使用 PRIMO 微模式系统对蛋白质的光诱导分子吸附,研究细胞对细胞外基质蛋白的反应

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Summary

我们的总体目标是了解细胞如何感知细胞外线索,导致定向的斧头生长。在这里,我们描述了光诱导分子吸附蛋白质的方法,用于生成细胞外基质成分的定义的微模式,以研究控制斧头生长和路径发现的特定事件。

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Melero, C., Kolmogorova, A., Atherton, P., Derby, B., Reid, A., Jansen, K., Ballestrem, C. Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins. J. Vis. Exp. (152), e60092, doi:10.3791/60092 (2019).

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Abstract

细胞感知各种细胞外线索,包括细胞外基质的组成和几何,由细胞本身合成和重塑。在这里,我们介绍使用PRIMO系统作为模式技术使用单一或蛋白质组合生产微模式的细胞外基质(ECM)基质的蛋白质分子吸附方法。该方法可实现以微米分辨率打印 ECM 图案,具有优异的可重复性。我们提供分步协议,并演示如何应用它来研究神经元路径查找的过程。LIMAP 与现有的微打印方法相比,在便于图案化多个组件以及能够生成具有任何几何体或渐变的图案方面具有显著优势。该协议可以很容易地适应研究几乎任何化学成分对细胞命运和细胞行为的贡献。最后,我们讨论可能出现的常见问题以及如何避免这些问题。

Introduction

近年来,生物科学越来越多地利用材料科学提供的进步。一个突出的例子是基质的微模式,可用于研究细胞反应,如细胞增殖1,2分化3,4,5,6,细胞迁移7,8,9和路径查找10,11.有许多技术可用于基板的微模式化,例如多光子激发光化学12,AFM 浸笔纳米光刻13,针脚和喷墨直接打印14,电子束光刻15或微流体16.然而,在生物领域广泛使用的两种技术是微接触印刷17,18,19或激光辅助图案3(图 1).与微接触打印相比,激光辅助模式在蛋白质和PEG稳定性以及细胞约束方面提供了更可靠的结果20.这里描述的一种更新颖的微模式处理方法是使用光诱导分子吸附蛋白21(利马普,图 1D) 使用市售系统(PRIMO,材料表).每种方法都有优点和限制,下面将对此进行简要介绍。微接触打印使用 PDMS 模具(图章),具有从石版画母版生成的所需微特征。邮票用选定的蛋白质孵育,然后转移到细胞培养基板上(加盖)18(图 1A).激光辅助图案使用紫外光来薄膜22,23,24,25,暴露随后可以涂上感兴趣的蛋白质的区域(图 1B).虽然使用照片图案方法实现的分辨率在微米范围内25,26,大多数这些技术都需要一个光掩膜,要么与样品接触,要么位于显微镜物体平面上23,27,28.在微接触打印和照片图案方面对蒙版的要求可能是一个限制;每个几何图案和尺寸都需要特定的蒙版,这可能既昂贵又耗时。与这些技术相比,LIMAP 不需要掩码 (图 1D).使用 PRIMO 系统进行 LIMAP 在开始时可能会耗费大量成本,因为它需要购买设备。然而,开源软件用于设计任何所需几何图形的模式,给予更多的自由度,并允许更复杂的实验,包括使用蛋白质浓度梯度。PRIMO 激光由数字控制的微镜设备 (DMD) 控制和引导,以创建任意数量的用户定义的几何形状。LIMAP 要求培养表面涂有防止细胞附着的分子。聚乙烯乙二醇(PEG)最常用作这种"防污"试剂;在玻璃或塑料表面形成致密的防粘膜29.随后,添加了一个照片创建器,允许通过照片拍摄机制高精度去除 PEG 胶片30在DMD的控制下局部暴露于紫外线下。这些无PEG区域可以涂上蛋白质,吸附到激光蚀刻表面,产生一个微模式。通过改变激光功率,可以从表面去除不同数量的PEG,使用户可以产生蛋白质梯度。PEG去除和涂布程序可以重复创建模式与两个或两个以上不同的蛋白质在同一微井21.生成的微模式为细胞提供粘合表面,允许研究细胞行为。在我们的研究中,我们使用微模式来研究神经元细胞系(CAD(Cathechominergic-一个分化)细胞的神经质或斧子路径发现31) 或原发性大鼠背原结条 (DRG) 神经元。在这里,我们概述了LIMAP的分步协议(图 2) 使用市售的 PRIMO 系统和随附的莱昂纳多软件。我们演示了如何使用它生成具有定义几何形状和多种蛋白质的图案,我们用它来研究斧道路径查找。我们讨论可能出现的常见问题以及如何避免这些问题。

Protocol

1. 图案模板的设计

注:图案模板使用数字绘图软件(材料表)生成。绘制不同的灰色水平将决定激光强度。使用软件设计图案模板允许快速生成具有任何所需几何形状和渐变的图案(图 3)。

  1. 使用绘图软件以数字方式绘制所需的图案模板。选择长度为 1824 像素和 1140 像素宽度的图像大小(在本研究中对应于 415 μm 长度和 260 μm 宽度)。将模式模板另存为 8 位 Tiff 文件。
    注:根据将微图案设备商业化的品牌(材料表),可按要求提供生成模板的分步协议。

2. 等离子清洗

注:最佳结果要求在阵列之前对表面进行等离子清洁,从而去除所有有机物并激活表面。在本例中,环境空气足以进行表面激活。使用等离子清洗器(材料表)的过程压力为1000-1300 mTorr,功率为29.6 W,为1-5分钟。

  1. 使用内井尺寸为 20 mm 且玻璃厚度为 0.16-0.19 mm 的玻璃底盘。"要测试多种条件,请使用 6 口玻璃底盘。否则,请使用单井玻璃底盘 (材料表)。
    注:等离子清洗设备商业化的品牌(材料表)可应要求提供等离子清洗分步协议。

3. 钝化

注:此步骤会产生防污膜,防止蛋白质吸附到玻璃表面。PEG作为抗污剂,对蛋白质吸附29具有高抗性。LIMAP 使用照片设置器通过 UV 光射局部去除 PEG。感兴趣的蛋白质然后会吸附到这些无PEG的表面21,产生微模式。

  1. 使用 PLL-PEG 钝化
    1. 在无菌条件下,切割 PDMS 模具(参见图 4A、B材料表),以确保它们适合内部玻璃底部井,并去除使用无菌钳子的内微井填充物。使用钳子将模具粘在玻璃井上。
    2. 确保模具紧紧地粘在玻璃上,防止形成气泡,在钝化过程中可能导致泄漏。
      注:PDMS模具也可以使用已发布的协议18,32内部制造。
    3. 在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备PLL-PEG溶液(材料表,0.1mg/mL)。在每个微井中加入20μL的PLL-PEG溶液,并在室温下孵育,1小时。
    4. 从微井中取出 15 μL 的 PLL-PEG,用 20 μL 的 PBS(材料表)清洗 5 次,而不会使其干燥。
      注:始终在两次之间留出大约 5 μL 的 PBS。由于微井体积小,特别容易干燥。干燥会导致微模式质量低劣。
    5. 将培养皿保持在 PBS 中(每口井 3 mL)4°C 长达 3 天,或继续下一步(步骤 3.1.5)。
    6. 从单个微井中取出 18 μL 的 PBS(例如,左上微井,参见图 4D),添加 5 μL 的光发动器(PLPP,材料表),并在剩余的微井中留下 20 μL 的 PBS。在系统校准步骤(步骤 4)期间,此带有 PLPP 的微井将用于创建参考模式(参见图 4D,E)。保护 PLPP 免受光线照射。
  2. 具有长效 PEG-SVA 的钝化
    注:要生成抗粘胶表面,可以使用:1) 与聚-L-Lysine(PLL-PEG,步骤 3.1)或 2) PEG-琥珀-琥珀酸 N-羟基硅酸 (PEG-SVA) 相连的 PEG。选择一个或另一个钝化选项的决定取决于存储选项(请参阅步骤 10)。用PEG-SVA孵育的培养菜肴需要双倍的钝化和光图案。
    1. 如步骤 3.1.1 中所述准备模具。
    2. 在每个微井中加入 20 μL 的 0.01% Poly-L-Lysine(PLL,材料表),并在室温下孵育 30 分钟,预涂有 PLL。
    3. 从微井中取出 15 μL 的 PLL,用 20 μL 的 1 M HEPES 缓冲液(材料表)清洗三次,而不会让水井干涸。
      注:始终在两次之间留出大约 5 μL 的 HEPES 或 PBS。由于微井体积小,特别容易干燥。干燥会导致微模式质量低劣。
    4. 准备 PEG-SVA 解决方案。PEG-SVA溶液(HEPES缓冲液1M中的50mg/mL)应在每次使用前新鲜制备。每微井制备 20 μL PEG-SVA。
    5. HEPES 缓冲器的 pH 必须介于 8-8.5 之间。在用pH纸制备PEG-SVA溶液之前,先测试HEPES pH。使用精密秤在离心管中称重 PEG-SVA。加入HEPES缓冲液和涡旋30s,直到溶解。当溶液透明时,PEG-SVA 被完全溶解。
      注: SVA 是允许 PEG 与先前涂层的 PLL 结合的酯。一旦 HEPES 缓冲器添加到 PEG-SVA 中,SVA 的半使用寿命为 15 分钟,应立即使用。
    6. 将 20 μL 的 PEG-SVA 溶液加入每个微井,并在室温下孵育,从微井中取出 15 μL PEG-SVA,用 20 μL 的 PBS(材料表)清洗 5 次,而不会让井干涸。
    7. 准备培养皿进行长期存储(最多 1 个月,请参阅步骤 10.2),或继续执行下一步(步骤 3.2.8)。
    8. 从单个微井中取出 18 μL 的 PBS(例如,左上微井,参见图 4D),添加 5 μL PLPP(材料表),并在剩余的微井中留下 20 μL 的 PBS。此微井将用于创建参考模式(参见 Fi gure 4D,E)。确保 PLPP 在微井的整个表面上是同质的。保护 PLPP 免受光线照射。

4. 系统校准

注:在这些步骤中,激光的焦点将调整到特定类型的培养皿(步骤 4.1)。仅在一个微井(步骤 4.2)中生成参考模式,然后使用蛋白质溶液(步骤 4.3)孵育,以确保激光的最佳对焦条件(步骤 4.4),这是获得锐利和定义模式所必需的。

  1. 激光校准
    注:在校准过程中,校准激光图像将投射到荧光高光的玻璃表面(校准良好,标有荧光荧光笔图4C),需要聚焦于显微镜。
    1. 使用荧光荧光笔 (材料表) 标记空的内玻璃井.
      注: 校准井必须具有与生成微图案的培养盘相同的玻璃厚度(0.16-0.19 mm)。如果使用 6 口玻璃底盘,则可以使用空井进行校准,并在无菌条件下使用荧光荧光笔进行标记。
    2. 打开显微镜、舞台和计算机。打开 PRIMO 微模式设备、打开微管理器和莱昂纳多软件。莱昂纳多软件通过插件下的微管理器操作。在材料表中查看设备和软件的品牌/目录编号。
    3. 在莱昂纳多的初始菜单中,选择"校准"。检查专用的 PRIMO 滤波器立方体在滤波器转塔中是否处于正确位置(光路);在显微镜和莱昂纳多软件上选择 20X 目标(0.75 DIC S 计划荧光,无相环)。
      注: 此协议调整为莱昂纳多版本 4.4。该协议可能需要针对其他版本进行调整。
    4. 将先前突出显示的校准井(图 4C) 置于目标上方。选择摄像机路径。调整目标焦点,直到PRIMO徽标和标记线的激光投影在焦点内照顾您的细胞。
    5. 将默认相机曝光时间保留为 25 ms. 调整激光强度以查看来自 PRIMO徽标投影中的字母I的灰色和其余白色字母。
    6. 记录焦平面的 Z 位置(目标对样品的高度),后来称为 Z 位置校准。这将是参考模式生成后获得的最佳焦点的近似值(参见步骤 4.2-4.4)。
  2. 参考模式
    1. 将培养皿与包含照片发动器的微井(参考模式微井,图 4D)置于目标上方,并在莱昂纳多软件中选择模式。
    2. 通过摄像机通过透射光可视化微井边缘,并从右侧菜单中选择 ROI 符号。将 ROI 圆的直径设置为 4000 μm,并将数字 ROI 的边缘与当前微井的边缘对齐。
    3. 通过在微井边缘移动舞台,确保数字 ROI 和当前微井之间有准确的重叠。ROI 位置将与舞台运动耦合。
    4. 选择锁定莱昂纳多软件将 ROI 锁定在所需位置。关闭传输的指示灯。
    5. 选择PRIMO以上载所需的模式模板,该模板将作为设计单元投影到 ROI 上(参见图 5)。模式将显示在下拉列表中,称为"操作",并显示在软件上的"操作"菜单中。
      注: 模式模板需要之前设计(请参阅步骤 1),并在在软件中加载模板之前保存为 8 位 Tiff 文件。
    6. 参考模式只需要一个小模式;例如,3 行,1 列(参见图 4E图 5B)。在"复制"菜单中,设置所需的列数和行数(莱昂纳多软件中的行)。单击"刷新"可观察模式设计的数字预览。
    7. 在"复制"菜单中设置激光剂量。在此设置和使用PLL-PEG的最佳激光剂量为1390 mJ/mm2
      注:激光功率可能介于 5-7.5 mW/mm2 之间。在这种情况下,它是7.5 mW/mm2,这需要大约30s来阵列每个设计单元,使用激光剂量1390mJ/mm2。如果培养皿表面使用 PEG-SVA 钝化(与 PLL-PEG 相比,激光剂量约为两倍),则可能需要更高的激光剂量。这需要事先测试。
    8. 导航到微井的外围区域(例如,顶部部分),远离微井的阵列生成(中心区域)的主要感兴趣区域(参见图 4E),然后选择"锁定"。等待,直到显示图案。
    9. 将焦点调整到校准的 Z 位置(请参阅步骤 4.1.6)。
      注: 如果其他用户在光图案轮之间使用相同的显微镜,建议执行额外的系统校准步骤。
    10. 选择"播放"符号以开始图案化。确保软件中的激光处于打开位置。等待,直到模式化过程完成。图案持续时间将显示在"估计时间"面板中。在莱昂纳多软件版本4.4模式完成后,所有操作显示为蓝色在可视化菜单。
  3. 参考模式的蛋白质孵育
    1. 在无菌条件下,用20μL的PBS清洗参考型微井三次,以去除PLPP。
    2. 在PBS中加入20μL荧光标记ECM蛋白(10μg/mL拉米宁、纤维蛋白或纤维蛋白原,参见材料表和步骤6)到参考模式微井。在室温下孵育10-20分钟(取决于蛋白质),防止光线照射(用铝箔包装盘子)。
    3. 孵育后,去除18μL的蛋白质溶液,用20μL的PBS洗涤三次;将未用于创建参考模式的微井保存在 PBS 的 20 μL 中(参见图 4D,E)。
  4. 可视化和设置最佳激光对焦
    1. 使用荧光显微镜、20X 物位和合适的软件(在材料表中检查本研究中使用的软件)来可视化参考模式。引用模式应在生成参考模式的外围区域(例如,上井区域)中可见(参见图 4E)。
    2. 通过相机路径调整图案边缘的焦点。根据参考模式的最佳焦点记录 Z 位置。此调整后的 Z 位置将是用于后续图案的最佳激光焦点。

5. 软件设置和照片图案

注:完成系统校准后(步骤 4),用户将上传所需的图案模板(模板配置,图 5)进行照片图案设计,并可选择为每个蛋白质生成一个或多个模式微井。微图案过程涉及光图案和蛋白质孵育步骤(见图2)。

  1. 在无菌条件下,从所有微井中取出18μL的PBS,并在每个微井中加入5μL的PLPP。确保 PLPP 在微井的整个表面上是同质的。
  2. 将文化盘与参考模式微井(图4D,E)置于目标上方,并在莱昂纳多软件中选择模式。
  3. 通过摄像机路径使用透射光可视化微井,并选择 ROI 符号。将 ROI 的直径设置为 4,000 μm,并将数字 ROI 的边缘重叠到当前微井的边缘。选择锁定
    注:ROI 的形状和直径取决于所使用的 PDMS 模具的设计和尺寸。例如,如果使用 5,000 x 5,000 μm PDMS 方形模具,请使用 5,000 x 5,000 μm 平方 ROI。
  4. 对盘的每个微井重复重叠步骤(步骤 5.3)。完成后,关闭传输的指示灯。
  5. 导航到参考模式微井的中心,远离参考模式区域,然后选择PRIMO以上载所需的模式模板,该模板将作为设计单元投影到 ROI 上(参见图 5)。模式将显示在下拉列表中,称为"操作",并显示在软件上的"操作"菜单中。
    注意:模式模板需要在实验之前设计,并在软件中加载模板之前保存为 8 位 Tiff 文件。
  6. 为了在整个微井中创建一个模式,需要复制设计单元。设计单元覆盖微井面积约 0.1 mm2。在"复制"菜单中,设置所需的列数和行数(软件中的行)(参见图 5)。
  7. 要生成连续模式,请调整列和线之间的间距;在本研究中,连续条纹的模式是使用-20至-35 μm间距(负间距)的列。此负间距在设计单元之间创建重叠(图5B,C)。
  8. 在"复制"菜单中设置激光剂量。在此设置和使用PLL-PEG的最佳激光剂量为1390 mJ/mm2。图案持续时间将显示在"估计时间"面板中。
    注:在这种情况下,激光功率为7.5 mW/mm2,使用1390 mJ/mm2的剂量,对每个设计单元进行大约30s的阵列。例如,在 4 列和 4 行(约 1.6 mm2)中复制的设计单元 (0.1 mm2) 需要 8 分钟才能进行图案化。如果培养皿表面使用 PEG-SVA 钝化(与 PLL-PEG 相比,激光剂量约为两倍),则可能需要更高的激光剂量。
  9. 选择"锁定"并等待,直到模式虚拟显示。
  10. 要更新模式的参数,请单击相关的操作,然后解锁并更新参数。完成模式更新后,再次选择"锁定"。
  11. 在同一微井(顺序微模式轮)中,多个蛋白质的图案需要精确对齐模式。要实现这种对齐,请同时上传所有所需图案模板集(第一个和第二个照片图案轮模式)。
  12. 设置模式模板的复制和剂量参数。设置参数后,模式将在"操作"列表中显示为"操作"。 将此模板配置另存为软件中的文件(参见图 5D)。
  13. 在"操作"列表中,仅选择在第一个模式轮圈期间要图案化的特定操作,然后取消选择在第二个模式轮值期间将模式化的操作(参见图 5D)。
  14. 导航到步骤 4.2 中生成参考模式的区域(例如,参考模式微井的顶部区域,参见图 4E)。将焦点调整到最佳 Z 位置(在步骤 4.4 中获得)。
    注: 强烈建议在正在使用的显微镜上选择完美的对焦系统(如果可用),以确保在整个照片图案过程中保持最佳的图案化 Z 位置。
  15. 选择"播放"符号以开始图案化。图案持续时间将显示在"估计时间"面板中。在莱昂纳多软件版 4.4 模式设置完成时,所有操作可视化菜单中显示为蓝色。

6. 蛋白质孵化

注:微井用ECM蛋白孵育(最好是荧光标记)。这些将仅绑定到 PEG 通过步骤 5 中描述的光图案过程被刻下的区域。每口井都含有一个带有4个微井的PDMS模具,允许同时测试4种不同的条件,例如,在每个微井中孵育不同的蛋白质(见图4D)。

  1. 使用荧光标记的蛋白质(例如,拉米宁、纤维蛋白或纤维蛋白原与红色或绿色荧光团结合),以可视化微模式(参见步骤 6.7 和 9.4)。或者,吸附未标记的蛋白质可以在后期使用免疫荧光进行可视化。
    注: ECM蛋白(例如,纤维素)可以使用现有协议33和市售荧光标签套件(即Alexa 488标签试剂盒)进行标记,或购买容易标记(例如,合苯纤维蛋白原-488或拉米宁-红色荧光红胺,见材料表)。
  2. 在无菌条件下,制备所需的ECM蛋白浓度(10μg/mL层宁、纤维蛋白或纤维蛋白原在PBS中,见材料表和步骤4.3)。
    注:荧光标记的ECM蛋白对光敏感,应防止光线(用铝箔包装盘),并应始终保存在冰上。
  3. 在无菌条件下,用20μL的PBS清洗微井三次,以去除PLPP。
  4. 从所有微井中取出 18 μL 的 PBS,并在每个微井中加入 20 μL 的 ECM 蛋白溶液。在室温下孵育20-30分钟,防止光线照射。
    注:最佳涂层孵育时间可能因蛋白质的类型和浓度而异。
  5. 孵育后,去除15μL的ECM蛋白溶液,用20μL的PBS清洗微井三次。
    注:始终在两次之间留出大约 5 μL 的 PBS。
  6. 如果只使用一种蛋白质(一轮微模式)进行图案化,则继续存储培养皿(步骤 10)或细胞电镀(步骤 11,参见图 2)。如果在同一微井中用不同蛋白质执行第二轮微模式,则继续存储培养皿(步骤 10)或阻止未特定的结合位点(步骤 7,参见图 2)。
  7. 可选的质量控制步骤:在电镀电池之前,使用荧光显微镜可视化和图像打印图案。选择适当的荧光通道并相应地调整曝光时间。
    注:要比较实验模式的荧光强度,对相同蛋白质使用相同的暴露时间至关重要。

7. 阻断非特异性结合位点(仅适用于多种蛋白质模式)

注:在同一微井中具有多个蛋白质的微阵列涉及顺序模式化步骤(参见图2)。在微井中加入阻滞剂(PLL-PEG 或 BSA),以防止交叉结合,当第二个孵育蛋白(步骤 9)与第一个孵育蛋白结合(步骤 6)时发生交叉结合,从而避免模式内蛋白质的混合物。

  1. 在无菌条件下,加入20μL的PLL-PEG(PBS中0.1毫克/升/升)或BSA(PBS中的1%BSA),作为阻止步骤,以防止交叉结合。
    注:阻塞效率可能因所使用的蛋白质的性质及其相关性而异。建议事先将 PLL-PEG 和 BSA 测试为阻塞剂(图 10D-I)。
  2. 在室温下孵育阻隔剂1小时,防止光线照射。去除15μL的阻滞剂,用20μL的PBS清洗所有微井三次。始终在两次之间留出大约 5 μL 的 PBS。
  3. 从所有微井中取出 18 μL 的 PBS,并在每个微井中加入 5 μL PLPP,确保 PLPP 在微井的整个表面上是均匀的。

8. 第二轮光图案(仅适用于多种蛋白质模式)

注:在第一轮光图案和蛋白质孵育后,生成微模式。在第二轮光图中,第二种蛋白质的图案将在同一微井中生成(参见图2C图5D)。在软件中,选择正确的模式模板(操作),将在此轮中进行模式化(参见图 5D)。

  1. 导航到第一个微井 (图 4D)。确保数字 ROI 和微井之间适当重叠。
  2. 加载以前保存的模板配置(步骤 5.12),并选择在第二个照片图案轮中要设置图案的操作(从第一轮中取消选择操作,参见图 5D)。
  3. 选择"播放"符号以开始图案化。确保软件中的激光处于打开位置。

9. 第二轮蛋白质孵育(仅适用于多种蛋白质模式)

注:在协议的这一部分,荧光标记的蛋白质/s将在第二轮光图案后在培养皿上孵育。

  1. 在无菌条件下,用20μL的PBS清洗微井三次,以去除PLPP。去除18μL的PBS,并在每个微井中加入20μL的ECM蛋白溶液。在室温下孵育20-30分钟,防止光线照射。
    注:最佳涂层孵育时间可能因蛋白质的类型和浓度而异。
  2. 孵育后,去除15μL的ECM蛋白溶液,用20μL的PBS清洗微井三次。始终在两次之间留出大约 5 μL 的 PBS。
  3. 继续存储培养皿(步骤 10)或细胞电镀(步骤 11,参见图 2)。
  4. 可选的质量控制步骤:使用荧光显微镜,在电镀电池之前可视化和图像打印图案。选择适当的荧光通道并调整曝光时间。
    注:要比较实验模式的荧光强度,对相同蛋白质使用相同的暴露时间至关重要。

10. 微模式的储存

注:具有吸附蛋白的微模式可以在协议的不同步骤中存储(参见图2)。如果使用多种蛋白质进行微模式,则在第一轮微模式处理后或完成两轮连续的微模式后,可以存储微模式(参见图 2B)。

  1. 使用 PLL-PEG 钝化时,将微模式储存在 PBS 中(每口井 3 mL),在 4°C 下存储长达 3 天。
  2. 如果培养皿被PEG-SVA钝化,微模式可以储存长达1个月。为此,使用双蒸馏脱离子水密集冲洗微模式,并使用无菌气枪干燥,尽管也可以使用正常空气。干燥后,微模式可在4°C下储存长达1个月(PRIMO系统支持团队,个人沟通)。

11. 电镀电池

注:在接下来的步骤中,细胞将被镀在制备的微图案培养皿上。在这些研究中,使用神经元细胞系(CAD细胞)31。然而,该协议可以调整,以研究其他细胞类型的兴趣(根据需要调整细胞电镀协议)。

  1. 使用分化培养基(DMEM补充1%谷氨酰胺,不含血清,1%笔/链球菌,见材料表),将CAD细胞区分48小时。
  2. 板 1 mL 的介质,内玻璃孔中装有细胞,覆盖所有微孔,并将培养皿放入 37°C、5% CO2培养箱中。

Representative Results

遵循上述方案,产生微图案表面,涂有ECM感兴趣的蛋白质。我们使用这些模式来跟踪神经元路径查找。

生成的模式应该是模板的精确表示形式。图 6中显示了一个示例,其中一个数字模式模板(图 6A) 表示一个设计单元(图 5B),它定义了从 20 到 2 μm 宽度的微模式,并贴上了标记纤维蛋白原 (图 6B)。使用ImageJ,荧光强度测量沿条纹垂直(图6C)和水平(图6E)和从每个条纹上方的15μm相应的背景区域获得。背景测量值从每个条带宽度的阵列测量中减去。

系统的一个限制是,在打印特征 +20 μm 时可以观察到边缘效应(图 6B,顶部条纹),与中心相比,图案边缘处的强度信号更高(图 6D,第一个峰值荧光强度曲线)。在我们的实验中,分辨率限制约为2μm;在这个宽度,我们观察到显著下降(约50%)在纤维蛋白原荧光强度相比,较宽条纹的强度(图6F,G)。使用 PRIMO 系统和此处概述的协议进行模式化可生成可重现模式,从四个单独的复制设计单元测量的 2 μm 宽度的平均荧光强度的最高标准偏差(图 6G.也发现图案条纹内的变异性较低;变异系数从3%到10%不等,20μm和2μm条纹具有最大的内部变异。这可能是系统的边缘效应和分辨率限制的结果。请注意,对于这些测量,我们仅测量条纹中心的强度,以避免用于获取这些图像的目标造成的不均匀照明(vignetting,图 6E)。

某些实验可能涉及需要确定蛋白质浓度的问题,可通过两种方式实现:1) 改变蛋白质浓度(图 7A,B)。不同浓度的层宁孵育,导致荧光强度显著不同,蛋白质浓度越高(图7B)。2) 用于薄膜(PEG)的激光剂量可以变化。较高的激光剂量将更大程度地去除防污膜,为感兴趣的蛋白质产生更多的结合位点(图7C,D),从而产生显著不同的荧光强度,随着激光的升高而增加剂量 (图 7D)。

改变激光剂量允许在同一模式内生成蛋白质梯度。如图 8 A所示,其中使用不同的灰度级别(从黑色(无激光功率)到白色(最大激光功率)设计了渐变模板。

激光强度与模板的灰度水平成正比(8 位图像中为 0 到 255 不等),生成 UV 照明的渐变。沿渐变条纹的荧光强度曲线的测量在图案模板(图8B)和生成的梯度模式(图8C,D)中是线性的。这是在同一模板和渐变模式内的所有渐变条纹之间可重现的(图 8B,D)。生成这种梯度是非常有用的,并有助于模仿在体内环境中,其中细胞经常对生物活性蛋白34,35,36,37的梯度作出反应。

细胞感知变化的细胞外环境,但分析,使细胞行为的研究,当细胞遇到这种变化是有限的。LIMAP可用于在同一微井中与多个蛋白质进行微模式。图 9中的示例,其中交叉模式生成与纤维内丁(水平)和拉米宁(垂直)的条纹。当创建具有多种蛋白质的模式时,在第一个和第二蛋白质孵育之间使用阻塞步骤来防止蛋白质交叉结合(参见步骤7)至关重要。阻滞效率可能因用于涂层的蛋白质的生化特性而异,我们建议测试多个阻塞缓冲液,包括 PLL-PEG (0.1 mg/mL) 和 BSA(1%)。为了评估这种交叉结合效应,我们使用ImageJ(图9)进行了荧光强度测量,我们发现交叉结合可以显著减少,使用PLL-PEG缓冲液(0.1mg/mL)用于纤维内丁和拉米宁交叉模式 (图 9D,H)。

生成的交叉模式用于CAD细胞(图10A,B)大鼠背根结节(DRG)神经元的细胞测定(图10C)。它们的神经酸盐 (CAD) 和斧子 (DRG) 沿着不同的线生长。CAD细胞被用作神经元模型,因为它们与原神经元相比,它们表现出类似的整数表达轮廓,并且它们仍然在培养48小时后显示富含活性的生长锥体(图10B),使它们适合寻路研究。

为了研究生成的微模式对原神经元可能产生的细胞毒性影响,DRG神经元在先前公布的协议38之后在微模式上被分离和培养。结果表明,主神经元能耐受微模式环境(图10C)。我们目前正在研究各种ECM蛋白如何影响斧状(神经酸盐)路径发现。使用DRG神经元,将进一步研究CAD细胞中的概念的初步证据。为了验证生成的微模式的质量,最好通过荧光显微镜对图案进行成像,以确保在进行细胞电镀之前,图案边缘已明确定义。在成像过程中,确保显微镜和照相机之间的光学调整,以避免外围变暗效应(晕影),从而影响数据的后分析和解释,这一点非常重要。此外,使用用于图像图案和从图案图像中减去此图像的相同曝光时间,获取无图案区域的图像。

总之,对于高质量的微模式生成,建议评估蛋白质浓度(图7A,B)、激光剂量(图7C,D)、蛋白质背景水平(图6E、F、H)使用多种蛋白质时,有效阻断步骤 (图 9) .当然,为了从细胞检测中获得可靠和可重复的数据,使用LIMAP生成的微模式的质量至关重要。

Figure 1
图1:微模式技术方案:微接触打印和激光辅助图案。A) 微接触印刷使用具有定义微特征的石版画母版来生成 PDMS 邮票,该图章是用感兴趣的蛋白质孵育的。然后,这种蛋白质被转移(标记)到玻璃表面,产生蛋白质微模式。(B) 激光辅助图案技术包括光图案和直接激光图案。(C) 大多数光图案方法使用 UV 光源和光掩膜(与基板表面接触或位于目标的焦点平面上),具有所需的几何形状,以便将 PEG 防污表面在特定位置进行。创建定义的模式。随后的蛋白质孵育步骤只导致激光分块区域的蛋白质吸附。(D) LIMAP 是一种光图案技术,不需要与基板接触的光掩膜(即无掩膜和非接触式方法)。LIMAP 使用光启动器,该启动器由低剂量的激光激活,从而将 PEG 的光暴露区域分十字。这为连续蛋白吸附创建附加位点。(E) 直接激光图案使用高能量光直接蚀刻PEG薄膜,允许在这些蚀刻区域结合蛋白质。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:方案,显示微模式协议中步骤的摘要。A) 一种蛋白质的微模式只涉及一轮微模式(光图案和蛋白质孵育),可在 8 小时 (B) 具有多种蛋白质的微模式下进行,需要连续两轮微模式,可在1-2天内完成,具体取决于正在准备的微模式的数量。可以在 1 天的工作中完成协议的 B 版本。连续箭头表示协议中步骤的直接流动。不连续箭头表示一步与一步之间存在明显的时间差(参见步骤 6.6 和 9.3)。(C) 在一轮微图案(红色条纹)或两轮连续的微图案(红色和绿色条纹)后获得的示例图案的原理图视图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:模式模板生成使用 LIMAP 用途广泛。A,B)使用 ImageJ(十字弓、B 字母)设计的图案模板示例。以白色绘制的形状以最大激光功率投影,黑色绘制的形状未投影。(C,D)使用 10 μg/mL 纤维蛋白原(绿色)孵育后从模板中获取的微模式。(C) 十字弓宽度为 50 μm,高度为 50 μm,水平间距为 75 μm,垂直为 50 μm。(D) 字母宽度为 80 μm 宽度,高度为 85 μm。C 和 D 中的刻度条表示 50 μm。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:LIMAP 协议的基本材料。A) 本协议中使用的模具直径为 20 mm,薄圆形 PDMS 件(250 μm 厚度),包含 4 个微井(每个直径 4 毫米)。微井中使用的体积范围为 5 至 20 μL,大大减少了每次实验所需的试剂和蛋白质量。(B) 6井玻璃底盘,每个井中已放置模具。微井含有20μL的PBS,使其可见。(C) 校准盘,其中内部玻璃井已标有绿色荧光笔,用于校准激光对焦。(D) 从 B 中的 6 井玻璃底盘(用虚线红色圆圈勾勒出)左上井的架构视图。内部玻璃底井以白色表示,模具显示为灰色。模具包含4个微井(编号为1-4),用于测试4种不同的实验条件(例如,不同的蛋白质浓度、图案几何形状、蛋白质组合等)。星号表示包含参考模式的微井。(E) 在顶部部分生成参考图案的微井(带填充箭头的箭头)的原理图视图。需要此参考模式才能获得图案的最佳激光对焦(参见步骤 4)。带空箭头的箭头表示微井的中心区域,用于系统校准后的后续模式。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:用于微模式的软件设置。A) 具有平行条纹的图案模板,使用 ImageJ 设计并保存为 8 位 Tiff 文件。(B-D)数字 ROIs(感兴趣的区域)的原理视图,与将生成微模式的当前微井重叠。(B) 要使用的图案模板(长度 1824 像素 =415 μm,宽度 1140 像素 =260 μm)在莱昂纳多上被选中,并作为设计单元(黑色虚线矩形中的红色条纹)投影到 ROI 上,该模板将覆盖约 0.1 mm2的微井面积。设计单元在复制菜单(模板配置)中复制 4 列和 4 行,从而在整个微井中创建模式。请注意列之间的空间。(C) 要调整连续条纹的图案,必须调整列之间的间距。在这种情况下,为了实现设计单元之间的重叠,在复制菜单中将列之间的间距设置为负间距-20 μm. (D) 为了在同一微井中对多个蛋白质进行模式化,模式的准确对齐是必填。在软件设置步骤(步骤 5)期间,同时上载所有所需的模式模板。在"操作"列表中,仅选择要在每个图案轮回期间进行模式化的特定操作,然后取消选择其余操作(步骤 5.12、5.13 和 8.2)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:使用LIMAP分析模式变异性。A) 使用 ImageJ 设计的图案模板用于从上到下对四个宽度不同的条纹(20、10、5、2 μm)进行微图案。(B) 孵育后获得微模式,孵育后使用10微克/mL的荧光标记纤维蛋白原(绿色)。(C) 沿垂直线进行强度测量,穿过微模式的条纹。(D) 从 (C) 中的测量中获得的垂直荧光强度曲线。请注意,在较大的宽度 (20 μm) 时,由于蛋白质在条纹边缘堆积,导致两个截然不同的荧光强度峰值(边缘效应),垂直轮廓发生变化。此效果仅在条纹宽度 ±20 μm. (E) 沿所描绘的水平线(荧光和背景)强度测量中可见。(F) 水平荧光强度曲线从 (E) 中的测量中获得。(G) 显示每个条带宽度的平均强度的图形,由四个单独的复制设计单位(图案间变化)测量。注意减少的蛋白质吸附到2μm条纹宽度的模式。(H) 所有条带宽度(变异系数)内的变化都很低,范围从 3 到 10%。G和H中的数据以均值 = SD显示。G和H的统计分析是使用单向方差分析(Kruskal-Wallis)非参数测试进行的,具有多重比较。P 值为 <0.001 表示 * 显著性。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:激光功率和蛋白质浓度变化对蛋白质吸附效率的影响。A) PLL-PEG表面用恒定的激光剂量(1390 mJ/mm2)进行激光斩结,并孵育出指示浓度的荧光标记的层皮素(洋红色)。(B) a 中层宁条纹荧光强度的定量。(C) 应用不同的指示激光剂量,然后以相同浓度(10微克/mL)的荧光标记纤维素(绿色)孵育。(D) 在 (C) 中纤维素条纹的荧光强度的定量表明,较高的激光剂量与更高水平的吸附蛋白相关。所有测量均减去背景。样本编号在列的底部指示;数据显示为均值 = SEM.使用非参数曼-惠特尼测试进行统计分析,采用双尾计算。P 值为 <0.0001 表示 = 显著性。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8:在微模式内生成蛋白质浓度梯度。A) 灰度渐变图案模板.(B) 从 (A) 测量的荧光强度剖面。(C) 用LIMAP从(A)的图案模板获得的模式,在孵育后用10μg/mL的荧光标记纤维素(绿色)。(D) n = 3 条条纹的荧光强度曲线和以均值 = SEM 表示的背景,显示蛋白质梯度强度的线性增加。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 9
图9:按顺序对几种蛋白质进行图案化时的交叉结合效应。A-C, E-G)带有 10 μm 荧光标记纤维质(青色、水平色)和荧光标记的层宁(洋红色,垂直)条纹的交叉图案。(A-C)使用 BSA 阻塞缓冲液处理的样品。(E-F)使用 PLL-PEG 处理的用于阻止未特定绑定站点的样本(步骤 7)。(A,E)合并荧光通道,显示纤维内丁和拉米宁。(B,F)仅显示纤维化的图像。(C,G)仅显示拉米宁的图像。对于 C,请注意拉明素也出现在水平纤维素正条纹上,这是由于 BSA 对未占用的绑定位点的无效阻塞造成的。对于 G,请注意,使用 PLL-PEG 进行阻隔可有效防止拉明宁与纤维内丁条纹的有效结合。(D,H)分别从A和E中指示的测量值(对角黄线)获得的荧光强度曲线。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 10
图10:交叉模式,以研究中微石/斧子路径查找。A-C)带有 10 μm 荧光标记纤维质(青色、水平色)和荧光标记的层宁(洋红色,垂直)条纹的交叉图案。(A,B)沿微模式生长的CAD细胞与神经酸盐的荧光图像。为了可视化神经酸盐,细胞被培养48小时,用4%PFA固定,并染色为图布林(A)或图布林和活性蛋白(B)。(C) 鼠背根结条 (DRG) 神经元,其斧头沿着微模式生长。为了可视化斧子,DRG神经元被培养为72小时,用4%的PFA固定,并染色为图布林。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 11
图 11:使用 LIMAP 生成微模式时获得的常见负结果示例。A-C)在不同情况下获得的10μg/mL荧光标记纤维蛋白原(绿色)的次优图案条纹。(A) 微井在模式生成过程中干涸。请注意背景(箭头)中的荧光水平以及 PBS 晶体(星号)的存在。(B) 在软件设置期间,条带之间的缝合未正确调整,导致设计单元之间出现间隙(箭头)的不连续条纹(参见步骤 3.4.7)。(C) 激光焦点是次优导致漫射条纹(箭头),不代表图案模板的实际条纹宽度,从上到下应为 20、10、5、2 μm,如 (B)。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

LIMAP (PRIMO) 微图案优势与微接触打印的比较
虽然微接触打印可能是生物领域最常用的微图案技术39,但使用LIMAP技术的研究人员似乎越来越多,40,41,42 4344.在这里,我们提出了使用PRIMO的协议,一个商用LIMAP系统。下面我们将简要讨论微接触打印和 LIMAP 照片图案的潜在优势和局限性。

微接触印刷需要通过旋转在玻璃或硅晶圆上涂上光掩膜(通常 SU-8)产生的石版画母版,然后用激光蚀刻所需的微特征。这些母版用作模板,以创建 PDMS 图章45。邮票用一种选定的蛋白质孵育,这种蛋白质吸附到它身上,然后被转移到细胞培养皿上(加盖)。蛋白质吸附到PDMS印记的过程取决于蛋白质的浓度、缓冲和孵育时间。这些参数需要事先测试,以获得最佳结果46

如果保存得当,大师可用于大量的实验,持续数月甚至数年。然而,该技术的一个限制因素是,必须重新设计新的石版画母版,以便进行每一个所需的修改。实验设计的变化可能导致耗时地生产新主机(最多数周),从而推迟实验。相比之下,LIMAP 照片图案不需要物理母版;它使用软件生成的模式模板,可用于灵活地调整所需的微模式几何形状以适应不断变化的研究问题。LIMAP也可用于在同一微模式内生成蛋白质梯度(图8),使用微接触打印47,很难以可重复的方式获得。

此外,在我们的例子中,使用LIMAP实现的微模式分辨率为2μm(图6B)。

接近此分辨率增加了模式内和模式间的可变性。生成大约 10 μm 宽度或以上图案的可重复性很强(图 6G,H)。相反,使用微接触打印很难始终获得低于 10 μm 的分辨率,并且在冲压小特征时查找人工制品(未显示数据)是很常见的。

我们已经表明,LIMAP可用于在同一微井内微模式多蛋白(图9),从而在实验中增加进一步的复杂性。虽然这可以通过微接触打印来实现,但在技术上,以高精度对齐不同的蛋白质可能相当苛刻。虽然使用LIMAP对多种蛋白质的图案似乎很直接,但必须指出,通过顺序涂层程序对蛋白质的交叉结合可以通过阻断试剂来减少,但不能完全消除(图9)。

关于一种或另一种技术的成本,此处描述的 LIMAP 需要购买微型图案设备 (PRIMO),这些设备可以安装在不同的荧光显微镜上,并且需要电动化级。尽管这项投资最初是成本密集型的,但从长期来看,除了消耗品(模具、PEG 和 PLPP)之外,没有其他购买。或者,PDMS模具也可以由自己的实验者按照公布的协议18,32在实验室中产生。微接触印刷的最大成本可能与新母版的生产有关,如果实验需要新的模式,这种成本可能会很大。

LIMAP 的一个缺点是此技术的吞吐量相对较低。与 LIMAP 所需的顺序激光微图案相比,微接触打印可以同时冲压步骤快速高效地生成大量微模式。例如,使用 PDMS 邮票(不包括邮票准备)进行微接触式打印,在大约 2 小时内可生产 6 个冲压玻璃盖玻片;使用 LIMAP 对类似区域(6 口盘)进行模式大约需要 4 小时,不包括表面钝化过程(考虑步骤 5.12 中描述的模式模板配置,参见图 5B)。

LIMAP 技术的另一个速率限制因子是大面积阵列所需的长时间照明(使用 7.5 mW/mm2激光,每个设计单元 30 s)。在这些情况下,微接触打印可能是首选选项。新推出的光电启动器(PLPP凝胶,材料表)应大大减少图案的拍摄时间,只需几分钟即可在大面积(高达 8 mm2)生成数百个微模式。

细胞培养的微模式表面时需要考虑的另一个重要因素是,与微接触打印获得的可变性相比,不同实验重复的微模式的可重复性。例如,图 7B,D所示的图形是三个独立实验重复的代表性数据,结果非常相似(未显示数据)。根据我们的经验和以前的出版物,这种可重复性水平是很难达到与微接触印刷48,49,50,51,52。

与其他需要专用化学来设计感光材料或使用感光剂(通常不太具有生物相容性3)的照相模式技术不同,LIMAP 的感光成分(PLPP)) 是生物相容性和耐受性良好的细胞21;在我们的手中,我们并没有经历任何细胞毒性跨越各种细胞,包括CAD,DRG神经元(图10),成纤维细胞,上皮细胞和黑色素瘤细胞(数据未显示)。与其他照片图案技术相比,使用 PRIMO 的 LIMAP 的另一个优点是不需要照片蒙版。与微接触式打印类似,需要为每个所需图案设计和生成新的光掩膜。

上述微接触打印的所有限制,请参阅该技术的手动方法。然而,可以使用带有邮票负载和压力控制的自动化设备53来提高微接触打印的吞吐量和可重复性。

使用 PRIMO 为 LIMAP 解决协议的关键步骤和问题解决
在该协议期间发现的最常见问题之一是微模式内具有高水平的背景荧光。这可能是由于微井干燥,这通常由于体积小。发生这种情况时,PBS 晶体经常出现在 ECM 模式周围(图 11A)。

蛋白质孵育后洗涤步骤不足或效率低下也会导致高水平的背景荧光。特别是在使用10μg/mL(图11B)或更高的蛋白质浓度时,可以观察到这一点。通过添加 PBS 附加洗涤步骤,可以减少背景中蛋白质的过量。

需要在每个实验中测量和描述蛋白质背景的存在,计算背景荧光强度(图6E),并从微模式强度中减去它(图6F-H)图 7B,D。高蛋白背景可能对CAD细胞的附着和发芽产生影响,影响对结果的解释。

当用户的经验有限时(图11B),由于模式之间重叠不足而出现,设计单元之间存在间隙是一个常见的问题。莱昂纳多软件中的两个参数可以进行调整来克服这一点:1) 可能需要列之间的负间距,具体取决于模式的设计(步骤 5.7,参见图 5B,C)。或者,2) 使用专家菜单中的渐变选项缝合列。使用 UV 粘合剂 (材料表) 进行快速测试以确定最佳间距参数。一小滴这种胶粘剂被涂在玻璃滑梯上,然后用玻璃盖玻片覆盖,制作薄膜。嵌入式 UV 胶粘剂采用低激光剂量(30 mJ/mm2)与感兴趣的图案模板进行光型图案。嵌入胶粘剂的紫外线照射区域将被固化,在明场显微镜下变得可见。测试结果被可视化,以评估模式内获得的间距。在我们的神经元实验中,条纹之间的间隙可能会对细胞行为产生不利影响,产生生长动力学的变化(速度降低或放弃路径)。

在莱昂纳多软件的最新更新(在出版时,Leonardo 4.11),可以上传以前设计的更大图案模板,覆盖更大的面积(使用20X目标高达8毫米2)的微井表面与目前每个设计单元0.1 mm2相比,无需将较小的设计单元拼接在一起。在阵列生成过程中缺乏激光对焦调整可能导致未定义的边(图11C)。因此,在阵列之前校准激光并执行参考模式步骤(参见步骤 4)至关重要。定义不当的条带会导致条带宽度的变化,使得斧子生长动力学和条带宽度之间的相关性变得困难。Axons 也倾向于放弃具有扩散边缘的条纹。此外,在打印宽度为 10-20 μm 或更高的条纹时,也可以看到边缘的可变性,从而导致边缘的蛋白质含量高于图案的中心区域(图 6B,D)。这种边缘效应是由光图案化过程中光源器的非均匀扩散产生的。光化反应是氧依赖的,在边缘扩散更多。在光图案化过程中,这种边缘效应可以在微井中用移液器将光发生器与质均最小化。此外,新型商业化光启动器(PLPP凝胶)还可以降低边缘效应(PRIMO系统支持团队,个人沟通)。

对多个蛋白质进行微印会导致交叉结合(图9A-D)。这可以通过提高用于在两种不同蛋白质的孵育步骤之间占据非特异性结合位点的阻塞效率来最小化。蛋白质的交叉结合会干扰实验结果的可重复性,并可能导致数据误读,因为很难确定每种蛋白质对斧头生长动力学和其他细胞行为的贡献。

结论
我们希望使用LIMAP提供的协议通过使用PRIMO系统促进蛋白质微模式的生成。虽然我们的协议侧重于如何在二维玻璃表面可靠地生产微图案,但其他人已经表明,可以使用LIMAP对软基板54进行微图案,为3D培养物使用微结构表面42。这些微模式可以是一个多功能的工具,研究细胞对微环境变化的反应。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了BBSRC、EPSRC、MRC和井康信托的支持。C.B. 实验室是曼彻斯特大学韦康细胞基质研究信托中心的一部分,该中心由韦康信托基金提供核心资助(赠款号088785/Z/09/Z)。作者希望感谢生物技术和生物科学研究理事会(BBSRC)向C.M.、K.J.(BB/M02020630/1)和P.A.(BB/P000681/1)以及工程和物理科学研究理事会(EPSRC)和医学部提供的资金。研究理事会(MRC)再生医学博士培训中心(EP/L014904/1)。作者感谢阿尔韦勒的信件和他们的售后支持团队。作者感谢来自曼彻斯特大学生物成像设施的彼得·马奇和罗杰·梅多斯在显微镜方面的帮助。这项研究中使用的生物成像设施显微镜是利用BBSRC、威尔康信托和曼彻斯特大学战略基金的赠款购买的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa 488 protein labeling kit Invitrogen A10235 Working concentration: N.A.
Alexa 647 protein labeling kit Invitrogen A20173 Working concentration: N.A.
CAD cells ECACC 8100805 Working concentration: N.A.
Conjugated fibrinogen-488 Molecular Probes F13191 Working concentration: 10 μg/ml
DMEM culture medium Gibco 11320033 Working concentration: N.A.
Epifluorescence Microscope** Nikon Eclipse Ti inverted Working concentration: N.A.
Fibronectin Sigma F4759 Working concentration: 10 μg/ml
(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above)
(diluted in PBS)
Fiji-Image J www.imagej.nih.gov Version 2.0.0-rc-54/1.51f Working concentration: N.A.
Fluorescent highlighter Stabilo Stabilo Boss Original Working concentration: N.A.
HEPES Gibco 15630080 Working concentration: 1M
Inkscape software Inkscape Check last update Working concentration: N.A.
Laminin-red fluorescent rhodamine Cytoskeleton, Inc. LMN01 Working concentration: 10 μg/ml
(diluted in PBS)
Leonardo software Alvéole version 4.11 Working concentration: N.A.
L-Glutamine Sigma G7513 Working concentration: 1%
Micro-manager software Open imaging Check last update Working concentration: N.A.
Motorized x/y stage PRIOR Scientific Proscan II Working concentration: N.A.
NIS Elements Software Nikon NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs) Working concentration: N.A.
PBS (without Ca2+, Mg2+) Sigma D8537 Working concentration: 1X
PDMS Stencils Alvéole visit www.alveolelab.com Working concentration: N.A.
PEG-SVA Laysan bio, Inc. MPEG-SVA-5000-1g Working concentration: 50 mg/ml
Phalloidin 405 Abcam ab176752 Working concentration: 1:1000
Photo-initiator (PLPP) Alvéole Classic PLPP Working concentration: 14.5 mg/ml
Photo-initiator (PLPP gel) Alvéole PLPP gel Working concentration: 4.76% diluted in ethanol
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V) Working concentration: N.A.
PLL-PEG SuSoS (also distributed by Alvéole) www.alveolelab.com Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)
Poly-L-Lysine Sigma P4707 Working concentration: 0.01%
Primo equipment Alvéole www.alveolelab.com Working concentration: N.A.
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Working concentration: 1%
Tubulin anti-alpha antibody Abcam DM1A Working concentration: 1:1000
CAD cells
Tubulin anti-beta 3 antibody Sigma T8660 Working concentration: 1:500
DRG neurons
UV adhesive Norland Products NOA81 Working concentration: N.A.
1 well glass bottom dish Cellvis D35-20-1.5-N Working concentration: N.A.
6 well glass bottom dish Cellvis P06-20-1.5-N Working concentration: N.A.
20x objective** Nikon no phase ring (check updated catalogue) Working concentration: N.A.
**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.

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