Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI)

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Immunology and Infection

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Summary

Este protocolo utiliza péptidos mixtos G6PI para construir modelos de artritis reumatoide que están más cerca de la artritis reumatoide humana en células CD4+ T y citoquinas. Células T asesinas naturales invariables de alta pureza (principalmente iNKT2) con fenotipos y funciones específicas se obtuvieron mediante inducción in vivo y purificación in vitro para inmunoterapia adoptiva.

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Meng, M., Chen, S., Gao, X., Liu, H., Wang, Y., Zhang, J., Dou, H., Li, W., Chen, D. Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice. J. Vis. Exp. (155), e60048, doi:10.3791/60048 (2020).

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Abstract

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica compleja. La patogénesis de la enfermedad está relacionada con células T (iNKT) asesinas naturales invariables. Los pacientes con AR activa presentan menos células iNKT, función celular defectuosa y polarización excesiva de Th1. En este estudio, se estableció un modelo animal de RA utilizando una mezcla de péptidos hGPI325-339 y hGPI469-483. Las células iNKT se obtuvieron por inducción in vivo y purificación in vitro, seguida de perfusión en ratones RA para inmunoterapia adoptiva. El seguimiento del sistema de imágenes in vivo (IVIS) reveló que las células iNKT se distribuyeron principalmente en el bazo y el hígado. El día 12 después de la terapia celular, la progresión de la enfermedad se desaceleró significativamente, los síntomas clínicos se aliviaron, la abundancia de células iNKT en el timo aumentó, la proporción de iNKT1 en el timo disminuyó, y los niveles de TNF-, IFN-o, y IL-6 en el suero disminuyó. La inmunoterapia adoptiva de las células iNKT restauró el equilibrio de las células inmunitarias y corrigió la inflamación excesiva del cuerpo.

Introduction

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por una invasividad crónica progresiva con incidencia de 0,5-1%1,2. La patogénesis subyacente se atribuye a la proliferación anormal de células autoreactivas CD4+ y CD8+ T, manifestadas por un aumento en la proporción de células CD4+IFN-+ y CD4+IL-17A+ T, y el número reducido de células CD4+IL-4+ y CD4+CD25+FoxP3+ T. Por lo tanto, la secreción de citoquinas inflamatorias se incrementa, y una reacción inflamatoria excesiva destruye el equilibrio nativo y la función de tolerancia del sistema inmunológico del cuerpo. Además, las células auxiliares del linfocito T (Th) 1 que penetran en la articulación agravan la respuesta inflamatoria y el daño articular. Por lo tanto, la inhibición de la respuesta inflamatoria excesiva y la restauración de la tolerancia inmune y el equilibrio inmune son clave para el tratamiento de RA3,4.

Las celdas iNKT tienen funciones y características de células NK y células T. Las células iNKT albergan una cadena distinta e invariable de receptor de células T (TCR) con repertorios limitados de cadena TCR5 y reconocen el antígeno glucólido presentado por la molécula CD1d del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) CD1d en la superficie de las células que presentan antígenos. 6 detectó un gran número de células iNKT y defectos funcionales en muchas enfermedades autoinmunes, incluida la AR. 7demostraron que las células iNKT tienen un efecto positivo en el mantenimiento de la tolerancia autoinmune y que cuando se restaura el número y la función de las células iNKT, la enfermedad se alivia. Además, Miellot-Gafsou et al.8 encontraron que las células iNKT no sólo abrogaron la enfermedad, sino que también aumentaron la progresión de la enfermedad. Estos resultados contradictorios sugieren que las células iNKT son células T heterogéneas, y la función de diferentes subconjuntos puede revertirse. En un estudio clínico de AR, la frecuencia de las células iNKT se correlacionó con la puntuación de la actividad de la enfermedad9. Los resultados también confirmaron que la frecuencia de iNKT se redujo en pacientes con AR, el número de subconjuntos de células CD4+IFN +T aumentó, y los niveles secretores de citoquinas inflamatorias IFN-o y TNF-o aumentaron10,11. Además,12 investigaron la diabetes tipo 1 (T1D) y encontraron que la infusión selectiva de células iNKT reguló la expresión de la citoquina inflamatoria IL-4, mantuvo la tolerancia inmune y presionó el desarrollo de la diabetes tipo 1. Por lo tanto, la infusión adoptiva de células iNKT específicas o la activación dirigida de células iNKT aumenta el nivel de células iNKT en pacientes con AR, lo que puede ser un avance en el tratamiento con AR.

La inmunoterapia celular es actualmente de gran interés y ha sido ampliamente utilizada en la terapia contra el cáncer. Sin embargo, las células iNKT son células inmunorreguladoras heterogéneas raras (sólo 0,3% del número total de PBMC)13,lo que limita las posibles aplicaciones clínicas. Estas células se dividen principalmente en tres subpoblaciones: 1) células iNKT1, que tienen una alta expresión de la leucemia promielocítica proteína zinc-dedo (PLZF) y factor de transcripción T-caja (T-bet); 2) células iNKT2 con expresión intermedia de PLZF y proteína de unión GATA 3 (GATA3); 3) células iNKT17 con baja expresión de PLZF y receptor nuclear huérfano (ROR) relacionado con retinoides- que secretan IFN-, IL-4 e IL-1714. Las células iNKT activadas secretan citoquinas similares a Th1, Th2 y Th17, que determinan los diferentes efectos inmunomoduladores de las células iNKT15. Los efectos inmunomoduladores e inmunoterapéuticos de la activación específica de varias subpoblaciones de células iNKT son diferentes. Por lo tanto, la selección de fenotipos específicos de células iNKT (principalmente iNKT2) con funciones antiinflamatorias para regular la respuesta inmune del cuerpo puede corregir el desequilibrio inmune y los trastornos inmunológicos en la AR.

El establecimiento de un modelo animal ideal es de gran importancia para el tratamiento y estudio de la patogénesis de la AR. Actualmente, los modelos animales más comúnmente utilizados y maduros incluyen artritis inducida por colágeno, artritis adyuvante, artritis inducida por cimosa, y artritis inducida por polisacáridos1617. Sin embargo, no hay ningún modelo que pueda simular completamente todas las características de la RA humana. La artritis inducida por colágeno tipo II (CIA) es un modelo clásico de artritis. La CIA es inducida por la inmunización de ratones con anticuerpos monoclonales específicos para colágeno tipo II, lo que refleja la dependencia de anticuerpos de este modelo de enfermedad. Describió un modelo con una respuesta inmune sistémica a la isomerasa de glucosa-6-fosfato (G6PI), que induce la poliartritis simétrica periférica en cepas de ratón susceptibles18,19. En este modelo, el desarrollo de la artritis depende de las células T, células B, e inmunidad innata18,19,20. Horikoshi21 encontró que los modelos de RA resultantes de la inmunización de ratones DBA/1 con fragmentos de polipéptidos G6PI son más similares a la RA humana en términos de células CD4+ T y citoquinas (es decir, IL-6 y TNF)) que los modelos de la CIA. Con el fin de aumentar el efecto estimulante en el sitio de reconocimiento TCR, los fragmentos de polipéptidos mixtos de G6PI (hGPI325-339 y hGPI469-483) se utilizaron para inmunizar ratones DBA/1 para construir el modelo de ratón RA. La tasa de éxito de este enfoque puede ser alta porque hGPI325-339 y hGPI469-483 son inmunodominantes para las respuestas de células T restringidas a Q-A. Por lo tanto, este modelo puede simular la sobreproliferación de células CD4+ T y defectos celulares iNKT en pacientes con AR22. La investigación básica de la inmunopatología de la AR sentó las bases para nuestra investigación más profunda.

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Protocol

Todos los ratones experimentales (150 en total) eran ratones machosanos, de 6 a 8 semanas de edad (20,0 x 1,5 g), criados en un entorno específico libre de patógenos (SPF). No hay ningún tratamiento especial antes del modelado. El experimento se dividió en un grupo de control saludable (15 ratones), un grupo de control de modelos (15 ratones) y un grupo de terapia celular (55 ratones). Este estudio fue aprobado por el Comité de Bienestar Animal y Etica de la Universidad de Hebei.

1. Construir el modelo de enfermedad

  1. Duplicación del modelo animal RA
    1. Pesar 1,75 mg de fragmentos de hG6PI 325-339 y hG6PI 469-483 y disolverlos en 5,25 ml de agua destilada triple de 4oC.
    2. Disolver el adyuvante completo de Freund (CFA) en un baño de agua de 50 oC, dibujar 5,25 ml en otro tubo centrífugo de 10 ml y enfriarlo para su uso.
    3. Coloque la mezcla de solución hG6PI y solución cfA en una unidad de emulsión artificial con dos jeringas de vidrio conectadas.
    4. Empuje la jeringa a una velocidad y frecuencia constantes de 10–20 x por minuto para emulsionar completamente la solución de péptido mixto y la solución cfA. Realizar la operación en un baño de hielo, y mantener las gotas de emulsión en el agua durante 10 minutos después de la finalización de la emulsión sin dispersión.
    5. Inyectar 150 l de hG6PI emulsionados en la raíz de la cola del ratón por vía subcutánea.
    6. Inyectar 200 mg de toxina de la tos ferina en el ratón por vía intraperitoneal a 0 h y 48 h después de la inyección de hG6PI.
  2. Verificación experimental del modelo RA
    1. Mida el grosor de la pata del ratón con una pinza Vernier (2 veces al día).
    2. Observar y marcar el grado de enrojecimiento e hinchazón del pie. Utilice los siguientes criterios de puntuación: 1) dedos de los dedos con hinchazón leve; 2) pedis de dorsum y almohadilla para el pie con hinchazón roja clara; 3) tobillo con hinchazón roja.
    3. Eutanasia a los ratones bajo anestesia profunda mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg de peso corporal) 14 días después del modelado y retire las patas para la tinción HE.
    4. Determinar los niveles de secreción de suero IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-o, e IFN-o utilizando un ensayo de matriz de cuentas citométricas comerciales (CBA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. Obtención de células iNKT con terapia celular adoptiva

  1. Inducción direccional de células iNKT
    1. Inyectar ratones normales por vía intraperitoneal con el valor de "GalCer" (0,1 mg/kg de peso corporal).
  2. Aislamiento de células iNKT
    1. Tres días después del modelado, inyectar ratones por vía intraperitoneal con un 1% de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal) para la anestesia. Los ratones anestesiados adecuadamente no muestran una respuesta de abstinencia de pata trasera a un pellizco del dedo del pies.
    2. Aísle el bazo de un ratón DBA/1 después de inyectarlo por vía intraperitoneal con el galCer. Preparar una suspensión de una sola célula cortando y moliendo el bazo en un tamiz de malla 200.
    3. Lave la suspensión celular con PBS, centrífuga a 200 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante. Repetir.
    4. Resuspender las células con 1 ml de solución de dilución de sangre y tejido entero. Añadir 3 ml de medio de separación de linfocitos de ratón, y luego centrifugar las células durante 20 min a 300 x g a temperatura ambiente.
    5. Recoger la capa de linfocitos blancos lechosos (es decir, la segunda capa de la parte superior), lavarla 2 veces con PBS, y contar con un contador de células automatizado.
  3. Clasificación de células activadamagnéticas magnéticas (MACS)Estrategia de selección positiva para la purificación de células iNKT
    NOTA: Para el pretratamiento de los tetrámeros CD1d, se diluyó 1 mg/ml de la galcer a 200 g/ml con un 0,5% de Tween-20 y un 0,9% de NaCl, y 5 ml de la solución resultante a 100 ml de la solución de tetrámero CD1d. La mezcla se incuba durante 12 h a temperatura ambiente y se colocó a 4oC para su uso. El TCR se diluyó 80veces con agua desionizada. Todos los demás anticuerpos se utilizaron como solución de stock.
    1. Resuspenda 107 células con 100 oC de PBS de 4 oC, agregue 10 sL de Tetramer-PE CD1d cargado con GalCer e incubarlas a 4 oC durante 15 minutos en la oscuridad.
    2. Lavar las células 2veces con PBS y resuspenderlas en 80 sL de PBS.
    3. Añadir 20 s de anti-PE-MicroBeads e incubarlos a 4 oC durante 20 minutos en la oscuridad.
    4. Lávelos 2 veces con PBS y resuspenda las células con 500 ml de PBS.
    5. Coloque la columna de clasificación en el campo magnético de la clasificadodora MACS y enjuague con 500 ml de PBS.
    6. Agregue la suspensión de celda del paso 2.3.4 a la columna de ordenación, recopile el flujo a través y enjuague 3x con búfer PBS.
    7. Retire el campo magnético y recoja las celdas de la columna de clasificación. En este punto, agregue 1 ml de búfer PBS a la columna de clasificación y empuje rápidamente el émbolo a una presión constante para conducir las celdas etiquetadas al tubo de recolección y obtener células iNKT purificadas. Cuente con un contador de celdas automatizado.
  4. Identificación del fenotipo celular iNKT
    1. Tome 1 x 106 células de los pasos 2.2.5 y 2.3.7, respectivamente, y resuspenda en 50 l de PBS.
    2. Incubación de anticuerpos: No añada el anticuerpo al tubo de control negativo, añada 0,5 ml de Tetramer de GalCer-PE-CD1d o 10 ml de FITC-TCR en el tubo de control positivo único. Añadir 0,5 ml de tetrámero de la galcer-PE-CD1d y 10 ml de FITC-TCR en el tubo de muestra. Incubarlos a 4oC durante 30 min en la oscuridad.
    3. Lavar las células en PBS y luego centrifugar a 200 x g durante 5 min.
    4. Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml de Foxp3 Foxation/Permeabilization solución de trabajo, e incubar las células durante 45 minutos a 4 oC en la oscuridad.
    5. Añadir 1 ml de 1x solución de trabajo Tampón de permeabilización y centrifugar las células a temperatura ambiente durante 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min.
    6. Descarta el sobrenadante. Añadir 1 l de ratón Anti-PLZF de Alexa Fluor 647 y 1 l de PerCP-Cy 5.5 mouse anti-T-bet (o 1 l de PerCP-Cy 5.5 mouse anti-ROR-t) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
    7. Añadir a 2 mL de solución de trabajo de tampón de permeabilización para la limpieza.
    8. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células en 500 s de PBS y mida por citometría de flujo.
  5. Identificación funcional de células iNKT
    1. Tome 3 x 106 células iNKT del paso 2.3.7 y resuspenda en 12 placas de pozo con 1,5 ml de medio incompleto RPMI-1640 (es decir, sin suero).
    2. Añadir éster de phorbol (PMA, 50 ng/mL) y calcio de ionomicina (IO, 1 g/ml) y colocar en una incubadora deCO2 durante 24 h.
    3. Recoger el sobrenadante celular y detectar los niveles de secreción de IL-2, IL-17A, TNF-, IL-6, IL-4, IFN-o, e IL-10 utilizando un ensayo comercial CBA de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  6. Estudio experimental sobre la vía migratoria de células iNKT en ratones RA
    1. Disolver el tinte DiR (2,5 mg/ml) en DMSO.
    2. Resuspenda las células iNKT en 6 placas de pozo con medio incompleto RPMI-1640. La densidad es de 1 x 106 celdas/ml.
    3. Añadir la solución diR (5 g/mL) e incubar en una incubadora de CO2 durante 25 min.
    4. Lavar con PBS y resuspender las células (3 x 106/300 l) para obtener células iNKT etiquetadas con DiR (DiR-iNKT).
    5. Inyectar un 1% de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal para anestesiar a los ratones. Los ratones anestesiados adecuadamente no muestran una retirada de la pata trasera hasta pellizcar el dedo del dedo del pies. Aplique pomada veterinaria en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia para la toma de imágenes.
    6. Inyectar células DiR-iNKT 3 x 106 por ratón en la vena de la cola con el modelo RA durante 8 días. Supervise las células iNKT en ratones después de la inyección durante 0 min, 10 min, 30 min, 60 min y día 0 (después de 3 h), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38 y 42 días utilizando un pequeño sistema de imágenes in vivo animal (IVIS). La longitud de onda de excitación utilizada era de 748 nm, la longitud de onda de emisión era de 780 nm y el tiempo de exposición era automático.
    7. Coloque cada ratón en una jaula separada después de cada observación y mantenga la recumbencia esternal. Observar hasta la recuperación de la anestesia.

3. Evaluación de la Inmunoterapia Adoptiva de Ratones RA con Células iNKT

  1. inmunoterapia adoptiva de células iNKT para ratones RA
    1. Inyectar 3 x 106 células iNKT células por ratón a través de la vena de la cola. Seleccione aleatoriamente 15 ratones que fueron modelados 8 días antes y obtenga células iNKT sin etiquetado DiR del paso 2.3.7 por la infusión de la vena de la cola.
  2. Evaluar la eficacia de la inmunoterapia adoptiva para células iNKT.
    1. Mida el grosor de la pata del ratón, cuantifique la hinchazón de la articulación del tobillo y puntúe sistemáticamente después de la perfusión de células iNKT como se describe en los pasos 1.2.1–1.2.2.
    2. Observe la infiltración de células inflamatorias y los cambios articulares de las articulaciones del ratón como se describe en el paso 1.2.3.
    3. Determinar los niveles de secreción de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-o, e IFN-o como se describe en el paso 1.2.4.
  3. Determine la frecuencia de las celdas y subconjuntos iNKT.
    1. Aísle el timo del ratón y prepare una suspensión de una sola célula.
    2. Separe los linfocitos con líquido de separación de linfocitos.
    3. Determine la frecuencia de celda iNKT y la frecuencia de los subgrupos como se describe en el paso 2.4.
  4. Análisis estadístico
    NOTA: Todos los datos se presentan como medias : Valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
    1. Utilice el análisis de un factor de varianza (ANOVA). Si se cumple la varianza, utilice la prueba LSD para una comparación adicional.
    2. Si la varianza no es uniforme, utilice la prueba no paramétrica. Utilice la prueba Kruskal-Wallis H para una comparación adicional31.

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Representative Results

La puntuación del índice de artritis y el grosor de la pata aumentaron después del modelado. En comparación con el grupo de control, los dedos del grupo modelo RA comenzaron a mostrar hinchazón roja a los 6 días después del modelado, con agravamiento gradual. A los 14 días, la hinchazón roja en la articulación del tobillo alcanzó su punto máximo, seguido de un alivio gradual. El grosor de la pata cambió de forma similar (P < 0.05) (Figura 1).

La infiltración de células inflamatorias aumentó significativamente después del modelado. Los resultados patológicos mostraron que el grado de infiltración de células inflamatorias en el tejido sinovial del tobillo de los ratones modelo RA era diferente en diferentes etapas. La inflamación del pico se produjo en el día 14 después del modelado(Figura 2).

Las citoquinas inflamatorias aumentaron y las citoquinas antiinflamatorias disminuyeron en el suero. En el grupo modelo RA, los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias (TNF--, IFN-o e IL-6) aumentaron significativamente(P < 0.05), mientras que las citoquinas antiinflamatorias (IL-4 e IL-10) disminuyeron significativamente(P < 0.05) (Figura 3).

Las células iNKT obtenidas por inducción in vivo y purificación in vitro consistían principalmente en subconjuntos de células iNKT2, que segregan citoquinas antiinflamatorias. La inyección intraperitoneal de la glorática aumentó la frecuencia de las células iNKT en el cuerpo, predominantemente el subgrupo iNKT2. La frecuencia de las células iNKT del bazo en ratones DBA/1 normales fue de aproximadamente el 2% de los linfocitos, (iNKT2 fue de aproximadamente 5%, iNKT1 alrededor del 15%, iNKT17 alrededor del 10%). Tres días después de la inyección intraperitoneal de la galcer, la frecuencia de las células iNKT era de aproximadamente el 6% de los linfocitos, (iNKT2 fue de aproximadamente 82%, iNKT1 alrededor del 1,5%, y iNKT17 aproximadamente 0,5%). Después de la purificación por MACS, la pureza de las células iNKT fue superior al 85%, de las cuales iNKT2 fue de aproximadamente 92%, iNKT1 alrededor de 0.4%, y iNKT17 alrededor de 0.2%(Figura 4).

Las células de iNKT cosechadas segregaron más citoquinas antiinflamatorias y menos citoquinas inflamatorias. Las células iNKT fueron aisladas de los bazos de los ratones normales e inyectaron intraperitonealmente con el gloro 3 días después de que se examinara el bazo del ratón (grupo de la "GalCer") y los niveles de citoquinas en el sobrenadante del cultivo celular. En comparación con el grupo de control, las citoquinas inflamatorias (IL-17A, TNF-, IFN-o e IL-6) del grupo de la clase -GalCer disminuyeron significativamente(P < 0.05), y el nivel antiinflamatorio de citoquina IL-4 aumentó significativamente(P < 0.05). No hubo diferencia significativa en IL-10(P > 0.05). La relación IFN-/IL-4 disminuyó significativamente(P < 0,05)(Figura 5).

El rastreo de IVIS confirmó que las células DiR-iNKT se infundieron de forma adoptiva en ratones RA y aparecieron inmediatamente en los pulmones después de la inyección. La fluorescencia se detectó en el hígado a 10 min y en el bazo a 60 min(Figura 6AI, 6AII, 6AIII). En los órganos aislados, no había fluorescencia en el timo y los ganglios linfáticos inguinales dentro de 1 h. La fluorescencia se detectó en los pulmones a 0 min, la intensidad de la fluorescencia fue la mayor a los 10 minutos, y luego se debilitó gradualmente. Hubo fluorescencia débil en el hígado a 0 min, y luego aumentó gradualmente. La fluorescencia en el bazo se detectó a 30 min y luego aumentó gradualmente(Figura 6AIV, 6C).

Después de la infusión de células DiR-iNKT en ratones RA, la fluorescencia se concentró principalmente en el hígado y el bazo(Figura 6BI, 6BII, 6BIII),pero no hubo fluorescencia en el timo y los ganglios linfáticos inguinales. El bazo y el hígado tuvieron la mayor intensidad de fluorescencia el día 1 después de la perfusión celular, pero se debilité gradualmente. El día 34, la fluorescencia superficial desapareció. El día 42, la fluorescencia de los órganos aislados desapareció. La intensidad media de la señal de fluorescencia del hígado después de la perfusión celular fue mayor que la del bazo(Figura 6BIV, 6D).

La infusión adoptiva de células iNKT en ratones RA puede aliviar la progresión de la enfermedad y mejorar los síntomas clínicos. Las células iNKT mejoraron los síntomas clínicos de los ratones RA después de la perfusión adoptiva. En comparación con el grupo modelo de RA no tratado, la hinchazón de la articulación del tobillo se sintió aliviada en el grupo de tratamiento celular, y las puntuaciones disminuyeron significativamente desde el día 10 hasta el día 20 después de la inyección. En el mismo período en el grupo de tratamiento celular, la infiltración de células inflamatorias en el tejido sinovial se redujo en comparación con el grupo modelo RA(Figura 2).

Las tasas de éxito de las células del tim ostión iNKT aumentaron significativamente(P < 0,05). En comparación con el grupo de control saludable, en el grupo modelo RA las tasas de células iNKT en el timo disminuyeron en las etapas de progreso (día 11), pico (día 14) y recuperación (día 20). En la inflamación máxima, estos valores fueron mínimos y rebotaron en la fase de remisión. El grupo de terapia celular mostró un aumento significativo de las tasas de células iNKT en las etapas de pico (día 14) y recuperación (día 20) en comparación con el grupo modelo RA (P < 0.05) (Figura 7).

Después de la perfusión celular de iNKT, la tasa de éxito de iNKT1 e iNKT17 en el timo disminuyó y el iNKT2 aumentó. En comparación con el grupo de control, en el grupo modelo RA en el día 11 iNKT1 e iNKT17 en el timo aumentó significativamente(P < 0.05), y iNKT2 disminuyó significativamente(P < 0.05). El día 14, iNKT1 e iNKT2 en el timo aumentaron significativamente(P< 0.05) y el iNKT17 disminuyó significativamente(P< 0.05). En el día 20, iNKT1 en el timo aumentó significativamente(P < 0.05), iNKT2 no cambió significativamente(P > 0.05), y el iNKT17 disminuyó significativamente(P < 0.05). La relación iNKT1/iNKT2 aumentó significativamente durante las tres etapas(P < 0,05).

En comparación con el grupo modelo RA, en el día 11 en el GalCer y los grupos de terapia celular, iNKT1 e iNKT17 fueron significativamente más bajos(P < 0.05) y iNKT2 aumentaron significativamente(P < 0.05). En el día 14, en el grupo iNKT1 e iNKT17 disminuyó significativamente(P < 0.05), y iNKT2 no cambió significativamente(P > 0.05); en el grupo de terapia celular iNKT1 e iNKT17 disminuyó significativamente(P < 0.05) y iNKT2 aumentó significativamente(P < 0.05). En el día 20, en el grupo de la GalCer, el iNKT1 disminuyó significativamente(P < 0,05), iNKT2 no cambió significativamente(P > 0,05), y iNKT17 aumentó significativamente(P < 0.05); en el grupo de terapia celular iNKT1 e iNKT17 disminuyó significativamente(P < 0.05) y iNKT2 aumentó significativamente(P < 0.05). La relación de iNKT1/iNKT2 disminuyó significativamente durante las tres etapas(P < 0,05)(Figura 7).

Los niveles de citoquinas inflamatorias aumentaron en suero y las citoquinas antiinflamatorias disminuyeron después de la perfusión de células iNKT. En el grupo de modelos RA, los niveles de suero de TNF-, IFN-o e IL-6in aumentaron significativamente(P < 0.05), mientras que IL-4 e IL-10 mostraron cantidades marcadamente disminuidas(P < 0.05) en comparación con el grupo de control. En el grupo de terapia celular iNKT, los niveles de TNF-, IFN-o e IL-6 en suero disminuyeron significativamente en las etapas de progreso y pico de inflamación (P < 0.05), mientras que IL-4 e IL-10 aumentaron significativamente(P < 0.05) en comparación con el grupo modelo RA (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: La puntuación de hinchazón articular y el cambio de grosor de la pata en ratones. (A) Hinchazón de la articulación del tobillo en ratones. (B,D) Grosor de la pata en diferentes grupos. (C) Cambios clínicos de puntuación en diferentes grupos. La puntuación de artritis del ratón y el grosor de la pata se redujeron significativamente en el grupo de terapia celular los días 10–20 (es decir, 2-12 días después del tratamiento) después del modelado. *P < 0.05 contra control, **P < 0.05 vs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cambios histopatológicos de la articulación del tobillo. La infiltración de células inflamatorias se redujo significativamente en el grupo de terapia celular y se incrementó significativamente en el grupo de AR el día 14. • Células inflamatorias. (A) 100x (B) 400x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Los niveles de citoquinas séricas en cada grupo. (A) Niveles séricos de citoquinas en ratones el día 11 después del modelado (pg/mL). (B) Niveles séricos de citoquinas en ratones el día 14 después del modelado (pg/mL). Los niveles de TNF-, IFN-o, y IL-6 disminuyeron significativamente, y los niveles de IL-4 e IL-10 aumentaron significativamente en el grupo de terapia celular. uncontrol P < 0.05 frente a. bP < 0.05 vs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Las tasas de celdas iNKT y la proporción de subconjuntos de celdas iNKT. (A,B,C) La tasa de iNKT2 en ratones normales es del 5%. (D,E,F) La tasa de iNKT2 es de aproximadamente 82% después de la inducción in vivo. (G, H, I) La tasa de iNKT2 es más del 92% después de la purificación de MACS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Niveles de citoquinas en el sobrenadante de cultivo de células iNKT derivadas del bazo de ratón. El nivel de IL-4 aumentó significativamente, y los niveles de IL-17A, TNF-, IFN-o, y IL-6 disminuyeron significativamente. uncontrol P < 0.05 frente a. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Distribución y metabolismo de las células iNKT trazadas por la pinza IVIS lumina II. (A,B) Ruta de migración de celdas iNKT. (C) El cambio de la intensidad media de la señal de fluorescencia en el bazo, el hígado y el pulmón. (D) El cambio de la intensidad media de la señal de fluorescencia en el bazo y el hígado. La fluorescencia se detectó en los pulmones y el hígado a 0 min, y luego aumentó gradualmente. La intensidad de la fluorescencia fue más fuerte a los 10 minutos en los pulmones y luego disminuyó. La fluorescencia del bazo se detectó a los 30 minutos, y luego aumentó gradualmente. La fluorescencia de todos los órganos desapareció el día 42. La intensidad media de la señal de fluorescencia del hígado es mayor que el bazo después de la perfusión celular (I: supino; II: mentira lateral; III: propenso; IV: tejido aislado; a: grupo de control; b: grupo de infusión celular; 1, 2, 3, 4, 5 son timo, bazo, hígado, ganglios linfáticos inguinales, pulmones). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Las tasas de iNKT y sus subconjuntos en el timo del ratón. (A) Las tasas de celdas iNKT a los 11, 14 y 20 días después del modelado. (B) La relación de iNKT1/iNKT2. (C,D,E) La tasa de iNKT1, iNKT2 e iNKT17. En los días 11, 14 y 20 (días 3, 6 y 12 después de la terapia celular), las tasas de células iNKT aumentaron significativamente, el iNKT1 y el iNKT17 del timo disminuyeron significativamente en el grupo de terapia celular, y el iNKT2 se incrementó significativamente. unP < 0.05 vs Control. bP < 0.05 vs RA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las células iNKT son células T especiales que unen inmunidad innata y adaptativa y se desarrollan principalmente a partir de CD4++/ CD8+ timocitos. Las células iNKT tienen diversas funciones inmunorreguladoras e interactúan con otras células inmunitarias por contacto directo y secreción de diferentes citoquinas23,afectando a las células dendríticas (CC), macrófagos, neutrófilos, células B, células T y diferenciación y desarrollo de células NK24. Es un activador clásico específico de la célula iNKT extraído de las esponjas. Varios estudios indican que la frecuencia de las células iNKT del bazo alcanza un pico después de una sola inyección intraperitoneal de la galcer durante 3 días25. Nuestros resultados experimentales demostraron el predominio del subconjunto iNKT2 en el bazo de ratones durante 3 días después de una inyección intraperitoneal de la galCer, que secreta principalmente citoquinas antiinflamatorias IL-4 e IL-10. También encontramos que la abundancia de células iNKT2 disminuyó y la de las células iNKT1 e iNKT17 aumentó en los ratones modelo RA durante la fase inflamatoria. Por lo tanto, aislamos las células iNKT del bazo del ratón por inyección intraperitoneal de -GalCer durante 3 días. Estos se utilizaron para tratar a los ratones modelo RA. La tasa del subconjunto iNKT2 fue del 82% después de la inducción in vivo. Después de la purificación por MACS, la tasa de iNKT2 superó el 92%.

La activación específica de las células iNKT se emplea como un nuevo tratamiento biológico para la AR. Horikoshi et al.21 demostraron que la inyección intradérmica de la artritis inducida por péptidos GPI inhibió significativamente el número de células CD4+ T. 26 mostraron que las inyecciones repetidas del activador selectivo sintético iNKT2 OCH inhibieron la CIA, mientras que el GalCer mostró un ligero efecto inhibitorio. Inyectamos iNKT derivado del bazo en ratones modelo RA, y los resultados mostraron que el grado de hinchazón de las articulaciones del tobillo en el grupo de terapia celular y el número de células inflamatorias que se infiltran en las articulaciones se redujo. El nivel de citoquinas antiinflamatorias séricas (p. ej., IL-4 e IL-10) aumentó, y disminuyó la secreción de citoquinas proinflamatorias (p. ej., IFN-y TNF-). la activación dirigida de las células iNKT fue capaz de aliviar la progresión de la AR e inhibir la respuesta inflamatoria. Además, detectamos la frecuencia de iNKT en el timo y encontramos que el número de células iNKT en el grupo modelo RA se redujo significativamente, mientras que la frecuencia en el timo aumentó después de la infusión de las células iNKT. Debido a la presencia del sistema de barrera sangre-timo, no consideramos el aumento de forma adoptiva infundida en el nivel de iNKT en el timo que se confirmó en experimentos posteriores. Una mayor detección de las subpoblaciones de células iNKT en el timo reveló que, en comparación con el grupo de control saludable, el número de células iNKT1 en el grupo modelo RA aumentó significativamente durante las tres etapas de inflamación y máximamente durante el pico de inflamación, mientras que la proporción del subconjunto iNKT2 comenzó a aumentar en el pico de inflamación. En particular, el subconjunto iNKT1 podría estar involucrado en la inflamación temprana de la AR, y el subconjunto iNKT2 puede desempeñar un papel importante en la inhibición de la inflamación. En comparación con el grupo modelo RA, el subconjunto iNKT1 en el grupo de terapia celular disminuyó significativamente durante la fase inflamatoria, y el subconjunto iNKT2 aumentó significativamente en la etapa temprana y de remisión de la inflamación. Estos resultados indicaron que la infusión adoptiva de fenotipos específicos y células iNKT funcionales aumentó significativamente la frecuencia de las células iNKT en RA y alteró la proporción de subconjuntos de células iNKT.

Utilizamos IVIS para observar la distribución de células iNKT en ratones después de la perfusión adoptiva y encontramos la mayor intensidad de fluorescencia en los pulmones 10 minutos después de la perfusión, que se desvaneció gradualmente. El hígado mostró fluorescencia débil, que aumentó gradualmente y disminuyó gradualmente después de 2 días. La fluorescencia se detectó en el bazo a 30 min, que aumentó gradualmente y disminuyó después de 2 días. La intensidad media de fluorescencia del hígado fue más fuerte que la del bazo. Sin embargo, no se detectó fluorescencia en el timo y los ganglios linfáticos inguinales. La detección de fluorescencia en los pulmones podría atribuirse a la infusión de células iNKT en la vena de la cola. Estas células circulan a los pulmones con la sangre. La fluorescencia hepática antes que el bazo, y la intensidad media de fluorescencia del hígado es más fuerte que la del bazo. Esta acumulación preferencial de las células iNKT puede deberse a los abundantes vasos sanguíneos en el hígado, el principal órgano metabólico. No se detectó fluorescencia en el timo. Esto podría deberse a la barrera hematológica, que podría dificultar la entrada de células iNKT. La fluorescencia nunca se detectó en los ganglios linfáticos inguinales, tal vez porque menos células iNKT entraron en los ganglios linfáticos y no alcanzaron el nivel mínimo de detección. Además, se podría especular que las células iNKT infundidas en la vena de la cola podrían no entrar en los ganglios linfáticos. Por lo tanto, hipotetizar que el desarrollo y diferenciación de las células iNKT en el timo podría naverse a través de vías de citoquinas después de la infusión adoptiva en los ratones. Esto debe aclararse aún más.

La IGP está presente en el suero y el líquido sinovial de la mayoría de los pacientes con AR y es una prueba comúnmente utilizada para el diagnóstico clínico de AR27. 28 utilizaron péptidos de diferentes longitudes de la secuencia de GPI e inmundaron los ratones DBA/1 para identificar seis epítopos de células T inmunodominantes. De ellos, tres eran artritogénicos. Los péptidos con >95% de incidencia de artritis son hGPI 325-339 y hGPI469-483. Nuestros estudios anteriores demostraron que el uso de una mezcla de los dos péptidos para establecer un modelo de RA es mejor que un solo péptido. En los modelos de RA resultantes, los dedos de los dedos de los dedos de los ratones comenzaron a aparecer rojos el día 6 y alcanzaron un pico de inflamación el día 14. La infiltración de células inflamatorias fue acompañada de hiperplasia tisular en el tejido sinovial de las articulaciones, y la infiltración de células inflamatorias fue más grave en el día 14. El número de células iNKT disminuyó significativamente en el timo en el pico de inflamación, que fue consistente con la tendencia de las células iNKT en pacientes con AR29. La detección posterior de subconjuntos de células iNKT reveló que la frecuencia de iNKT1 e iNKT17 en el timo aumentó y la frecuencia de iNKT2 disminuyó durante la progresión de la inflamación (día 11). Además, los niveles de citoquinas séricas IFN-o e IL-17A aumentaron durante la progresión (día 11) y el pico de inflamación (día 14), lo que sugiere una polarización similar de los subgrupos Th1 y Th17 en ratones modeloRA 30. Por lo tanto, el modelo de ratón RA inducido por fragmentos de polipéptidos mixtos hGPI325-339 y hGPI469-483 exhibió las características de la hiperproliferación de células CD4+ T y defectos celulares iNKT, que era similar al de los pacientes con AR, y podría ser utilizado como un modelo animal ideal para investigar la inmunidad de las células de RA. Estos resultados estuvieron de acuerdo con los de nuestros estudios anteriores y demostraron la estabilidad del modelo31de RA inducido por hGPIs.

En general, el modelo de ratón RA inducido por los péptidos mixtos G6PI puede simular los cambios en las células CD4+ T, células iNKT y citoquinas relacionadas en pacientes con AR. Esto proporciona un buen modelo para la investigación en profundidad de la AR. Consecutivamente, se utilizó iNKT (principalmente iNKT2) inducido por inyección intraperitoneal de galCer y purificado in vitro en el tratamiento de la AR. Puede corregir el desequilibrio inmune causado por la proliferación anormal de los subconjuntos Th, aliviar la progresión de la AR, y en el futuro puede proporcionar métodos novedosos para el tratamiento clínico de la AR.

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Disclosures

Los autores no declaran financiación ni conflictos de intereses.

Acknowledgments

Nuestro estudio fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges and university's key research project of Hebei province (ZD2017009) y el Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Estamos agradecidos por su apoyo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF BD 563490 America
Anti-PE MicroBeads Miltenyi 130-048-801 Germany
Columns Miltenyi MS Germany
Cryogenic Centrifuge Beckman Allegra® X-15R America
DiR Thermo Fisher Scientific D12731 America
Embedding Center Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. BMJ-1 China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain BD 553170 America
Flow cytometer BD Accuri C6 America
Freund's complete adjuvant Sigma F5881 America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) Karebay Biochem 18062202 China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) Karebay Biochem 18062203 China
In Vivo Imaging System PerkinElmer caliper IVIS lumina II America
Ionomycin Calcium Cayman 10004974 America
KRN7000 AdipoGen AG-CN2-0013 America
Mouse CD1d Tetramer-PE MBL TS-MCD-1 Japan
Mouse percoll Solarbio P8620 China
Optical Microscope Olympus Olympus-II Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt BD 562683 America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet BD 561316 America
Pertussis toxin Sigma P7208 America
phorbol esters Cayman 10008014 America
Red Blood Cell Lysis Buffer BD 555899 America
RPMI-1640 Biological Industries 01-100-1ACS Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit BD 560485 America
Ultramicrotome Leica Leica EM UC6 Germany

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