufsrichtungsdatei kann manuell durchgeführt werden, indem Diffusionsrichtungen auf ja oder automatisch mithilfe des DTI_SET_DIRECTIONS-Makros eingegeben werden.
    8. Öffnen Sie den Geometrie-Editor, und platzieren Sie das Sichtfeld zwischen dem Bulbus und dem Kleinhirn, das nur das Großhirn enthält, um Artefakt und Scanzeit zu reduzieren. Positionieren Sie sechs Sättigungsbänder von 5 mm außerhalb des Gehirns, um Artefakte zu reduzieren, indem Sie auf Sättigung klicken und die Bänder mit den Bildlaufleisten in die bevorzugte Position schieben.
      HINWEIS: Der Bulbus und das Kleinhirn können anhand anatomischer Landmarken und der drei Bilder des Tripilot-Scans identifiziert werden.
  9. Erfassen Sie die importierten Sequenzen, indem Sie auf das Ampelsymbol klicken. Unter Verwendung der Einstellungen der oben beschriebenen Parameter beträgt die Erfassungszeit des T2-RARE-Scans 12 min, der ersten DWI-Schale 15 min, der zweiten DWI-Schale 21 min und der dritten Schale 30 min. Die Gesamterfassungszeit beträgt ca. 80 min (auf einem einzigen Empfängerkanalsystem).
  10. Entfernen Sie das Tier nach Abschluss des Scanprotokolls vom Scannerbett und legen Sie es in einen sauberen Käfig mit einem Heizkissen bei 37 °C. Bringen Sie das Tier in den heimischen Käfig zurück, wenn es das Bewusstsein wiedererlangt.

4. Bildverarbeitung

HINWEIS: In den folgenden Abschnitten wird die Verarbeitung der Diffusionsbilder in MRtrix3, ExploreDTI19 und Amide Software20 beschrieben, die Open-Access-Toolboxes sind. Die Vorverarbeitungsschritte können jedoch in anderen Toolboxes (z. B. FSL, MedInria, DTIStudio) durchgeführt werden.

  1. Übertragen Sie die erfassten Daten aus der Erfassungskonsole, indem Sie die 2dseq-Datei exportieren.
  2. Konvertieren Sie die 2dseq-Dateien (Rohe DWI-Dateien) in das .mif-Format, das die Standardformatierung von MRtrix3 ist, um weitere Vorverarbeitungsschritte in MRtrix3 zu ermöglichen. Verketten Sie außerdem die drei Diffusionsschalen mit den folgenden Befehlen in der Shell:
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_T2.mih (für die T2-gewichteten Bilder)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi1.mih (für die erste Diffusionsschale)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi2.mih (für die zweite Diffusionsschale)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi3.mih (für die dritte Diffusionsschale)
    mrcat ratID_dwi1.mif ratID_dwi2.mif ratID_dwi3.mif ratID_dwi.mif
  3. Führen Sie die Rauschkorrektur und die Gibbs-Klingeltkorrektur auf den DWIs in MRtrix321,22durch. Konvertieren Sie außerdem die korrigierten DWI-Bilder und das T2-Bild mit den folgenden Befehlen in das NIFTI-Format:
    dwidenoise ratID_dwi.mif ratID_dwi_denoised.mif
    mrdegibbs ratID_dwi_denoised.mif ratID_dwi_denoised_gr.mif
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr.mif ratID.nii
    mrconvert ratID_T2.mif ratID_T2.nii
  4. Korrigieren sie für EPI-, Bewegungs- und Eddystromverzerrungen in ExploreDTI:
    1. Konvertieren Sie die NIFTI-Bilder in eine .mat-Datei, indem Sie auf DTI*.mat-Datei berechnen | Konvertieren Sie Rohdaten in die Datei DTI*.mat. Ändern Sie die Diffusionstensorschätzung in gewogene Lineare und den b-Wert in NaN. Stellen Sie die Voxelgröße auf 0,333 0,333 0,6, die Anzahl der Nicht-DWI-Bilder auf 17, die Anzahl der DWI-Bilder auf 142 und die Matrixgröße auf 105 105 25 ein.
      HINWEIS: Durch Festlegen des b-Werts auf NaN betrachtet ExploreDTI das Dataset als Kurtose-Datensatz.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Einstellungen, um die Einstellungen für die EPI-Korrektur anzupassen (dies ist standardmäßig deaktiviert). Wählen Sie SM/EC/EPI-Korrektur, registrieren Sie sich auch für andere Daten? und klicken Sie auf Ja, um die EPI-Korrektur (nicht starr) zumachen. Geben Sie das Suffix des anatomischen T2-Bildes an, das dem Diffusionsdatensatz entspricht.
      HINWEIS: ExploreDTI korrigiert EPI-Verzerrungen mithilfe der Bildregistrierung zwischen dem unverzerrten anatomischen Bild und dem Diffusionsbild.
    3. Klicken Sie auf die Registerkarte Plugins und wählen Sie Korrektur für Betreffbewegungen & EC/EPI-Verzerrungen aus und wählen Sie die vorverarbeitete Diffusionsdatendatei aus Schritt 2.3 aus. Stellen Sie sicher, dass sich das T2-Bild im selben Ordner befindet und die gleiche Basis wie der Namen der Diffusionsdatendatei hat (z. B. rat1.nii für das DWI und rat1_T2.nii für das anatomische Bild). In diesem Schritt wird eine Datei "native" (*native.mat) und "transformiert" (*trafo.mat) generiert.
  5. Berechnen Sie die DTI-Metriken für jede Ratte, indem Sie auf Plugins klicken und Stoffe nach *.nii exportieren und die parametrischen Karten des DTI-Modells auswählen: fraktionierte Anisotropie (FA), mittlere Diffusivität (MD), radiale Diffusivität (RD) und axiale Diffusivität (AD; als "größter Eigenwert L1" bezeichnet.
  6. Exportieren Sie außerdem die parametrischen Karten für das Kurtosemodell (MK, AK und RK) und das WMTI-Modell (AWF, AxEAD, RadEAD und TORT). Die Verarbeitung der Diffusionsbilder führt zu 12 parametrischen Karten (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3), die für weitere mikrostrukturelle Analysen verwendet werden können.
  7. Erstellen Sie mit MRtrix3 eine Maskendatei für den Hippocampus jeder Ratte.
    1. Laden Sie das FA-Bild der Ratte in den MRtrix-Viewer, indem Sie auf Tool und ROI-Editorklicken.
    2. Erstellen Sie einen neuen ROI, indem Sie auf die Schaltfläche"+" klicken und bearbeiten, um den ROI auf jedem Slice zu zeichnen, der den Hippocampus enthält (Abbildung 4). Um unerwünschte Bereiche aus dem gezogenen ROI zu löschen, drücken Sie die rechte Maustaste.
    3. Wenn die Zeichnung des ROI abgeschlossen ist, speichern Sie das Maskenbild, indem Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken.
      HINWEIS: Diese Maskendatei wird eine binäre NIFTI-Bilddatei mit Voxeln des Wertes 1 sein, die das Hippocampusgewebe enthält, und verbleibende Voxel haben Werte von 0. Um die Region des Hippocampus über Ratten hinweg zu standardisieren, können die parametrischen Karten mit einer studienspezifischen Vorlage mit vordefinierten Interessengebieten mit der Abgegrenzung23 oder einem Rattenhirnatlas koregistriert werden.
  8. Um die Diffusionsmetriken des Hippocampus der Ratte zu extrahieren, verwenden Sie die erstellte Maskendatei von Schritt 4.6 und öffnen Sie die Amide-Software.
    1. Öffnen Sie die parametrischen Karten und das Maskenbild der Ratte.
    2. Um den ROI der Maskendatei zu Amide hinzuzufügen, wählen Sie das Maskendateibild aus, klicken Sie auf Bearbeiten | ROI hinzufügen | 3D Isocontour und klicken Sie auf den ROI im Maskenbild angezeigt. Geben Sie dem ROI einen aussagekräftigen Namen und bestätigen Sie, dass dieses Volume nur Voxel mit einem Wert von einem enthalten sollte.
    3. Um die Mittelwerte der Diffusionsmetriken im Hippocampus zu berechnen, klicken Sie auf Extras | Berechnen Sie die ROI-Statistik und geben Sie die Bilder und den ROI an, die einbezogen werden sollten. Nachdem Sie auf Ausführengeklickt haben, erscheint ein weiterer Bildschirm mit berechneten Werten, die für weitere statistische Analysen verwendet werden können. Diese Datei kann entweder gespeichert oder in ein bevorzugtes Datenformat kopiert werden (z. B. .xlsx oder .csv datei).

5. Statistische Analyse

HINWEIS: In den folgenden Abschnitten beschreiben wir die Verarbeitung der Diffusionsbilder in SPSS Statistics 24; Die statistische Analyse kann jedoch in anderen statistischen Toolboxen durchgeführt werden.

  1. Laden Sie die Daten im Breitformat in eine SPSS *.sav-Datei.
  2. Um statistische Unterschiede zwischen den beiden Gruppen für jeden Zeitpunkt (d. h. Basiswert oder 1 Tag nach der Verletzung) zu testen, klicken Sie auf Analysieren | Nichtparametrische Tests | Legacy-Dialoge | 2 Unabhängige Stichprobentests. Laden Sie die zu testenden Variablen, und geben Sie die Gruppen an (z. B. TBI- und Scheingruppen). Geben Sie Mann-Whitney U als Testtyp an.
  3. Um statistische Unterschiede zwischen den 2 Zeitpunkten innerhalb jeder Gruppe zu testen, muss die Datendatei aufgeteilt werden. Gehen Sie zu Zu Daten, Datei aufteilen und Gruppen vergleichen angeben. Klicken Sie als Nächstes auf Analysieren, Nichtparametrische Tests, Legacy-Dialoge, 2 verwandte Stichprobentests, laden Sie die Variablen, die verglichen werden müssen, und geben Sie Wilcoxon als Testtyp an.
    ANMERKUNG: Um mehrere Vergleiche zu korrigieren, werden p-Werte für jedes Diffusionsmodell mit Bonferroni-Korrektur [d. h. p-Wert geteilt durch die Anzahl der verglichenen Parameter (DTI 4, DKI 3 und WMTI 4)] angepasst. Genauer gesagt gilt p < 0.0125 als signifikant für die DTI- und WMTI-Modelle, und p < 0,016 gilt als signifikant für das DKI-Modell.

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Representative Results

In der Studie überlebten alle TBI-Ratten (n = 10) den Aufprall und konnten sich innerhalb von 15 min nach Ablösung von der Anästhesie23von dem Aufprall und der Anästhesie erholen. Auf den CT-Bildern gab es keine Hinweise auf Schädelfrakturen und die T2-Bilder zeigten keine Anomalien wie Blutungen, vergrößerte Ventrikel oder Ödembildung an der Kontussionsstelle 1 Tag nach dem Trauma (Abbildung5). Auf der Grundlage dieser visuellen Inspektionen der anatomischen Bilder wurden daher keine großen fokalen Läsionen festgestellt, was die diffuse und milde Natur der Verletzung bestätigte.

Die Qualität des Coregistrationsschritts (nicht starr) zwischen dem T2-Bild und dem Diffusionsdatensatz (Schritt 4.4) wurde untersucht, indem der farbcodierten FA-Karte (Abbildung 6) eine Überlagerung des T2-Bildes hinzugefügt wurde (Abbildung 6). Anschließend wurden die parametrischen Karten FA, MD, AD und RD berechnet (Abbildung 1) und in die Amide-Software geladen. Basierend auf der FA-Karte wurde ein ROI einschließlich der Hippocampusstruktur gezeichnet (Abbildung 4). Die statistischen Werte der Diffusionsmetriken wurden für alle Voxel innerhalb der Interessenregion durchschnittlich berechnet, und die Mittelwerte jeder DTI-Metrik wurden zur weiteren Analyse exportiert. Eine weitere Qualitätsprüfung der Diffusionsdaten kann durch DieInspektion der Ausreißer in den DTI-Metriken durchgeführt werden. Beispielsweise sollten die FA-Werte im Hippocampus bei 0,15 liegen; Daher können Werte von <0.10 (bezeichnet isotrope Diffusion) oder >0,30 (Werte werden in weißer Materie gesehen) als biologisch unglaubwürdige Werte angesehen werden. Diese Datenpunkte sollten von der weiteren Analyse abgelehnt werden. Außerdem wurden die Mittelwerte für AK, RK und MK des Diffusionskurtosismodells sowie aWF, AxEAD, RadEAD und TORT des WMTI-Modells berechnet (Abbildung 2, Abbildung 3).

In unserer Studie ergab die Analyse der DTI-Metriken signifikante erhöhte FA-Werte (p = 0,007) und verringerte Diffusivitätswerte (MD und RD) (p = 0,007 bzw. 0,007) nach Auswirkungen in der mTBI-Gruppe (Abbildung 7). Diese Abnahmen von FuE und MD unterschieden sich signifikant von der Scheingruppe (p = 0,005 bzw. p = 0,004). Diffusionskurtose-Metriken zeigten eine signifikante Abnahme der RK (p = 0,005) nach dem Aufprall, aber keine Änderungen in AK oder MK (Abbildung 8). Bei Verwendung des WMTI-Modells zeigten RadEAD (p = 0,007) und TORT (p = 0,007) einen signifikanten Rückgang bzw. Anstieg in der mTBI-Gruppe 1 Tag nach dem Aufprall (Abbildung 9C,D). Die Werte in der Scheingruppe zeigten keine signifikanten Veränderungen.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative parametrische Karten für fraktionierte Anisotropie (FA), mittlere Diffusivität (MD), axiale Diffusivität (AD) und radiale Diffusivität (RD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative parametrische Karten für mittlere Kurtose (MK), Axialkurtose (AK) und radiale Kurtose (RK). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative parametrische Karten für axonale Wasserfraktion (AWF), axiale und radiale extra axonale Diffusivität (AxEAD, RadEAD) und Tortuosität (TORT). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Erstellen einer Maske in MRtrix3. Ein ROI wird um den Hippocampus auf allen Slices gezeichnet, die das Volumen des Hippocampus enthalten, und das Volume wird als Maskendatei gespeichert. Dies kann entweder für jede Ratte einzeln oder mithilfe einer studienspezifischen Vorlagenmaskendatei erfolgen, in der jede der parametrischen Karten mitregistriert werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: CT- und T2-gewichtete Bilder eines repräsentativen mTBI-Tieres 1 Tag nach dem Aufprall. Die CT-Bilder (obere Reihe) zeigen keine Schädelfrakturen. Auf den T2-gewichteten Bildern (untere Reihe) wurden keine Blutungen, vergrößerte Ventrikel oder Ödembildung enden. Bemerkenswert ist, dass die Ödembildung als hyperintensiver Bereich um den Wundbereich aus dem chirurgischen Eingriff deutlich sichtbar ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Farbcodierte FA-Karte des Diffusionsdatensatzes überlagert mit dem anatomischen Bild nach Korrektur für EPI, Bewegung und Eddy-Stromkorrektur in ExploreDTI. Gezeigt wird eine schlechte Korrektur und Co-Registrierung auf der linken Seite und gute Beispiele auf der rechten Seite. Es sollte sichergestellt werden, dass die Farbcodierung korrekt ist: Links-Rechts-Richtung in Rot (z.B. Corpus callosum), vorder-posteriore Richtung in grün und minderwertig-überlegene Richtung in Blau (z.B. Cingulum). Darüber hinaus sollte das farbcodierte FA-Bild perfekt an das anatomische Bild ausgerichtet sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Veränderungen der Diffusions-Tensor-Metriken des Hippocampus für Scheintiere (n = 10) und mTBI-Tiere (n = 10). Nach dem Aufprall gab es einen signifikanten Anstieg der FA (A) und einen signifikanten Rückgang der mittleren Diffusivität (B) und der radialen Diffusivität (D) bei den mTBI-Tieren (B,D). Bei den mTBI-Ratten wurden keine signifikanten Unterschiede zur axialen Diffusivität (C) beobachtet. Die Scheintiere zeigten keine signifikanten DTI-Änderungen (*p < 0,0125). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Veränderungen der Diffusionskurtose-Metriken des Hippocampus für Scheintiere (n = 10) und mTBI-Tiere (n = 10). Nach dem Aufprall gab es einen signifikanten Rückgang der RK (C) der mTBI-Tiere, aber keine Änderungen in AK (B) oder MK (A). Die Scheintiere zeigten keine Veränderungen (*p < 0.0166). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Änderungen der Integritätsmetriken des Hippocampus für Scheintiere (n = 10) und mTBI-Tiere (n = 10). Nach dem Aufprall gab es einen signifikanten Rückgang von RadEAD (C) und einen signifikanten Anstieg der TORT (D) der mTBI-Tiere, aber keine Änderung bei AWF oder AxEAD (A,B). Die Scheintiere zeigten keine Veränderungen (*p < 0.0125). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Da mTBI oft das Ergebnis einer diffusen und subtilen Verletzung ist, die keine Anomalien bei CT- und konventionellen MRT-Scans zeigt, bleibt die Bewertung von mikrostrukturellen Schäden nach einem leichten Trauma eine Herausforderung. Daher sind fortschrittlichere bildgebende Verfahren erforderlich, um das volle Ausmaß des Traumas zu visualisieren. Die Anwendung der Diffusions-Magnetresonanztomographie in der TBI-Forschung hat in den letzten zehn Jahren mehr Interesse gewonnen, wo Diffusionstensor-Bildgebung am häufigsten verwendet wird5. Eine Einschränkung des DTI-Modells ist die Annahme eines Gaußschen Diffusionsprozesses, der keine genaue Annahme für die Mikrostruktur des Gehirns ist (bestehend aus einem komplexen Netzwerk von Axonen und Zellen mit Membranen, die als Barrieren fungieren), was zu DTI-Metriken führt, die nicht spezifisch für der zugrunde liegenden biologischen Mikrostruktur24. Diffusionskurtosis-Bildgebung ist eine Erweiterung des DTI-Modells und versucht, den Grad der nicht-Gaußschen Diffusion zu charakterisieren17. Dies kann zusätzliche Informationen über die Heterogenität oder Komplexität des Gewebes liefern.

Ein Nachteil von DTI- und DKI-Modellen ist jedoch, dass sie nur eine Darstellung des Diffusionssignals sind, das das probabilistische Wasserverschiebungsprofil charakterisiert, aber nicht spezifisch für Mikrostruktur6ist. Auf der anderen Seite ist das auf dem Kurtosistensor basierende Integritätsmodell für den weißen Materietrakt eine mikrostrukturelle Kartierungstechnik, die a priori biologische Informationen (Annahmen) in das Modell18einbezieht. Es ordnet das Diffusionssignal Gewebeteilen zu und kann biologische Attribute direkter beurteilen. Diese biophysikalischen Modelle können somit neue Informationen zur Beschreibung von Anomalien nach mTBI bieten und dieses Problem der Unspezifität überwinden6. Anhand dieser drei verschiedenen Modelle konnten mikrostrukturelle Veränderungen und biologische Prozesse nach mTBI genauer visualisiert werden, insbesondere mit Dem Marmarou-Gewichtsabfallmodell.

Das Marmarou Gewichtsabnahmemodell ist einfach zu bedienen und erfordert nur eine kleine Operation; Es wird jedoch empfohlen, die Ratte unmittelbar nach dem ersten Aufprall vom Glasrohr wegzuziehen, um einen zweiten zu vermeiden. Zusätzlich ist es manchmal erforderlich, um der Ratte zu helfen, ihren Atemreflex nach dem Aufprall wiederzuerlangen. Das recht lange MRT-Protokoll mit einer Gesamterfassungszeit von rund 80 min wird sowohl von den Scheinratten als auch von den mTBI-Ratten gut vertragen. Obwohl es während des Scannens wichtig ist, den Atemzyklus zu überwachen und die Anästhesie anzupassen, wenn das Tier zu tief oder leicht schläft. Es ist auch wichtig, das Tier sowohl während als auch nach dem Erwerb warm zu halten, bis die Ratte vollständig wach ist, um Unterkühlung zu vermeiden.

Bei fortgeschrittenen Diffusions-MRT summierten sich Bewegungsartefakte so weit wie möglich. Eine einfache Lösung, um die Bewegung während des Scannens zu reduzieren, besteht darin, eine Zahnstange zu verwenden und den Kopf mit einem kleinen Stück Klebeband oder zwei Ohrstangen zu fixieren, falls verfügbar. Dadurch wird sichergestellt, dass sich der Kopf nicht jedes Mal nach oben und unten bewegt, wenn die Ratte atmet.

Mithilfe fortschrittlicher Diffusions-MRT-Protokolle müssen die erfassten Bilder mehrere (Vor-)Verarbeitungsschritte durchlaufen, meist mit verschiedenen Software-Tools, bevor sie für weitere Analysen verwendet werden können. Ein Nachteil der Verwendung verschiedener Software-Tools zur Verarbeitung der diffusionsgewichteten Bilder besteht darin, dass (häufig) jedes Werkzeug sein eigenes Datenformat verwendet, um die Tabelle mit Denkverlaufsrichtungen zu kodieren. MRtrix3 speichert die Gradienteninformationen zusammen mit dem diffusionsgewichteten Bild in einer .mif-Datei, während ExploreDTI eine separate Datei (B-Matrix) verwendet, um die Verlaufsrichtungen zu speichern. Daher ist es wichtig zu überprüfen, ob die Verlaufsrichtungen korrekt von MRtrix3 nach ExploreDTI übertragen werden. Dies kann durch Überprüfen, ob die Farbcodierung auf farbcodierten FA-Bildern korrekt ist [d.h. links-rechts Richtung in Rot (z. B. Corpus callosum), vorder-posteriorrichtung in grün und minderwertig-überlegene Richtung in blau (z. B. Cingulum)]. Die farbcodierten FA-Bilder können auch verwendet werden, um die Qualität des nicht starren Ko-Registrierungsprozesses zwischen den diffusionsgewichteten Bildern und strukturellen T2-gewichteten Bildern zu überprüfen.

Mit ExploreDTI wurden parametrische Karten mit den DTI-, DKI- und WMTI-Modellen extrahiert. Das DTI-Modell stellte parametrische Karten für MD, AD, RD und FA bereit, während das DKI-Modell parametrische Karten für MK, AK und RK bereitstellt. Obwohl vier Metriken des WMTI-Modells berechnet wurden (d. h. AWF, AxEAD, RadEAD, TORT), war es nicht möglich, intraaxonale Diffusivität (IAD) innerhalb von ExploreDTI zu extrahieren. IAD kann mit einem MATLAB-Tool von den Entwicklern des WMTI-Modells25bezogen werden. Dazu müssen die diffusionsgewichteten Bilder und Gradienteninformationen erneut von ExploreDTI in Matlab übertragen werden. Dieser Schritt ist erneut anfällig für Fehler bei der Codierung von Verlaufsdaten. Zusätzlich müssen der Kurtosistensor und die WMTI-Parameter neu geschätzt und berechnet werden.

Die Vorverarbeitung der erfassten Bilder, die Abschätzung der Tensoren und die Berechnung der parametrischen Karten erfordern eine lange Rechenzeit. Korrekturen für EPI, Bewegungs- und Wirbelstrom erforderten 40 min pro Datensatz auf einem Server mit acht Kernen und 16 GB RAM. Anhand einer ROI-Analyse wurden die Mittelwerte innerhalb des Hippocampus vor und 1 Tag nach dem Aufprall berechnet. Änderungen der DTI-, DKI- und WMTI-Metriken wurden dann in der mTBI-Gruppe quantifiziert. In den DKI-Metriken und AWF des WMTI-Modells wurde jedoch eine große Variabilität zwischen den Antragstellern beobachtet, was zu einem unerwarteten Unterschied der Basiswerte zwischen den Schein- und mTBI-Gruppen führte. Dies ist höchstwahrscheinlich das Ergebnis von Voxeln, die biologisch unglaubwürdige Werte (Ausreißer) innerhalb der untersuchten Region enthalten und in zukünftigen Studien vor der Berechnung der Mittelwerte in Amid herausgefiltert werden können.

Abschließend zeigt dieses Protokoll die Durchführbarkeit eines fortgeschrittenen Diffusions-MRT zur Untersuchung und Quantifizierung mikrostruktureller Veränderungen im Hippocampus in einem Rattenmodell von mTBI. Anhand von drei verschiedenen Diffusionsmodellen können ergänzende Informationen über die zugrunde liegenden biologischen Prozesse gewonnen werden, die zu den Bedingungen nach mTBI beitragen. Dies stellt einen Schritt nach vorn bei der Entwicklung von Biomarkern für mTBI dar, die empfindlich genug sein können, um spezifische mikrostrukturelle Veränderungen in der frühen Phase nach leichten Auswirkungen zu identifizieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken der Forschungsstiftung Flandern (FWO) für die Unterstützung dieser Arbeit (Grant-Nummer: G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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