रिकवरेबल ऑप्टो-सिलिकॉन जांच और स्वतंत्र रूप से चल चूहे में दोहरी साइट उच्च घनत्व रिकॉर्डिंग के लिए Tetrode के साथ हाइब्रिड Microdrive प्रणाली

Neuroscience

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Summary

इस प्रोटोकॉल एक संकर microdrive सरणी है कि स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में दो मस्तिष्क क्षेत्रों में नौ स्वतंत्र रूप से समायोज्य tetrodes और एक समायोज्य ऑप्टो-सिलिकॉन जांच के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है के निर्माण का वर्णन करता है. यह भी प्रदर्शन सुरक्षित रूप से ठीक होने और कई प्रयोजनों के लिए ऑप्टो-सिलिकॉन जांच reusing के लिए एक विधि है।

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Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto, J. Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (150), e60028, doi:10.3791/60028 (2019).

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Abstract

बहु क्षेत्रीय तंत्रिका रिकॉर्डिंग कई मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच ठीक timescale बातचीत को समझने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, पारंपरिक microdrive डिजाइन अक्सर केवल एक या एकाधिक क्षेत्रों से रिकॉर्ड करने के लिए इलेक्ट्रोड का एक प्रकार के उपयोग की अनुमति, एकल इकाई या गहराई प्रोफ़ाइल रिकॉर्डिंग की उपज सीमित. यह भी अक्सर पथ को लक्षित करने के लिए optogenetic उपकरणों के साथ इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग गठबंधन करने की क्षमता को सीमित करता है और / यहाँ प्रस्तुत स्वतंत्र रूप से चलती चूहों उपज और इसके निर्माण और microdrive सरणी के पुन: उपयोग का वर्णन करने के लिए एक संकर microdrive सरणी है. वर्तमान डिजाइन नौ tetrodes और एक ऑप्टो-सिलिकॉन जांच स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में एक साथ दो अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रत्यारोपित कार्यरत हैं. Tetrodes और ऑप्टो-सिलिकॉन जांच इकाई और दोलन गतिविधियों की उपज को अधिकतम करने के लिए मस्तिष्क में डोर्सोवेन्ट्रोल अक्ष के साथ स्वतंत्र रूप से समायोज्य हैं। इस microdrive सरणी भी प्रकाश के लिए एक सेट अप शामिल, क्षेत्रीय या सेल प्रकार विशिष्ट प्रतिक्रियाओं और लंबी दूरी की तंत्रिका सर्किट के कार्यों की जांच करने के लिए optogenetic हेरफेर मध्यस्थता. इसके अलावा, ऑप्टो-सिलिकॉन जांच को प्रत्येक प्रयोग के बाद सुरक्षित रूप से पुनर्प्राप्त और पुन: उपयोग किया जा सकता है। क्योंकि microdrive सरणी 3 डी मुद्रित भागों के होते हैं, microdrives के डिजाइन आसानी से विभिन्न सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. सबसे पहले वर्णित microdrive सरणी के डिजाइन और कैसे optogenetics प्रयोगों के लिए एक सिलिकॉन जांच करने के लिए ऑप्टिकल फाइबर संलग्न करने के लिए, tetrode बंडल के निर्माण और एक माउस मस्तिष्क में सरणी के प्रत्यारोपण के बाद है. स्थानीय क्षेत्र क्षमता और इकाई optogenetic उत्तेजना के साथ संयुक्त spiking की रिकॉर्डिंग भी स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में microdrive सरणी प्रणाली की व्यवहार्यता का प्रदर्शन.

Introduction

यह कैसे न्यूरॉन गतिविधि संज्ञानात्मक प्रक्रिया का समर्थन करता है समझने के लिए महत्वपूर्ण है, इस तरह के सीखने और स्मृति के रूप में, जांच कैसे विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों गतिशील रूप से एक दूसरे के साथ बातचीत द्वारा. संज्ञानात्मक कार्यों अंतर्निहित तंत्रिका गतिविधि की गतिशीलता को स्पष्ट करने के लिए, बड़े पैमाने पर extracellular इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी microdrive सरणियों की सहायता से स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में आयोजित किया गया है1,2,3, 4. पिछले दो दशकों में, कई प्रकार के माइक्रोड्राइव सरणी को चूहों के लिए कई मस्तिष्क क्षेत्रों में इलेक्ट्रोड लगाने के लिए विकसित किया गया है5,6,7,8 और चूहों9, 10 , 11 , 12. फिर भी, वर्तमान microdrive डिजाइन आम तौर पर कई जांच प्रकार के उपयोग के लिए अनुमति नहीं है, शोधकर्ताओं को विशिष्ट लाभ और सीमाओं के साथ एक भी इलेक्ट्रोड प्रकार का चयन करने के लिए मजबूर. उदाहरण के लिए, टेट्रोड सरणियां घनी आबादी वाले मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस सीए11,13के लिए अच्छी तरह से काम करती हैं, जबकि सिलिकॉन जांच शारीरिक कनेक्शन14 का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर ज्यामितीय प्रोफ़ाइल देती है , 15.

Tetrodes और सिलिकॉन जांच अक्सर विवो पुरानी रिकॉर्डिंग में के लिए उपयोग किया जाता है, और प्रत्येक अपने फायदे और नुकसान है. Tetrodes लागत प्रभावशीलता और यांत्रिक कठोरता के अलावा एकल इलेक्ट्रोड16,17की तुलना में बेहतर एकल इकाई अलगाव में महत्वपूर्ण लाभ के लिए सिद्ध किया गया है. वे माइक्रोड्राइव8,18, 19,20के साथ संयुक्त होने पर एकल इकाई गतिविधियों की अधिक पैदावार भी प्रदानकरतेहैं . तंत्रिका परिपथों21के प्रकार्य को समझने के लिए एक साथ अभिलेखित न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि करना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, समय से संबंधित22 या इनाम कोडिंग23 कोशिकाओं जैसे कार्यात्मक विषमांगी सेल प्रकारों की छोटी आबादी की जांच करने के लिए बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। स्पाइक अनुक्रमों13,24,25की डिकोडिंग गुणवत्ता में सुधार करने के लिए बहुत अधिक कोशिका संख्याओं की आवश्यकता होती है .

Tetrodes, हालांकि, इस तरह के प्रांतस्था या thalamus में के रूप में स्थानिक रूप से वितरित कोशिकाओं, रिकॉर्डिंग में एक नुकसान है। टेट्रोड के विपरीत, सिलिकॉन जांच स्थानिक वितरण और स्थानीय क्षेत्र क्षमता (एलएफपी) की बातचीत और एक स्थानीय संरचना14,26के भीतर spiking गतिविधियों प्रदान कर सकते हैं। मल्टी-शैंक सिलिकॉन जांच आगे रिकॉर्डिंग साइटों की संख्या में वृद्धि और एकल या पड़ोसी संरचनाओं27भर में रिकॉर्डिंग की अनुमति देते हैं। तथापि, ऐसी सरणियाँ टेट्रोडों की तुलना में इलेक्ट्रोड स्थलों की स्थिति में कम लचीली होती हैं। इसके अलावा, जटिल स्पाइक छँटाई एल्गोरिदम उच्च घनत्व जांच में आवश्यक हैं tetrodes द्वारा प्राप्त डेटा दर्पण के लिए पड़ोसी चैनलों की कार्रवाई क्षमता के बारे में जानकारी निकालने के लिए28,29,30. इसलिए, एकल इकाइयों की समग्र उपज अक्सर टेट्रोड से कम होती है। इसके अलावा, सिलिकॉन जांच उनकी कमजोरी और उच्च लागत के कारण हानिकारक हैं। इस प्रकार, tetrodes बनाम सिलिकॉन जांच का चुनाव रिकॉर्डिंग के उद्देश्य पर निर्भर करता है, जो कि क्या रिकॉर्डिंग साइटों पर एकल इकाइयों या स्थानिक रूपरेखा की एक उच्च उपज प्राप्त करने की एक सवाल है प्राथमिकता है.

तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्डिंग के अलावा, optogenetic हेरफेर तंत्रिका विज्ञान में अधिक शक्तिशाली उपकरणों में से एक बनगया है की जांच कैसे विशिष्ट सेल प्रकार और / 32,33. तथापि, ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए माइक्रोड्राइव सरणी डिजाइन में अतिरिक्त विचार करने की आवश्यकता होती है ताकि फाइबर कनेक्टर को उत्तेजना प्रकाश स्रोतों34,35,36से जोड़ा जा सके । अक्सर, फाइबर ऑप्टिक्स को जोड़ने के लिए एक अपेक्षाकृत बड़ी शक्ति की आवश्यकता होती है, जो मस्तिष्क में जांच के यांत्रिक बदलाव का कारण बन सकती है। इसलिए, यह पारंपरिक microdrive सरणियों के लिए एक प्रत्यारोपण ऑप्टिकल फाइबर गठबंधन करने के लिए एक तुच्छ काम नहीं है.

उपरोक्त कारणों के लिए, शोधकर्ताओं इलेक्ट्रोड के प्रकार के चयन का अनुकूलन करने के लिए या रिकॉर्डिंग के उद्देश्य के आधार पर एक ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपण करने के लिए आवश्यक हैं. उदाहरण के लिए टेट्रोड का उपयोग हिप्पोकैम्पस1,13में उच्च इकाई उपज प्राप्त करने के लिए किया जाता है , जबकि सिलिकॉन जांच का उपयोग कॉर्टिकल क्षेत्रों के स्तरीय गहराई प्रोफाइल की जांच करने के लिए किया जाता है , जैसे कि मध्य एन्टोरिनल कॉर्टेक्स (एमईसी )37. वर्तमान में, चूहों के लिए टेट्रोड और सिलिकॉन जांच के एक साथ प्रत्यारोपण के लिए माइक्रोड्राइव5,11की सूचना दी गई थी। हालांकि, यह microdrives के वजन की वजह से चूहों में कई tetrodes और सिलिकॉन जांच प्रत्यारोपण करने के लिए बेहद चुनौतीपूर्ण है, माउस सिर पर सीमित स्थान, और विभिन्न जांच को रोजगार के लिए microdrive डिजाइन करने के लिए स्थानिक आवश्यकताओं. हालांकि यह एक microdrive के बिना सिलिकॉन जांच प्रत्यारोपण करने के लिए संभव है, इस प्रक्रिया की जांच के समायोजन के लिए अनुमति नहीं देता है और सिलिकॉन जांच वसूली की सफलता दर को कम करतीहै 12,38. इसके अलावा, ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को माइक्रोड्राइव सरणी डिजाइन में अतिरिक्त विचारों की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल का निर्माण और स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में पुरानी रिकॉर्डिंग के लिए एक microdrive सरणी प्रत्यारोपण करने के लिए कैसे दर्शाता है, जो नौ स्वतंत्र रूप से समायोज्य tetrodes और एक समायोज्य ऑप्टो-सिलिकॉन जांच के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है. इस microdrive सरणी भी optogenetic प्रयोगों और सिलिकॉन जांच की वसूली की सुविधा.

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों टेक्सास दक्षिण पश्चिमी चिकित्सा केंद्र के विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. microdrive सरणी भागों की तैयारी

  1. दंत मॉडल राल का उपयोग कर के एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग कर microdrive सरणी भागों मुद्रित (चित्र 1A,बी). सुनिश्चित करें कि मुद्रित भागों पर छोटे छेद स्पष्ट और व्यवहार्य रखने के लिए अलग-अलग 3 डी मुद्रित परतों की मोटाई 50 डिग्री से कम है।
    नोट: microdrive सरणी पांच भागों के होते हैं (चित्र 1C):(1) microdrive सरणी के मुख्य शरीर है, जो tetrodes के लिए नौ microdrive-screws और एक पेंच शामिल हैं एक सिलिकॉन जांच के लिए (चित्र 1Ca-d). तल पर ऑप्टो-सिलिकॉन जांच के लिए टेटरोड बंडल और होल का समन्वय लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र के निर्देशांकों पर निर्भर करता है (चित्र 1Cd); (2) एक शटल एक सिलिकॉन-प्रोब या optrode संलग्न करने के लिए (चित्र 1Ce); (3) सिलिकॉन जांच कनेक्टर को पकड़ने के लिए एक जांच विद्युत संयोजी माउंट (चित्र 1Cf; (4) एक फाइबर ferrule धारक है कि शरीर के केंद्र भाग के लिए clamps प्रत्यारोपण ऑप्टो-सिलिकॉन जांच के अवांछितआंदोलनों को रोकने के लिए जब plugging / और (5) एक परिरक्षण शंकु जो स्थिर अभिलेखन के लिए माइक्रोड्राइव सरणी को भौतिक और विद्युत परिरक्षण प्रदान करता है (चित्र 1च)। माइक्रोड्राइव सरणी का कुल भार 5ण्9 ह है, जिसमें परिरक्षण शंकु (सारणी1)शामिल है। यदि छेद मुद्रित भागों में भरा हुआ है, ड्रिल बिट्स का उपयोग कर छेद बाहर ड्रिल: #76 भीतरी छेद के लिए और tetrode-microdrive शिकंजा के लिए बाहरी छेद के लिए #68, tetrode microdrive-screw समर्थक छेद के लिए #71, और #77 के नीचे गाइड-पोस्ट के लिए छेद के लिए शरीर.
  2. microdrive सरणी शरीर में गाइड पदों की प्रविष्टि.
    1. 26-Ga स्टेनलेस स्टील के तार के दो 16 मिमी लंबाई में कटौती. धीरे से एक रोटरी चक्की का उपयोग कर तार युक्तियाँ पैनापन.
    2. तार को शरीर के निचले छिद्रों में सम्मिलित करें (चित्र 2क) गाइड पदों को सुरक्षित करने के लिए शरीर के तल पर cyanoacrylate गोंद की एक छोटी राशि लागू करें.

2. ऑप्टो-सिलिकॉन जांच की तैयारी

  1. एक सिलिकॉन जांच के लिए microdrive पेंच तैयार करें.
    नोट: सिलिकॉन जांच के लिए microdrive पेंच एक कस्टम पेंच के होते हैं (300 डिग्री मीटर पिच), एक समर्थन ट्यूब का समर्थन, और एक एल आकार ट्यूब (चित्र 2B).
    1. माइक्रोड्राइव हेड के लिए मोल्ड तैयार की जा रही है (चित्र 2ब्) मोल्ड का निर्माण करने के लिए, माइक्रोड्राइव के 3 डी मुद्रित प्लास्टिक पैटर्न तैयार करें (चित्र 2Ca)। फिर, पैटर्न के चारों ओर टेप डाल द्वारा एक अस्थायी दीवार बनाने के बाद तरल सिलिकॉन जेल डालना. धीरे से मिलाते हुए हवा के बुलबुले निकालें, जब तक यह ठीक हो जाता है प्रतीक्षा करें, तो पैटर्न से सिलिकॉन-जेल मोल्ड निकालें (चित्र 2Cb)।
    2. एक रोटरी चक्की का उपयोग कर 23 जी स्टेनलेस तार के 18 मिमी और 9.5 मिमी लंबाई में कटौती। दंत एक्रिलिक के आसंजन को बढ़ाने के लिए एक रोटरी चक्की के साथ तारों के शीर्ष 2-3 मिमी Rroughen.
    3. एक कस्टम पेंच ले लो और सिलिकॉन तेल की छोटी राशि लागू करने के लिए दंत एक्रिलिक के साथ घर्षण को कम. तारों और मोल्ड करने के लिए एक कस्टम पेंच सेट करें।
    4. तारों और शिकंजा के आसपास हवा के बुलबुले को खत्म करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग कर मोल्ड में दंत एक्रिलिक डालो। वायु बबल संदूषण माइक्रोड्राइव को कमजोर कर देगा। इंतजार जब तक दंत एक्रिलिक पूरी तरह से ठीक हो जाता है, तो मोल्ड से microdrive शिकंजा दूर ले. प्लास का उपयोग कर एक 60 डिग्री कोण करने के लिए लंबे समय तक तार टिप के 6 मिमी मोड़।
    5. पेंच को घुमाने के लिए माइक्रोड्राइव शिकंजा (उदाहरण के लिए, दरारें, हवा-बबल, और घर्षण) की गुणवत्ता की जांच करें। यदि वहाँ उच्च घर्षण है, पेंच बारी बारी से जब तक वे एक अनुकूलित चालक टिप, जो microdrive पेंच के साथ जोड़ों के साथ एक बिजली पेंच चालक का उपयोग कर चिकनी हो जाते हैं.
    6. यह पेंच मोड़ द्वारा आसानी से ऊपर और नीचे ले जाता है कि क्या जाँच करने के लिए microdrive सरणी शरीर में microdrive पेंच स्थापित करें. पेंच के लिए धागे स्वचालित रूप से जब शरीर के छेद में पेंच डालने बनाया जाता है.
  2. शटल तैयार करें (चित्र3Aa)
    1. तेज कैंची का उपयोग कर के दो 5 मिमी लंबाई polyetheretherketone (पीक) ट्यूबिंग कट। शटल के दोनों ओर ट्यूबों संरेखित करें. ट्यूब गोंद और शटल epoxy का उपयोग कर.
    2. गाइड पदों पर सिलिकॉन तेल की छोटी राशि लागू करें. microdrive सरणी शरीर के गाइड पदों पर डालने से शटल की गुणवत्ता की जाँच करें. सुनिश्चित करें कि शटल अत्यधिक घर्षण के बिना सुचारू रूप से चलता है।
  3. एक ऑप्टोरोड तैयार करें (चित्र 3एबी)। यदि ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग की आवश्यकता नहीं है तो इस चरण को छोड़ दिया जा सकता है.
    1. एक माणिक कटर का उपयोग कर लंबाई में 21 मिमी करने के लिए ऑप्टिकल फाइबर को छोड़ दें। टिप फ्लैट और चमकदार बनाने के लिए फाइबर टिप पीस.
    2. धीरे सिलिकॉन जांच के सामने की ओर ऑप्टिकल फाइबर जगह है. फाइबर टिप इलेक्ट्रोड साइटों के शीर्ष के ऊपर 200-300 डिग्री की स्थिति में है. पारदर्शी टेप के साथ अस्थायी रूप से फाइबर पकड़ो.
    3. ऑप्टिकल फाइबर सिलिकॉन के आधार पर गोंद-प्रोब epoxy की छोटी राशि का उपयोग कर. कम से कम 5 एच के लिए प्रतीक्षा करें जब तक epoxy पूरी तरह से ठीक हो जाता है.
      नोट: यह इलेक्ट्रोड साइटों के रूप में एक ही पक्ष पर ऑप्टिकल फाइबर संलग्न करने के लिए सिफारिश की है. पीठ पर फाइबर संलग्न ठीक से रिकॉर्डिंग साइटों को रोशन करने से प्रकाश को रोका जा सकता है.
  4. सिलिकॉन जांच के लिए शटल संलग्न करें (चित्र 3Ac):सिलिकॉन-प्रोब के आधार के पीछे एपॉक्सी की एक छोटी राशि लागू करें। सिलिकॉन-प्रोबी के आधार के लिए शटल के नीचे का हिस्सा संलग्न करें, और धीरे से epoxy के प्रारंभिक इलाज के दौरान शटल और सिलिकॉन-प्रोब बेस के बीच एक अंतर के गठन से बचने के लिए 2-3 मिनट के लिए स्थिति में पकड़। कम से कम 5 एच के लिए प्रतीक्षा करें जब तक epoxy पूरी तरह से ठीक हो जाता है.
  5. मुख्य शरीर के गाइड पोस्ट पर शटल ट्यूबों को सूक्ष्मदर्शी के नीचे सावधानी से सम्मिलित करें (चित्र 3ख) । इस प्रक्रिया के दौरान, ठीक चम्मितता के साथ शटल की नाली पकड़.
  6. पेंच मोड़ द्वारा पेंच छेद में microdrive पेंच डालें. शटल सिर की नाली में एल आकार के तार की नोक डालने से सिलिकॉन जांच और microdrive-screw संलग्न (चित्र 3C).
  7. जांच विद्युत योजक धारक को माइक्रोड्राइव सरणी निकाय (चित्र 3डी) से संलग्न करें।
    1. 3.5 मिमी धागा लंबाई के लिए दो #0 शिकंजा कट. बर्र को हटाने के लिए युक्तियाँ पीस.
    2. जांच संयोजी धारक को शरीर पर रखें। धारक में सिलिकॉन जांच विद्युत संबंधक रखें.
    3. epoxy का उपयोग कर धारक में सिलिकॉन जांच संबंधक सुरक्षित, और सिलिकॉन जांच की वसूली प्रक्रिया के लिए अनुमति देने के लिए microdrive सरणी शरीर के लिए यह गोंद नहीं करने के लिए सुनिश्चित हो. जांच संयोजी धारक को पकड़ने के लिए शिकंजा डालें।
  8. ऑप्टो-सिलिकॉन जांच और माइक्रोड्राइव सरणी शरीर (चित्र 3 डी) के लिए फेरूल-धारक को संलग्न करें।
    1. 6 मिमी धागा लंबाई के लिए दो #0 शिकंजा कट. बर्र को हटाने के लिए युक्तियाँ पीस.
    2. वजन और अंतरिक्ष को कम करने के लिए 2.5-3.0 मिमी बाहरी व्यास के साथ छोटे हेक्स पागल बनाने के लिए दो #0 मशीन स्क्रू नट्स के बाहर पीस लें।
    3. धारक के घटक ए में शिकंजा डालें। एपॉक्सी का उपयोग करके पेंच के सिर को गोंद करें।
    4. शरीर के साथ घर्षण को कम करने के लिए घटक ए और बी में सिलिकॉन तेल की छोटी राशि लागू करें। घटक एक शरीर में डालें, तो अस्थायी रूप से व्युत्क्रम tweezers का उपयोग कर पकड़.
    5. घटक बी घटक ए के शिकंजा पर रखें। शिकंजा में अनुकूलित पागल धागा. शरीर पर फेरूल धारक को सुरक्षित करने के लिए नट्स को कसने के लिए प्लास का उपयोग करें।
    6. फाइबर फेरूल धारक (घटक बी) की नाली में फाइबर फेरूल डालें। सुनिश्चित करें कि फाइबर ferrule धारक से बाहर 4-5 मिमी चिपके हुए है.
    7. फेरूल और धारक नाली के बीच एपॉक्सी की छोटी राशि लागू करें। जब तक एपॉक्सी पूरी तरह से ठीक न हो तब तक प्रतीक्षा करें और जांचें कि फेरूल नहीं चलता है। microdrive-screw मोड़ से पहले पागल ढीला द्वारा चिकनी गति के लिए शटल और ferrule धारक की जाँच करें.
    8. जांच की कार्य दूरी की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि जांच टिप पूरी तरह से शरीर में वापस आ जाता है जब फेरूल-धारक शीर्ष स्थान पर है, जबकि शटल ट्यूब अभी भी गाइड-पोस्ट के साथ जुड़े हुए हैं। अधिकतम काम दूरी सिलिकॉन जांच और लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र की लंबाई से निर्धारित होता है.
    9. microdrive-screw ढीला है, तो समर्थन के लिए और अधिक धागे जोड़ने के लिए पेंच के आसपास दंत एक्रिलिक की छोटी राशि लागू होते हैं। जब यह ठीक हो जाता है, जकड़न और स्थिरता की जांच करने के लिए पेंच बारी बारी से।

3. Tetrode तैयारी

नोट: यह प्रक्रिया पहले प्रकाशित लेख8,19,20,39के समान है .

  1. टेट्रोड के लिए माइक्रोड्राइव शिकंजा तैयार करें। एक टेट्रोड के लिए माइक्रोड्राइव में एक कस्टम-मशीन्ड स्क्रू और 23 जी ट्यूबिंग होती है (चित्र 2ख) । यह कार्यविधि अनुभाग 2.1 के समान है.
  2. 30 जी स्टेनलेस स्टील टयूबिंग कि एक 5.5 लाख तार के अंदर है की एक बंडल बनाओ. इस मामले में, नौ 30 जी ट्यूबिंग की कुल (आठ रिकॉर्डिंग tetrodes और एक संदर्भ इलेक्ट्रोड) का इस्तेमाल किया गया.
  3. ड्राइव शरीर के नीचे से 30 जी बंडल धागा, और मुख्य शरीर के लिए 20 जी पतली दीवारों टयूबिंग के साथ उन्हें सुरक्षित. टिप भी और फ्लश बनाने के लिए एक रोटरी चक्की के साथ बंडल के नीचे ट्रिम। एक रोटरी चक्की के साथ 30 जी ट्यूब के शीर्ष भाग ट्रिम इतना है कि 30 जी ट्यूब के बारे में बाहर चिपक जाती है 0.5 मुख्य शरीर से मिमी.
  4. 30 जी ट्यूबिंग में 5.5 लाख पॉलीमिड इन्सुलेट ट्यूब लोड करें। टेटरोड तारों को तैयार करें और उन्हें 32-चैनल विद्युत इंटरफेस बोर्ड (ईआईबी) में लोड करें। अंतिम परिशुद्धता कटौती से पहले प्रतिबाधा परीक्षक के साथ बिजली के कनेक्शन की जाँच करें.
  5. कम इलेक्ट्रोड टिप प्रतिबाधा 250-350 k करने के लिए$ सोने चढ़ाना समाधान के साथ। superglue के साथ सभी tetrodes ठीक करें.
  6. सील और स्नेहन के लिए खनिज तेल के साथ polyimide ट्यूब और tetrode के बीच अत्यधिक अंतर भरें. ईआईबी के लिए जमीन के तार मार्ग.
    नोट: यदि आवश्यक हो, ऑप्टिकल फाइबर tetrode तारों के साथ एकीकृत किया जा सकता12.

4. परिरक्षण शंकु संलग्न

  1. मुद्रित शंकु के अंदर चांदी प्रवाहकीय परिरक्षण पेंट पेंट करें। माइक्रोड्राइव सरणी को शंकु के अंदर रखें (चित्र 3ई)।
  2. 3.5 मिमी धागा लंबाई के लिए दो #0 शिकंजा कट. जगह में microdrive सरणी पकड़ करने के लिए शंकु के बाहर से शिकंजा जकड़ना.
  3. विद्युत भूमि के साथ परिरक्षण शंकु कनेक्ट करने के लिए पेंच सिर के चारों ओर चांदी रंग लागू करें। जमीन तार और शंकु के बीच विद्युत कनेक्टिविटी की जाँच करें. सुरक्षित रूप से शरीर को संलग्न करने के लिए microdrive सरणी शरीर और परिरक्षण शंकु के बीच epoxy की एक छोटी राशि लागू करें।
    नोट: परिरक्षण शंकु तैयार करने के लिए एक और तरीका एल्यूमीनियम टेप40 (चित्र 3F) का उपयोग करने के लिए है। सबसे पहले, कागज के लिए एल्यूमीनियम पन्नी चिपका के बाद परिरक्षण शंकु के लिए पैटर्न कागज तैयार (चित्र 3Fa). फिर, कागज रोल और यह cyanoacrylate गोंद की एक छोटी राशि का उपयोग कर microdrive शरीर के लिए देते हैं (चित्र 3Fb). इस शंकु का भार 0ण्72 ह है तथा माइक्रोड्राइव सरणी का कुल भार 4ण्7 ह (सारणी1) तक कम हो जाता है।

5. प्रत्यारोपण सर्जरी

नोट: यह प्रक्रिया पहले प्रकाशित लेख18,39,41 दोहरी साइट प्रत्यारोपण के लिए से संशोधित किया गया है. सुनिश्चित करें कि सर्जरी के बाद तेजी से वसूली के लिए माइक्रोड्राइव प्रत्यारोपण के लिए जानवर का वजन 25 ग्राम से अधिक है।

  1. तैयारी
    1. एक जमीन पेंच तैयार करने के लिए, एक खोपड़ी पेंच करने के लिए चांदी के तार देते हैं और चांदी के रंग लागू होते हैं। फिर, चांदी के रंग का उपयोग कर तार के विपरीत पक्ष के लिए एक सोने की पिन देते हैं।
    2. एक stereotactic डिवाइस के लिए microdrive सरणी पकड़ करने के लिए ड्राइव होल्डिंग एडाप्टर तैयार करें। एक स्टेनलेस हैंडल करने के लिए एक पुरुष कनेक्टर संलग्न epoxy का उपयोग कर. सुनिश्चित करें कि कनेक्टर और स्टेनलेस हैंडल का संरेखण सीधे है.
    3. मामले में है कि हिस्टोलॉजिकल पुष्टि रिकॉर्डिंग के बाद की जरूरत है, tetrodes या सिलिकॉन जांच38के पीछे करने के लिए Di-I लागू होते हैं।
    4. वांछित गहराई होने के लिए सिलिकॉन-प्रोब को कम करें। प्लास का उपयोग करके फेरूल धारक के नट्स को ढीला करें, सिलिकॉन-प्रोब (ऑप्टो-सिलिकॉन जांच) को सिलिकॉन-प्रोब के माइक्रोड्राइव-स्क्रू को मोड़कर कम करें, फिर फेरूल धारक को सुरक्षित करने के लिए नट्स को जकड़ना। जब हिप्पोकैम्पस क्षेत्र CA1 में tetrodes प्रत्यारोपण और MEC में एक सिलिकॉन जांच, tetrode cannula और सिलिकॉन-प्रोब की नोक के बीच की दूरी 3-4 मिमी है.
  2. एक stereotaxic डिवाइस में एनेस्थेटाइज्ड माउस (0.8%-1.5% आइसोफ्लुरेन) सेट करें। माउस की संवेदनाहारी स्थिति को टो-पिंच प्रतिवर्त की अनुपस्थिति के द्वारा पुष्टि की जाती है। सुखाने को रोकने के लिए आंखों पर स्पष्ट मरहम लगाएं। मजबूत सर्जिकल प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए पन्नी के एक टुकड़े के साथ आंखों को कवर करें।
  3. फर शेविंग के बाद आयोडीन और आइसोप्रोपेनोल के साथ माउस की खोपड़ी को कीटाणुरहित करें। मानक शल्य कैंची का उपयोग कर खोपड़ी पर एक 1.5-2.0 सेमी चीरा बनाओ, और नीचे lidocaine लागू करने के बाद कपास swabs का उपयोग खोपड़ी पर ऊतक निकालें.
  4. माउस सिर को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के साथ संरेखित करें. सुनिश्चित करें कि ब्ग्मा और लैम्बडा के बीच ऊंचाई का अंतर 100 डिग्री से कम है। एक एटलस का उपयोग कर craniotomy स्थान निर्धारित करने और एक बाँझ पेंसिल के साथ इन स्थानों को चिह्नित.
  5. खोपड़ी शिकंजा (0.8 मिमी व्यास, 0.200 मिमी धागा पिच) उन्हें घूर्णन द्वारा लंगर 1.5 बदल जाता है (0.3 मिमी) खोपड़ी पर, शल्य चिमटी और एक पेचकश का उपयोग कर के बाद ड्रिलिंग 8-11 0.5 मिमी ड्रिल बिट का उपयोग खोपड़ी में छेद.
    नोट: ललाट खोपड़ी में 2-4 छेद, पार्श्विक खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष में 2-3 छेद, और इंटरपेरिअल खोपड़ी में 1-2 छेद सुझाए गए हैं।
  6. इंटरपेरिटल हड्डी में छेद ड्रिलिंग के बाद इसे एक बारी (0.2 मिमी) घुमाकर छेद करने के लिए जमीन पेंच संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि इस छेद मस्तिष्क के मामले में हड्डी के माध्यम से घुसना नहीं है; अन्यथा, सेरेबेलर संकेत रिकॉर्डिंग दूषित हो जाएगा. जाँच करें कि प्रतिबाधा जमीन पेंच और खोपड़ी शिकंजा एक प्रतिबाधा मीटर का उपयोग के बीच 1 kHz पर कम से कम 20 k$ है.
    नोट: बड़ा प्रतिबाधा रिकॉर्डिंग के दौरान गति कलाकृतियों की शुरूआत का कारण होगा।
  7. चिह्नित स्थानों पर craniotomy प्रदर्शन. ड्यूरा चूहों में बरकरार रखा जा सकता है.
  8. जमीन पेंच और microdrive सरणी की जमीन संबंधक के पुरुष पिन कनेक्ट करें. जमीन पेंच और परिरक्षण के बीच को मापने के द्वारा प्रतिबाधा मीटर का उपयोग कर कनेक्टिविटी की जाँच करें।
  9. एडाप्टर के लिए microdrive सरणी सेट करें, यह stereotaxic डिवाइस के लिए सेट करें, और धीरे-धीरे सिलिकॉन जांच वांछित गहराई तक कम। सुनिश्चित करें कि टेट्रोड बंडलों को मस्तिष्क की सतह के ऊपर रखा गया है लेकिन जब सिलिकॉन जांच मस्तिष्क में डाली जाती है तो माइक्रोड्राइव सरणी के अंदर अभी भी (चित्र 4क) ।
  10. सिलिकॉन जांच के क्षेत्र को सील करने के लिए सावधानी पूर्वक सिलिकॉन ग्रीज और टेट्रोड बंडल (चित्र 4ख) को सावधानी से लागू करें। एक 20 जी सुई की नोक पर सिलिकॉन तेल की एक छोटी राशि रखो और सुई का उपयोग कर जांच के आसपास तेल लागू होते हैं. दोहराएँ जब तक सिलिकॉन तेल पूरी तरह से जांच के आसपास के क्षेत्र को शामिल किया गया है ताकि दंत एक्रिलिक पर या इलेक्ट्रोड के नीचे प्रवाह नहीं करता / तेल इलेक्ट्रोड साइटों को छूने के लिए नहीं जाने के लिए सावधान रहें, अन्यथा यह नाटकीय रूप से रिकॉर्डिंग साइटों के प्रतिबाधा में वृद्धि होगी.
  11. खोपड़ी में एंकरिंग शिकंजा के लिए microdrive सरणी को ठीक करने के लिए दंत एक्रिलिक लागू करें।
    नोट: यह एक्रिलिक के इलाज के दौरान उत्पादित अत्यधिक गर्मी से बचने के लिए तीन परतों में दंत एक्रिलिक लागू करने के लिए सिफारिश की है.
  12. माइक्रोड्राइव सरणी से एडाप्टर सावधानी से निकालें। निर्जलीकरण को रोकने के लिए पीबीएस के 1 एमएल को इंजेक्शन। इंजेक्शन 5 मिलीग्राम/किलोग्राम meloxicam subcutaneously एक एनाल्जेसिक उपचार के रूप में।
  13. बिजली के कनेक्शन के अंदर हो रही से किसी भी गंदगी को रोकने के लिए टेप का एक टुकड़ा द्वारा सिलिकॉन जांच संबंधक कवर. एक प्लास्टिक पैराफिन फिल्म का उपयोग कर microdrive सरणी कवर और यह जगह में टेप.
  14. 3 दिनों के लिए उपयुक्त एनाल्जेसिक उपचार प्रशासन (उदाहरण के लिए, 2 मिलीग्राम/किलोग्राम meloxicam के subcutaneous इंजेक्शन प्रति दिन एक बार)। Tetrode समायोजन शुरू करने से पहले वसूली के लिए 3-5 दिनों की अनुमति दें. वसूली अवधि के बाद प्रत्यारोपित माउस चित्र 4Cमें दिखाया गया है.

6. सिलिकॉन-प्रोब की वसूली (चित्र 4D)

  1. केटामाइन (75 मिलीग्राम/किलोग्राम) और डेक्समेडेटोमिडिन (1 मिलीग्राम/किग्रा) एनेस्थेटिक्स इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन और टो-पिंच प्रतिवर्त की अनुपस्थिति की पुष्टि की। एक हुड का उपयोग कर दिल के माध्यम से सीधे perfusing 4% paraformaldehyde द्वारा एनेस्थेटाइज़्ड माउस को ठीक करें। कृन्तकों के सर्जिकल तरीकों का वर्णन पहले42किया गया है .
  2. एक प्लाई का उपयोग कर के ferrule धारक के पागल ढीला. फिर, ध्यान से यह समायोजन पेंच मोड़ द्वारा शरीर के शीर्ष करने के लिए पूरी तरह से microdrive सरणी शरीर के अंदर की ओर सिलिकॉन जांच वापस लेने के द्वारा कदम. शीर्ष स्थिति पर जांच आयोजित करने के लिए पागल जकड़ना.
  3. साइड से खोपड़ी खुर द्वारा नीचे से माउस मस्तिष्क बाहर ले लो. microdrive सरणी अब जानवर से अलग है.
  4. पूरी तरह से एल के आकार का microdrive-screw कि सिलिकॉन जांच ड्राइव हटा दें. प्लास का उपयोग करके फेरूल धारक के नट्स को ढीला करें और निकाल लें। फेरूल धारक के घटक ए को बाहर निकालो।
  5. जांच संबंधक माउंट खोलना और ड्राइव शरीर से अलग. जाँच करें कि जांच कनेक्टर माउंट microdrive सरणी शरीर से आ सकता है.
  6. चने के साथ शटल के शीर्ष भाग पकड़ो, तो ध्यान से microdrive सरणी से सिलिकॉन जांच विधानसभा बाहर स्लाइड.
  7. संपर्क लेंस क्लीनर के साथ जांच टिप साफ (पहले एंजाइम के साथ, फिर 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड) कम से कम 1 दिन के लिए. माइक्रोस्कोप के नीचे आइसोप्रोपेनोल पैड का उपयोग करके इलेक्ट्रोड टिप को सावधानी से पोंछें। एक स्थिर मुक्त भंडारण बॉक्स में जांच रखें.
    नोट: शटल और जांच संबंधक माउंट सिलिकॉन जांच से जुड़े रहते हैं और अगले प्रत्यारोपण में पुन: उपयोग किया जा सकता है.
    नोट: कुछ सिलिकॉन जांच हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ सहनीय नहीं हैं. इस मामले में, केवल प्रोटीओलिटिक एंजाइम युक्त संपर्क लेंस समाधान का उपयोग करें।
  8. अगली सर्जरी के लिए microdrive सरणी शरीर का पुन: उपयोग करने के लिए, ठीक टिप अभ्यास और nippers का एक संयोजन का उपयोग कर दंत एक्रिलिक निकालें. फिर, एसीटोन में हटाए गए दंत एक्रिलिक को डुबोकर खोपड़ी-स्क्रूज को ठीक करें। ध्यान दें कि एसीटोन microdrive सरणी के प्लास्टिक भागों भंग हो जाएगा.
  9. microdrive शरीर और एक स्केलपेल का उपयोग कर शंकु परिरक्षण शंकु के बीच epoxy निकालें.
    नोट: microdrive टूट नहीं है, तो कोई अतिरिक्त भागों अगली सर्जरी के लिए फिर से मुद्रित करने की आवश्यकता है।

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Representative Results

माइक्रोड्राइव सरणी का निर्माण 5 दिनों के भीतर किया गया था। माइक्रोड्राइव तैयारी की समय-सीमा सारणी 2में वर्णित है। इस microdrive का उपयोग करना, नौ tetrodes और एक सिलिकॉन जांच हिप्पोकैम्पस CA1 और माउस के MEC में प्रत्यारोपित किया गया [21 सप्ताह पुराने / यह ट्रांसजेनिक माउस एमईसी परत III पिरामिड न्यूरॉन्स में क्रे व्यक्त करता है। माउस के साथ इंजेक्शन किया गया था 200 nL के AAV5-DIO-ChR2-YFP (टिटर: 7.7 x 1012 gc/ LFPs एक कम पास फिल्टर (1-500 हर्ट्ज) का उपयोग कर दर्ज किए गए, और spiking इकाइयों एक उच्च पास फिल्टर (0.8-5 kHz) का उपयोग कर पाया गया. प्रकाश उत्तेजना (जेड 450 एनएम) फाइबर कनेक्टर के अंत में मापा 10.6 mW तीव्रता पर एक 1 एमएस पल्स चौड़ाई का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था। टेट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए संदर्भ इलेक्ट्रोड एक समर्पित टेट्रोड तार का उपयोग करके सफेद पदार्थ में रखा गया था। सिलिकॉन जांच रिकॉर्डिंग के लिए संदर्भ जांच के शीर्ष चैनल के रूप में स्थापित किया गया था.

टेटरोड समायोजन के बाद, व्यवहार निष्पादन का परीक्षण रेखीय ट्रैक पर किया गया (चित्र 5क) और एक खुले क्षेत्र में (चित्र 5ख) । दोनों प्रयोगों में, माउस $ 30 मिनट के लिए स्वतंत्र रूप से पता लगाया (चित्र 5Aa,b,c; चित्र 5Ba,b,c) . इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों को रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान गंभीर गति से संबंधित शोर के बिना सफलतापूर्वक रिकॉर्ड किया गया था (चित्र5विज्ञापन, ई; चित्र 5 Bd,ई). इसके बाद, एमईसी में प्रकाश उत्तेजना एमईसी परत III न्यूरॉन्स कि परियोजना को प्रोत्साहित करने के लिए किया गया था CA143 (चित्र 6A)। जब चूहा सो रहा था, तब टेटरोड और सिलिकॉन जांच से सहज स्पिकिंग क्रियाकलाप (चित्र 6 बी, सी) और एलएफपी ( चित्र6डी) रिकॉर्ड किए गए थे। Tetrodes में दर्ज LFPs बड़ी लहर गतिविधियों से पता चला, सुझाव है कि सभी tetrodes CA1 पिरामिड सेल परत के आसपास के क्षेत्र में तैनात थे. प्रकाश-प्रेरित उत्तरदायी गतिविधियों को पहले एमईसी में देखा गया था, इसके बाद सीए 1 में 13-18 एमएस विलंबता (चित्र6E) के साथ मनाया गया।

Figure 1
चित्र 1: Microdrive सरणी ओवरव्यू। (क) माइक्रोड्राइव सरणी का कंकाल दृश्य, टेट्रोड ओर से (क) और सिलिकॉन-प्रोब साइड (इ)। (ख) भरी हुई माइक्रोड्राइव सरणी की वास्तविक छवि, जिसे टेट्रोड साइड से और सिलिकॉन-प्रोब साइड (इ) से देखा जाता है। माइक्रोड्राइव सरणी पैनल (ख) में जिग चरण पर रखा गया है। (सी) व्यक्तिगत 3 डी मुद्रित microdrive सरणी भागों. (क-घ) माइक्रोड्राइव सरणी बॉडी, जिसे चार अलग-अलग कोणों से देखा जाता है (क: टेटरोड साइड व्यू; ख: सिलिकॉन-प्रोब साइड व्यू; ग: शीर्ष दृश्य; घ: नीचे देखें)। पैनल (ग) में डैश्ड रेखा का एक बढ़ाया हुआ दृश्य चित्र 2कमें दिखाया गया है। (ड) शटल, जो सिलिकॉन-प्रोब के समायोजन की अनुमति देता है। एक सिलिकॉन जांच पैनल (ई) में डैश्ड लाइन पर संलग्न है। (च) जांच-कनेक्टर धारक, जिसमें 32 चैनल सिलिकॉन-प्रोब-प्रोब कनेक्टर है। (छ) फाइबर फेरूल धारक, जो प्रकाश स्रोत के साथ फाइबर संबंधक को प्लग/अनप्लग करते समय जांच के आंदोलन से रोकने के लिए ऑप्टिकल फाइबर फेरूल रखता है। इस भाग में दो घटक होते हैं: [पैनल (g) और घटक A और B]. (ज) मुद्रित परिरक्षण शंकु, जो प्रवाहकीय सामग्री के साथ चित्रित होने पर भौतिक और विद्युत परिरक्षण प्रदान करता है। शंकु खिड़की microdrive सरणी तैयारी है, जो अंततः टेप या 3 डी मुद्रित सामग्री का एक टुकड़ा द्वारा कवर किया जाता है के दौरान संरचना के अंदर देखने की क्षमता की अनुमति देता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: मुख्य शरीर पर गाइड पोस्ट और microdrive शिकंजा की तैयारी. (ए) गाइड के बाद तैयारी. (क) चित्र 1ब्में दर्शाए गए माइक्रोड्राइव सरणी पिंड का विस्तृत दृश्य। (ख) गाइड पोस्ट-प्रविष्टि शरीर के छेद में। (बी) माइक्रोड्राइव-स्क्रू डिजाइन। (क) सिलिकॉन-प्रोब के लिए माइक्रोड्राइव-स्क्रू, जिसमें 300 डिग्री मीटर पिच कस्टम स्क्रू, सहायक ट्यूब और एल-आकार की नली होती है। (ख) एक टेट्रोड के लिए माइक्रोड्राइव-स्क्रू, जिसमें 160 डिग्री मीटर पिच कस्टम स्क्रू और 30 जी स्टेनलेस गाइड ट्यूब होती है। (सी) माइक्रोड्राइव-स्क्रू के शीर्ष टुकड़े का निर्माण: (क) माइक्रोड्राइव-स्क्रू के लिए एंटी-मोल्ड के 3 डी-मुद्रित पैटर्न की तैयारी। तस्वीर सिलिकॉन-प्रोब microdrive-screw के लिए एक पैटर्न से पता चलता है. (ख) मोल्ड एंटी-मोल्ड पैटर्न (क) और सिलिकॉन-रबर सामग्री का उपयोग करके बनाया गया है। इकट्ठे microdrive-screws कस्टम-crews और तारों / ट्यूब डालने, और प्रत्येक अच्छी तरह से दंत एक्रिलिक डालने के द्वारा उत्पादित कर रहे हैं. इनसेट: मोल्ड के कुओं का बढ़ाया दृश्य। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Microdrive सरणी असेंबली. (क) ऑप्टो-सिलिकॉन जांच की तैयारी। (क) शटल के लिए दो प्लास्टिक गाइड ट्यूब संलग्न करना। (ख) ऑप्टिकल फाइबर को सिलिकॉन-प्रोब तक ग्लू करना। (ग) ऑप्टो-सिलिकॉन जांच के लिए शटल को संलग्न करना। इस चित्र में, शटल के नीचे का हिस्सा (डैश्ड लाइन) सिलिकॉन-प्रोब के आधार [ख) के पीछे से जुड़ा हुआ है। शटल और सिलिकॉन जांच टांग समानांतर में होना चाहिए. (बी) माइक्रोड्राइव सरणी निकाय के गाइड-पोस्टमें ऑप्टो-सिलिकॉन जांच शटल असेंबली लोड करना। (C) सिलिकॉन-प्रोब माइक्रोड्राइव की सापेक्ष स्थिति जब जांच पूरी तरह से शरीर में वापस आ जाती है (क) और ड्राइव बॉडी (ख) में सबसे कम पर तैनात होने पर। एल आकार तार शटल पर नाली में डाला जाता है. (डी) फाइबर फेरूल धारक और जांच कनेक्टर माउंट का एक विस्फोट दृश्य। (ई) शील्डिंग शंकु संलग्न. प्रवाहकीय सामग्री शंकु के अंदर चित्रित किया है. (एफ) एक कागज और एल्यूमीनियम टेप का उपयोग कर वैकल्पिक परिरक्षण शंकु। (क) एक पैटर्न कागज। (ख) एक संलग्न वैकल्पिक परिरक्षण शंकु, जो 3 डी मुद्रित संस्करण की तुलना में 1.1 ग्राम वजन कम कर देता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सर्जरी और सिलिकॉन जांच की वसूली के दौरान जांच सील. (ए) सिलिकॉन-ग्रीस लागू करने से पहले, craniotomy के बाद microdrive सरणी और माउस खोपड़ी. सिलिकॉन जांच इस समय मस्तिष्क में 2mm के बारे में डाला जाता है. (बी) दंत एक्रिलिक से जांच की रक्षा के लिए सिलिकॉन-प्रोब और टेटरोड बंडलों के चारों ओर सिलिकॉन-ग्रीस लागू करना। (सी) वसूली अवधि के बाद लंबे समय से प्रत्यारोपित माउस, जब माउस चल रहा है (क), सौंदर्य (ख), और जब काउंटर संतुलन चरखी प्रणाली (ग) के साथ रिकॉर्डिंग केबल से जुड़ा. (घ) बरामद सिलिकॉन जांच, (क) से पहले और बाद में (ख) सफाई समाधान में विसर्जन। (क) में जैविक ऊतकों को सफाई प्रक्रिया (ख) के बाद हटा दिया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: व्यवहार माउस से हिप्पोकैम्पस CA1 और मध्यस्थ entorhinal प्रांतस्था (MEC) में एक साथ tetrode/सिलिकॉन-प्रोब रिकॉर्डिंग के उदाहरण. (ए) रैखिक ट्रैक पर रिकॉर्डिंग. (क) रेकोडन के लिए प्रयुक्त रैखिक ट्रैक। (ख) ट्रैक पर 30 मिनट के लिए माउस की खोज के ट्रैजेक्शन। (ग) रैखिक पथ पर व्यवहार निष्पादन। (घ)ई) Tetrode से प्रतिनिधि LFP रिकॉर्डिंग (घ) और सिलिकॉन जांच (ई). (बी) खुले क्षेत्र में रिकॉर्डिंग। (क) रीकोडिंग के लिए उपयोग किया जाने वाले खुला क्षेत्र कक्ष। (ख) कक्ष में 30 मिनट के लिए माउस की खोज के त्रासदियों। (ग) खुले क्षेत्र में व्यवहार निष्पादन। (घ, ई) Tetrode से प्रतिनिधि LFP रिकॉर्डिंग (घ) और सिलिकॉन जांच (ई). एलईडी माउस की स्थिति रिकॉर्ड करने के लिए सिर एम्पलीफायर से जुड़ा हुआ है। रैखिक ट्रैक और खुले क्षेत्र कक्ष विद्युत भूमि के साथ जुड़े हुए हैं इलेक्ट्रोस्टैटिक शोर को कम करने के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: CA1 और MEC और optogenetic उत्तेजना में एक साथ रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि परिणाम. (A) इंजेक्शन के 4 सप्ताह के बाद AAV5-DIO-ChR2-YFP की अभिव्यक्ति. MEC परत III पिरामिड न्यूरॉन्स कि पृष्ठीय MEC से पृष्ठीय CA1 के लिए उनके axons परियोजना. डैश्ड रेखाएँ: ओरी, स्तर ओरियन; pry, स्तर पिरामिड; रेड, स्तर रेडिएटम; मोल, स्तर लाकुनोसम आणविक। (बी) टेट्रोड में से एक से प्रतिनिधि स्पाइक रिकॉर्डिंग। (क) टेटरोड से अभिलेखित स्पाइक्स के 2D क्लस्टर प्रक्षेपा। (ख) तीन समूहों के औसत स्पाइक तरंग के उदाहरण, जो डैश्ड रेखाओं द्वारा इंगित किए गए हैं (ं) (सी) सिलिकॉन-प्रोब इलेक्ट्रोड साइटों में से एक से प्रतिनिधि स्पाइक रिकॉर्डिंग। (क) स्पाइक प्रमुख घटकों के 2D क्लस्टर अनुमान। (ख) तीन समूहों के औसत स्पाइक तरंग के उदाहरण। स्पाइक क्लस्टर्स (गुलाबी और हरा) शोर क्लस्टर्स (नीला) से अलग किए जाते हैं. में क्लस्टर (B,C) KlustaKwik सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर गणना कर रहे हैं। (डी) एक साथ सीए 1 (क) में टेटेरोड से दर्ज सहज एलएफपी के निशान और एमईसी (ख) में सिलिकॉन जांच। काले तीर (बी) और सिलिकॉन-प्रोब इलेक्ट्रोड साइट में दिखाए गए टेटरोड को इंगित करते हैं (सी)। (ई) एलएफपी प्रतिसादों को स्पंदित ऑप्टिकल उत्तेजना (10.6 मावा, 1 एमएस; भरा हुआ लाल ऐरोहेड) सीए 1 (क) में टेटेरोडसेस से और एमईसी (ख) में सिलिकॉन जांच के लिए एलएफपी प्रतिक्रियाएं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ग्राम संख्या योग [gram]
मुख्य पिंड 1.25 1 1.25
शटल 0.04 1 0.04
अन्वेषी संयोजी आरोह 0.19 1 0.19
तंतु फेरूल धारक 0.1 1 0.1
परिरक्षण शंकु 1.82 1 1.82 (0.72)*
चालकीय पेस्ट 0.2 1 0.2
मशीन पेंच (#00, 2 मिमी), ईआईबी धारण करने के लिए 0.05 2 0.1
मशीन पेंच (#0-80, 3.5 मिमी) 0.06 4 0.24
मशीन पेंच (#0-80, 6 मिमी) 0.09 2 0.18
अखरोट 0.03 2 0.06
माइक्रोड्राइव (टेट्रोड) 0.05 9 0.45
माइक्रोड्राइव (सिलिकॉन जांच) 0.29 1 0.29
सिलिकन अन्वेषी 0.28 1 0.28
विद्युत अंतरापृष् ठ पट्ट 0.6 1 0.6
कुल 5.8 (4.7)*

तालिका 1: प्रत्येक microdrive सरणी भाग के व्यक्तिगत वजन. microdrive सरणी का कुल वजन 5.9 जी epoxy के साथ सुरक्षात्मक शंकु फिक्सिंग के बाद किया गया था (* एक कागज और एल्यूमीनियम टेप का उपयोग कर एक वैकल्पिक परिरक्षण शंकु का उपयोग करने के मामले में).

प्रक्रियाओं समय
माइक्रोड्राइव तैयारी
3 डी भागों मुद्रण 1 दिन
ऑप्टोरोड तैयारी
microdrive सिर के लिए मोल्ड तैयार 1 दिन*
माइक्रोड्राइव सिर की तैयारी 3 ज
ऑप्टिकल फाइबर संलग्न करना 3 ज
एक शटल संलग्न 3 ज
टेट्रोड तैयारी
microdrive सिर के लिए मोल्ड तैयार 1 दिन*
माइक्रोड्राइव सिर तैयारी 3 ज
टेटरोड तारों को लोड कर रहा है 1 दिन
परिरक्षण शंकु संलग्न करना
चित्रकारी परिरक्षण रंग रात भर *
माइक्रोड्राइव शरीर के साथ संलग्न 3 ज
* इन प्रक्रिया समानांतर में आयोजित किया जा सकता है

तालिका 2: microdrive तैयारी की समय रेखा. 3 डी भागों मुद्रण, सिलिकॉन रबर के इलाज के लिए इंतज़ार कर / दंत एक्रिलिक / epoxy, और tetrode तारों लोड हो रहा है microdrive सरणी तैयारी के समय के बहुमत ले, कुल 4-5 दिनों में.

अनुपूरक फ़ाइलें: अनुपूरक फ़ाइलों में .sldprt और .stl दोनों स्वरूप में पाँच microdrive भागों का 3D मॉडल डेटा शामिल है. मूल 3 डी मॉडल फ़ाइलें सॉफ्टवेयर Solidworks2003 के साथ बनाया गया था. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे निर्माण और एक संकर microdrive सरणी है कि स्वतंत्र समायोज्य tetrodes और स्वतंत्र रूप से व्यवहार चूहों में एक सिलिकॉन जांच का उपयोग कर दो मस्तिष्क क्षेत्रों से तंत्रिका गतिविधियों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है प्रत्यारोपण. यह भी optogenetic प्रयोगों और प्रयोगों के बाद सिलिकॉन जांच की वसूली को दर्शाता है. जबकि समायोज्य सिलिकॉन जांच33 या ऑप्टो-सिलिकॉन जांच36 प्रत्यारोपण पहले चूहों में प्रदर्शन कर रहे हैं, इस प्रोटोकॉल एक साथ tetrode सरणी और ऑप्टो-सिलिकॉन जांच प्रत्यारोपण में स्पष्ट लाभ लचीला प्रदान करने के लिए है प्रत्यारोपित जांच प्रकार का चुनाव. प्रत्यारोपित जांच के प्रकार को प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर चालू किया जा सकता है, जैसे बहु-शांक जांच27,44 या अति घनत्व न्यूरोपिक्सेल21,45. समन्वय और प्रत्यारोपण7 के कोण आसानी से जरूरत के रूप में 3 डी वस्तु डिजाइन चरण में संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, दोहरी साइट या यहां तक कि ट्रिपल साइट रिकॉर्डिंग स्मृति से संबंधित मस्तिष्क संरचनाओं में कार्य सीखने के दौरान संभव है, जैसे हिप्पोकैम्पस46, entorhinal प्रांतस्था47, prefrontal प्रांतस्था48, amygdala49, और cingulate प्रांतस्था50|

वहाँ सफल प्रत्यारोपण और रिकॉर्डिंग के लिए कई महत्वपूर्ण प्रक्रियाएं हैं. सिलिकॉन आधारित जांच की कमजोरी के कारण, किसी भी यांत्रिक कंपन या microdrive सरणी के लिए प्रभावों विधानसभा के दौरान कम से कम किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, माइक्रोड्राइव सरणी में सिलिकॉन जांच लोड करने से पहले ड्रिल का उपयोग करके भरे हुए छेदों को खोलना समाप्त कर देना चाहिए. इसके अलावा, यह ध्यान से माइक्रोड्राइव सरणी निर्माण और प्रत्यारोपण सर्जरी के दौरान प्रत्येक कदम में जमीन कनेक्शन की जांच करने के लिए दर्ज की गई डेटा की स्थिरता सुनिश्चित करने पर जोर दिया जाना चाहिए. अस्थिर या उच्च impedance कनेक्शन जमीन के लिए रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान भारी शोर और गति से संबंधित कलाकृतियों का कारण. स्थिर रिकॉर्डिंग के लिए, यह मस्तिष्क ऊतक नकारात्मक प्रत्यारोपण सर्जरी से प्रभावित है क्योंकि इलेक्ट्रोड बहाव से बचने के लिए सर्जरी के बाद 1-2 सप्ताह इंतजार करने के लिए सिफारिश की है। हालांकि, सिलिकॉन जांच पर संकेत गुणवत्ता पिछले अनुभव के आधार पर शल्य चिकित्सा आघात से 1-2 सप्ताह के बाद ठीक हो जाती है। यह अन्य चूहों द्वारा प्रत्यारोपित microdrive सरणी को नुकसान को रोकने के लिए एकल आवास का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग के लिए, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अधिकांश सिलिकॉन-प्रोब्स प्रकाश-उत्तेजनाओं51के जवाब में फोटो-कलाकृतियों को प्रेरित करते हैं, जबकि अन्य फोटो-शिल्पी52 को कम करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं (फोटो-आर्टीफैक्ट कम होते हैं सिलिकॉन-प्रोब्स जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं)।

microdrive सरणी का वजन (5.9 जी) पिछले लेख12,53में वर्णित ठेठ microdrives से भारी है , मुख्य रूप से microdrive सरणी शरीर के कारण (कुल वजन का $21%), परिरक्षण शंकु ($31%), और धातु भागों (स्क्रू) और पागल: $ 22%). प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए 25 ग्राम से अधिक के वजन के साथ चूहों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है ($2-3 महीने की उम्र C57BL/6 चूहों54,55) के लिए प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए, क्योंकि पर्याप्त शरीर के वजन वाले चूहों को पहले ठीक हो जाते हैं। इस कारण से, इस microdrive सरणी किशोर चूहों के लिए सबसे अच्छा समाधान नहीं हो सकता है. जबकि उपकरणों है कि माउस के bodyweight के 5%-10% कर रहे हैं अक्सर प्रत्यारोपण के लिए सहन किया जा करने के लिए निर्देशित कर रहे हैं12,56 (हालांकि इस57के लिए कोई समर्थन प्रकाशित डेटा है), इस microdrive सरणी के bodyweight के $ 24% वजन 25 g चूहों ($19% जब नीचे वर्णित वैकल्पिक शंकु का उपयोग कर).

हालांकि, प्रत्यारोपित वयस्क चूहों को स्वतंत्र रूप से चारों ओर ले जाने और घर पिंजरों में चारों ओर कूद करने में सक्षम थे. इसी तरह के माइक्रोड्राइव सरणी वजन ($4.5 ग्राम) के साथ प्रत्यारोपित चूहे को पहले भी खाद्य प्रतिबंध13,17के तहत व्यवहार कार्य (रेखीय भूलभुलैया कार्य) करने के लिए दिखाया गया है। वजन का नुकसान रिकॉर्डिंग के दौरान एक समस्या नहीं है, एक counterweight संतुलन प्रणाली के रूपमें 18,34,58 या headpost प्रणाली59 microdrive सरणी का समर्थन करेंगे. इसके अलावा, microdrive सरणी के कुल वजन ऊंचाई को कम करने या परिरक्षण शंकु की मोटाई को कम करने और छोटे शिकंजा का उपयोग करने के लिए डिजाइन को संशोधित करके कम किया जा सकता है.

वर्तमान 3 डी मुद्रण सामग्री का उपयोग करना, परिरक्षण शंकु की मोटाई अप करने के लिए कम किया जा सकता $0.3 मिमी ( $0.6 मिमी की वर्तमान मोटाई से). शंकु ऊंचाई के रूप में लंबे समय के रूप में tetrode तारों अभी भी कवर किया जा सकता है $ 5 मिमी कम किया जा सकता है। टेटरोड तारों के एक्सपोजर के परिणामस्वरूप तारों का टूटना और दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग की विफलता होगी। वैकल्पिक रूप से, कागज और एल्यूमीनियम टेप का उपयोग कर परिरक्षण शंकु की तैयारी शंकु वजन को कम कर सकते हैं $0.7 ग्राम (कुल वजन का $15%; मूल microdrive सरणी के कुल वजन से 20% कम); हालांकि, इन शारीरिक शक्ति के साथ एक tradeoff हैं. इसके अलावा, microdrive के आकार (वर्तमान परिरक्षण शंकु: 4.2 x 4.0 x 2.6 सेमी - प्रमुख अक्ष x लघु अक्ष x ऊंचाई) भोजन और पानी का उपयोग करने के लिए एक बाधा हो सकता है अगर वे पशु पिंजरे के ऊपर से प्रदान की जाती हैं. जब तक वे पिंजरे के फर्श पर या sidewall से प्रदान की जाती हैं, microdrive चूहों के प्राकृतिक व्यवहार, जैसे खाने, पीने, सौंदर्य, पालन, या घोंसले60परेशान नहीं करता है.

अंत में, इस microdrive प्रोटोकॉल गतिशीलता और लंबे समय से चल तंत्रिका सर्किट के कार्यों को समझने के लिए स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में कई मस्तिष्क क्षेत्रों से रिकॉर्डिंग के लिए लचीला विकल्प के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के भाग में जापान सोसायटी द्वारा विज्ञान विदेशी अनुसंधान फैलोशिप के संवर्धन के लिए (HO), समाप्त विद्वान कार्यक्रम (TK), मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (TK), मस्तिष्क अनुसंधान फाउंडेशन (TK), संकाय विज्ञान और प्रौद्योगिकी अधिग्रहण और प्रतिधारण कार्यक्रम (TK), मस्तिष्क और व्यवहार अनुसंधान फाउंडेशन (TK), और सुमितोमो फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट (JY), NARSAD युवा अन्वेषक अनुसंधान अनुदान (JY) द्वारा. हम पांडुलिपि की तैयारी के दौरान बहुमूल्य टिप्पणियों और सुझावों के लिए डब्ल्यू मार्क्स धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#00-90 screw J.I. Morris #00-90-1/8 EIB screws
#0-80 nut Small Parts B00DGB7CT2 brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screw Small Parts B000FMZ57G brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubes Small Parts SLPT-22-24 for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubing Small Parts HTX-23R for tetrode
23 Ga stainless wire Small Parts HTX-23R-24-10 for L-shape/support wire
26 Ga stainless wire Small Parts GWX-0200 for guide-posts
30 Ga stainless wire Small Parts HTX-30R for tetrode
3-D CAD software package Dassault Systèmes SolidWorks 2003
3D printer FormLab Form2
5.5mil polyimide insulating tubes HPC Medical 72113900001-012
aluminum foil tape Tyco Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape for the alternative shielding cone
conductive paste YSHIELD HSF54 for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdrive AMT UNM1.25-HalfMoon half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdrive AMT Yamamoto_0000-160_9mm slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylic Stoelting 51459
dental model resin FormLab RS-F2-DMBE-02
Dremel rotary tool Dremel model 800 a grinder
drill bit Fine Science Tool 19007-05
electric interface board Neuralynx EIB-36-Narrow
epoxy Devcon GLU-735.90 5 minutes epoxy
eye ointment Dechra Puralube Ophthalmic Ointment to prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheet Thorlabs LFG5P for polishing the optical fiber
fine tweezers Protech International 15-368 for loading/recovering the silicon probe
gold pins Neuralynx EIB Pins Small
ground wire A-M Systems 781500 0.010 inch bare silver wire
headstage preamp Neuralynx HS-36
impedance meter BAK electronics Model IMP-2 1 kHz testing frequency
mineral oil ZONA 36-105 for lubricating screws and wires
optical fiber Doric MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording system Neuralynx Digital Lynx 4SX
ruby fiber scribe Thorlabs S90R for cleaving the optical fiber
silicon grease Fine Science Tool 29051-45
silicon probe Neuronexus A1x32-Edge-5mm-20-177 Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probe Neuronexus A1x32-6mm-50-177 Fig. 4C
silicon probe washing solution Alcon AL10078844 contact lens cleaner
silicone lubber Smooth-On Dragon Skin 10 FAST for preparation of microdrive mold
silver paint GC electronic 22-023 silver print II coating, used for ground wires
skull screw Otto Frei 2647-10AC 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissors ROBOZ RS-5880
stereotaxic apparatus Kopf Model 942
super glue Loctite LOC230992 for applying to guide-posts
surgical tweezers ROBOZ RS-5135
Tetrode Twister Jun Yamamoto TT-01
tetrode wires Sandvik PX000004

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