العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا نقدم بروتوكول التفكك الميكانيكية لعزل الضامة بسرعة من العقدة الجذر الظهري للنماذج الظاهرية والتحليل الوظيفي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yu, X., Leff, J., Guan, Z. Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages. J. Vis. Exp. (151), e60023, doi:10.3791/60023 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

هناك اهتمامات متزايدة لدراسة التفاعلات الجزيئية والخلوية بين الخلايا المناعية والخلايا العصبية الحسية في العقد ية الجذر الظهري بعد إصابة العصب المحيطي. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة، تستجيب لإصابة الأنسجة من خلال داء الفيغوسية، وعرض مستضد، وإطلاق سراح السيتوكين. وقد تورطت الأدلة الناشئة مساهمة الضامة جذور الظهر في تطوير الألم العصبي وإصلاح axonal في سياق إصابة الأعصاب. الفينول بسرعة (أو "العزلالسريع من") استجابة الضامة الجذور الظهرية في سياق إصابة الأعصاب هو المطلوب لتحديد عوامل المناعة العصبية غير معروف. هنا نبين كيف أن مختبرنا يعزل الضامة بسرعة وفعالية من العقد الجذرية الظهرية باستخدام بروتوكول فك نأفة ميكانيكية خالية من الإنزيمات. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد في جميع أنحاء للحد من الإجهاد الخلوي. هذا البروتوكول هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة بالمقارنة مع البروتوكول الأنزيمي القياسية، وقد استخدمت بشكل روتيني لتحليلنا فرز الخلايا تنشيط الفلورة.

Introduction

هناك الآن أدلة كبيرة على أن الخلايا المناعية تسهم في الألم العصبي بعد إصابة العصب المحيطي1،2. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة الناضجة، تستجيب لإصابة الأنسجة والعدوى الجهازية من خلال داء البلغم، وعرض المستضد، وإطلاق السيتوكين. بالتوازي مع تنشيط microglia الناجم عن إصابة الأعصاب في القرن الظهري الشوكي ، توسع الضامة في العقد ية الجذر الظهرية (DRG) بشكل كبير بعد إصابة الأعصاب3،4. وتجدر الإشارة إلى أن هناك مصالح متزايدة لتحديد ما إذا كانت الضامة تسهم في نمو الألم العصبي بعد إصابة الأعصاب المحيطية من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية الحسية في DRG5،6،7، 8 , 9 , 10 سنوات , 11.وعلاوة على ذلك، والدراسات الحديثة تورط أيضا مساهمة الضامة DRG في إصلاح axonal بعد إصابة الأعصاب12،13. وتشير دراسة أخرى كذلك إلى أن التجمعات السكانية الفرعية في الضامة (أي CD11b+Ly6Chi وCD11b+Ly6Cمنخفضة/- الخلايا) قد تلعب دوراً مختلفاً في فرط الحساسية الميكانيكية14. ولذلك، فإن الفينول بسرعة استجابة الضامة DRG في سياق إصابة الأعصاب قد تساعدنا على تحديد عوامل المناعة العصبية التي تسهم في الألم العصبي.

تقليديا ، فإن بروتوكول عزل الضامة في DRG ينطوي على خطوات متعددة بما في ذلك الهضم الأنزيمي15،16. وغالبا ما تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا ويمكن أن تكون مكلفة بالنسبة للتجارب الواسعة النطاق. على الرغم من أن الهضم الخفيف مع الكولاجين النوع الثاني (4 ملغ / مل) وديسباس النوع الثاني (4.7 ملغ / مل) لمدة 20 دقيقة أوصى سابقا15، فمن المتصور أن الخلايا بعد التعرض لهذا الإنزيم عرضة لتلف الخلايا أو موت الخلايا ، والتي قد تؤدي إلى انخفاض العائد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفرق في نوعية الإنزيمات من دفعة إلى دفعة قد يؤثر بشكل أكبر على كفاءة هذه العملية. والأهم من ذلك، الضامة المعرضة لهضم الإنزيم قد تكون محفزة بشكل غير مرغوب فيه، وبالتالي يمكن أن تكون مختلفة جدا عن الوضع في الجسم الحي. وقد تؤدي التغييرات إلى تعقيد نتائج الدراسة الوظيفية.

هنا نقوم بوصف بروتوكول خال من الإنزيم لعزل الضامة DRG بسرعة في 4 درجة مئوية باستخدام التفكك الميكانيكي. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد للحد من الإجهاد الخلوي. ونتيجة لذلك، يوفر نهجنا ميزة للحفاظ على اتساق العزلة، ويفترض أن الخلايا المعزولة هي أكثر صحة وأقل تحفيزا. كما نقدم الأدلة للتحقق من جودة الخلايا المعزولة مع تحليل فرز الخلايا المنشط ة الفلورية (FACS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو وأجريت وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. جمع DRG القطنية من الفئران التجريبية

  1. قبل بدء التجربة، قم بإعداد حل العمل لوسط تدرج الكثافة (على سبيل المثال، Percoll) عن طريق خلط 9 وحدات تخزين من الوسط مع 1 وحدة تخزين من Ca++/Mg++-free HBSS. أبقيه على الثلج
  2. التخدير الماوس مع 2.5٪ Avertin. تأكد من أن الحيوان هو التخدير الكامل من قبل عدم الاستجابة لقرصة مخلب الخلفية.
    ملاحظة:تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع.
  3. Perfuse الماوس transcardially مع 10 مل من قبل المبردة 1X PBS.
    1. وضع الماوس في موقف supine مع أربعة الكفوف المضمون مع الشريط داخل غطاء محرك الدخان الكيميائية. رفع الجلد تحت القفص الصدري من قبل ملقط، وجعل شق صغير مع مقص الجراحية لفضح الكبد والحجاب الحاجز.
    2. الاستمرار في استخدام مقص لقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري، وفتح التجويف الجنبي لفضح القلب النابض.
    3. بسرعة قطع الزائدة الأذينية الحق مع مقص قزحية العين. بمجرد ملاحظة النزيف، أدخل إبرة 30 G في الطرف الخلفي من البطين الأيسر، وحقن ببطء 10 مل من PBS 1X المبردة مسبقا لperfuse الحيوان.
  4. إجراء استئصال الصفيحات الظهرية15 على الماوس وضعت في موقف عرضة.
    ملاحظة: إذا تم التخطيط لثقافة الخلية، رش الماوس مع الإيثانول 70٪ قبل شق واستخدام الأدوات الجراحية قبل تعقيمها للتشريح.
    1. استخدم مشرط بحجم 11 لإجراء شقوق جانبية طولية عميقة تبدأ من منطقة الصدر وصولاً إلى المنطقة العجزية. إزالة الجلد عن طريق مقص لفضح طبقة العضلات الظهرية.
    2. استخدم فريدمان بيرسون رونجور لتقشير الأنسجة الضامة والعضلات حتى يتم الكشف عن عمليات العمود الفقري اللوبوسكرال والعمليات العرضية الثنائية.
    3. استخدم مقص ربيع نويس لفتح العمود الفقري الظهري بعناية، ثم قم بالتبديل إلى فريدمان بيرسون رونغور لإزالة العظام الفقرية لفضح الحبل الشوكي مع الأعصاب الشوكية السليمة المرفقة.
  5. تشريح بعناية ipsilateral والمضادة القطنية DRG (L4 /L5 DRG في دراستنا) ووضعها في 1 مل من الجليد الباردة Ca++/ Mg++خالية 1X HBSS في المجانسة الأنسجة Dounce. الآن الأنسجة جاهزة للخطوة 2.
    ملاحظة: تقليم العصب الشوكي تعلق على DRG إذا كان ذلك ممكنا.

2. عزل خلايا واحدة من الماوس القطني DRG

  1. تجانس أنسجة DRG مع مدقة فضفاضة في الخالطون Dounce 20-25 مرات.
  2. ضع مصفاة خلية نايلون معقمة بـ 70 م في أنبوب مخروطي معقم بـ 50 مل. الرطب مصفاة الخلية مع 800 درجة مئوية من الجليد البارد 1X HBSS، ويتم جمع تدفق من خلال في أنبوب مخروطي.
  3. جمع تعليق الأنسجة المتجانسة من المجانسة باستخدام ماصة وتمر من خلال الرطب 70 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون في أنبوب مخروطي 50 مل.
  4. شطف المجانسة مرتين مع 800 درجة مئوية من الجليد البارد 1X HBSS ثم decant في نفس أنبوب مخروطي 50 مل مع مصفاة الخلية لزيادة الغلة.
  5. أضف 1.5 مل من وسط تدرج الكثافة متساوي التوتر المثلج (المعد في الخطوة 1.1) إلى أنبوب معقمة من البوليستيرين FACS بـ 5 مل.
  6. نقل التجانس الخلية من أنبوب مخروطي 50 مل (في الخطوة 2.4) في أنبوب FACS، مزيج جيد مع وسط التدرج الكثافة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. أضف 500 ميكرولتر إضافية من HBSS 1x لإغلاق الجزء العلوي.
  7. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  8. يستنشق بعناية supernatant التي تحتوي على الملين في المتوسط دون إزعاج بيليه الخلية في الجزء السفلي من أنبوب FACS.
  9. إعادة تعليق الخلايا في PBS أو FACS العازلة التي تحتوي على 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) لتحليل FACS.
    ملاحظة: من المتوقع أن يكون هناك ما لا يقل عن 50,000 إلى 100,000 خلية من L4/L5 DRG ماوس واحد.
    1. إعادة تعليق خلايا DRG المعزولة ميكانيكيًا (L4/L5) في 100 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على مصل البقر الجنيني بنسبة 5% ثم الحضانة مع الأجسام المضادة CX3CR1-APC (1:2000) في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    2. غسل الخلايا مع 5 مل من PBS مرة واحدة. الطرد المركزي الخلايا 360 × ز لمدة 8 دقائق في 4 درجة مئوية.
    3. يستنشق supernatant، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 300 درجة مئوية من PBS لتحليل FCAS. إذا تم تخطيط فرز الخلايا، قم بإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS بدلاً من ذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتحقق من صحة الخلايا المعزولة، اخترنا أولا ً الفئران المعدلة وراثياً (MAFIA)17. هذا الخط يعبر عن البروتين FK506 المخدرات الانضج (FKBP)-فاس الانتحار الانصهار الجينات والبروتين الفلورسنت الأخضر (eGFP) تحت سيطرة المروج لمستقبلات CSF1 (CSF1R)، والتي يتم التعبير عنها على وجه التحديد في كل من الضامة وmicroglia. حقن الجهازية من ديمرزر البروتين ربط FK, AP20187 (AP), يحفز المبرمج من الخلايا التي تعبر عن transgene. التعبير عن EGFP يسمح لنا أيضا لمراقبة الضامة في DRG. لاستنفاد الضامة في الفئران المافيا، بدأنا دراساتنا مع 3 حقن يومية داخل اقابي AP (1 ملغ / كغ). بعد الحقنة الأخيرة، تم تقسيم DRG لتلطيخ المناعة لGFP. سجلنا خسارة كبيرة من GFP+ الخلايا في DRG من الفئران المعالجة AP مقارنة مع الفئران المعالجة VEH(الشكل 1A-B). في تجربة منفصلة، استخدمنا هذا البروتوكول لفصل الضامة DRG ميكانيكيا بعد العلاج. كشف تحليل FACS اللاحق عن استنفاد ناجح للسكانمرحبا GFP في الفئران المعالجة AP(الشكل 1C-D)وأظهرت جودة عالية من الخلايا المعزولة.

كما قمنا بتوصيف خلايا DRG المعزولة من الفئران البرية. كانت خلايا DRG معزولة ميكانيكيا (L4/L5) ملطخة بالأجسام المضادة CX3CR1-APC ألفا ماوس. وجدنا أن 6٪ من خلايا DRG كانت CX3CR1+ الضامة(الشكل 2A-B). كما تم تقييم صلاحية الخلية مع يوديد بروبيديوم (التركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل) الذي يربط الحمض النووي داخل الخلايا من الخلايا غير القابلة للحياة، وكشف أن أكثر من 80٪ من خلايا DRG معزولة حديثا كانت قابلة للحياة(الشكل 2C-D).

Figure 1
الشكل 1: تحليل FACS من الضامة في DRG من الفئران المافيا بعد العلاج AP.
تلقت فئران المافيا حقن اعادة العين يوميا من 1 ملغ / كغ من AP20187 (AP) أو مركبة (VEH) لمدة 3 أيام قبل التحليل. (ألف، باء) الصور التمثيلية تلطيخ المناعة التي تظهر استنفاد AP الناجمة عن GFP+ (الأخضر) الضامة في L4/L5 DRG بعد العلاج AP3. تم استخدام NF200 (الأزرق) لتسمية الخلايا العصبية myelinated. شريط مقياس:50 درجة مئوية. (جيم، دال) تم تحديد النسبة المئوية لخلاياHI CSF1R-GFP بعد التفكك الميكانيكي لـ L4/5 DRG من خلال تحليل FACS، وتظهر مجموعة بيانات تمثيلية من ثلاث تجارب مستقلة مع النسبة المئوية لفئة الخلايا المسورة المشار إليها. وتبين النتيجة أن 4٪ من مجموع الخلايا المعزولة من DRG من الحيوانات المعالجة VEH كانت GFPمرحبا الضامة. وعلى النقيض من ذلك، كان 0.4٪ فقط من مجموع خلايا DRG GFPمرحبا الضامة في الماوس المعالجة AP. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توصيف أجهزة إدارة الأصول والبيانات ية لالضامة في مجموعة الفئران البرية.
(ألف، باء) تم تجميع Ipsilateral L4 و L5 DRG من الفئران الساذجة من النوع البري للانفصال الميكانيكي. تم قياس النسبة المئوية CX3CR1+ الضامة من خلال تحليل FACS(A). واستند التجهم لCX3CR1+ الخلايا على الفلورة الخلفية في الخلايا الحاضنة مع APC-مترافق isotype السيطرة الأجسام المضادة (B). (جيم، دال) تم تقييم صلاحية الخلايا لخلايا DRG المعزولة حديثاً مع تلطيخ اليودبرويديوم (PI). PI+ الخلايا (C) كانت مسورة على أساس الفلورة الخلفية في الخلايا غير الملطخة (D). وتظهر مجموعة بيانات تمثيلية من ثلاث تجارب مستقلة مع النسبة المئوية لفئة الخلايا المسورة المشار إليها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نقدم طريقة جديدة لإثراء بفعالية الضامة المعزولة من الماوس DRG. النهج التقليدي لعزل الخلايا المناعية DRG يتطلب الهضم الأنزيمي15،18، والتي يتم استبدالها الآن مع التجانس الميكانيكية في بروتوكولنا للحد من تلف الخلايا غير المرغوب فيها وزيادة الغلة. ولذلك، فإن البروتوكول الجديد أقل استهلاكاً للوقت بكثير. والأهم من ذلك، قد يحفز هضم الإنزيم الضامة ويغيّر التوقيع الجزيئي. وعلى النقيض من ذلك، فإن نهجنا الميكانيكي يحد إلى حد كبير من الإجهاد الخلوي.

باستخدام تحليل FACS، ونحن تميز كذلك الضامة في خلايا DRG معزولة وأظهرت انتعاش الخلوية كبيرة. وقد تبين أن أكثر من 80 في المائة من خلايا DRG المعزولة بموجب هذا البروتوكول قابلة للحياة(الشكل 2D). ومن المتوقع ما لا يقل عن 50،000 إلى 100،000 خلية من L4 /L5 DRG من ماوس واحد. لذلك، يمكننا أن نستنتج بثقة أن خلايا DRG يمكن فرزها مرة أخرى إلى التجمعات الفرعية الضامة14 إما للثقافة أو عزل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي قد تؤثر على العائد. وفي حالة ملاحظة غلة الخلية غير المرضية، ينبغي الاشتباه في التجانس غير الكافي أو المفرط في الخطوة 2-1. يمكن استخدام مدى موت الخلايا الذي تم تقييمه مع PI(الشكل 2)أو تلطيخ 7-AAD لتحسين البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، قد يتطلب تشريح DRG في الخطوة 1.4 ممارسة متكررة للمبتدئين.

حاليا، لدينا مختبر يستخدم أساسا هذا البروتوكول لدراسة الضامة DRG. من المرجح، يمكن توسيع تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الخلايا غير العصبية الأخرى في DRG، مثل الخلايا الساتلية19، والخلايا T20. وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتأكيد فعالية عزل الخلايا. لسوء الحظ، لدينا طريقة التفكك الميكانيكية الحالية ليست مثالية لعزل الخلايا العصبية الحسية DRG، والهضم الأنزيمي لا يزال الأسلوب الأكثر فعالية لعزل الخلايا العصبية الحسية15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة تتعلق بهذه المخطوطة.

Acknowledgments

وقد تم دعم الدراسة من قبل: مؤسسة التثقيف والبحوث التخدير (XY)؛ قسم التخدير والرعاية المحيطة بالجراحة (XY) في جامعة كاليفورنيا في لوس أنسياف. و1R01NS100801-01 (GZ). وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مختبر HDFCCC لتحليل الخلايا مرفق الموارد المشتركة من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (P30CA082103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AP20187 Clontech 635058
α-mouse CX3CR1-APC antibody Biolegend 149007
Avertin Sigma T48402
Cell strainer (70 mm nylon) Falcon 352350
Centrifuge Eppendorf 5810R
Dounce tissue homogenizer Wheaton 357538 (1ml)
FACS tubes (5ml) Falcon 352052
Friedman-Pearson Rongeur FST 16121-14
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) Gibco 14185-052
Noyes Spring Scissor FST 15012-12
Percoll Sigma P4937-500ml
Propidium iodide Sigma P4864-10ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354, (6312), 572-577 (2016).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19, (3), 138-152 (2018).
  3. Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184, (2), 590-605 (2003).
  4. Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8, (1), 1778 (2017).
  5. Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22, (5), 1301-1312 (2018).
  6. Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17, (7), 775-786 (2016).
  7. Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86, (1-2), 25-32 (2000).
  8. Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
  9. Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130, (3), 225-234 (2007).
  10. Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158, (9), 1666-1677 (2017).
  11. Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
  12. Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35, (48), 15934-15947 (2015).
  13. Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
  14. Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112, (49), E6808-E6817 (2015).
  15. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2, (1), 152-160 (2007).
  16. Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
  17. Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75, (4), 612-623 (2004).
  18. Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7, (1), 16460 (2017).
  19. Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91, (5), 1085-1096 (2016).
  20. Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21, (5), 518-523 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics