نظام Microdrive الهجين مع مسبار أوبتو السيليكون القابل ة للاسترداد وTetrode لتسجيل الكثافة العالية في الموقع المزدوج في الفئران المتحركة بحرية

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف هذا البروتوكول بناء صفيف محرك صغير هجين يسمح بزرع تسعة تيترودقابل قابل للتعديل بشكل مستقل ومسبار واحد قابل للتعديل للأوبتو-السيليكون في منطقتين من مناطق الدماغ في الفئران المتحركة بحرية. كما تبين طريقة لاسترداد بأمان وإعادة استخدام مسبار السيليكون الأوبتو لأغراض متعددة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto, J. Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (150), e60028, doi:10.3791/60028 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يمكن أن توفر التسجيلات العصبية متعددة المناطق معلومات حاسمة لفهم التفاعلات على نطاق زمني دقيق بين مناطق الدماغ المتعددة. ومع ذلك، فإن تصاميم المحركات الصغيرة التقليدية غالباً ما تسمح فقط باستخدام نوع واحد من الأقطاب الكهربائية للتسجيل من مناطق مفردة أو متعددة، مما يحد من العائد من تسجيلات ملف تعريف وحدة واحدة أو عمق. كما أنه غالباً ما يحد من القدرة على الجمع بين تسجيلات القطب الكهربائي مع الأدوات الوراثية البصرية لاستهداف المسار و / أو نوع الخلية نشاط معين. يعرض هنا مجموعة محرك أقراص صغيرة هجينة للفئران المتحركة بحرية لتحسين العائد ووصف ًا لتلفيقها وإعادة استخدامها لصفيف microdrive. يستخدم التصميم الحالي تسعة tetrodes ومسبار واحد من السيليكون الأوبتو المزروعة في منطقتين الدماغ المختلفة في وقت واحد في الفئران تتحرك بحرية. وtetrodes ومسبار opto-silicon قابلة للتعديل بشكل مستقل على طول محور الظهر في الدماغ لتحقيق أقصى قدر من العائد من وحدة والأنشطة المذبذبة. كما تتضمن صفيفة المحركات الدقيقة هذه مجموعة للمعالجة البصرية الخفيفة والوسيطة للتحقيق في الاستجابات والوظائف الإقليمية أو الخاصة بالخلايا من الدوائر العصبية البعيدة المدى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استعادة مسبار السيليكون الأوبتو بأمان وإعادة استخدامه بعد كل تجربة. نظرًا لأن صفيف microdrive يتكون من أجزاء مطبوعة ثلاثية الأبعاد، يمكن تعديل تصميم محركات الأقراص الصغيرة بسهولة لاستيعاب إعدادات مختلفة. وصف لأول مرة هو تصميم مجموعة microdrive وكيفية إرفاق الألياف البصرية إلى مسبار السيليكون لتجارب علم الوراثة البصرية، تليها تصنيع حزمة tetrode وزرع مجموعة في الدماغ الماوس. كما أن تسجيل الإمكانات الميدانية المحلية والتجسس على الوحدة إلى جانب التحفيز البصري الوراثي يدل أيضاً على جدوى نظام صفيف اتّساع الأقراص الدقيقة في الفئران المتحركة بحرية.

Introduction

من المهم أن نفهم كيف يدعم النشاط العصبي العملية المعرفية، مثل التعلم والذاكرة، من خلال التحقيق في كيفية تفاعل مناطق الدماغ المختلفة بشكل حيوي مع بعضها البعض. لتوضيح ديناميات النشاط العصبي الكامنة وراء المهام المعرفية، وقد أجريت على نطاق واسع الفيزيولوجيا الكهربائية خارج الخلية في الحيوانات تتحرك بحرية مع المعونة من صفائف microdrive1،2،3، 4. في العقدين الماضيين، تم تطوير عدة أنواع من مجموعة microdrive لزرع الأقطاب الكهربائية في مناطق الدماغ متعددة للفئران5،6،7،8 والفئران9، 10 سنوات , 11 , 12.ومع ذلك، تصاميم microdrive الحالية عموما لا تسمح لاستخدام أنواع متعددة من التحقيق، مما اضطر الباحثين لاختيار نوع قطب واحد مع فوائد محددة والقيود. على سبيل المثال، صفائف tetrode تعمل بشكل جيد لمناطق الدماغ ذات الكثافة السكانية العالية مثل الحصين السدورية CA11،13، في حين أن تحقيقات السيليكون تعطي لمحة هندسية أفضل لدراسة الاتصالات التشريحية14 , 15.

وغالبا ما تستخدم Tetrodes وتحقيقات السيليكون لتسجيل في الجسم الحي المزمن، ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة. وقد ثبت Tetrodes لديها مزايا كبيرة في عزل وحدة واحدة أفضل من أقطاب واحدة16،17، بالإضافة إلى فعالية التكلفة والصلابة الميكانيكية. كما أنها توفر عوائد أعلى من أنشطةوحدة واحدة عندما جنبا إلى جنب مع محركات الأقراص الصغيرة 8،18،19،20. من الضروري زيادة عدد الخلايا العصبية المسجلة في وقت واحد لفهم وظيفة الدوائر العصبية21. على سبيل المثال، هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الخلايا للتحقيق في مجموعات صغيرة من أنواع الخلايا غير المتجانسة وظيفيا مثل 22 ذات الصلة بالوقت أو مكافأة الترميز23 خلية. مطلوب أرقام خلايا أعلى بكثير لتحسين جودة فك التشفير من تسلسل ارتفاع13،24،25.

Tetrodes، ومع ذلك، لديها عيب في تسجيل الخلايا الموزعة مكانيا، كما هو الحال في القشرة أو المهاد. وعلى النقيض من التيترودي، يمكن أن توفر تحقيقات السيليكون التوزيع المكاني والتفاعل بين الإمكانات الميدانية المحلية (LFPs) وأنشطة التنصت داخل الهيكل المحلي14و26. تحقيقات السيليكون متعددة الساق زيادة عدد مواقع التسجيل والسماح بالتسجيل عبر هياكل واحدة أو مجاورة27. ومع ذلك، فإن هذه الصفائف أقل مرونة في تحديد مواقع الأقطاب الكهربائية مقارنة بـ tetrodes. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب خوارزميات فرز ارتفاع معقدة في تحقيقات عالية الكثافة لاستخراج المعلومات حول إمكانات العمل من القنوات المجاورة لعكس البيانات التي تم الحصول عليها من قبل tetrodes28،29،30. وبالتالي، فإن العائد الإجمالي للوحدات الفردية غالبا ما يكون أقل من التيترودي. وعلاوة على ذلك، فإن تحقيقات السيليكون غير مواتية بسبب هشاشتها وارتفاع تكلفتها. وبالتالي، فإن اختيار التيتروديس مقابل تحقيقات السيليكون يعتمد على الهدف من التسجيل، وهو ما إذا كان الحصول على عائد عال من الوحدات الواحدة أو التنميط المكاني في مواقع التسجيل هو الأولوية.

بالإضافة إلى تسجيل النشاط العصبي، أصبح التلاعب الجيني البصري واحدة من الأدوات الأكثر قوة في علم الأعصاب لدراسة كيفية مساهمة أنواع الخلايا المحددة و / أو مسارات وظائف الدائرة العصبية13،31، 32و33. ومع ذلك، تتطلب التجارب البصرية الاعتبار الإضافي في تصميم صفيف microdrive لإرفاق موصل الألياف لتحفيز مصادر الضوء34،35،36. في كثير من الأحيان، ربط الألياف البصرية يتطلب قوة كبيرة نسبيا، والتي قد تؤدي إلى تحول ميكانيكي من التحقيق في الدماغ. ولذلك، فإنه ليس مهمة تافهة للجمع بين الألياف البصرية القابلة للزرع إلى صفائف microdrive التقليدية.

للأسباب المذكورة أعلاه، يطلب من الباحثين لتحسين اختيار نوع القطب الكهربائي أو لزرع الألياف البصرية اعتمادا على الهدف من التسجيل. على سبيل المثال يتم استخدام tetrodes لتحقيق أعلى العائد وحدة في الحصين1،13، في حين يتم استخدام تحقيقات السيليكون للتحقيق في ملف عمق اللامينار من المناطق القشرية ، مثل القشرة الانطوفية الوسيطة (MEC)37. وفي الوقت الراهن، تم الإبلاغ عن محركات الأقراص الدقيقة لزرع التيتروديس وتحقيقات السيليكون في وقت واحد للفئران5و11. ومع ذلك، فإنه من الصعب للغاية لزرع tetrodes متعددة وتحقيقات السيليكون في الفئران بسبب وزن microdrives، مساحة محدودة على رأس الماوس، والمتطلبات المكانية لتصميم microdrive لتوظيف تحقيقات مختلفة. على الرغم من أنه من الممكن زرع تحقيقات السيليكون دون microdrive، وهذا الإجراء لا يسمح لتعديل التحقيق ويقلل من معدل نجاح استرداد السيليكون التحقيق12،38. وعلاوة على ذلك، تتطلب التجارب البصريات اعتبارات إضافية في تصميم صفيف اتّساح. يوضح هذا البروتوكول كيفية بناء وغرس صفيف microdrive للتسجيل المزمن في الفئران المتحركة بحرية، والذي يسمح بزرع تسعة tetrodes قابل للتعديل بشكل مستقل وواحد قابل للتعديل البصريات السيليكون التحقيق. كما تسهل هذه المجموعة الميكرودرايف التجارب البصرية واسترداد مسبار السيليكون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من المركز الطبي جنوب غرب جامعة تكساس.

1. الاستعدادات لأجزاء صفيف microdrive

  1. طباعة أجزاء صفيف microdrive باستخدام طابعة 3D باستخدام الراتنج نموذج الأسنان (الشكل1A،B). تأكد من أن سمك الطبقات المطبوعة ثلاثية الأبعاد الفردية أقل من 50 درجة مئوية للحفاظ على الثقوب الصغيرة على الأجزاء المطبوعة واضحة وقابلة للحياة.
    ملاحظة: مجموعة microdrive يتكون من خمسة أجزاء (الشكل1C):(1) الجسم الرئيسي لمجموعة microdrive، والذي يتضمن تسعة مسامير microdrive لtetrodes والمسمار واحد لمسبار السيليكون (الشكل1Ca-d). تنسيق حزمة tetrode وثقب للمسبار opto-silicon في الجزء السفلي يعتمد على إحداثيات منطقة الدماغ المستهدفة (الشكل1Cd)؛ (2) مكوك لإرفاق السيليكون التحقيق أو optrode (الشكل1Ce)؛ (3) جبل التشتم الكهربائي التحقيق لعقد جهاز توصيل السيليكون التحقيق (الشكل1Cf)؛ (4) حامل الطويق الألياف التي المشابك إلى الجزء الأوسط من الجسم لمنع الحركات غير المرغوب فيها من التحقيق الأوبتو السيليكون المزروعة عند توصيل / فصل موصل الألياف البصرية (الشكل1Cg)؛ و (5) مخروط التدريع الذي يوفر التدريع المادي والكهربائي لصفيف microdrive لتسجيل مستقر (الشكل1Ch). الوزن الإجمالي لصفيف microdrive هو 5.9 غرام، بمافي ذلك مخروط التدريع (الجدول 1). إذا تم انسداد الثقوب في الأجزاء المطبوعة، وحفر الثقوب باستخدام بت الحفر: #76 للثقوب الداخلية #68 للثقوب الخارجية لمسامير tetrode-microdrive، #71 لtetrode microdrive المسمار ثقب مؤيد، #77 للثقوب لأدلة المشاركات في الجزء السفلي من الجسم.
  2. إدراج المشاركات الإرشادية في نص صفيف microdrive.
    1. قطع اثنين من أطوال 16 ملم من 26-Ga أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ. شحذ بلطف نصائح الأسلاك باستخدام طاحونة دوارة.
    2. إدراج الأسلاك في الثقوب السفلية من الجسم (الشكل2A). تطبيق كمية صغيرة من الغراء cyanoacrylate في الجزء السفلي من الجسم لتأمين المشاركات دليل.

2. البصريات السيليكون إعداد التحقيق

  1. إعداد المسمار microdrive لمسبار السيليكون.
    ملاحظة: المسمار microdrive للتحقيق السيليكون يتكون من المسمار مخصص (300 درجة مئوية الملعب)، ودعم أنبوب الدعم، وأنبوب على شكل L (الشكل2B).
    1. إعداد القالب لرئيس microdrive (الشكل2C). لبناء القالب، وإعداد نمط من البلاستيك 3D المطبوعة من microdrive (الشكل2Ca). ثم، صب هلام السيليكون السائل بعد صنع جدار زمني عن طريق وضع الأشرطة حول النمط. إزالة فقاعات الهواء عن طريق هز بلطف، والانتظار حتى يتم الشفاء منه، ثم إزالة قالب هلام السيليكون من نمط (الشكل2Cb).
    2. قطع 18 ملم و 9.5 ملم أطوال من 23 G أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام طاحونة دوارة. قم بخشونة أعلى 2-3 ملم من الأسلاك مع طاحونة دوارة لتعزيز التصاق الاكريليك الأسنان.
    3. تأخذ المسمار مخصص واحد وتطبيق كمية صغيرة من زيت السيليكون للحد من الاحتكاك مع الاكريليك الأسنان. تعيين الأسلاك والمسمار مخصص إلى القالب.
    4. صب الاكريليك الأسنان في القالب باستخدام حقنة للقضاء على فقاعات الهواء حول الأسلاك ومسامير. تلوث فقاعة الهواء سيجعل microdrive هشة. انتظر حتى يتم الشفاء الكامل الاكريليك الأسنان، ثم خلع مسامير microdrive من القالب. ثني 6 مم من طرف السلك الأطول إلى زاوية 60 درجة باستخدام كماشة.
    5. تحقق من جودة مسامير microdrive (على سبيل المثال، الشقوق، فقاعات الهواء، والاحتكاك) لتدوير المسمار. إذا كان هناك احتكاك عال، تدوير المسمار حتى تصبح على نحو سلس باستخدام سائق المسمار الكهربائية مع طرف سائق مخصص، والتي الأزواج مع المسمار microdrive.
    6. تثبيت المسمار microdrive في الجسم مجموعة microdrive للتحقق ما إذا كان يتحرك صعودا وهبوطا بسلاسة عن طريق تحويل المسمار. يتم إنشاء المواضيع للالمسمار تلقائيا عند إدراج المسمار في حفرة من الجسم.
  2. إعداد المكوك(الشكل 3Aa).
    1. قطع اثنين من أطوال 5 ملم من أنابيب بوليثيركيتون (نظرة خاطفة) باستخدام مقص حاد. محاذاة الأنابيب على جانبي المكوك. الغراء الأنابيب والمكوك باستخدام الايبوكسي.
    2. تطبيق كمية صغيرة من زيت السيليكون على المشاركات دليل. تحقق من جودة المكوك عن طريق إدراج على المشاركات دليل من الجسم صفيف microdrive. تأكد من أن المكوك يتحرك بسلاسة دون احتكاك مفرط.
  3. إعداد البصريات (الشكل3Ab). يمكن تخطي هذه الخطوة إذا لم تكن هناك حاجة إلى تجربة وراثية بصريات.
    1. تُشقّ الألياف البصرية إلى طولها 21 مم باستخدام قاطع روبي. طحن طرف الألياف لجعل طرف مسطح ولامعة.
    2. وضع بلطف الألياف البصرية على الجانب الأمامي من السيليكون التحقيق. يتم وضع طرف الألياف 200-300 ميكرومتر فوق الجزء العلوي من مواقع القطب الكهربائي. عقد الألياف مؤقتا مع شريط شفاف.
    3. الغراء الألياف البصرية إلى قاعدة السيليكون التحقيق باستخدام كمية صغيرة من الايبوكسي. انتظر 5 ساعة على الأقل حتى يشفى الايبوكسي تماما.
      ملاحظة: من المستحسن إرفاق الألياف البصرية على نفس الجانب مثل مواقع القطب الكهربائي. إرفاق الألياف في الجانب الخلفي قد يمنع الضوء من إضاءة مواقع التسجيل بشكل صحيح.
  4. إرفاق المكوك إلى التحقيق السيليكون (الشكل3Ac):تطبيق كمية صغيرة من الايبوكسي في الجزء الخلفي من قاعدة السيليكون التحقيق. قم بإرفاق الجزء السفلي من المكوك بقاعدة مسبار السيليكون، واثبت بلطف في الموقع لمدة 2-3 دقائق لتجنب تكوين فجوة بين المكوك وقاعدة مسبار السيليكون أثناء العلاج الأولي للإيبوكسي. انتظر ما لا يقل عن 5 ح حتى يشفى الايبوكسي تماما.
  5. إدراج بعناية أنابيب المكوك على المشاركات دليل من الجسم الرئيسي تحت المجهر (الشكل3B). خلال هذا الإجراء، عقد الأخدود من المكوك مع ملاقط غرامة.
  6. إدراج microdrive المسمار في ثقب المسمار عن طريق تحويل المسمار. إشراك التحقيق السيليكون وmicrodrive المسمار عن طريق إدراج غيض من سلك شكل L في الأخدود من رئيس المكوك (الشكل3C).
  7. إرفاق حامل جهاز الاتصال الكهربائية التحقيق إلى الجسم مجموعة microdrive (الشكل3D).
    1. قطع اثنين من مسامير #0 إلى طول الموضوع 3.5 ملم. طحن نصائح لإزالة نتوءات.
    2. ضع حامل جهاز الاتصال على الجسم. ضع موصل السيليكون المسبار الكهربائي في الحامل.
    3. تأمين موصل التحقيق السيليكون في حامل باستخدام الايبوكسي، وتأكد من عدم الغراء إلى الجسم مجموعة microdrive للسماح لإجراء الانتعاش من التحقيق السيليكون. إدراج مسامير لعقد حامل جهاز الاتصال التحقيق.
  8. إرفاق حامل الطويق إلى التحقيق opto-السيليكون وهيئة مجموعة microdrive (الشكل3D).
    1. قطع اثنين من مسامير #0 إلى طول الموضوع 6 ملم. طحن نصائح لإزالة نتوءات.
    2. طحن الجزء الخارجي من اثنين من المكسرات آلة #0 المسمار لجعل المكسرات عرافة صغيرة مع قطرها الخارجي 2.5-3.0 ملم للحد من الوزن والفضاء.
    3. أدخل البراغي في المكون A من الحامل. الغراء رؤساء المسمار باستخدام الايبوكسي.
    4. تطبيق كمية صغيرة من الشحوم السيليكون إلى المكون A و B للحد من الاحتكاك مع الجسم. إدراج المكون A في الجسم، ثم عقد زمنيا باستخدام ملاقط معكوسة.
    5. ضع المكون B على مسامير المكون A. خيط المكسرات حسب الطلب في مسامير. استخدام كماشة لتشديد المكسرات لتأمين حامل الطويق على الجسم.
    6. إدراج الطويق الألياف في الأخدود من حامل الطويق الألياف (المكون B). تأكد من أن الطويق الألياف هو الشائكة 4-5 ملم من حامل.
    7. تطبيق كمية صغيرة من الايبوكسي بين الطويق والأخدود حامل. انتظر حتى يتم الشفاء الكامل الايبوكسي والتحقق من أن الطويق لا تتحرك. تحقق من المكوك وحامل الطويق للحركة على نحو سلس عن طريق تخفيف المكسرات قبل تحويل microdrive المسمار.
    8. تحقق من مسافة العمل من التحقيق. تأكد من أن طرف التحقيق يتراجع تماما في الجسم عندما يكون حامل الطويق في المركز العلوي في حين أن أنابيب المكوك لا تزال مرتبطة مع المشاركات دليل. يتم تحديد مسافة العمل القصوى من خلال طول مسبار السيليكون ومنطقة الدماغ المستهدفة.
    9. إذا كان microdrive المسمار فضفاضة، وتطبيق كمية صغيرة من الاكريليك الأسنان حول المسمار لإضافة المزيد من المواضيع للدعم. عندما يتم علاجه، تدوير المسمار للتحقق من ضيق والاستقرار.

3- إعداد تيترود

ملاحظة: يشبه هذا الإجراء المقالات8و19و20و39المنشورة سابقاً.

  1. إعداد مسامير microdrive لtetrode. وmicrodrive لtetrode يتكون من المسمار المخصصة تشكيله و23 G الأنابيب (الشكل2B). وهذا الإجراء مماثل للفرع 2-1.
  2. جعل حزمة من 30 G أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ التي لديها 5.5 مل الأسلاك داخل. وفي هذه الحالة، استخدم ما مجموعه تسعة أنابيب من نوع 30 غرام (ثمانية أنابيب مسجلة وقطب مرجعي واحد).
  3. خيط حزمة 30 G من الجزء السفلي من جسم محرك الأقراص، وتأمينها مع 20 G أنابيب رقيقة الجدران إلى الجسم الرئيسي. تقليم الجزء السفلي من حزمة مع طاحونة دوارة لجعل غيض حتى وتدفق. تقليم الجزء العلوي من أنابيب 30 G مع طاحونة دوارة بحيث أنبوب 30 G العصي بها حوالي 0.5 ملم من الجسم الرئيسي.
  4. تحميل 5.5 مليون بوليميد أنابيب عازلة في أنابيب 30 G. إعداد أسلاك tetrode وتحميلها في 32 قناة لوحة واجهة كهربائية (EIB). تحقق من الاتصال الكهربائي مع اختبار المقاومة قبل قطع الدقة النهائية.
  5. مقاومة طرف القطب السفلي إلى 250-350 كيلو واط مع حل طلاء الذهب. إصلاح جميع tetrodes مع superglue.
  6. ملء الفجوة المفرطة بين أنبوب بوليميد وtetrode مع الزيوت المعدنية لختم وتزييت. توجيه الأسلاك الأرضية إلى بنك الاستثمار الأوروبي.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن دمج الألياف البصرية على طول أسلاك tetrode12.

4. إرفاق مخروط التدريع

  1. طلاء الفضة موصل الطلاء التدريع على داخل مخروط المطبوعة. وضع مجموعة microdrive داخل المخروط (الشكل3E).
  2. قطع اثنين من مسامير #0 إلى طول الموضوع 3.5 ملم. ربط مسامير من خارج المخروط لعقد مجموعة microdrive في مكان.
  3. تطبيق الطلاء الفضة حول رئيس المسمار لربط كهربائيا مخروط التدريع مع الأرض الكهربائية. تحقق من الاتصال الكهربائي بين الأسلاك الأرضية والمخروط. تطبيق كمية صغيرة من الايبوكسي بين الجسم مجموعة microdrive ومخروط التدريع لإرفاق الجسم بشكل آمن.
    ملاحظة: طريقة أخرى لإعداد مخروط التدريع هو استخدام شريط الألومنيوم40 (الشكل3F). أولا، إعداد ورقة نمط للمخروط التدريع بعد التمسك رقائق الألومنيوم إلى ورقة (الشكل3Fa). ثم، لفة ورقة وإرفاقها إلى الجسم microdrive باستخدام كمية صغيرة من الغراء cyanoacrylate (الشكل3Fb). وزن هذا المخروط هو 0.72 غرام ويتم تخفيض الوزن الإجمالي لصفيف microdriveإلى 4.7 غرام (الجدول 1).

5. جراحة الزرع

ملاحظة: يتم تعديل هذا الإجراء من المقالات المنشورة سابقا18و39و41 لزرع الموقع المزدوج. تأكد من أن وزن الحيوان هو أكثر من 25 غرام لزرع microdrive للانتعاش أسرع بعد الجراحة.

  1. اعداد
    1. لإعداد المسمار الأرض، وإرفاق الأسلاك الفضية إلى المسمار الجمجمة وتطبيق الطلاء الفضي. ثم، إرفاق دبوس الذهب إلى الجانب الآخر من السلك باستخدام الطلاء الفضي.
    2. قم بإعداد محول الضغط على محرك الأقراص للاحتفاظ بصفيف محرك الأقراص الصغيرة إلى جهاز مجسم. إرفاق المتصل الذكور إلى مقبض غير القابل للصدأ باستخدام الايبوكسي. تأكد من أن محاذاة المتصل ومقبض غير القابل للصدأ مستقيمة.
    3. في حالة أن هناك حاجة إلى تأكيد النسيج بعد التسجيل، وتطبيق Di-I إلى tetrodes أو المؤخر من السيليكون التحقيق38.
    4. خفض السيليكون التحقيق وصولا الى عمق المطلوب. تخفيف المكسرات من حامل الطويق باستخدام كماشة، وانخفاض السيليكون التحقيق (opto-السيليكون التحقيق) عن طريق تحويل السيليكون التحقيق microdrive المسمار، ثم ربط المكسرات لتأمين حامل الطويق. عند زرع tetrodes في منطقة فرس النهر CA1 ومسبار السيليكون في MEC، والمسافة بين قنية tetrode وطرف السيليكون التحقيق هو 3-4 ملم.
  2. تعيين الماوس التخدير (0.8٪ -1.5٪ isoflurane) في جهاز مجسم. يتم تأكيد حالة التخدير من الماوس من خلال عدم وجود رد الفعل اصبع القدم قرصة. تطبيق مرهم واضح على العينين لمنع التجفيف. تغطية العينين مع قطعة من احباط للحماية من التعرض للضوء الجراحية القوية.
  3. تطهير فروة رأس الفأر باليود والإيزوبروبانول بعد حلق الفراء. قم بعمل شق 1.5-2.0 سم في فروة الرأس باستخدام مقص جراحي قياسي، وإزالة الأنسجة فوق الجمجمة باستخدام مسحات القطن بعد تطبيق الليدوكائين تحت الجلد.
  4. محاذاة رأس الماوس مع أداة stereotaxic. تأكد من أن الفرق في الارتفاع بين البريما ولامدا أقل من 100 درجة مئوية. تحديد موقع استئصال الجمجمة باستخدام أطلس ووضع علامة على هذه المواقع مع قلم رصاص معقمة.
  5. تثبيت مسامير الجمجمة (قطر 0.8 ملم، 0.200 مم الملعب الموضوع) عن طريق تناوب لهم 1.5 يتحول (0.3 ملم) على الجمجمة، وذلك باستخدام ملاقط الجراحية ومفك بعد حفر 8-11 ثقوب في الجمجمة باستخدام 0.5 ملم بت الحفر.
    ملاحظة: 2-4 ثقوب في الجمجمة الأمامية، 2-3 ثقوب في كل جانب من الجمجمة الجدارية، و1-2 ثقوب في الجمجمة بين البارية.
  6. إرفاق المسمار الأرض إلى الحفرة عن طريق تدوير دورة واحدة (0.2 ملم) بعد حفر حفرة في العظام بين الباريات. تأكد من أن هذه الحفرة لا تخترق من خلال العظام في حالة الدماغ. وإلا، فإن إشارات المخيخ تلوث التسجيل. تحقق من أن المقاومة أقل من 20 كيلو واط في 1 كيلوهرتز بين المسمار الأرضي ومسامير الجمجمة باستخدام متر المعاوقة.
    ملاحظة: سوف يؤدي مقاومة أكبر إدخال القطع الأثرية الحركة أثناء التسجيل.
  7. إجراء استئصال الجمجمة في المواقع المميزة. يمكن ترك دورا سليمة في الفئران.
  8. قم بتوصيل دبوس الذكور من المسمار الأرض وموصل الأرض صفيف microdrive. تحقق من الاتصال باستخدام متر المعاوقة عن طريق قياس بين المسمار الأرض والتدريع.
  9. تعيين صفيف microdrive إلى المحول، وتعيينها إلى جهاز stereotaxic، وخفض ببطء التحقيق السيليكون حتى العمق المطلوب. تأكد من أن حزم tetrode يتم وضعها فوق سطح الدماغ ولكن لا يزال داخل مجموعة microdrive عندما يتم إدراج مسبار السيليكون في الدماغ (الشكل4A).
  10. تطبيق بعناية الشحوم السيليكون لختم منطقة التحقيق السيليكون وحزمة tetrode (الشكل4B). وضع كمية صغيرة من الشحوم السيليكون في غيض من إبرة 20 G وتطبيق الشحوم حول تحقيقات باستخدام الإبرة. كرر حتى الشحوم السيليكون يغطي تماما المنطقة المحيطة التحقيق بحيث الاكريليك الأسنان لا تتدفق على أو تحت الأقطاب الكهربائية / تحقيقات. يجب الحرص على عدم السماح للشحوم لمس مواقع القطب الكهربائي، وإلا فإنه سيزيد بشكل كبير من مقاومة مواقع التسجيل.
  11. تطبيق الاكريليك الأسنان لإصلاح مجموعة microdrive إلى مسامير الإرساء في الجمجمة.
    ملاحظة: فمن المستحسن تطبيق الاكريليك الأسنان في ثلاث طبقات لتجنب الحرارة المفرطة المنتجة أثناء علاج الاكريليك.
  12. قم بإزالة المحول من صفيف محرك الأقراص الصغيرة بعناية. حقن 1 مل من PBS تحت الجلد لمنع الجفاف. حقن 5 مغ/كغ ميلوكسيكام تحت الجلد كعلاج مسكن.
  13. قم بتغطية موصل مسبار السيليكون بواسطة قطعة من الشريط لمنع أي أوساخ من الدخول إلى الداخل من الوصلات الكهربائية. قم بتغطية صفيف الأقراص الصغيرة باستخدام فيلم البارافين البلاستيكي وشريطه في مكانه.
  14. إدارة العلاج مسكن المناسبة لمدة 3 أيام (على سبيل المثال، الحقن تحت الجلد من 2 ملغ / كغ ميلوكسيكام مرة واحدة في اليوم). السماح 3-5 أيام للانتعاش قبل البدء في التكيف tetrode. يظهر الماوس المزروع بعد فترة التعافي في الشكل 4C.

6. استعادة السيليكون التحقيق (الشكل 4D)

  1. حقن الكيتامين (75 ملغ / كغ) وdexmedetomidine (1 ملغ / كغ) التخدير داخل اقصابي وأكد غياب من رد الفعل اصبع القدم قرصة. إصلاح الماوس التخدير عن طريق مباشرة perfusing 4٪ paraformaldehyde من خلال القلب باستخدام غطاء محرك السيارة. وصفت الطرق الجراحية للقوارض سابقا42.
  2. تخفيف المكسرات من حامل الطويق باستخدام كماشة. ثم، نقله بعناية إلى الجزء العلوي من الجسم عن طريق تحويل المسمار ضبط لسحب تماما السيليكون التحقيق نحو داخل الجسم مجموعة microdrive. ربط المكسرات لعقد التحقيق في موقف أعلى.
  3. إخراج الدماغ الماوس من أسفل عن طريق تكسير الجمجمة من الجانب. يتم الآن فصل صفيف microdrive عن الحيوان.
  4. قم بإزالة المسمار الصغير على شكل حرف L الذي يدفع مسبار السيليكون بالكامل. تخفيف وإخراج المكسرات من حامل الطويق باستخدام كماشة. إخراج المكون A من حامل الطويق.
  5. فك تركيب موصل المسبار وفصل عن جسم محرك الأقراص. تحقق من أن موصل التحقيق جبل يمكن أن تأتي قبالة من هيئة صفيف محرك الأقراص الصغيرة.
  6. عقد الجزء العلوي من المكوك مع ملاقط، ثم حرك بعناية الجمعية السيليكون التحقيق من مجموعة microdrive.
  7. تنظيف طرف التحقيق مع نظافة العدسات اللاصقة (أولا مع الإنزيم، ثم 3٪ بيروكسيد الهيدروجين) لمدة يوم واحد على الأقل. مسح بعناية طرف القطب باستخدام منصات isopropanol تحت المجهر. احتفظ بالمسبار في صندوق تخزين خالي من الثبات.
    ملاحظة: المكوك وموصل التحقيق جبل لا تزال تعلق على التحقيق السيليكون ويمكن إعادة استخدامها في زرع المقبل.
    ملاحظة: بعض تحقيقات السيليكون غير مقبولة مع بيروكسيد الهيدروجين. في هذه الحالة، استخدم محلول العدسات اللاصقة التي تحتوي على إنزيم بروتيوليتيك فقط.
  8. لإعادة استخدام جسم صفيف microdrive للجراحة التالية، قم بإزالة أكريليك الأسنان باستخدام مزيج من التدريبات الدقيقة والمقصات. ثم، واستعادة مسامير الجمجمة عن طريق غمر الاكريليك الأسنان إزالتها في الأسيتون. لاحظ أن الأسيتون سوف يذوب أجزاء بلاستيكية من صفيف microdrive.
  9. إزالة الايبوكسي بين الجسم microdrive ومخروط التدريع باستخدام مشرط.
    ملاحظة: لا تحتاج إلى طباعة أجزاء إضافية مرة أخرى للجراحة التالية إذا لم يتم قطع محرك الأقراص الصغيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إنشاء صفيف microdrive في غضون 5 أيام. ويرد وصف للجدول الزمني لإعداد المحركات الصغيرة في الجدول 2. باستخدام هذا microdrive، تم زرع تسعة tetrodes ومسبار السيليكون واحد في CA1 فرس النهر وMEC من الماوس [21 أسبوعا من العمر / 29 ز وزن الجسم الذكور pOxr1-Cre (C57BL/6 الخلفية)]، على التوالي. هذا الماوس المعدلة وراثيا يعبر عن كري في MEC الطبقة الثالثة الخلايا العصبية الهرمية. تم حقن الماوس مع 200 nL من AAV5-DIO-ChR2-YFP (titer: 7.7 × 1012 gc/mL) في MEC 10 أسابيع قبل زرع القطب الكهربائي. تم تسجيل LFPs باستخدام عامل تصفية منخفض التمرير (1-500 هرتز)، وتم الكشف عن وحدات التنصت باستخدام فلتر تمرير عالي (0.8 كيلوهرتز). تم إجراء التحفيز الضوئي (= 450 نانومتر) باستخدام عرض نبض 1 مللي ثانية عند كثافة 10.6 مليواط تم قياسه في نهاية موصل الألياف. تم وضع القطب المرجعي لتسجيل tetrode في المادة البيضاء باستخدام سلك tetrode مخصص. تم تعيين المرجع لتسجيل مسبار السيليكون كالقناة العليا للمسبار.

بعد تعديل tetrode، تم اختبار الأداء السلوكي على مسار خطي (الشكل5A)وفي حقل مفتوح (الشكل5B). في كلتا التجربتين، والماوس استكشاف بحرية لمدة ~ 30 دقيقة (الشكل5AA، ب، ج؛ الشكل 5Ba,b,c). تم تسجيل الإشارات الكهرولوجية بنجاح دون الضوضاء الشديدة المتعلقة بالحركة طوال جلسة التسجيل (الشكل5الإعلان،ه؛ الشكل 5 Bd,e). بعد ذلك، تم إجراء تحفيز الضوء في MEC لتحفيز الخلايا العصبية MEC الطبقة الثالثة التي مشروع إلى CA143 (الشكل6A). تم تسجيل أنشطة التنصت العفوية (الشكل6B،C) وLFPs (الشكل6D)من tetrodes ومسبار السيليكون عندما كان الماوس نائما. وأظهرت الملوثات التي سجلتها هذه المراكز في التزاز أنشطة تموج كبيرة، مما يشير إلى أن جميع التزازات كانت متمركزة بالقرب من طبقة الخلايا الهرمية CA1. وقد لوحظت لأول مرة الأنشطة استجابة الناجمة عن الضوء في MEC، تليها في CA1 مع الكمون 13-18 مللي ثانية (الشكل6E).

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على صفيف محرك الأقراص الصغيرة. (أ) منظر هيكلي لصفيف المحركات الدقيقة، من جانب التيترودي (أ) وجانب مسبار السيليكون (ب). (ب) صورة حقيقية لصفيف الأقراص الصغيرة المحملة، ينظر إليها من جانب تيترود (أ) ومن جانب مسبار السيليكون (ب). يتم وضع صفيف microdrive على مرحلة الرقصة في اللوحة (ب). (C) أجزاء صفيف محرك الأقراص الصغيرة الفردية المطبوعة ثلاثية الأبعاد. (أ-د) جسم صفيف microdrive، ينظر إليه من أربع زوايا مختلفة (أ: عرض جانبي tetrode؛ ب: عرض جانبي للسيليكون ومسبار؛ ج: عرض علوي؛ د: منظر سفلي). تظهر طريقة عرض مكبرة للخط المتقطع في اللوحة (ج) في الشكل 2A. (هـ) المكوك الذي يحمل المسبار السليكوني ويسمح بتعديله. يتم إرفاق مسبار السيليكون في خط متقطع في لوحة (ه). (و) حامل جهاز الربط المسباري، الذي يحمل جهاز اتصال من السيليكون من 32 قناة. (ز) حامل الطويق الألياف، الذي يحمل الرفرة الألياف البصرية لمنع من حركة التحقيق عند توصيل / فصل موصل الألياف مع مصدر الضوء. ويتألف هذا الجزء من عنصرين: [لوحة (ز) والمكونات ألف وباء]. (ح) مخروط التدريع المطبوع، الذي يوفر التدريع المادي والكهربائي عند طلائه بمواد موصلة. تسمح النافذة المخروطية بالقدرة على رؤية داخل الهيكل أثناء إعداد صفيف microdrive، والذي يتم تغطيته في نهاية المطاف بواسطة قطعة من الشريط أو المواد المطبوعة ثلاثية الأبعاد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد المشاركات الإرشادية ومسامير microdrive على الجسم الرئيسي. (أ) دليل ما بعد الإعداد. (أ) عرض مكبر لهيكل صفيف محرك الأقراص الصغيرة المبين في الشكل 1Cc. (ب) توجيه ما بعد الإدراج في ثقوب الجسم. (ب) تصاميم microdrive المسمار. (أ) المسمار microdrive لمسبار السيليكون، والذي يتكون من 300 متر الملعب المسمار مخصص، ودعم أنبوب، وأنبوب على شكل حرف L. (ب) المسمار microdrive لtetrode، والذي يتكون من 160 متر الملعب المسمار مخصص و 30 G أنبوب دليل غير القابل للصدأ. (C) تصنيع الجزء العلوي من مسامير microdrive: (أ) إعداد أنماط 3D المطبوعة من المضادة للقالب لmicrodrive المسمار. تظهر الصورة نمطًا لمفتاح الميكرودرايف من السيليكون. (ب) القالب المصنوع باستخدام نمط مضاد للقالب (أ) والمواد المطاطية السيليكونية. يتم إنتاج تجميعها microdrive مسامير عن طريق إدراج العرف مسامير والأسلاك / أنبوب، وصب الاكريليك الأسنان في كل بئر. الواردة: عرض مكبر ة لآبار القالب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تجميع صفيف محرك الأقراص الصغيرة. (ألف) إعداد مسبار للسليكون الأوبتو. (أ) ربط أنبوبين من أنابيب التوجيه البلاستيكي بالمكوك. (ب) لصق الألياف البصرية إلى السيليكون التحقيق. (ج) ربط المكوك بمسبار السيليكون الأوبتو. في هذه الصورة، يتم إرفاق الجزء السفلي من المكوك (خط متقطع) إلى قاعدة السيليكون التحقيق [الجانب الخلفي من (ب)]. المكوك وعرقوب السيليكون التحقيق ينبغي أن تكون في نفس الوقت. (ب) تحميل تجميع المكوك المسبار الأوبتو السيليكون في المشاركات الإرشادية لهيئة صفيف microdrive. (C) الوضع النسبي للمحرك الصغير للمسبار السيليكوني عندما يتم سحب المسبار بالكامل إلى الجسم (أ) وعندما يتم وضعه في أدنى مستوى في جسم محرك الأقراص (ب). يتم إدخال سلك على شكل حرف L في الأخدود على المكوك. (D) عرض انفجرت من حامل الطويق الألياف وجبل موصل التحقيق. (هـ) مخروط التدريع المرفق. يتم رسم المواد الموصلة داخل المخروط. (و) مخروط التدريع البديل باستخدام ورقة وشريط من الألومنيوم. (أ) ورقة نمطية. (ب) مخروط حماية بديل مرفق، مما يقلل من 1.1 غرام من الوزن مقارنة بالنسخة المطبوعة ثلاثية الأبعاد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ختم التحقيقات أثناء الجراحة واسترداد مسبار السيليكون. (أ) صفيف محرك الأقراص الدقيقة وجمجمة الماوس بعد استئصال الجمجمة، قبل تطبيق الشحوم السيليكونية. يتم إدراج السيليكون التحقيق حوالي 2mm في الدماغ في هذا الوقت. (ب) تطبيق السيليكون الشحوم حول السيليكون التحقيق وحزم tetrode لحماية تحقيقات من الاكريليك الأسنان. (ج) الفأر المزروع بشكل مزمن بعد فترة التعافي، عندما يكون الماوس يمشي (أ)، والاستمالة (ب)، وعند توصيله بكابل التسجيل مع نظام البكرة موازنة (ج). (د) مسبار السيليكون المسترد، قبل (أ) وبعد (ب) الغمر في محلول التنظيف. تتم إزالة الأنسجة البيولوجية في (أ) بعد عملية التنظيف (ب). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: أمثلة على تسجيل تيترود/السيليكون المسبار المتزامن في CA1 فرس النهر والقشرة الإنطابية الوسيطة (MEC) من فأر ة يتصرف. (أ) التسجيل على المسار الخطي. (أ) المسار الخطي المستخدم لإعادة الترميز. (ب) مسارات استكشاف الفأر لمدة 30 دقيقة تقريبًا على المسار. (ج) الأداء السلوكي على المسار الخطي. (د-هـ) تسجيلات LFP التمثيلية من tetrode (d) ومسبار السيليكون (ه). (ب) التسجيل في الميدان المفتوح. (أ) الغرفة الميدانية المفتوحة المستخدمة لإعادة الترميز. (ب) مسارات استكشاف الفأر لمدة 30 دقيقة في الغرفة. (ج) الأداء السلوكي في المجال المفتوح. (د)(ه) تسجيلات LFP التمثيلية من tetrode (d) ومسبار السيليكون (ه). يتم إرفاق LED إلى مكبر للصوت الرأس لتسجيل مواقف الماوس. يتم توصيل المسار الخطي وغرفة المجال المفتوح مع الأرض الكهربائية للحد من الضوضاء الكهروستاتيكية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: النتائج التمثيلية للتسجيلات المتزامنة في CA1 وMEC والتحفيز البصري. (أ) التعبير عن AAV5-DIO-ChR2-YFP بعد 4 أسابيع من الحقن. MEC الطبقة الثالثة الخلايا العصبية الهرمية التي توقع محاورها من MEC الظهرية إلى CA1 الظهرية. خطوط متقطعة: أوري، الطبقة oriens؛ حدق ، والهرم الطبقة ، و راد ، الطبقة رادياتوم ؛ مول، الطبقة لاكونوسوم الجزيئية. (ب) تسجيل ارتفاع تمثيلي من إحدى التزازات. (أ) إسقاطات عنقودية من نوعين للزيادات المسجلة من التزاز. (ب) أمثلة على متوسط شكل موجة الارتفاع لثلاث مجموعات، وهي مبينة بخطوط متقطعة في (أ). (C) تسجيل المسامير التمثيلية من أحد مواقع أقطاب السيليكون. (أ) إسقاطات مجموعة من الجوانب المزدوجة للمكونات الرئيسية للارتفاع الحاد. (ب) أمثلة على متوسط شكل الموجة الحادة لثلاث مجموعات. يتم فصل مجموعات سبايك (الوردي والأخضر) من مجموعات الضوضاء (الأزرق). يتم حساب الكتل في (B,C) باستخدام برنامج KlustaKwik. (د) آثار الـ LFPs التلقائية المسجلة في وقت واحد من التزاز في CA1 (أ) ومسبار السيليكون في MEC (ب). تشير الأسهم السوداء إلى التيترودي المعروضة في (B) وموقع قطب السيليكون المسبار الموضح في (C). (هاء) استجابات LFP للتحفيز البصري النبضي (10.6 مللي واط، 1 مللي ثانية؛ رأس السهم الأحمر المملوء) من التزاز في CA1 (أ) ومسبار السيليكون في MEC (b). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

غرام / واحد عدد مجموع [غرام]
الجسم الرئيسي 1.25 1 1.25
خدمه نقل مكوكيه 0.04 1 0.04
التحقيق المتصل جبل 0.19 1 0.19
الألياف الطويق حامل 0.1 1 0.1
التدريع مخروط 1.82 1 1.82 (0.72)*
لصق موصل 0.2 1 0.2
آلة المسمار (#00، 2 ملم)، لعقد EIB 0.05 2 0.1
آلة المسمار (#0-80، 3.5 ملم) 0.06 4 0.24
آلة المسمار (#0-80، 6mm) 0.09 2 0.18
الجوز 0.03 2 0.06
محرك الأقراص الدقيقة (تيترود) 0.05 9 0.45
محرك الأقراص الدقيقة (مسبار السيليكون) 0.29 1 0.29
السيليكون التحقيق 0.28 1 0.28
لوحة واجهة كهربائية 0.6 1 0.6
مجموع 5.8 (4.7)*

الجدول 1: الوزن الفردي لكل جزء من صفيف اتّز. وكان الوزن الإجمالي لمجموعة microdrive 5.9 غرام بعد إصلاح مخروط واقية مع الايبوكسي (* في حالة استخدام مخروط التدريع البديل باستخدام ورقة وشريط الألومنيوم).

الاجراءات الوقت
إعداد محرك الأقراص الصغيرة
3D أجزاء الطباعة يوم واحد
أوبتركرود إعداد
إعداد القالب لرئيس microdrive يوم واحد*
إعداد رأس محرك الأقراص الصغيرة 3(ساعة)
إرفاق ألياف بصرية 3(ساعة)
إرفاق مكوك 3(ساعة)
إعداد تيترودي
إعداد القالب لرئيس microdrive يوم واحد*
إعداد رؤوس المحركات الصغيرة 3(ساعة)
تحميل أسلاك التيترود يوم واحد
إرفاق مخروط التدريع
الطلاء الطلاء التدريع بين عشية وضحاها*
إرفاق الجسم microdrive 3(ساعة)
* يمكن إجراء هذه الإجراءات بالتوازي

الجدول 2: الجدول الزمني لإعداد محرك الأقراص الصغيرة. الطباعة 3D أجزاء، في انتظار علاج المطاط سيليكون / الأسنان الاكريليك / الايبوكسي، وتحميل الأسلاك tetrode تأخذ معظم الوقت من إعداد مجموعة microdrive، في المجموع 4-5 أيام.

الملفات التكميلية: تتضمن الملفات التكميلية بيانات طراز ثلاثي الأبعاد لخمسة أجزاء microdrive بتنسيق .sldprt و .stl. تم إنشاء ملفات النموذج 3D الأصلي مع البرنامج Solidworks2003. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوضح البروتوكول كيفية بناء وغرس صفيف محرك صغير هجين يسمح بتسجيل الأنشطة العصبية من منطقتين من الدماغ باستخدام tetrodes قابل للتعديل مستقلة ومسبار السيليكون في الفئران تتصرف بحرية. كما أنه يوضح التجارب البصرية واستعادة مسبار السيليكون بعد التجارب. في حين أن قابل للتعديل السيليكون التحقيق33 أو البصريات السيليكون التحقيق36 زرع أظهرت سابقا في الفئران, هذا البروتوكول له مزايا واضحة في مجموعة tetrode في وقت واحد وزرع التحقيق opto-السيليكون لتوفير مرنة اختيار أنواع التحقيق المزروعة. يمكن تبديل نوع التحقيق المزروع اعتمادا على الهدف من التجربة، مثل تحقيقات متعددة الساق27،44 أو فائقة الكثافة Neuropixels21،45. التنسيق وزاوية زرع7 يمكن تعديلها بسهولة في مرحلة تصميم الكائن 3D حسب الحاجة. على سبيل المثال، يمكن تسجيل الموقع المزدوج أو حتى الموقع الثلاثي أثناء مهام التعلم عبر هياكل الدماغ المتعلقة بالذاكرة، مثل الحصين46، القشرة الإنهيرة47، القشرة الأمامية48، اللوزة49، وقشرة اللثة50.

هناك العديد من الإجراءات الحاسمة لنجاح الزرع والتسجيل. بسبب هشاشة المسبارات القائمة على السيليكون، يجب تقليل أي اهتزازات ميكانيكية أو تأثيرات على صفيف microdrive أثناء التجميع. على سبيل المثال، يجب الانتهاء من فتح الثقوب المسدودة باستخدام الحفر قبل تحميل مسبار السيليكون في صفيف محرك الأقراص الصغيرة. أيضا، ينبغي التأكيد على التحقق بعناية من اتصال الأرض في كل خطوة أثناء بناء مجموعة microdrive وجراحة زرع لضمان استقرار البيانات المسجلة. تسبب الاتصالات غير المستقرة أو عالية المعاوقة إلى الأرض ضوضاء شديدة والقطع الأثرية المتعلقة بالحركة أثناء جلسة التسجيل. بالنسبة للتسجيلات المستقرة، من المستحسن الانتظار 1-2 أسابيع بعد الجراحة لتجنب الانجراف الكهربائي لأن أنسجة الدماغ تتأثر سلبا بعملية زرع. ومع ذلك، جودة إشارة على التحقيق السيليكون يتعافى بعد 1-2 أسابيع من الصدمة الجراحية استناداً إلى الخبرة السابقة. من المستحسن استخدام السكن المفرد لمنع الأضرار التي لحقت بمجموعة microdrive المزروعة من قبل الفئران الأخرى. بالنسبة للتجربة البصرية، من المهم أن نلاحظ أن معظم تحقيقات السيليكون تحفز الصور الأثرية استجابة للمحفزات الضوئية51،في حين تم تصميم البعض الآخر لتقليل الصور الأثرية52 (هناك صورة قطعة أثرية خفضت السيليكون تحقيقات التي تتوفر تجاريا).

وزن صفيف microdrive (5.9 غرام) أثقل من محركات الأقراص الدقيقة النموذجية الموصوفة في المواد السابقة12و53، ويرجع ذلك أساسا إلى جسم صفيف microdrive (~ 21٪ من الوزن الإجمالي)، مخروط التدريع (~ 31٪)، والأجزاء المعدنية (مسامير والمكسرات: ~22٪). من المستحسن استخدام الفئران مع أوزان أكثر من 25 غرام (~ 2-3 أشهر من العمر لC57BL/6 الفئران54،55) لعملية زرع ، لأن الفئران مع أوزان الجسم كافية تميل إلى التعافي في وقت سابق. لهذا السبب، قد لا يكون هذا الصفيف microdrive أفضل حل للفئران الأحداث. في حين أن الأجهزة التي هي 5٪ -10٪ من وزن الجسم الماوس غالبا ما توجه إلى أن يتسامح مع يزرع12،56 (على الرغم من عدم وجود دعم البيانات المنشورة لهذا57) ، وهذا صفيف microdrive يزن ~ 24 ٪ من وزن الجسم من 25 غرام الفئران (~ 19٪ عند استخدام مخروط بديل المبينة أدناه).

ومع ذلك، كانت الفئران الكبار المزروعة قادرة على التحرك بحرية والقفز في الأقفاص المنزلية. الفئران المزروعة مع وزن صفيف microdrive مماثلة (~ 4.5 غرام) وقد ثبت سابقا لأداء المهمة السلوكية (مهمة المتاهة الخطية) حتى في ظل تقييد الغذاء13،17. العيب من الوزن ليست مشكلة أثناء التسجيل، كما نظام موازنة موازنة18،34،58 أو نظام البريد 59 سوف تدعم مجموعة microdrive. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقليل الوزن الإجمالي لصفيف microdrive عن طريق خفض الارتفاع أو تقليل سمك مخروط التدريع وتعديل التصميم لاستخدام مسامير أصغر.

باستخدام مواد الطباعة 3D الحالية، يمكن تقليل سمك مخروط التدريع تصل إلى ~ 0.3 ملم (من سمك الحالي من ~ 0.6 ملم). يمكن تخفيض ارتفاع مخروط ~ 5 ملم طالما لا يزال يمكن تغطية أسلاك tetrode. وسيؤدي التعرض لأسلاك التيترود إلى كسر الأسلاك وفشل التسجيل على المدى الطويل. بدلا من ذلك، إعداد مخروط التدريع باستخدام الورق والألومنيوم الشريط يمكن أن تقلل من وزن مخروط إلى ~ 0.7 غرام (~ 15٪ من الوزن الإجمالي؛ خفض 20٪ من الوزن الإجمالي لمجموعة microdrive الأصلي)؛ على الرغم من أن هذه هي المفاضلة مع القوة البدنية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حجم محرك الأقراص الدقيقة (مخروط التدريع الحالي: 4.2 × 4.0 × 2.6 سم = المحور الرئيسي × المحور الصغير × الارتفاع) يمكن أن يكون عقبة أمام الوصول إلى الغذاء والماء إذا تم توفيرها من أعلى القفص الحيواني. طالما أنها يتم توفيرها على أرضية القفص أو من الجدار الجانبي، فإن microdrive لا يزعج السلوكيات الطبيعية للفئران، مثل الأكل أو الشرب أو الاستمالة أو تربية أو التعشيش60.

في الختام، يوفر بروتوكول microdrive هذا للباحثين خيارات مرنة للتسجيل من مناطق الدماغ المتعددة في الفئران المتحركة بحرية لفهم ديناميات ووظائف الدوائر العصبية طويلة المدى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل جزئيا من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم في الخارج الزمالات البحثية (HO)، وهبت برنامج العلماء (TK)، وبرنامج علوم الحدود البشرية (TK)، ومؤسسة أبحاث الدماغ (TK)، كلية العلوم والتكنولوجيا اكتساب واكتساب برنامج الاحتفاظ (TK)، ومؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك (TK)، ومنحة أبحاث مؤسسة سوميتومو (JY)، منحة أبحاث الباحث الشاب NARSAD (JY). نشكر و. ماركس على التعليقات والاقتراحات القيمة أثناء إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#00-90 screw J.I. Morris #00-90-1/8 EIB screws
#0-80 nut Small Parts B00DGB7CT2 brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screw Small Parts B000FMZ57G brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubes Small Parts SLPT-22-24 for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubing Small Parts HTX-23R for tetrode
23 Ga stainless wire Small Parts HTX-23R-24-10 for L-shape/support wire
26 Ga stainless wire Small Parts GWX-0200 for guide-posts
30 Ga stainless wire Small Parts HTX-30R for tetrode
3-D CAD software package Dassault Systèmes SolidWorks 2003
3D printer FormLab Form2
5.5mil polyimide insulating tubes HPC Medical 72113900001-012
aluminum foil tape Tyco Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape for the alternative shielding cone
conductive paste YSHIELD HSF54 for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdrive AMT UNM1.25-HalfMoon half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdrive AMT Yamamoto_0000-160_9mm slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylic Stoelting 51459
dental model resin FormLab RS-F2-DMBE-02
Dremel rotary tool Dremel model 800 a grinder
drill bit Fine Science Tool 19007-05
electric interface board Neuralynx EIB-36-Narrow
epoxy Devcon GLU-735.90 5 minutes epoxy
eye ointment Dechra Puralube Ophthalmic Ointment to prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheet Thorlabs LFG5P for polishing the optical fiber
fine tweezers Protech International 15-368 for loading/recovering the silicon probe
gold pins Neuralynx EIB Pins Small
ground wire A-M Systems 781500 0.010 inch bare silver wire
headstage preamp Neuralynx HS-36
impedance meter BAK electronics Model IMP-2 1 kHz testing frequency
mineral oil ZONA 36-105 for lubricating screws and wires
optical fiber Doric MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording system Neuralynx Digital Lynx 4SX
ruby fiber scribe Thorlabs S90R for cleaving the optical fiber
silicon grease Fine Science Tool 29051-45
silicon probe Neuronexus A1x32-Edge-5mm-20-177 Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probe Neuronexus A1x32-6mm-50-177 Fig. 4C
silicon probe washing solution Alcon AL10078844 contact lens cleaner
silicone lubber Smooth-On Dragon Skin 10 FAST for preparation of microdrive mold
silver paint GC electronic 22-023 silver print II coating, used for ground wires
skull screw Otto Frei 2647-10AC 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissors ROBOZ RS-5880
stereotaxic apparatus Kopf Model 942
super glue Loctite LOC230992 for applying to guide-posts
surgical tweezers ROBOZ RS-5135
Tetrode Twister Jun Yamamoto TT-01
tetrode wires Sandvik PX000004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261, (5124), 1055-1058 (1993).
  2. Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. The Journal of Neuroscience. 16, (2), 823-835 (1996).
  3. Keating, J. G., Gerstein, G. L. A chronic multi-electrode microdrive for small animals. Journal of Neuroscience Methods. 117, (2), 201-206 (2002).
  4. Winson, J. A compact micro-electrode assembly for recording from the freely moving rat. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 35, (2), 215-217 (1973).
  5. Michon, F., et al. Integration of silicon-based neural probes and micro-drive arrays for chronic recording of large populations of neurons in behaving animals. Journal of Neural Engineering. 13, (4), 046018 (2016).
  6. Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162, (1-2), 129-138 (2007).
  7. Billard, M. W., Bahari, F., Kimbugwe, J., Alloway, K. D., Gluckman, B. J. The systemDrive: a Multisite, Multiregion Microdrive with Independent Drive Axis Angling for Chronic Multimodal Systems Neuroscience Recordings in Freely Behaving Animals. eNeuro. 5, (6), (2018).
  8. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  9. Lu, P. L., et al. Microdrive with Two Independent Moveable Sets for Wide-Ranging, Multi-Site, Multi-Channel Brain Recordings. Journal of Medical and Biological Engineering. 34, (4), 341-346 (2014).
  10. Haiss, F., Butovas, S. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. Journal of Neuroscience Methods. 187, (1), 67-72 (2010).
  11. Headley, D. B., DeLucca, M. V., Haufler, D., Pare, D. Incorporating 3D-printing technology in the design of head-caps and electrode drives for recording neurons in multiple brain regions. Journal of Neurophysiology. 113, (7), 2721-2732 (2015).
  12. Voigts, J., Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: an ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8 (2013).
  13. Yamamoto, J., Tonegawa, S. Direct Medial Entorhinal Cortex Input to Hippocampal CA1 Is Crucial for Extended Quiet Awake Replay. Neuron. 96, (1), 217-227 (2017).
  14. Schomburg, E. W., et al. Theta phase segregation of input-specific gamma patterns in entorhinal-hippocampal networks. Neuron. 84, (2), 470-485 (2014).
  15. Fernandez-Ruiz, A., et al. Entorhinal-CA3 Dual-Input Control of Spike Timing in the Hippocampus by Theta-Gamma Coupling. Neuron. 93, (5), 1213-1226 (2017).
  16. Rey, H. G., Pedreira, C., Quian Quiroga, R. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, (Pt B), 106-117 (2015).
  17. Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. Journal of Neuroscience Methods. 63, (1-2), 43-54 (1995).
  18. Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100, (4), 2430-2440 (2008).
  19. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  20. Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., Angelaki, D. E. Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  21. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, (7679), 232-236 (2017).
  22. Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321, (5894), 1322-1327 (2008).
  23. Gauthier, J. L., Tank, D. W. A Dedicated Population for Reward Coding in the Hippocampus. Neuron. 99, (1), 179-193 (2018).
  24. Davidson, T. J., Kloosterman, F., Wilson, M. A. Hippocampal replay of extended experience. Neuron. 63, (4), 497-507 (2009).
  25. Gerwinn, S., Macke, J., Bethge, M. Bayesian population decoding of spiking neurons. Frontiers in Computational Neuroscience. 3, 21 (2009).
  26. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64, (3), 404-418 (2009).
  27. Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. Journal of Neurophysiology. 90, (2), 1314-1323 (2003).
  28. Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19, (9), 1165-1174 (2016).
  29. Hilgen, G., et al. Unsupervised Spike Sorting for Large-Scale, High-Density Multielectrode Arrays. Cell Reports. 18, (10), 2521-2532 (2017).
  30. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature neuroscience. 19, (4), 634-641 (2016).
  31. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14, (3), 031001 (2017).
  32. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, (3), 338-346 (2014).
  33. Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157, (4), 845-857 (2014).
  34. Rangel Guerrero, D. K., Donnett, J. G., Csicsvari, J., Kovacs, K. A. Tetrode Recording from the Hippocampus of Behaving Mice Coupled with Four-Point-Irradiation Closed-Loop Optogenetics: A Technique to Study the Contribution of Hippocampal SWR Events to Learning. eNeuro. 5, (4), (2018).
  35. Liang, L., et al. Integrated and Quick-to-Assemble (SLIQ) Hyperdrives for Functional Circuit Dissection. Frontiers in Neural Circuits. 11, 8 (2017).
  36. Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7, (1), 2773 (2017).
  37. Quilichini, P., Sirota, A., Buzsaki, G. Intrinsic circuit organization and theta-gamma oscillation dynamics in the entorhinal cortex of the rat. The Journal of Neuroscience. 30, (33), 11128-11142 (2010).
  38. Sauer, J. F., Struber, M., Bartos, M. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  39. Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
  40. Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. Journal of Visualized Experiments. 91, (91), e51675 (2014).
  41. Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. Journal of Neuroscience Methods. 178, (2), 291-300 (2009).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  43. Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal cortex layer III input to the hippocampus is crucial for temporal association memory. Science. 334, (6061), 1415-1420 (2011).
  44. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. The European Journal of Neuroscience. 31, (12), 2279-2291 (2010).
  45. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 92-100 (2018).
  46. Jones, M. W., Wilson, M. A. Theta rhythms coordinate hippocampal-prefrontal interactions in a spatial memory task. PLoS Biology. 3, (12), e402 (2005).
  47. Frank, L. M., Brown, E. N., Wilson, M. A. A comparison of the firing properties of putative excitatory and inhibitory neurons from CA1 and the entorhinal cortex. Journal of Neurophysiology. 86, (4), 2029-2040 (2001).
  48. Kitamura, T., et al. Eng and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science. 356, (6333), 73-78 (2017).
  49. McGaugh, J. L., Cahill, L., Roozendaal, B. Involvement of the amygdala in memory storage: interaction with other brain systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (24), 13508-13514 (1996).
  50. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, (5672), 881-883 (2004).
  51. Mikulovic, S., et al. On the photovoltaic effect in local field potential recordings. Neurophotonics. 3, (1), 015002 (2016).
  52. Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49, (2), 169-177 (2019).
  53. Meng, E., Hoang, T. MEMS-enabled implantable drug infusion pumps for laboratory animal research, preclinical, and clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, (14), 1628-1638 (2012).
  54. Hu, S., et al. Dietary Fat, but Not Protein or Carbohydrate, Regulates Energy Intake and Causes Adiposity in Mice. Cell Metabolism. 28, (3), 415-431 (2018).
  55. Yang, Y., Smith, D. L. Jr, Keating, K. D., Allison, D. B., Nagy, T. R. Variations in body weight, food intake and body composition after long-term high-fat diet feeding in C57BL/6J mice. Obesity. 22, (10), 2147-2155 (2014).
  56. Morton, D. B., et al. Refinements in telemetry procedures. Seventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement, Part A. Laboratory Animals. 37, (4), 261-299 (2003).
  57. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  58. Lin, L., et al. Large-scale neural ensemble recording in the brains of freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 28-38 (2006).
  59. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
  60. Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics