ग्लूकोज में आईएनकेटी कोशिकाओं की दत्तक इम्यूनोथेरेपी-6-फॉस्फेट Isomerase (G6PI)-प्रेरित आरए चूहों

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Immunology and Infection

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Summary

यह प्रोटोकॉल G6PI मिश्रित पेप्टाइड्स का उपयोग करता है ताकि गठिया मॉडल का निर्माण किया जा सकता है जो सीडी 4+ टी कोशिकाओं और साइटोकिन्स में मानव रूमेटॉयड गठिया के करीब हैं। विशिष्ट फेनोटाइप और कार्यों के साथ उच्च शुद्धता इनवेरिएंट प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाएं (मुख्य रूप से iNKT2) को वेवो इंडक्शन और इन विट्रो शुद्धि में दत्तक इम्यूनोथेरेपी के लिए प्राप्त किया गया था।

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Meng, M., Chen, S., Gao, X., Liu, H., Wang, Y., Zhang, J., Dou, H., Li, W., Chen, D. Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice. J. Vis. Exp. (155), e60048, doi:10.3791/60048 (2020).

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Abstract

रुमेटी गठिया (आरए) एक जटिल पुरानी भड़काऊ ऑटोइम्यून बीमारी है। रोग का रोगजनन इनवेरिएंट नेचुरल किलर टी (आईएनकेटी) कोशिकाओं से संबंधित है। सक्रिय आरए वाले रोगी कम iNKT कोशिकाओं, दोषपूर्ण सेल समारोह, और Th1 के अत्यधिक ध्रुवीकरण पेश करते हैं। इस अध्ययन में, एक आरए पशु मॉडल hGPI325-339 और hGPI469-483 पेप्टाइड्स के मिश्रण का उपयोग कर स्थापित किया गया था । आईएनकेटी कोशिकाओं को वीवो इंडक्शन और इन विट्रो शुद्धि में प्राप्त किया गया था, जिसके बाद दत्तक इम्यूनोथेरेपी के लिए आरए चूहों में जलसेक किया गया था। इन वीवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) ट्रैकिंग से पता चला कि आईएनकेटी कोशिकाओं को मुख्य रूप से तिल्ली और जिगर में वितरित किया गया था। सेल थेरेपी के बाद 12 दिन पर, रोग प्रगति काफी धीमा हो गई, नैदानिक लक्षणों को कम किया गया, थाइमस में आईएनकेटी कोशिकाओं की बहुतायत में वृद्धि हुई, थाइमस में iNKT1 का अनुपात कम हो गया, और टीएनएफ-α, IFN-, और आईएल-6 के स्तर में सीरम कम हो गया। आईएनकेटी कोशिकाओं की दत्तक इम्यूनोथेरेपी ने प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संतुलन को बहाल किया और शरीर की अत्यधिक सूजन को ठीक किया।

Introduction

रुमेटी गठिया (आरए) एक ऑटोइम्यून रोग है जो 0.5-1% घटना1,2के साथ पुरानी, प्रगतिशील आक्रामकता की विशेषता है। अंतर्निहित रोगजनन को ऑटोरेएक्टिव सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं के असामान्य प्रसार के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जो सीडी 4+आईएफएन-+ और सीडी4 + आईएल-17ए +टी कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि से प्रकट होता है, और सीडी 4+आईएल-4+ और सीडी4 +सीडी 25 + FoxP3 +टी कोशिकाओं की कम संख्या। इसलिए, भड़काऊ साइटोकिन्स का स्राव बढ़ जाता है, और अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रिया शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली के देशी संतुलन और सहिष्णुता कार्य को नष्ट कर देती है। इसके अलावा, सहायक टी लिंफोसाइट (Th) 1 कोशिकाएं जो संयुक्त में प्रवेश करती हैं, भड़काऊ प्रतिक्रिया और संयुक्त क्षति को बढ़ाती हैं। इसलिए, अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा सहिष्णुता और प्रतिरक्षा संतुलन की बहाली का अवरोध आरए3,4के उपचार के लिए महत्वपूर्ण है।

आईएनकेटी कोशिकाओं में एनके सेल और टी सेल कार्य और विशेषताएं दोनों हैं। आईएनकेटी कोशिकाएं सीमित टीसीआर-चेन प्रदर्शनों के साथ एक अलग, इनवैरिएंट टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) α-चेन को आश्रय देते हैंऔर एंटीजन-पेश कोशिकाओं की सतह पर प्रमुख हिस्टोकॉम्पिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) वर्ग I अणु सीडी1डी द्वारा प्रस्तुत ग्लाइकोलिपिड एंटीजन को पहचानते हैं। मित्सुओ एट अल6 ने आरए सहित कई ऑटोइम्यून रोगों में बड़ी संख्या में आईएनकेटी कोशिकाओं और कार्यात्मक दोषों का पता लगाया। ऑरयोर एट अल7 ने दिखादिया कि आईएनकेटी कोशिकाओं का ऑटोइम्यून सहिष्णुता बनाए रखने पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है और जब आईएनकेटी कोशिकाओं की संख्या और कार्य बहाल हो जाता है, तो बीमारी को समाप्त कर दिया जाता है। इसके अलावा, Miellot-Gafsou एट अल8. पाया कि iNKT कोशिकाओं ने न केवल रोग को निरस्त किया बल्कि बीमारी की प्रगति को भी बढ़ाया। इन विरोधाभासी परिणामों से पता चलता है कि iNKT कोशिकाएं विषम टी कोशिकाएं हैं, और विभिन्न सबसेट के कार्य को उलट दिया जा सकता है। आरए के नैदानिक अध्ययन में, आईएनकेटी कोशिकाओं की आवृत्ति रोग गतिविधि9के स्कोर से सहसंबद्ध है। परिणामों ने यह भी पुष्टि की कि आरए रोगियों में आईएनकेटी की आवृत्ति में कमी आई, सीडी4+आईएफएन-+ टी सेल सबसेट की संख्या में वृद्धि हुई, और भड़काऊ साइटोकिन्स आईएफएन-एऔर टीएनएफ-α के गुप्त स्तरमें 10, 11की वृद्धि हुई। इसके अलावा शरीफ एट अल12 ने टाइप 1 डायबिटीज (T1D) की जांच की और पाया कि आईएनकेटी कोशिकाओं के चयनात्मक अर्क ने भड़काऊ साइटोकिन आईएल-4 की अभिव्यक्ति को बढ़ादिया, प्रतिरक्षा सहिष्णुता बनाए रखी, और टाइप 1 मधुमेह के विकास को रोका । इसलिए, विशिष्ट iNKT कोशिकाओं के दत्तक जलसेक या iNKT कोशिकाओं के लक्षित सक्रियण आरए रोगियों में iNKT कोशिकाओं के स्तर को बढ़ाता है, जो आरए उपचार में एक सफलता हो सकती है।

सेलुलर इम्यूनोथेरेपी वर्तमान में बहुत रुचि है और व्यापक रूप से कैंसर चिकित्सा में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, आईएनकेटी कोशिकाएं दुर्लभ, विषम इम्यूनोरेगुलेटरी कोशिकाएं (पीबीएमसी की कुल संख्या का केवल 0.3%)13हैं, जो संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों को सीमित करती हैं। इन कोशिकाओं को मुख्य रूप से तीन उपआबादी में विभाजित किया गया है: 1) iNKT1 कोशिकाओं, जो प्रोमायलोसाइटिक ल्यूकेमिया जिंक-फिंगर प्रोटीन (PLZF) और टी बॉक्स प्रतिलेखन कारक (टी-बेट) की एक उच्च अभिव्यक्ति है; 2) पीएलजेडएफ और गेटा बाध्यकारी प्रोटीन 3 (GATA3) की मध्यवर्ती अभिव्यक्ति के साथ iNKT2 कोशिकाएं; 3) PLZF और रेटिनोइड से संबंधित अनाथ परमाणु रिसेप्टर (ROR) की कम अभिव्यक्ति के साथ iNKT17 कोशिकाओं-- सक्रिय iNKT कोशिकाओं Th1, Th2, और Th17 की तरह साइटोकिन्स, जो iNKT कोशिकाओं15के विभिन्न इम्यूनोमोडुलेटरी प्रभाव निर्धारित स्राव । आईएनकेटी कोशिकाओं की विभिन्न उपआबादी की विशिष्ट सक्रियता के इम्यूनोमोडुलेटरी और इम्यूनोथेरप्यूटिक प्रभाव अलग-अलग हैं। इसलिए, शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने के लिए विरोधी भड़काऊ कार्यों के साथ आईएनकेटी कोशिकाओं (मुख्य रूप से iNKT2) के विशिष्ट फेनोटाइप का चयन आरए में प्रतिरक्षा असंतुलन और प्रतिरक्षा विकारों को सही कर सकता है।

आरए रोगजनन के उपचार और अध्ययन के लिए एक आदर्श पशु मॉडल की स्थापना का बहुत महत्व है। वर्तमान में, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले और परिपक्व पशु मॉडलों में कोलेजन-प्रेरित गठिया, अडजूवांगठिया, ज़िमोसन-प्रेरित गठिया, और पॉलीसैकराइड-प्रेरित गठिया16-17शामिल हैं। हालांकि, ऐसा कोई मॉडल नहीं है जो मानव आरए की सभी विशेषताओं को पूरी तरह से अनुकरण कर सके। टाइप II कोलेजन-प्रेरित गठिया (सीआईए) एक क्लासिक गठिया मॉडल है। सीआईए टाइप II कोलेजन-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ चूहों के प्रतिरक्षण से प्रेरित है, जो इस रोग मॉडल की एंटीबॉडी निर्भरता को दर्शाती है। बेनूर्स एट अल ग्लूकोज-6-फॉस्फेट आइसोमरसे (G6PI) के लिए एक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ एक मॉडल का वर्णन किया है, जो अतिसंवेदनशील माउस उपभेदों में परिधीय सममित पॉलीआर्थराइटिस लाती है18,19। इस मॉडल में गठिया का विकास टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और जन्मजात प्रतिरक्षा18,19,20पर निर्भर करता है। होरिकोशी21 ने पाया कि जी6पीआई पॉलीपेप्टाइड टुकड़ों के साथ डीबीए/1 चूहों के प्रतिरक्षण के परिणामस्वरूप आरए मॉडल सीआईए मॉडल की तुलना में सीडी4+ टी कोशिकाओं और साइटोकिन्स (यानी आईएल-6 और टीएनएफ-α) के संदर्भ में मानव आरए के समान हैं । टीसीआर मान्यता स्थल पर उत्तेजक प्रभाव को बढ़ाने के लिए, जी6पीआई (hGPI325-339 और hGPI469-483) के मिश्रित पॉलीपेप्टाइड टुकड़ों का उपयोग आरए माउस मॉडल के निर्माण के लिए डीबीए/1 चूहों को प्रतिरक्षित करने के लिए किया गया था। इस दृष्टिकोण की सफलता दर अधिक हो सकती है क्योंकि hGPI325-339 और hGPI469-483 I-A क्यू-प्रतिबंधित टी सेल प्रतिक्रियाओं के लिए इम्यूनोप्रमुख हैं। इसलिए, यह मॉडल22आरए रोगियों में सीडी 4+ टी कोशिकाओं और आईएनकेटी सेल दोषों के प्रसार का अनुकरण कर सकता है। आरए इम्यूनोपैथोलॉजी के बुनियादी शोध ने हमारी आगे गहराई से जांच की नींव रखी ।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक चूहों (कुल में १५०) स्वस्थ पुरुष DBA/1 चूहों, 6-8 सप्ताह पुराने (२०.० ± १.५ ग्राम), एक विशिष्ट रोगजनक मुक्त (एसपीएफ) वातावरण में पाला गया । मॉडलिंग से पहले कोई स्पेशल ट्रीटमेंट नहीं है। इस प्रयोग को एक स्वस्थ नियंत्रण समूह (15 चूहों), एक मॉडल नियंत्रण समूह (15 चूहों) और एक सेल थेरेपी समूह (55 चूहों) में विभाजित किया गया था। इस अध्ययन को हेबेई विश्वविद्यालय की पशु कल्याण एवं नैतिक समिति ने मंजूरी दी थी।

1. रोग मॉडल का निर्माण

  1. आरए पशु मॉडल डुप्लिकेट
    1. एचजी6पीआई 325-339 और एचजी6पीआई 469-483 टुकड़ों का 1.75 मिलीग्राम वजन और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस ट्रिपल आसुत पानी के 5.25 मिलीग्राम में भंग करें।
    2. 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्ण फ्रायंड के अडजुवांट (सीएफए) को भंग करें, 5.25 मीटर को एक और 10 मीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में खींचें, और उपयोग के लिए इसे ठंडा करें।
    3. दो ग्लास सीरिंज जुड़े के साथ एक कृत्रिम पायसीकरण इकाई में HG6PI समाधान और सीएफए समाधान के मिश्रण रखो।
    4. मिश्रित पेप्टाइड समाधान और सीएफए समाधान को पूरी तरह से पायस करने के लिए सिरिंज को 10-20x प्रति मिन की निरंतर गति और आवृत्ति पर पुश करें। आइस बाथ में ऑपरेशन करें, और पायस की बूंदों को बिना फैलाव के पायसीकरण पूरा होने के बाद 10 मितस के लिए पानी में रखें।
    5. माउस की पूंछ की जड़ में पायसफाइड एचजी6पीआई के 150 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
    6. HG6PI इंजेक्शन के बाद 0 एच और 48 घंटे में माउस इंट्रापेरिटोनी में 200 मिलीग्राम पेर्टोसिस टॉक्सिन इंजेक्ट करें।
  2. आरए मॉडल का प्रायोगिक सत्यापन
    1. माउस के पंजा की मोटाई को वर्नियर कैलिपर (2x एक दिन) के साथ मापें।
    2. पैर की लालिमा और सूजन की डिग्री का निरीक्षण और निशान। निम्नलिखित स्कोरिंग मानदंडों का उपयोग करें: 1) हल्के सूजन वाले उंगलियों; 2) स्पष्ट लाल सूजन के साथ डोरसम पेडीऔर पैर पैड; 3) लाल सूजन के साथ टखने।
    3. 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा गहरे संज्ञाहरण के तहत चूहों को मॉडलिंग के 14 दिन बाद और उसके धुंधला के लिए पंजे को हटा दें।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक साइटोमेट्रिक मनका सरणी (सीबीए) परख का उपयोग करके सीरम आईएल-2, आईएल-4, आईएल-6, आईएल-10, आईएल-17ए, टीएनएफ-α, और आईएफएन-एकेके के स्राव के स्तर का निर्धारण करें।

2. दत्तक सेलुलर थेरेपी के साथ iNKT कोशिकाओं को प्राप्त करना

  1. आईएनकेटी कोशिकाओं का दिशात्मक प्रेरण
    1. सामान्य चूहों को α-GalCer (0.1 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन) के साथ इंट्रापेरिटोनी इंजेक्ट करें।
  2. आईएनकेटी कोशिकाओं का अलगाव
    1. मॉडलिंग के तीन दिन बाद, एनेस्थेटाइजेशन के लिए चूहों को इंट्रापेरिटोनल 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम/किलोशरीर वजन) के साथ इंजेक्ट करें। पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड चूहों एक पैर की उंगलियों चुटकी के लिए एक हिंद पंजा वापसी प्रतिक्रिया नहीं दिखाते हैं ।
    2. इसे α-GalCer के साथ इंट्रापेरिटोनी इंजेक्शन के बाद एक डीबीए/1 माउस की तिल्ली को अलग करें । तिल्ली को 200 जाल छलनी में काटकर और पीसकर एक ही सेल सस्पेंशन तैयार करें।
    3. पीबीएस के साथ सेल निलंबन धोएं, 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्री, और अतिशयोक्ति को त्यागें। दोहराएँ.
    4. पूरे रक्त और ऊतक कमजोर पड़ने के समाधान के 1 mL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। माउस लिंफोसाइट जुदाई माध्यम के 3 mL जोड़ें, और फिर कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 20 न्यूनतम के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
    5. दूधिया सफेद लिम्फोसाइट्स (यानी, शीर्ष से दूसरी परत) की परत एकत्र करें, इसे पीबीएस के साथ 2x धोएं, और एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिनें।
  3. आईएनकेटी कोशिकाओं के शुद्धिकरण के लिए चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई (एमएएस) सकारात्मक चयन रणनीति
    नोट: CD1d tetramers के पूर्व उपचार के लिए, α-Galcer के 1 मिलीग्राम/mL Tween के ०.५% और NaCl के ०.९% के साथ २०० μg/mL को पतला किया गया था, और जिसके परिणामस्वरूप समाधान के 5 μL CD1d tetramer समाधान के १०० μL में जोड़ा गया था । मिश्रण कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था और उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। टीसीआर को डिओनाइज्ड पानी के साथ 80x पतला किया गया था। अन्य सभी एंटीबॉडी का उपयोग स्टॉक समाधान के रूप में किया जाता था।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ 107 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, α-GalCer-लोडेड सीडी1डी टेट्रामर-पीई के 10 माइक्रोन जोड़ें, और अंधेरे में 15 min के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं 2x धोने और उन्हें पीबीएस के 80 μL में फिर से निलंबित।
    3. एंटी-पीई-माइक्रोमोतियों के 20 माइक्रोन जोड़ें और अंधेरे में 20 मिन के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. उन्हें पीबीएस के साथ 2x धोएं और पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    5. छंटाई कॉलम को एमएबीएस सॉर्टर के चुंबकीय क्षेत्र में रखें और पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कुल्ला करें।
    6. सेल निलंबन को चरण 2.3.4 से छंटाई कॉलम में जोड़ें, प्रवाह को एकत्र करें, और पीबीएस बफर के साथ 3x कुल्ला करें।
    7. चुंबकीय क्षेत्र को हटा दें और छंटाई कॉलम से कोशिकाओं को इकट्ठा करें। इस बिंदु पर, छंटाई कॉलम में पीबीएस बफर का 1 mL जोड़ें, और जल्दी से संग्रह ट्यूब पर लेबल कोशिकाओं को चलाने और शुद्ध iNKT कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए लगातार दबाव पर प्लंजर को धक्का दें। एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिनती।
  4. आईएनकेटी सेल फेनोटाइप की पहचान
    1. क्रमशः चरण 2.2.5 और 2.3.7 से 1 x 106 कोशिकाओं को लें, और उन्हें पीबीएस के 50 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
    2. एंटीबॉडी इन्क्यूबेशन: एंटीबॉडी को निगेटिव कंट्रोल ट्यूब में न जोड़ें, सिंगल पॉजिटिव कंट्रोल ट्यूब में एलवाईएल-गैलसेर-पीई-सीडी1डी टेट्रामर या फिटेक-टीसीआर के 10 माइक्रोन को जोड़ें। नमूना ट्यूब में α-GalCer-PE-CD1d tetramer और 10 μL के 0.5 μL जोड़ें। अंधेरे में 30 मिन के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. पीबीएस में कोशिकाओं को धोएं और फिर 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्री।
    4. अधिनेता को त्यागें, Foxp3 Foxation/Permeabilization काम समाधान के 1 mL जोड़ें, और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ min के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट ।
    5. 1x Permeabilization बफर काम समाधान के 1 mL जोड़ें और 5 मिन के लिए कमरे के तापमान पर ५०० x ग्राम के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को अपकेंद्री ।
    6. अधिस्थान त्यागें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए एलेक्सा फ्लोर 647 माउस एंटी-पीएलजेडएफ और परसीपी-Cy 5.5 माउस एंटी-टी-बेट (या परसीपी-Cy 5.5 माउस एंटी-RORοt के 1 μL) के 1 माइक्रोन जोड़ें।
    7. सफाई के लिए परमीबिलाइजेशन बफर वर्किंग सॉल्यूशन के 2 mL में जोड़ें।
    8. अधिनेता को त्यागें, पीबीएस के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उपाय करें।
  5. आईएनकेटी कोशिकाओं की कार्यात्मक पहचान
    1. चरण 2.3.7 से 3 x 106 आईएनकेटी कोशिकाओं को लें और उन्हें आरपीएमआई-1640 अधूरे माध्यम (यानी सीरम के बिना) के 1.5 मिलील के साथ 12 अच्छी प्लेटों में फिर से निलंबित करें।
    2. 24 घंटे के लिए एक सीओ2 इनक्यूबेटर में phorbol ester (PMA, ५० एनजी/mL) और ionomycin कैल्शियम (IO, 1 μg/mL) जोड़ें ।
    3. सेल सुपरनेट ले लीजिए और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक सीबीए परख का उपयोग कर आईएल-2, आईएल-17ए, टीएनएफ-α, आईएल-6, आईएल-4, IFN-10 के स्राव के स्तर का पता लगाएं।
  6. आरए चूहों में iNKT कोशिकाओं के प्रवास मार्ग पर प्रयोगात्मक अध्ययन
    1. डीआईआर डाइ (डीएमएसओ में 2.5 मिलीग्राम/mL) भंग करें।
    2. आरपीएमआई-1640 अधूरे माध्यम के साथ 6 अच्छी प्लेटों में आईएनकेटी कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। घनत्व 1 × 106 कोशिकाओं/mL है ।
    3. 25 मिन के लिए एक सीओ2 इनक्यूबेटर में डीआईआर (5 μg/mL) समाधान जोड़ें और इनक्यूबेट करें ।
    4. पीबीएस के साथ धोएं और डीआईआर-लेबल आईएनकेटी कोशिकाओं (डीआईआर-आईएनकेटी) प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं (3 x 10 6/300 माइक्रोन) को फिर से निलंबित करें।
    5. चूहों को एनेस्थेटिज करने के लिए इंट्रापेरिटोनी से 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) इंजेक्ट करें। पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड चूहों पैर की उंगलियों चुटकी के लिए एक हिंद पंजा वापसी नहीं दिखाते हैं। इमेजिंग के लिए संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए माउस आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम लगाएं।
    6. 8 दिनों के लिए आरए मॉडल के साथ पूंछ नस में डीआईआर-आईएनकेटी कोशिकाओं को 3 x 106 प्रति माउस इंजेक्ट करें। 0 मिन, 10 मिन, 30 मिन, 60 मिन, और दिन 0 (3 घंटे के बाद), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38, और 42 दिनों के लिए चूहों पोस्टइंजेक्शन में आईएनकेटी कोशिकाओं की निगरानी करें वीवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) में एक छोटे जानवर का उपयोग करके। एक्साइटिंग तरंगदैर्ध्य का उपयोग 748 एनएम था, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 780 एनएम था, और एक्सपोजर समय स्वचालित था।
    7. प्रत्येक अवलोकन के बाद प्रत्येक माउस को एक अलग पिंजरे में रखें और स्टर्नल रीक्यूबेंसी बनाए रखें। संज्ञाहरण से वसूली तक निरीक्षण करें।

3. आईएनकेटी कोशिकाओं के साथ आरए चूहों की दत्तक इम्यूनोथेरेपी का मूल्यांकन

  1. आरए चूहों के लिए iNKT सेल दत्तक इम्यूनोथेरेपी
    1. पूंछ नस के माध्यम से माउस प्रति माउस 3 x 106 कोशिकाओं iNKT कोशिकाओं सुई। बेतरतीब ढंग से 15 चूहों का चयन करें जो 8 दिन पहले मॉडलिंग करते थे और पूंछ नस जलसेक द्वारा चरण 2.3.7 से डीआईआर लेबलिंग के बिना आईएनकेटी कोशिकाओं को प्राप्त करते थे।
  2. आईएनकेटी कोशिकाओं के लिए दत्तक इम्यूनोथेरेपी की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करें।
    1. माउस के पंजा की मोटाई को मापें, टखने के जोड़ की सूजन की मात्रा निर्धारित करें, और 1.2.1-1.2.2 चरणों में वर्णित iNKT कोशिकाओं के अर्क के बाद व्यवस्थित रूप से स्कोर करें।
    2. 1.2.3 चरण में वर्णित माउस जोड़ों के भड़काऊ सेल घुसपैठ और संयुक्त परिवर्तन ों का निरीक्षण करें।
    3. आईएल-2, आईएल-4, आईएल-6, आईएल-10, आईएल-17ए, टीएनएफ-α और आईएफएन-ए के स्राव के स्तर का निर्धारण करें जैसा कि चरण 1.2.4 में वर्णित है।
  3. iNKT कोशिकाओं और सबसेट की आवृत्ति निर्धारित करें।
    1. माउस थाइमस को अलग करें और एक एकल सेल निलंबन तैयार करें।
    2. लिम्फोसाइट पृथक्करण तरल पदार्थ के साथ लिम्फोसाइट्स को अलग करें।
    3. चरण 2.4 में वर्णित आईएनकेटी सेल आवृत्ति और उपसमूह आवृत्ति निर्धारित करें।
  4. सांख्यिकीय विश्लेषण
    नोट: सभी डेटा को मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है ± एसडी. पी एंड एलटी के मूल्यों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
    1. विचरण (एनोवा) के एक-कारक विश्लेषण का उपयोग करें। यदि विचरण संतुष्ट है, तो आगे की तुलना के लिए एलएसडी परीक्षण का उपयोग करें।
    2. यदि विचरण एक समान नहीं है, तो नॉनपैरामेट्रिक टेस्ट का उपयोग करें। आगे की तुलना31के लिए क्रुस्कल-वालिस एच टेस्ट का उपयोग करें ।

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Representative Results

मॉडलिंग के बाद गठिया इंडेक्स स्कोर और पंजा मोटाई बढ़ गई। कंट्रोल ग्रुप से तुलना की जाए तो आरए मॉडल ग्रुप के ये जाप ने मॉडलिंग के 6 दिन बाद रेड सूजन दिखाना शुरू किया, जिसमें धीरे-धीरे उत्तेजना हुई। 14 दिनों में, टखने के जोड़ में लाल सूजन नुकीला, धीरे से राहत के बाद । पंजा की मोटाई इसी तरह बदल गई(पी एंड एलटी; 0.05)(चित्रा 1)।

मॉडलिंग के बाद भड़काऊ सेल की घुसपैठ में काफी इजाफा हुआ। रोग के परिणामों से पता चला है कि आरए मॉडल चूहों के टखने के सिनोवियल ऊतक में भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ की डिग्री विभिन्न चरणों में अलग थी। चोटी सूजन दिन 14 पोस्ट मॉडलिंग(चित्रा 2)पर हुई ।

भड़काऊ साइटोकिन्स बढ़ गए और सीरम में भड़काऊ साइटोकिन्स में कमी आई। आरए मॉडल समूह में, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स (टीएनएफ-α, IFN-a, और IL-6) के सीरम स्तर में काफी वृद्धि हुई(पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05), जबकि विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स (आईएल-4 और आईएल-10) में काफी कमी आई(पी एंड एलटी; 0.05)(चित्र ा 3)।

वीवो इंडक्शन और इन विट्रो शुद्धि में प्राप्त आईएनकेटी कोशिकाओं में मुख्य रूप से आईएनकेटी 2 सेल सबसेट शामिल थे, जो विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स को स्रावित करते हैं। α-GalCer के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन ने शरीर में आईएनकेटी कोशिकाओं की आवृत्ति में वृद्धि की, मुख्य रूप से iNKT2 उपसमूह। सामान्य डीबीए/1 चूहों में तिल्ली आईएनकेटी कोशिकाओं की आवृत्ति लिम्फोसाइट्स का लगभग 2% थी, (iNKT2 लगभग 5%, iNKT1 लगभग 15%, iNKT17 लगभग 10%। α-GalCer के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के तीन दिन बाद, आईएनकेटी कोशिकाओं की आवृत्ति लिम्फोसाइट्स का लगभग 6% थी, (iNKT2 लगभग 82%, iNKT1 लगभग 1.5% था, और iNKT17 लगभग 0.5%)। एमएएस द्वारा शुद्धिकरण के बाद, आईएनकेटी कोशिकाओं की शुद्धता 85% से अधिक थी, जिनमें से आईएनकेटी 2 लगभग 92%, आईएनकेटी 1 लगभग 0.4% थी, और आईएनकेटी17 लगभग 0.2%(चित्रा 4)।

काटा iNKT कोशिकाओं को और अधिक विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स और कम भड़काऊ साइटोकिन्स स्रावित । iNKT कोशिकाओं को सामान्य चूहों की तिल्ली से अलग किया गया था और माउस तिल्ली (α-GalCer समूह) और सेल संस्कृति सुपरनेटेंट में साइटोकिन के स्तर की जांच के 3 दिन बाद α-GalCer के साथ इंजेक्शन इंट्रापेरिटोनी से इंजेक्शन दिया गया था। नियंत्रण समूह की तुलना में, α-GalCer समूह के भड़काऊ साइटोकिन्स (आईएल-17A, टीएनएफ-α, IFN-1, और आईएल-6) में काफी कमी आई(पी एंड एलटी; 0.05), और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन आईएल-4 का स्तर काफी बढ़ गया(पी एंड एलटी; 0.05)। आईएल-10(पी एंड जीटी;0.05) में कोई खास अंतर नहीं था। आईएफएन-ए/आईएल-4 अनुपात में काफी कमी आई(पी एंड एलटी; ०.०५)(चित्रा 5)

आईवीआईएस ट्रेसिंग ने पुष्टि की कि डीआईआर-आईएनकेटी कोशिकाओं को एआरचूहों में दत्तक रूप से संचार किया गया था और तुरंत फेफड़ों के पोस्टइंजेक्शन में दिखाई दिया था। फ्लोरेसेंस जिगर में 10 मिन में और तिल्ली में ६० मिन में पाया गया था(चित्र6एआई, 6AII, 6AIII)। अलग अंगों में, 1 घंटे के भीतर थाइमस और इंग्युइनल लिम्फ नोड्स में कोई फ्लोरेसेंस नहीं था। 0 मिनट में फेफड़ों में फ्लोरेसेंस का पता चला था, फ्लोरेसेंस की तीव्रता 10 मिनट में सबसे बड़ी थी, और फिर धीरे-धीरे कमजोर हो गई। 0 मिन में लिवर में कमजोर फ्लोरेसेंस था, और फिर धीरे-धीरे यह बढ़ गया। तिल्ली में फ्लोरेसेंस का पता 30 मिन में लगा और फिर धीरे-धीरे बढ़ गया(चित्रा 6एआईवी, 6सी)।

आरए चूहों में डीआईआर-आईएनकेटी कोशिकाओं के अर्क के बाद, फ्लोरेसेंस मुख्य रूप से जिगर और तिल्ली(चित्र6बीआई, 6बीआई, 6BIII)में केंद्रित था, लेकिन थाइमस और इंगिनल लिम्फ नोड्स में कोई फ्लोरेसेंस नहीं था। तिल्ली और जिगर सेल जलसेक के बाद 1 दिन पर सबसे अधिक फ्लोरेसेंस तीव्रता थी, लेकिन यह धीरे-धीरे कमजोर हो गया। 34 दिन में सतह की फ्लोरेसेंस गायब हो गई। ४२ दिन, अलग अंगों की फ्लोरेसेंस गायब हो गया । सेल जलसेक के बाद जिगर की औसत फ्लोरेसेंस सिग्नल तीव्रता तिल्ली(चित्रा 6बीआईवी, 6डी)की तुलना में अधिक थी।

आरए चूहों में iNKT कोशिकाओं के दत्तक जलसेक रोग प्रगति को कम करने और नैदानिक लक्षणों में सुधार कर सकते हैं । आईएनकेटी कोशिकाओं ने दत्तक जलसेक के बाद आरए चूहों के नैदानिक लक्षणों में सुधार किया। अनुपचारित आरए मॉडल समूह के साथ तुलना में, टखने के संयुक्त की सूजन सेल उपचार समूह में राहत मिली थी, और स्कोर काफी दिन 10 से दिन 20 postinjection में कमी आई । सेल ट्रीटमेंट ग्रुप में इसी अवधि में रा मॉडल ग्रुप(फिगर 2)की तुलना में सिनोवियल टिश्यू में भड़काऊ सेल घुसपैठ कम हो गई थी।

थाइमस आईएनकेटी कोशिकाओं की सफलता दर में उल्लेखनीय वृद्धि हुई(पी एंड एलटी; 0.05)। स्वस्थ नियंत्रण समूह के साथ तुलना में, आरए मॉडल समूह में थाइमस में आईएनकेटी कोशिकाओं की दरों में प्रगति (दिन 11), पीक (दिन 14) और वसूली (दिन 20) चरणों में कमी आई। पीक सूजन पर, इन मूल्यों को कम से कम थे और छूट चरण में खुशहाली लौटने लगी। सेल थेरेपी समूह ने आरए मॉडल समूह(पी एंड एलटी; ०.०५)(चित्रा 7)की तुलना में शिखर (दिन 14) और वसूली (दिन 20) चरणों में आईएनकेटी कोशिकाओं की काफी वृद्धि की दरों को दिखाया ।

आईएनकेटी सेल इन्फ्यूजन के बाद थाइमस में आईएनकेटी1 और आईएनकेटी17 की सफलता दर घटी और आईएनकेटी2 में बढ़ोतरी हुई। नियंत्रण समूह की तुलना में, 11 दिन पर आरए मॉडल समूह में और थाइमस में iNKT17 में काफी वृद्धि हुई(पी एंड एलटी; 0.05), और iNKT2 में काफी कमी आई(पी एंड एलटी; 0.05)। 14 दिन, आईएनकेटी 1 और आईएनकेटी 2 थाइमस में काफी वृद्धि हुई(पीएंडएलटी; 0.05) और आईएनकेटी17 में काफी कमी आई(पीएंडएलटी; 0.05)। 20 दिन, थाइमस में आईएनकेटी 1 में काफी वृद्धि हुई(पी एंड एलटी;0.05), आईएनकेटी 2 में उल्लेखनीय परिवर्तन नहीं हुआ(पी एंड जीटी; 0.05), और iNKT17 में काफी कमी आई(पी एंड एलटी;0.05)। आईएनकेटी1/आईएनकेटी2 अनुपात में तीनों चरणों(पी एंड एलटी; 0.05) के दौरान काफी वृद्धि हुई।

आरए मॉडल समूह की तुलना में, α-GalCer और सेल थेरेपी समूहों में 11 दिन पर, iNKT1 और iNKT17 काफी कम थे(पी एंड एलटी; ०.०५) और iNKT2 में काफी वृद्धि हुई(पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०५) । 14 दिन में, α-GalCer समूह iNKT1 और iNKT17 में काफी कमी आई(पी एंड एलटी; ०.०५), और iNKT2 में काफी बदलाव नहीं आया(पी एंड जीटी; ०.०५); सेल थेरेपी समूह iNKT1 और iNKT17 में काफी कमी आई(पी एंड एलटी; 0.05) और iNKT2 में काफी वृद्धि हुई(पी एंड एलटी; 0.05)। 20 दिन, α-GalCer समूह में iNKT1 में काफी कमी आई(पी एंड एलटी; ०.०५), iNKT2 में काफी बदलाव नहीं आया(पी एंड जीटी; ०.०५), और iNKT17 में काफी वृद्धि हुई(पी एंड एलटी; ०.०५); सेल थेरेपी समूह iNKT1 और iNKT17 में काफी कमी आई(पी एंड एलटी; 0.05) और iNKT2 में काफी वृद्धि हुई(पी एंड एलटी; 0.05)। आईएनकेटी1/आईएनकेटी2 के अनुपात में तीनों चरणों(पी एंड एलटी; 0.05)(चित्र ा 7)के दौरान काफी कमी आई।

सीरम में भड़काऊ साइटोकिन्स का स्तर बढ़ा था और आईएनकेटी सेल इन्फ्यूजन के बाद एंटी-भड़काऊ साइटोकिन्स में कमी आई थी। आरए मॉडल समूह में, टीएनएफ-α, आईएफएन-ए, और आईएल-6इन सीरम के स्तर में काफी वृद्धि हुई(पी एंड एलटी; 0.05), जबकि आईएल-4 और आईएल-10 ने नियंत्रण समूह की तुलना में स्पष्ट रूप से कम मात्रा(पी एंड एलटी; 0.05) दिखाई। आईएनकेटी सेल थेरेपी ग्रुप में सीरम में टीएनएफ-α, आईएफएन-एऔर आईएल-6 का स्तर काफी कम हो गया, जबकि आईएल-4 और आईएल-10 में आरए मॉडल ग्रुप(फिगर 3)की तुलना में काफी बढ़ोतरी(पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०५) में काफी वृद्धि हुई ।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों में संयुक्त सूजन स्कोर और पंजा मोटाई बदल जाता है। (क)चूहों में टखने के जोड़ की सूजन। (बी,डी) विभिन्न समूहों में पंजा मोटाई। (ग)विभिन्न समूहों में नैदानिक स्कोर में परिवर्तन। मॉडलिंग के बाद 10-20 (यानी इलाज के बाद 2-12 दिन) दिन में सेल थेरेपी ग्रुप में माउस आर्थराइटिस स्कोर और पंजा की मोटाई काफी कम हो गई थी। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम कंट्रोल, **पी एंड एलटी; 0.05 बनाम आरए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: टखने के जोड़ के हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तन। सेल थेरेपी ग्रुप में भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ काफी कम हो गई थी और 14 दिन आरए ग्रुप में काफी बढ़ोतरी हुई थी। ♫ = भड़काऊ कोशिकाओं। (A)100x(B)400x। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रत्येक समूह में सीरम साइटोकिन्स का स्तर। (A)मॉडलिंग (स्नातकोत्तर/mL) के बाद 11 दिन चूहों में सीरम साइटोकिंस का स्तर । (ख)मॉडलिंग (स्नातकोत्तर/mL) के बाद 14 दिन चूहों में सीरम साइटोकिंस का स्तर । टीएनएफ-α, IFN-1, और IL-6 के स्तर में काफी कमी आई है, और आईएल-4 और आईएल-10 के स्तर में काफी वृद्धि हुई सेल थेरेपी समूह में। एकपी एंड एलटी; 0.05 बनाम नियंत्रण। बीपी एंड एलटी; ०.०५ बनाम आरए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: iNKT कोशिकाओं की दरें और iNKT सेल सबसेट का अनुपात। (ए, बी, सी) सामान्य चूहों में iNKT2 की दर ~ 5% है। (D,E,F) वीवो इंडक्शन में आईएनकेटी2 की दर करीब 82 फीसद है। (जी, एच, मैं) एमएएस शुद्धिकरण के बाद आईएनकेटी2 की दर 92% से अधिक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: माउस तिल्ली-व्युत्पन्न iNKT कोशिकाओं की संस्कृति अधिनात में साइटोकिन का स्तर। आईएल-4 का स्तर काफी बढ़ गया है, और आईएल-17ए, टीएनएफ-α, IFN-1, और IL-6 के स्तर में काफी कमी आई। एकपी एंड एलटी; 0.05 बनाम नियंत्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: कैलिपर आईवीआईएस ल्यूमिना द्वितीय द्वारा पता लगाया गया आईएनकेटी कोशिकाओं का वितरण और चयापचय। (ए, बी) आईएनकेटी कोशिकाओं का प्रवास पथ। (ग)तिल्ली, यकृत और फेफड़ों में औसत फ्लोरेसेंस सिग्नल तीव्रता का परिवर्तन। (D)तिल्ली और जिगर में औसत फ्लोरेसेंस सिग्नल तीव्रता का परिवर्तन। 0 मिन में फेफड़ों और लिवर में फ्लोरेसेंस का पता चला और फिर धीरे-धीरे बढ़ गया। फ्लोरेसेंस की तीव्रता फेफड़ों में 10 मीटर पर सबसे मजबूत थी और फिर कम हो गई । तिल्ली की फ्लोरेसेंस 30 मिन में पता चला, फिर धीरे-धीरे बढ़ गई। सभी अंगों की फ्लोरेसेंस ४२ दिन गायब हो गई । यकृत की औसत फ्लोरेसेंस सिग्नल तीव्रता कोशिका जलसेक के बाद तिल्ली से अधिक है (I: सुपिन; द्वितीय: पार्श्व झूठ बोल; III: प्रवण; चतुर्थ: अलग ऊतक; एक: नियंत्रण समूह; ख: सेल जलसेक समूह; 1, 2, 3, 4, 5 थाइमस, तिल्ली, जिगर, इंगिनल लिम्फ नोड्स, फेफड़े हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: iNKT की दरें और माउस थाइमस में इसके सबसेट। }मॉडलिंग के 20 दिन बाद 11, 14 और आईएनकेटी कोशिकाओं की दरें। (ख)iNKT1/iNKT2 का अनुपात । (C,D,E) iNKT1, iNKT2, और iNKT17 की दर। दिन 11, 14, और 20 (सेल थेरेपी के बाद दिन 3, 6, और 12) पर, iNKT कोशिकाओं की दरों में काफी वृद्धि हुई, iNKT1 और थाइमस के iNKT17 सेल थेरेपी समूह में काफी कम हो गया, और iNKT2 काफी बढ़ गया था । एकपी एंड एलटी; 0.05 बनाम नियंत्रण। बीपी एंड एलटी; 0.05 बनाम आरए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

आईएनकेटी कोशिकाएं विशेष टी कोशिकाएं हैं जो जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा को पाटती हैं और मुख्य रूप से सीडी 4+++/सीडी8+ थाइमोसाइट्स से विकसित की जाती हैं। आईएनकेटी कोशिकाओं में विविध इम्यूनोरेगुलेटरी कार्य होते हैं और विभिन्न साइटोकिन्स23के सीधे संपर्क और स्राव द्वारा अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं, जिससे डेंग्ड्रिटिक कोशिकाएं (डीसी), मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, बी कोशिकाएं, टी कोशिकाएं, और एनके सेल विभेदन और विकास24प्रभावित होते हैं। α-GalCer स्पंज से निकाला गया एक शास्त्रीय आईएनकेटी सेल-विशिष्ट सक्रियक है। कई अध्ययनों से संकेत मिलता है कि तिल्ली iNKT सेल आवृत्ति 3 दिनों के लिए α-GalCer के एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद एक चोटी तक पहुंचता है25। हमारे प्रयोगात्मक परिणामों ने α-GalCer के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद 3 दिनों के लिए चूहों तिल्ली में iNKT2 सबसेट की प्रधानता का प्रदर्शन किया, जो मुख्य रूप से विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस आईएल-4 और आईएल-10 का स्राव करता है। हमने यह भी पाया कि iNKT2 कोशिकाओं की बहुतायत में कमी आई और iNKT1 और iNKT17 कोशिकाओं में भड़काऊ चरण के दौरान आरए मॉडल चूहों में वृद्धि हुई । इसलिए, हमने माउस तिल्ली की आईएनकेटी कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए α-GalCer के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा अलग किया। इनका इस्तेमाल आरए मॉडल चूहों के इलाज के लिए किया जाता था। वीवो इंडक्शन के बाद आईएनकेटी2 सबसेट की दर 82% थी। एमएएस द्वारा शुद्धिकरण के बाद, iNKT2 की दर 92% से अधिक हो गई।

iNKT कोशिकाओं की विशिष्ट सक्रियण आरए के लिए एक उपन्यास जैविक उपचार के रूप में नियोजित है। होरिकोशी एट अल.21 ने दिखाया कि α-GalCer के इनट्रेडरमल इंजेक्शन ने सीडी 4+ टी कोशिकाओं की संख्या को काफी बाधित करके जीपीआई पेप्टाइड-प्रेरित गठिया को बाधित किया। चिबा एट अल.26 से पता चला है कि सिंथेटिक iNKT2 चयनात्मक एक्टिवेटर ओच के दोहराया इंजेक्शन सीआईए हिचकते हैं, जबकि α-GalCer एक मामूली निरोधात्मक प्रभाव दिखाया । हमने तिल्ली-व्युत्पन्न iNKT को आरए मॉडल चूहों में इंजेक्ट किया, और परिणामों से पता चला कि सेल थेरेपी समूह में टखने के जोड़ों की सूजन की डिग्री और जोड़ों में घुसपैठ करने वाली भड़काऊ कोशिकाओं की संख्या कम हो गई थी। सीरम विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स (जैसे, आईएल-4 और आईएल-10) का स्तर बढ़ गया, और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स (जैसे, आईएफएन-एऔर टीएनएफ-α) का स्राव कम हो गया। iNKT कोशिकाओं की लक्षित सक्रियण आरए की प्रगति को कम करने और भड़काऊ प्रतिक्रिया को बाधित करने में सक्षम था। इसके अलावा हमने थाइमस में आईएनकेटी की फ्रीक्वेंसी का पता लगाया और पाया कि आरए मॉडल ग्रुप में आईएनकेटी कोशिकाओं की संख्या काफी कम हो गई थी, जबकि आईएनकेटी कोशिकाओं के जलसेक के बाद थाइमस में फ्रीक्वेंसी बढ़ गई। रक्त थाइमस बैरियर प्रणाली की उपस्थिति के कारण, हमने बाद के प्रयोगों में पुष्टि की गई थाइमस में आईएनकेटी के स्तर में दत्तक संचार वृद्धि पर विचार नहीं किया। थाइमस में आईएनकेटी कोशिकाओं की उपआबादी का इसके अलावा पता चला कि, स्वस्थ नियंत्रण समूह की तुलना में, आरए मॉडल समूह में iNKT1 कोशिकाओं की संख्या सूजन के तीन चरणों के दौरान और सूजन के चरम के दौरान अधिकतम वृद्धि हुई, जबकि iNKT2 सबसेट का अनुपात सूजन के चरम पर बढ़ने लगा। विशेष रूप से, iNKT1 सबसेट आरए की शुरुआती सूजन में शामिल हो सकता है, और iNKT2 सबसेट सूजन को बाधित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। आरए मॉडल समूह की तुलना में, सेल थेरेपी समूह में iNKT1 सबसेट काफी भड़काऊ चरण के दौरान कमी आई, और iNKT2 सबसेट सूजन के प्रारंभिक और छूट चरण में काफी वृद्धि हुई। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि विशिष्ट फेनोटाइप और कार्यात्मक आईएनकेटी कोशिकाओं के दत्तक अर्क ने आरए में आईएनकेटी कोशिकाओं की आवृत्ति में काफी वृद्धि की और आईएनकेटी सेल सबसेट के अनुपात को बदल दिया।

हमने दत्तक जलसेक के बाद चूहों में आईएनकेटी कोशिकाओं के वितरण का निरीक्षण करने के लिए आईवीआईएस का उपयोग किया और जलसेक के बाद फेफड़ों में 10 मिन में उच्चतम फ्लोरेसेंस तीव्रता पाई, जो धीरे-धीरे फीका हो गई। लिवर में कमजोर फ्लोरेसेंस दिखा, जो धीरे-धीरे बढ़ता गया और 2 दिन बाद धीरे-धीरे कम हो जाता है। तिल्ली में 30 मिन में फ्लोरेसेंस का पता चला, जो धीरे-धीरे बढ़ता गया और 2 दिन बाद कम हो गया। जिगर की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता तिल्ली की तुलना में मजबूत थी। हालांकि, थाइमस और इंगुइनल लिम्फ नोड्स में कोई फ्लोरेसेंस नहीं पाया गया। फेफड़ों में फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए पूंछ की नस में iNKT कोशिकाओं के अर्क के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । इन कोशिकाओं को रक्त के साथ फेफड़ों में परिचालित किया जाता है। तिल्ली की तुलना में पहले जिगर फ्लोरेसेस, और जिगर की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता तिल्ली की तुलना में मजबूत होती है। आईएनकेटी कोशिकाओं का यह तरजीही संचय जिगर में प्रचुर मात्रा में रक्त वाहिकाओं, मुख्य मेटाबोलिक अंग के कारण हो सकता है। थाइमस में फ्लोरेसेंस का पता नहीं चला। यह हेमेटोलॉजिकल बाधा के कारण हो सकता है, जो आईएनकेटी कोशिकाओं के प्रवेश में बाधा डाल सकता है। फ्लोरेसेंस का कभी भी इंगिनल लिम्फ नोड्स में पता नहीं चला, शायद इसलिए कि कम आईएनकेटी कोशिकाओं ने लिम्फ नोड्स में प्रवेश किया और पता लगाने के न्यूनतम स्तर तक नहीं पहुंचा। इसके अलावा, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि आईएनकेटी कोशिकाओं ने पूंछ की नस में संचार किया है, लिम्फ नोड्स में प्रवेश नहीं कर सकता है। इसलिए, हम परिकल्पना करते हैं कि थाइमस में आईएनकेटी कोशिकाओं के विकास और भेदभाव को चूहों में दत्तक जलसेक के बाद साइटोकिन रास्तों के माध्यम से विनियमित किया जा सकता है। इसे और स्पष्ट करने की जरूरत है ।

जीपीआई अधिकांश आरए रोगियों के सीरम और सिनोविचल तरल पदार्थ में मौजूद है और नैदानिक आरए निदान27के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला परीक्षण है। ब्रून्स एट अल.28 ने जीपीआई अनुक्रम से विभिन्न लंबाई के पेप्टाइड्स का उपयोग किया और छह इम्यूनोप्रमुख टी सेल एपिटोप्स की पहचान करने के लिए डीबीए/1 चूहों को प्रतिरक्षित किया। इनमें से तीन गठिया थे। गठिया की 95% घटनाओं के साथ पेप्टाइड्स एचजीपीआई 325-339 और एचजीपीआई469-483 हैं। हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एक आरए मॉडल स्थापित करने के लिए दो पेप्टाइड्स के मिश्रण का उपयोग एक ही पेप्टाइड से बेहतर है। परिणामस्वरूप आरए मॉडल में, चूहों के पंजों और जोड़ों 6 दिन लाल दिखाई देने लगे और 14 दिन सूजन की चोटी पर पहुंच गए। भड़काऊ सेल घुसपैठ जोड़ों के सिनोवियल ऊतक में ऊतक हाइपरप्लासिया के साथ था, और भड़काऊ सेल घुसपैठ 14 दिन में सबसे गंभीर थी। सूजन के चरम पर थाइमस में आईएनकेटी कोशिकाओं की संख्या में काफी कमी आई थी, जो आरए रोगियों29में आईएनकेटी कोशिकाओं की प्रवृत्ति के अनुरूप थी। आईएनकेटी सेल सबसेट का और पता लगाने से पता चला है कि थाइमस में आईएनकेटी 1 और आईएनकेटी17 की आवृत्ति बढ़ी और सूजन की प्रगति (दिन 11) के दौरान आईएनकेटी 2 की आवृत्ति में कमी आई। इसके अलावा, सीरम साइटोकिंस आईएफएन-एएफएन और आईएल-17ए का स्तर प्रगति (दिन 11) और सूजन के शिखर (दिन 14) के दौरान बढ़ गया, जो आरए मॉडल चूहों30में Th1 और Th17 उपसमूहों के समान ध्रुवीकरण का सुझाव देता है। इसलिए, एचजीपीआई325-339 और एचजीपीआई469-483 मिश्रित पॉलीपेप्टाइड टुकड़ों द्वारा प्रेरित आरए माउस मॉडल ने सीडी 4+ टी सेल हाइपरप्रसार और आईएनकेटी सेल दोषों की विशेषताओं का प्रदर्शन किया, जो आरए रोगियों के समान था, और आरए कोशिकाओं की प्रतिरक्षा की जांच के लिए एक आदर्श पशु मॉडल के रूप में उपयोग किया जा सकता है। ये परिणाम हमारे पिछले अध्ययनों के लोगों के साथ सहमत थे और एचजीपीआई-प्रेरित आरए मॉडल31की स्थिरता का प्रदर्शन किया ।

सामान्य तौर पर, मिश्रित G6PI पेप्टाइड्स द्वारा प्रेरित आरए माउस मॉडल सीडी 4+ टी कोशिकाओं, आईएनकेटी कोशिकाओं और आरए रोगियों में संबंधित साइटोकिन्स में परिवर्तन ों का अनुकरण कर सकता है। यह आरए की गहराई से जांच के लिए एक अच्छा मॉडल प्रदान करता है। लगातार, iNKT (मुख्य रूप से iNKT2) α-GalCer के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित और शुद्ध इन विट्रो का उपयोग आरए के उपचार में किया गया था। यह Th सबसेट के असामान्य प्रसार के कारण प्रतिरक्षा असंतुलन को ठीक कर सकता है, आरए की प्रगति को दूर कर सकता है, और भविष्य में आरए के नैदानिक उपचार के लिए उपन्यास विधियां प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखक कोई धन या हितों के टकराव की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हमारे अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) (81771755), हेबेई प्रांत (ZD2017009) के कॉलेजों और विश्वविद्यालय के विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रमुख अनुसंधान परियोजना और हेबेई विश्वविद्यालय के मेडिकल प्रयोग केंद्र की पशु प्रयोगशाला द्वारा समर्थित किया गया था। हम उनके समर्थन के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF BD 563490 America
Anti-PE MicroBeads Miltenyi 130-048-801 Germany
Columns Miltenyi MS Germany
Cryogenic Centrifuge Beckman Allegra® X-15R America
DiR Thermo Fisher Scientific D12731 America
Embedding Center Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. BMJ-1 China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain BD 553170 America
Flow cytometer BD Accuri C6 America
Freund's complete adjuvant Sigma F5881 America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) Karebay Biochem 18062202 China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) Karebay Biochem 18062203 China
In Vivo Imaging System PerkinElmer caliper IVIS lumina II America
Ionomycin Calcium Cayman 10004974 America
KRN7000 AdipoGen AG-CN2-0013 America
Mouse CD1d Tetramer-PE MBL TS-MCD-1 Japan
Mouse percoll Solarbio P8620 China
Optical Microscope Olympus Olympus-II Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt BD 562683 America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet BD 561316 America
Pertussis toxin Sigma P7208 America
phorbol esters Cayman 10008014 America
Red Blood Cell Lysis Buffer BD 555899 America
RPMI-1640 Biological Industries 01-100-1ACS Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit BD 560485 America
Ultramicrotome Leica Leica EM UC6 Germany

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References

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