Imágenes de difusión avanzada en el hipocampo de ratas con lesión cerebral traumática leve

Neuroscience

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Summary

El objetivo general de este procedimiento es obtener información cuantitativa de la microestructural del hipocampo en una rata con lesión cerebral traumática leve. Esto se realiza utilizando un protocolo avanzado de resonancia magnética ponderado por difusión y un análisis basado en la región de interés de los mapas de difusión paramétricos.

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Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

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Abstract

La lesión cerebral traumática leve (mTBI) es el tipo más común de lesión cerebral adquirida. Dado que los pacientes con lesión cerebral traumática muestran una tremenda variabilidad y heterogeneidad (edad, género, tipo de trauma, otras patologías posibles, etc.), los modelos animales desempeñan un papel clave en el desvele de factores que son limitaciones en la investigación clínica. Proporcionan un entorno estandarizado y controlado para investigar los mecanismos biológicos de lesión y reparación después de TBI. Sin embargo, no todos los modelos animales imitan la naturaleza difusa y sutil de mTBI de manera efectiva. Por ejemplo, los modelos de impacto cortical controlado (CCI) y lesión de percusión de fluido lateral (LFPI) comúnmente utilizados hacen uso de una craneotomía para exponer el cerebro e inducir un trauma focal generalizado, que no se observa comúnmente en mTBI. Por lo tanto, estos modelos experimentales no son válidos para imitar mTBI. Por lo tanto, se debe utilizar un modelo adecuado para investigar mTBI. El modelo de caída de peso Marmarou para ratas induce alteraciones microestructurales y deterioros cognitivos similares a los observados en pacientes que sufran traumatismos leves; por lo tanto, este modelo fue seleccionado para este protocolo. Las tomografías computarizadas convencionales y las imágenes por resonancia magnética (RM) generalmente no muestran daño después de una lesión leve, porque el mTBI a menudo induce sólo lesiones sutiles y difusas. Con la RMN ponderada por difusión, es posible investigar las propiedades microestructurales del tejido cerebral, lo que puede proporcionar más información sobre las alteraciones microscópicas después de un trauma leve. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es obtener información cuantitativa de una región de interés seleccionada (es decir, hipocampo) para seguir la progresión de la enfermedad después de obtener una lesión cerebral leve y difusa.

Introduction

Lesión cerebral traumática (TBI) ha ganado más atención en los últimos años, ya que ha quedado claro que estas lesiones cerebrales pueden resultar en consecuencias cognitivas, físicas, emocionales y sociales de por vida1. A pesar de esta creciente conciencia, la TBI leve (mTBI, o conmoción cerebral) todavía es a menudo subdeclarada y no diagnosticada. MTBI se ha referido como una epidemia silenciosa, y las personas con antecedentes de mTBI muestran tasas más altas de abuso de sustancias o problemas psiquiátricos2. Varios pacientes con MTBI no se diagnostican cada año debido a la naturaleza difusa y sutil de las lesiones, que a menudo no son visibles en las exploraciones convencionales de tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética (RM). Esta falta de evidencia radiológica de lesiones cerebrales ha llevado al desarrollo de técnicas de diagnóstico por imágenes más avanzadas, como la RMN por difusión, que son más sensibles a los cambios microestructurales3.

La RMN por difusión permite el mapeo in vivo de la microestructura, y esta técnica de RMN se ha utilizado ampliamente en estudios TBI4,5,6. A partir del tensor de difusión, la anisotropía fraccionaria (FA) y la difusividad media (MD) se calculan para cuantificar la alteración en la organización microestructural después de una lesión. Las revisiones recientes en pacientes con mTBI informan de aumentos en fa y disminuciones en MD después de una lesión, que puede ser indicativo de hinchazón axonal7. Por el contrario, también se han encontrado aumentos en el MD y disminuciones de FA y se ha sugerido que subyacen a las interrupciones en la estructura parénquimal después de la formación de edema, la degeneración axonal o la desalineación/interrupción de la fibra8. Estos hallazgos mixtos pueden explicarse parcialmente por la heterogeneidad clínica significativa de mTBI causada por diferentes tipos de impacto y gravedad (por ejemplo, aceleración de rotación, traumatismo por fuerza contundente, lesión por explosión o combinación de la primera). Sin embargo, actualmente no hay un consenso claro sobre la patología subyacente y la base biológica/celular que sustenta las alteraciones en la organización microestructural.

Los modelos animales proporcionan un entorno estandarizado y controlado para investigar los mecanismos biológicos de lesión y reparación después de TBI con mayor detalle. Se han desarrollado varios modelos experimentales para TBI que representan diferentes aspectos de la TBI humana (por ejemplo, trauma focal frente a trauma difuso o trauma causado por fuerzas de rotación)9,10. Los modelos animales de uso común incluyen el impacto cortical controlado (CCI) y la lesión de percusión de fluido lateral (LFPI) modelos11,12. Aunque los parámetros experimentales pueden estar bien controlados, estos modelos hacen uso de una craneotomía para exponer el cerebro. Las craneotomías o fracturas craneales no se observan comúnmente en mTBI; por lo tanto, estos modelos experimentales no son válidos para imitar mTBI. El modelo de aceleración de impacto desarrollado por Marmarou et al.13 hace uso de un peso que se deja caer desde una cierta altura sobre la cabeza de la rata, que está protegido por un casco. Este modelo animal induce alteraciones microestructurales y deterioros cognitivos similares a los observados en pacientes que sufren traumatismos leves. Por lo tanto, este modelo de caída de peso Marmarou es apropiado para investigar biomarcadores de imágenes para mTBI difuso14,15.

Este informe demuestra la aplicación de rmes de difusión avanzada en un modelo de rata mTBI utilizando el modelo de caída de peso Marmarou. Se muestra por primera vez cómo inducir un traumatismo leve y difuso, y luego se proporciona un análisis utilizando el modelo de imágenes de tensor esdecir de difusión (DTI). La información biológica específica se obtiene con el uso de modelos de difusión más avanzados [es decir, imágenes de kurtosis de difusión (DKI) y modelo de integridad del tracto de materia blanca (WMTI)]. Específicamente, se infligen traumas leves y luego se evalúan los cambios microestructurales en el hipocampo utilizando una resonancia magnética convencional ponderada por T2 y un protocolo avanzado de imágenes de difusión.

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Protocol

El protocolo ha sido aprobado por el Comité de ética animal de la Universidad de Gante (ECD 15/44Aanv), y todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Comisión Europea (Directiva 2010/63/UE).

1. Preparación de animales y fijación del casco

  1. Pesar una rata Wistar H hembra (250 g o 12 semanas de edad) y anestesiar en una pequeña cámara de inducción llena de una mezcla de isoflurano (5%) y O2 durante al menos 1 min.
  2. Inyectar la rata con 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello, devolverla a la jaula del hogar y permitir que la analgesia preventiva durante al menos 30 minutos surta efecto.
    NOTA: Durante la espera de 30 minutos, se puede preparar el sitio quirúrgico.
  3. Coloque una almohadilla calefactora a 37oC bajo el campo quirúrgico. Coloque los instrumentos quirúrgicos esterilizados en el campo quirúrgico que fue desinfectado con 70% de etanol.
  4. Coloque la rata de nuevo en la cámara de inducción y anestetiza la rata hasta que no responda a un pellizco de pata o cola.
  5. Coloque la rata en el campo quirúrgico e inserte un catéter en la vena posterior lateral. A continuación, afeitar la cabeza de la rata, eliminar el exceso de piel y desinfectar el cuero cabelludo y el resto del área quirúrgica con clorohexidina.
  6. Inyectar 100 oL de 2% de lidocaína localmente en el cuero cabelludo.
  7. Haga una incisión de línea media usando un tamaño de bisturí 11 para exponer el cráneo, eliminando cualquier exceso de membranas con tijeras pequeñas. Retirar la piel utilizando un espéculo ocular con una extensión máxima de 1 cm.  Además, retire el periosteum frotando suavemente un bastoncillo de algodón estéril a través del cráneo hasta que el periosteum ya no esté presente.
  8. Ponga una gota de pegamento tisú en el cráneo y otra en el disco metálico esterilizado (diámetro de 10 mm y 3 mm de espesor), que actúa como el casco. Pegue el disco aproximadamente un tercio antes y dos tercios detrás del bregma. Deje que el pegamento se seque durante 1 min.

2. Inducción de lesión cerebral traumática (TBI)

  1. Coloque la rata en la cama hecha a medida con un colchón de espuma de cierta constante de resorte (ver Tabla de Materiales). Coloque la rata directamente debajo de un tubo de plástico transparente con un peso de latón de 450 g con el casco lo más horizontal posible. Separe la rata de la anestesia.
  2. Tire del peso hasta 1 m y suelte cuando esté listo. Asegúrese de que haya un segundo experimentador para alejar la rata del tubo de plástico inmediatamente después del impacto para evitar un segundo impacto.
    NOTA: Las ratas heridas falsas reciben el mismo procedimiento experimental (pasos 1.1–2.7), excepto el paso 2.2.
  3. Vuelva a conectar la rata a la anestesia e inyecte 1 ml de solución fisiológica (0,9% NaCl) a través del catéter para reducir el choque hemodinámico.
    NOTA: Es posible que la rata deje de respirar brevemente debido al impacto. Comprima suavemente el tórax si la rata no respira espontáneamente después de 2 s para estimular el reflejo respiratorio.
  4. Retire el casco tirando suavemente del cráneo. Retire el pegamento restante del cráneo y la piel y cierre la incisión con sutura quirúrgica. Aplique gel de analgesia local con una punta de aplicador estéril.
  5. Coloque la rata en la cama del escáner de tomografía computarizada. Confirme la posición correcta utilizando un escaneo de exploradores. Ajuste el campo de visión para permitir la toma de imágenes de toda la cabeza dentro de una posición de cama. Administrar una tomografía computarizada de propósito general y dosis baja para descartar fracturas de cráneo.
    NOTA: La fractura de cráneo es un criterium para la eutanasia.
  6. Coloque la rata en una jaula limpia sobre una almohadilla de calentamiento (37 oC). Monitorea el tiempo para recuperar la conciencia. Una vez que la rata es capaz de sentarse erguida, la rata puede ser devuelta a la jaula de casa.
  7. Administrar una segunda dosis de 0,05 mg/kg de buprenorfina un día después de la inducción de TBI.

3. Resonancia magnética de difusión (RM)

NOTA: Las imágenes ponderadas por difusión se realizan antes y 1 día después de la inducción del trauma.

  1. Anestesiar a la rata en una pequeña cámara de inducción llena de una mezcla de isoflurano (5%) y O2. Cuando la rata no responde a una pata o pellizco de cola, reduzca la anestesia al 2% con un caudal de 500 ml/min. Transfiera al animal al lecho del escáner en primera posición propensa a la cabeza.
  2. Coloque la rata en el soporte de la cabeza con la barra de dientes y el cono de la nariz, entregando la anestesia, y deslice la cabeza hacia adelante hasta que el centro del cerebro esté en el nivel del centro de la bobina de RMN de volumen de cuadratura. Aplique pomada lubricante en los ojos en pequeñas cantidades para evitar cualquier daño a la córnea. Fije la cabeza con un pequeño trozo de cinta para evitar el movimiento durante el escaneo.
  3. Coloque una almohadilla de presión debajo del tórax de la rata para monitorear la respiración y cubrir la rata con una manta de calentamiento de agua caliente circulante y una envoltura de burbujas para mantener la rata caliente. Antes de la exploración, compruebe el monitor respiratorio para asegurarse de que la señal está clara sin ruido y que el ciclo respiratorio es consistente. Reubique la almohadilla de presión, si es necesario.
    NOTA: La frecuencia respiratoria debe mantenerse entre 1 respiración por 1.200–1.700 ms ajustando el nivel de anestesia entre 1% y 2%.
  4. Deslice la bobina de volumen de la cuadratura sobre la cabeza. Ajuste los capacitores de ajuste y emparejamiento de la bobina a la frecuencia e impedancia adecuadas de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el proveedor de la bobina. Avance el lecho del escáner en el orificio del escáner para comenzar a escanear.
  5. Obtenga un escaneo de explorador de tres planos por defecto ("tripiloto") para garantizar el posicionamiento correcto.
    1. Cargue la secuencia de tripilot en el Control de escaneado haciendo clic en Nuevo análisis y seleccionando la secuencia de tripiloto de la lista de protocolos. A continuación, haga clic en el botón de semáforo para iniciar el análisis.
    2. Cuando el escaneo haya terminado, cargue el escaneo en la pantalla de la imagen y asegúrese de que 1) la cabeza está acostada recta y 2) el cerebro está colocado en el centro del imán y la bobina. Ajuste la posición de la cabeza y/o la cama del escáner, si es necesario, y adquiera un nuevo escaneo de tripiloto.
  6. Ajuste el campo magnético local mediante un protocolo de shimming de segundo orden automatizado: cargue el protocolo shim de segundo orden en el control de escaneado como se describe en el paso 3.5.1. A continuación, haga clic en la pestaña Acq . Ajustes de corriente ? Ajuste específico del método para la Homogeneidad de Campo Local en la ventana Herramienta de Control del Espectrómetro para iniciar el shimming automatizado.
  7. Cargue una nueva secuencia T2 Rapid imaging with Refocused Echoes (RARE) en el control Scan como se describe en el paso 3.5.1.
    1. Adquiera imágenes ponderadas T2 utilizando la configuración predeterminada, excepto los siguientes parámetros:
    2. Abra la pestaña Editar análisis y ajuste el tiempo de repetición (TR) y el tiempo de eco (TE) a 5.500 ms y 37 ms, respectivamente. Además, modifique el campo de visión y el tamaño de la matriz para permitir una resolución en el plano más alta de 109 ám x 109 m (resolución por defecto: 156 m x 156 m). Asegúrese de que el espesor de la rebanada es de 600 m, el número de rodajas se establece en 45 y el factor RARE se establece en 8.
    3. Abra el editor de geometría y coloque el paquete de rebanadas en la posición correcta, incluyendo el bulbo del cerebro y el cerebelo.
  8. Cargue tres nuevas secuencias de giro-eco (DtiEpi) ponderadas por difusión eco-planar desde la carpeta B_DIFFUSION en el protocolo Scan Control como se describe en el paso 3.5.1.
    NOTA: Utilizando tres "conchas" de difusión diferentes, se puede estimar el modelo18 de la imagen tensora de difusión (DTI) modelo4,16, imágenes de kurtosis de difusión (DKI) modelo17e integridad del tracto blanco (WMTI). Se recomienda utilizar al menos tres valores b diferentes, con el valor b más alto que tenga un máximo de 3000 s/mm2 con al menos 15 direcciones espaciadas uniformemente por vaciado de imágenes17.
    1. Adquiera imágenes ponderadas por difusión (DMI) utilizando la configuración predeterminada, aparte de los siguientes ajustes:
    2. Abra la pestaña Editar escaneo y ajuste los parámetros geométricos en la ficha Geometría.
    3. Establezca la orientación de la rebanada en axial y el número de rodajas en 25, lo que resulta en un espesor de rodaja de 500 m y una distancia entre la rodaja de 600 m. Modifique la dirección de lectura en izquierda-derecha.
    4. Haga clic en la pestaña Contraste para ajustar el tiempo de eco a 24 ms y el tiempo de repetición a 6.250 ms.
    5. Establezca el ancho de banda en 250.000 Hz y active la supresión de grasa. Ajuste el número de promedios a uno.
    6. Haga clic en la pestaña Investigación y cambie el número de promedios (segmentos EPI) a 4.
    7. Haga clic en la pestaña Difusión dentro de la pestaña de investigación.
      1. Ajuste el número de direcciones de difusión a 32 para el primer vaciado, 46 para el segundo vaciado y 64 para el tercer vaciado.
      2. Ajuste las direcciones de degradado con archivos de direcciones de degradado personalizados.
      3. Cambie el número de imágenes B0 a 5 para el primer vaciado, 5 para el segundo vaciado y 7 para el tercer vaciado.
      4. Ajuste el valor b por dirección a 800 s/mm2 para el primer vaciado, 1500 s/mm2 para el segundo vaciado y 2000 s/mm2 para el tercer vaciado.
        NOTA: El ajuste de las direcciones de degradado con un archivo de direcciones de degradado personalizado se puede realizar manualmente estableciendo Introducir direcciones de difusión en sí o automáticamente mediante la macro DTI_SET_DIRECTIONS.
    8. Abra el editor de geometría y coloque el campo de visión entre el bulbo y el cerebelo que contiene solo el cerebro para reducir el tiempo de artefacto y escaneo. Coloque seis bandas de saturación de 5 mm fuera del cerebro para reducir los artefactos haciendo clic en Saturación y deslizando las bandas en la posición preferida utilizando las barras de desplazamiento.
      NOTA: El bulbo y el cerebelo se pueden identificar en función de los puntos de referencia anatómicos y las tres imágenes del escaneo del tripiloto.
  9. Adquiera las secuencias importadas haciendo clic en el símbolo del semáforo. Utilizando la configuración de los parámetros descritos anteriormente, el tiempo de adquisición de la exploración T2-RARE es de 12 min, del primer shell DWI 15 min, del segundo shell DWI 21 min y del tercer shell 30 min. El tiempo total de adquisición es de aproximadamente 80 min (en un único sistema de canal receptor).
  10. Al finalizar el protocolo de escaneo, retire el animal de la cama del escáner y colóquelo en una jaula limpia con una almohadilla calefactora a 37 oC. Devuelva al animal a la jaula de casa cuando recupere la conciencia.

4. Procesamiento de imágenes

NOTA: En las secciones siguientes, el procesamiento de las imágenes de difusión se describe en MRtrix3, ExploreDTI19 y Amide software20 que son cajas de herramientas de acceso abierto. Sin embargo, los pasos de preprocesamiento se pueden realizar en otras cajas de herramientas (por ejemplo, FSL, MedInria, DTIStudio).

  1. Transfiera los datos adquiridos desde la consola de adquisición exportando el archivo 2dseq.
  2. Convierta los archivos 2dseq (archivos DWI sin procesar) en el formato .mif, que es el formato estándar de MRtrix3, para permitir más pasos de preprocesamiento en MRtrix3. Además, concatenar los tres shells de difusión utilizando los siguientes comandos en el shell:
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_T2.mih (para las imágenes ponderadas en T2)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi1.mih (para el primer shell de difusión)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi2.mih (para el segundo shell de difusión)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi3.mih (para el tercer shell de difusión)
    mrcat ratID_dwi1.mif ratID_dwi2.mif ratID_dwi3.mif ratID_dwi.mif
  3. Realice la corrección de ruido y la corrección de timbre Gibbs en los DWI en MRtrix321,22. Además, convierta las imágenes DWI corregidas y la imagen T2 al formato NIFTI utilizando los siguientes comandos:
    dwidenoise ratID_dwi.mif ratID_dwi_denoised.mif
    mrdegibbs ratID_dwi_denoised.mif ratID_dwi_denoised_gr.mif
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr.mif ratID.nii
    mrconvert ratID_T2.mif ratID_T2.nii
  4. Realice la corrección de las distorsiones de corriente EPI, motion y Eddy en ExploreDTI:
    1. Convierta las imágenes NIFTI en un archivo .mat haciendo clic en Calcular archivo DTI*.mat . Convertir datos sin procesar en archivo DTI*.mat. Cambie la estimación del tensor de difusión a lineal ponderado y el valor b a NaN. Ajuste el tamaño del voxel a 0,333 0,333 0,6, el número de imágenes no DWI a 17, el número de imágenes DWI a 142 y el tamaño de matriz a 105 105 25.
      NOTA: Al establecer el valor b en NaN, ExploreDTI considerará el conjunto de datos como un conjunto de datos de kurtosis.
    2. Haga clic en la pestaña Configuración para ajustar la configuración de la corrección EPI (esta opción está desactivada de forma predeterminada). Seleccione la corrección SM/EC/EPI, también registrarse en otros datos? y haga clic en Sí, para hacer la corrección EPI (no rígida). Especifique el sufijo de la imagen anatómica T2 correspondiente al conjunto de datos de difusión.
      NOTA: ExploreDTI corrige las distorsiones EPI mediante el registro de imágenes entre la imagen anatómica no distorsionada y la imagen de difusión.
    3. Haga clic en la pestaña Plugins y seleccione Corrección para el movimiento del sujeto y distorsiones EC/EPI y seleccione el archivo de datos de difusión preprocesado del paso 2.3. Asegúrese de que la imagen T2 está en la misma carpeta y tiene la misma base que el nombre del archivo de datos de difusión (por ejemplo, rat1.nii para el DWI y rat1_T2.nii para la imagen anatómica). Este paso generará un archivo "nativo" (*native.mat) y "transformado" (*trafo.mat).
  5. Calcule las métricas de DTI para cada rata haciendo clic en Plugins y Export stuff a *.nii y seleccionando los mapas paramétricos del modelo DTI: anisotropía fraccionaria (FA), difusividad media (MD), difusividad radial (RD) y difusividad axial (AD; denotado como "mayor valor eigenvalue L1").
  6. Además, exporte los mapas paramétricos para el modelo de kurtosis (MK, AK y RK) y el modelo WMTI (AWF, AxEAD, RadEAD y TORT). El procesamiento de las imágenes de difusión dará como resultado 12 mapas paramétricos (Figura1, Figura2, Figura 3) que se pueden utilizar para análisis microestructurales adicionales.
  7. Cree un archivo de máscara para el hipocampo de cada rata con MRtrix3.
    1. Cargue la imagen FA de la rata en el visor de MRtrix haciendo clic en Herramienta y editor de ROI.
    2. Cree un nuevo ROI haciendo clic en el botón "+" y pulse Editar para dibujar el ROI en cada sector que incluya el hipocampo (Figura 4). Para borrar áreas no deseadas del ROI dibujado, pulse el botón derecho del ratón.
    3. Cuando se complete el dibujo del ROI, guarde la imagen de máscara haciendo clic en el botón Guardar.
      NOTA: Este archivo de máscara será un archivo de imagen binario NIFTI con vóxeles de valor 1 que contiene el tejido del hipocampo, y los vóxeles restantes tendrán valores de 0. Para estandarizar la región del hipocampo entre ratas, los mapas paramétricos se pueden registrar con una plantilla específica de estudio con regiones predefinidas de interés delineadas23 o un atlas cerebral de rata.
  8. Para extraer las métricas de difusión del hipocampo de la rata, utilice el archivo de máscara creado del paso 4.6 y abra el software Amide.
    1. Abra los mapas paramétricos y la imagen de máscara de la rata.
    2. Para añadir el ROI del archivo de máscara a Amide, seleccione la imagen del archivo de máscara, haga clic en Editar . Añadir ROI ( ADD ROI ) 3D Isocontour y haga clic en el ROI que se muestra en la imagen de la máscara. Asigne al ROI un nombre significativo y confirme que este volumen solo debe contener vóxeles que tengan un valor de uno.
    3. Para calcular los valores medios de las métricas de difusión en el hipocampo, haga clic en Herramientas . Calcule las estadísticas de ROI e indique las imágenes y el ROI que deben incluirse. Después de hacer clic en Ejecutar, aparecerá otra pantalla con valores calculados que se pueden utilizar para un análisis estadístico posterior. Este archivo se puede guardar o copiar en un formato de datos preferido (por ejemplo, archivo .xlsx o .csv).

5. Análisis estadístico

NOTA: En las secciones siguientes, describimos el procesamiento de las imágenes de difusión en SPSS Statistics 24; sin embargo, el análisis estadístico se puede realizar en otras cajas de herramientas estadísticas.

  1. Cargue los datos en formato ancho en un archivo SPSS *.sav.
  2. Para comprobar las diferencias estadísticas entre los dos grupos para cada punto de tiempo (es decir, línea de base o 1 día después de la lesión), haga clic en Analizar . Pruebas no paramétricas ? Diálogos heredados (Legacy Dialogs) 2 Pruebas de muestras independientes. Cargue las variables que deben probarse y especifique los grupos (es decir, grupos TBI y sham). Indique el Mann-Whitney U como el tipo de prueba.
  3. Para comprobar las diferencias estadísticas entre el 2 punto de tiempo dentro de cada grupo, el archivo de datos debe dividirse. Vaya a Ir a datos, Dividir archivo e indique Comparar grupos. A continuación, haga clic en Analizar, Pruebas no paramétricas, Diálogos heredados, 2 pruebasde muestras relacionadas , cargue las variables que deben compararse e indique Wilcoxon como tipo de prueba.
    NOTA: Para corregir varias comparaciones, los valores p se ajustan para cada modelo de difusión utilizando la corrección de Bonferroni [es decir, el valor p dividido por el número de parámetros comparados (DTI 4, DKI 3 y WMTI 4)]. Más específicamente, p < 0.0125 se considera significativo para los modelos DTI y WMTI, y p < 0.016 se considera significativo para el modelo DKI.

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Representative Results

En el estudio, todas las ratas TBI (n 10) sobrevivieron al impacto y fueron capaces de recuperarse del impacto y la anestesia dentro de 15 minutos después de desprendimiento de la anestesia23. En las imágenes de TC, no había evidencia de fracturas de cráneo y las imágenes T2 no mostraban ninguna anomalía comosangrado, ventrículos agrandados o formación de edema en el lugar de la contusión 1 día después del trauma (Figura 5). Así, sobre la base de estas inspecciones visuales de las imágenes anatómicas, no se detectaron grandes lesiones focales, confirmando la naturaleza difusa y leve de la lesión.

La calidad del paso de registro conjunto (no rígido) entre el conjunto de datos de imagen y difusión T2 (paso 4.4) se examinó añadiendo una superposición de la imagen T2 al mapa FA codificado por color (Figura6). A continuación, se calcularon los mapas paramétricos FA, MD, AD y RD (Figura 1) y se cargaron en el software Amide. Sobre la base del mapa FA, se dibujó un ROI que incluye la estructura del hipocampo (Figura4). Los valores estadísticos de las métricas de difusión se calcularon promediados en todos los vóxeles dentro de la región de interés y los valores medios de cada métrica DTI se exportaron para su posterior análisis. Se puede realizar otra comprobación de calidad de los datos de difusión inspeccionando los valores atípicos en las métricas de DTI. Por ejemplo, los valores FA en el hipocampo deben ser alrededor de 0.15; por lo tanto, los valores de <0.10 (que denota la difusión isotrópica) o >0.30 (los valores se ven en la materia blanca) pueden considerarse como valores biológicamente inverosímiles. Estos puntos de datos deben rechazarse de un análisis posterior. Además, se calcularon los valores medios para AK, RK y MK del modelo de kurtosis de difusión, así como para el AWF, AxEAD, RadEAD y TORT del modelo WMTI (Figura2, Figura3).

En nuestro estudio, el análisis de las métricas de DTI reveló un aumento significativo de los valores de FA (p - 0,007) y disminuyó los valores de difusividad (MD y RD) (p a 0,007 y p a 0,07, respectivamente) después del impacto en el grupo mTBI (Figura7). Estas disminuciones en RD y MD fueron significativamente diferentes del grupo falso (p a 0,005 y p a 0,004, respectivamente). Las métricas de kurtosis de difusión mostraron una disminución significativa en RK (p - 0,005) después del impacto, pero no hay cambios en AK o MK (Figura8). Usando el modelo WMTI, RadEAD (p - 0.007) y TORT (p - 0.007) mostraron un descenso y un aumento significativos, respectivamente, en el grupo mTBI 1 día después del impacto (Figura9C,D). Los valores del grupo falso no mostraron ningún cambio significativo.

Figure 1
Figura 1: Mapas paramétricos representativos para la anisotropía fraccionaria (FA), la difusividad media (MD), la difusividad axial (AD) y la difusividad radial (RD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Mapas paramétricos representativos para la curtosis media (MK), la kurtosis axial (AK) y la kurtosis radial (RK). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Mapas paramétricos representativos para la fracción de agua axonal (AWF), la difusividad extra axonal axial y radial (AxEAD, RadEAD) y la tortuosidad (TORT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Creación de una máscara en MRtrix3. Se dibuja un ROI alrededor del hipocampo en todas las rebanadas que contienen el volumen del hipocampo, y el volumen se guarda como un archivo de máscara. Esto se puede hacer para cada rata individualmente o mediante un archivo de máscara de plantilla específico de estudio en el que cada uno de los mapas paramétricos se puede co-registrar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes ponderadas CT y T2 de un animal mTBI representativo 1 día después del impacto. Las imágenes de TC (fila superior) no muestran ninguna fractura craneal. En las imágenes ponderadas en T2 (fila inferior) no se demostró sangrado, agrandamiento de ventrículos o formación de edema. Cabe destacar que la formación de edema es claramente visible como un área hiperintensa alrededor del área de la herida de la intervención quirúrgica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Mapa FA codificado en color del conjunto de datos de difusión superpuesto con la imagen anatómica después de la corrección para EPI, movimiento y corrección de corriente de Eddy en ExploreDTI. Se muestra una mala corrección y registro previo a la izquierda y buenos ejemplos a la derecha. Debe asegurarse de que la codificación del color es correcta: dirección izquierda-derecha en rojo (por ejemplo, corpus callosum), dirección anterior-posterior en verde y dirección inferior-superior en azul (por ejemplo, cingulum). Además, la imagen FA codificada en color debe estar perfectamente alineada con la imagen anatómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Cambios en las métricas de tensores de difusión del hipocampo para los animales falsos (n a 10) y mTBI (n a 10). Tras el impacto, se produjo un aumento significativo de FA (A) y disminuciones significativas de la difusividad media (B) y la difusividad radial (D) en los animales mTBI (B,D). No se observaron diferencias significativaspara la difusividad axial (C) en las ratas mTBI. Los animales falsos no mostraron ningún cambio significativo en la DTI (*p < 0.0125). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Cambios en las métricas de kurtosis de difusión del hipocampo para animales falsos (n a 10) y mTBI (n.o 10). Tras el impacto, hubo una disminución significativa en RK (C) de los animales mTBI, pero no hay cambios en AK (B) o MK (A). Los animales falsos no mostraron ningún cambio (*p < 0.0166). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Cambios en las métricas de integridad del tracto de materia blanca del hipocampo para animales falsos (n a 10) y mTBI (n a 10). Tras el impacto, hubo una disminución significativa en RadEAD (C) y un aumento significativo en TORT (D) de los animales mTBI, pero no hay cambios en AWF o AxEAD (A,B). Los animales falsos no mostraron ningún cambio (*p < 0.0125). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Dado que el mTBI a menudo es el resultado de una lesión difusa y sutil que no muestra anomalías en las tomografías computarizadas y las resonancias magnéticas convencionales, la evaluación del daño microestructural después de un trauma leve sigue siendo un desafío. Por lo tanto, se necesitan técnicas de diagnóstico por imágenes más avanzadas para visualizar la extensión completa del trauma. La aplicación de imágenes de resonancia magnética de difusión en la investigación TBI ha despertado más interés durante la última década, donde la imagen de tensor de difusión se utiliza con mayor frecuencia5. Una limitación del modelo DTI es la asunción de un proceso de difusión gaussiana que no es una suposición precisa para la microestructura cerebral (que consiste en una compleja red de axónes y células con membranas que actúan como barreras), lo que resulta en métricas de DTI no específicas la microestructura biológica subyacente24. La difusión de imágenes de kurtosis es una extensión del modelo DTI e intenta caracterizar el grado de difusión no gaussiana17. Esto puede proporcionar información adicional sobre la heterogeneidad o complejidad del tejido.

Sin embargo, un inconveniente de los modelos DTI y DKI es que son sólo una representación de la señal de difusión, que caracteriza el perfil de desplazamiento de agua probabilística pero no es específico de la microestructura6. Por otro lado, el modelo de integridad del tracto de materia blanca basado en el tensor de kurtosis es una técnica de mapeo microestructural que incorpora información biológica a priori (suposiciones) en el modelo18. Atribuye la señal de difusión a los compartimentos tisulares y puede evaluar los atributos biológicos más directamente. Por lo tanto, estos modelos biofísicos pueden ofrecer nueva información para describir anomalías después de mTBI y superar este problema de no especificidad6. Utilizando estos tres modelos diferentes, las alteraciones microestructurales y los procesos biológicos fueron capaces de visualizarse siguiendo mTBI con más detalle, específicamente mediante el modelo de caída de peso Marmarou.

El modelo de caída de peso Marmarou es fácil de usar y requiere sólo cirugía menor; sin embargo, se recomienda un segundo experimentador para mover la rata lejos del tubo de vidrio inmediatamente después del primer impacto para evitar un segundo. Además, a veces se requiere para ayudar a la rata a recuperar su reflejo respiratorio después del impacto. El protocolo de RMN bastante largo, con un tiempo total de adquisición de alrededor de 80 min, es bien tolerado tanto por las ratas falsas como por las ratas mTBI. Aunque, durante la exploración, es importante controlar el ciclo respiratorio y ajustar la anestesia si el animal está durmiendo demasiado profundamente o a la ligera. También es importante mantener al animal caliente durante y después de la adquisición hasta que la rata esté completamente despierta para evitar la hipotermia.

En la RMN de difusión avanzada, los artefactos de movimiento deben evitarse tanto como sea posible. Una solución simple para reducir el movimiento durante el escaneo es hacer uso de una barra de dientes y fijar la cabeza con un pequeño trozo de cinta adhesiva o dos barras para los oídos, si está disponible. Esto asegura que la cabeza no se moverá hacia arriba y hacia abajo cada vez que la rata tome un respiro.

Utilizando protocolos de RMN de difusión avanzados, las imágenes adquiridas deben pasar por varios pasos de procesamiento (pre), en su mayoría utilizando diferentes herramientas de software, antes de que puedan ser utilizadas para análisis posteriores. Un inconveniente del uso de diferentes herramientas de software para procesar las imágenes ponderadas por difusión es que (a menudo) cada herramienta utiliza su propio formato de datos para codificar la tabla de direcciones de degradado. MRtrix3 almacena la información de degradado junto con la imagen ponderada por difusión en un archivo .mif, mientras que ExploreDTI hace uso de un archivo independiente (matriz B) para almacenar las direcciones de degradado. Por lo tanto, es importante comprobar que las direcciones de degradado se transfieren correctamente de MRtrix3 a ExploreDTI. Esto se puede hacer comprobando que la codificación de color es correcta en las imágenes FA codificadas en color [es decir, dirección izquierda-derecha en rojo (por ejemplo, corpus callosum), dirección anterior-posterior en verde y dirección inferior-superior en azul (por ejemplo, cingulum)]. Las imágenes FA codificadas en color también se pueden utilizar para comprobar la calidad del proceso de registro conjunto no rígido entre las imágenes ponderadas por difusión y las imágenes estructurales ponderadas por T2.

Con ExploreDTI, se extrajeron mapas paramétricos utilizando los modelos DTI, DKI y WMTI. El modelo DTI proporcionamapas paramétricos para MD, AD, RD y FA, mientras que el modelo DKI proporciona mapas paramétricos para MK, AK y RK. Aunque se calcularon cuatro métricas del modelo WMTI (es decir, AWF, AxEAD, RadEAD, TORT), no fue posible extraer la difusividad intraaxonal (IAD) dentro de ExploreDTI. IAD se puede obtener utilizando una herramienta MATLAB proporcionada por los desarrolladores del modelo WMTI25. Para ello, las imágenes ponderadas por difusión y la información de degradado deben transferirse de nuevo de ExploreDTI a Matlab. Este paso vuelve a ser propenso a errores relacionados con la codificación de la información de degradado. Además, los parámetros kurtosis tensor y WMTI deben estimarse y calcularse de nuevo.

El preprocesamiento de las imágenes adquiridas, la estimación de los tensores y el cálculo de los mapas paramétricos requieren un largo período de tiempo de cálculo. Las correcciones para EPI, movimiento y corriente de reventado requerían 40 min por conjunto de datos en un servidor con ocho núcleos y 16 GB de RAM. Utilizando un análisis de ROI, los valores medios dentro del hipocampo se calcularon antes y 1 día después del impacto. A continuación, se cuantificaron los cambios en las métricas DTI, DKI y WMTI en el grupo mTBI. Sin embargo, en las métricas DKI y AWF del modelo WMTI, se observó una gran variabilidad entre temas, lo que dio lugar a una diferencia inesperada en los valores de línea base entre los grupos sham y mTBI. Esto es probablemente el resultado de vóxeles que contienen valores biológicamente inverosímiles (valores atípicos) dentro de la región investigada y puede filtrarse en estudios futuros antes de calcular los valores medios en Amida.

En conclusión, este protocolo demuestra la viabilidad de la RMN de difusión avanzada para investigar y cuantificar alteraciones microestructurales en el hipocampo en un modelo de rata de mTBI. Utilizando tres modelos de difusión diferentes, se puede obtener información complementaria sobre los procesos biológicos subyacentes que contribuyen a las condiciones después de mTBI. Esto representa un paso adelante en el desarrollo de biomarcadores para mTBI que pueden ser lo suficientemente sensibles como para identificar cambios microestructurales específicos en la fase inicial después de un impacto leve.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Los autores quieren agradecer a Research Foundation - Flandes (FWO) por apoyar este trabajo (Número de subvención: G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

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References

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