Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ионно-массовая спектрометрия и методы молекулярного моделирования могут характеризовать селективное металлическое хелативирование производительности разработанных металлосвязывающих пептидов и медно-связывающего пептида метанобактина. Разработка новых классов металлических хелатных пептидов поможет привести к терапии заболеваний, связанных с дисбалансом ионов металла.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ионизация электроспрея (ESI) может передавать пептидный или пептидный комплекс в газофазный комплекс, сохраняя при этом его массу, общий заряд, металлосвязывающие взаимодействия и конформационную форму. Соединение ESI с ионной массой-спектрометрией (IM-MS) обеспечивает инструментальную технику, которая позволяет одновременно измерять массу пептида к заряду (м/з) и сечение столкновения (CCS), которые относятся к его стойхиометрии, состоянию протонации, и конформационная форма. Общий заряд пептидного комплекса контролируется протонацией 1) кислой пептидной и основных участков пептида и 2) состояния окисления металлического иона (ы). Таким образом, общее состояние заряда комплекса является функцией рН раствора, который влияет на пептиды металлических ионных связывающих сродства. Для анализа ESI-IM-MS решения пептида и ионов металла готовятся из растворов только для водных, при этом рН регулируется с разбавленной aqueous уксусной кислотой или гидроксидом аммония. Это позволяет определить зависимость от рН и селективность ионов металла для конкретного пептида. Кроме того, м/з и CCS пептидного комплекса могут быть использованы с помощью молекулярного моделирования B3LYP/LanL2D, чтобы различить связывающие участки координации иона металла и третичной структуры комплекса. Результаты показывают, как ESI-IM-MS может охарактеризовать селективное хелатирование работы набора альтернативных пептидов метанобактина и сравнить их с медно-связывающим пептидным метанобактином.

Introduction

Ионы меди и цинка имеют важное значение для живых организмов и имеют решающее значение для процессов, включая окислительную защиту, рост тканей, дыхание, холестерин, метаболизм глюкозы и чтение генома1. Для обеспечения этих функций, такие группы, как тиолат Cys, имидазол его2,3, (более редко) тиоэтер метионина, и карбоксилат глю и Асп выборочно включать металлы в качестве кофакторов в активных местах металлургии. Сходство этих координационных групп поднимает интригующий вопрос о том, как Его и Кис лиганды выборочно включать либо Cu (I/II) или N (II) для обеспечения правильного функционирования.

Селективная привязка часто достигается путем приобретения и оборота пептидов, которые контролируют концентрации ионов Cu (I/II)4. Cu(I/II) является высокореактивной и вызывает окислительный ущерб или приключений связывания с ферментами, так что его свободная концентрация жестко регулируется медных сопровождающих и медно-регулирующих белков, которые транспортируют его безопасно в различные места в клетке и плотно контролировать свой гомеостаз5,6. Нарушение метаболизма меди или гомеостаза непосредственно связано с болезнью Менкеса и Уилсона7, а также рак7 и нервные расстройства, такие как прион8 и болезнь Альцгеймера9.

Болезнь Уилсона связана с повышением уровня меди в глазах, печени и участках мозга, где редокс-реакции Cu (I/II) производят реактивные виды кислорода, вызывая гепатомлентику и неврологическую дегенерацию. Существующие хелатотерапии являются небольшой тиол аминокислоты пеницилламин и триэтиленетрамин. Кроме того, метанотрофных медь приобретения пептиды метанобатактина (мб)10,11 экспонат терапевтический потенциал из-за их высокой связывающей сродство cu (I)12. Когда метанобактин (mb-OB3b) из трихоспория Methylosinus OB3b был изучен в животной модели болезни Вильсона, медь была эффективно удалена из печени и выводится через желчь13. Эксперименты in vitro подтвердили, что mb-OB3b может хеляции меди из медного металлотионеина, содержащегося в цитозоле печени13. Лазерная абляция индуктивно связаны плазменной массой спектрометрии визуализации методы исследовали пространственное распределение меди в болезни Вильсона образцы печени14,15,16 и показали, что mb-OB3b удаляет медь с короткими периодами лечения только 8 дней17.

MB-OB3b также будет связываться с другими ионами металла, включая Ag (I), Au(III), Pb (II), Mn (II), Co (II), Fe (II), Ni (II), и Зн(II)18,19. Конкуренция за физиологические Cu (I) связывания сайт выставлен ag (I), потому что он может вытеснить Cu (I) из комплекса MB-OB3b, как с Ag (I) и Ni (II) также показывает необратимые связывания мб, которые не могут быть смещены Cu (I)19. В последнее время серия альтернативных метаноактина (амб) олигопептиды с 2His-2Cys связывающий мотив были изучены20,21, и их N (II) и Cu (I/II) связывающие свойства характеризуется. Их первичные аминокислотные последовательности похожи, и все они содержат мотив 2His-2Cys, Pro и ацетилированный N-терминус. Они в основном отличаются от mb-OB3b, потому что мотив 2His-2Cys заменяет два энетиола оксазолон связывания сайтов mb-OB3b.

Ионизация электроспрея в сочетании с ионно-массовой спектрометрией (ESI-IM-MS) обеспечивает мощную инструментальную технику для определения металлосвязывающих свойств пептидов, поскольку она измеряет их массу к заряду(м/з)и столкновение поперечное сечение (CCS) при сохранении их массы, заряда и конформационной формы от фазы решения. М/з и CCS относятся к пептидам стоихиометрии, состоянию протонации и конформации. Stoichiometry определяется потому, что личность и количество каждого элемента, присутствуют в видов явно определены. Общий заряд пептидного комплекса связан с состоянием протонации кислых и основных участков и состоянием окисления металлического иона (ы). CCS дает информацию о конформиционной форме пептидного комплекса, поскольку она измеряет вращенный средний размер, который относится к третичной структуре комплекса. Общее состояние заряда комплекса также является функцией рН и влияет на металлическую ионную сродство пептида, потому что депротонированные основные или кислые участки, такие как карбоксил, его, Cys и Tyr, также являются потенциальными местами связывания металлического иона. Для анализа пептид и ион металла готовятся в водных растворах с рН, скорректированным разбавленной aqueous уксусной кислотой или гидроксидом аммония. Это позволяет определить зависимость от рН и селективность ионов металла для пептида. Кроме того, м/з и CCS, определенные ESI-IM-MS, могут быть использованы с помощью молекулярного моделирования B3LYP/LanL2D, чтобы обнаружить тип координации ионов металла и третичной структуры комплекса. Результаты, приведенные в этой статье, показывают, как ESI-IM-MS может охарактеризовать селективную хелатную производительность набора пептидов amb и сравнить их с медно-связывающим пептидом mb-OB3b.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов

  1. Культура Метилосинус трихоспорий OB3b, изолировать Cu (I) бесплатно mb-OB3b18,22,23, заморозить сухой образец и хранить при -80 градусов по Цельсию до использования.
  2. Синтезировать амб пептиды (ямт;98% чистоты для amb1, amb 2 , amb4;
  3. Покупка хлорида из 98% чистоты марганца (II), хлорида кобальта (II), хлорида никле (II), хлорида меди (II), медь (II) нитрата, серебра (I) нитрата, хлорида цинка (II), хлорида железа (III) хлорида и свинца (II) хлорида.
  4. Приобретите поли-DL-аланиновые полимеры, используемые в качестве калибрантов для измерения поперечных сечений видов amb и hPLC класса или более высокого гидроксида аммония, ледниковой уксусной кислоты и ацетонитрила.

2. Подготовка биржевого раствора

  1. Пептидный стоковый раствор
    1. Взвесьте точно, используя по крайней мере три значительные цифры, масса 10,0-20,0 мг mb-OB3b или amb в 1,7 мл пластикового флакона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взвешенная масса должна дать либо 12,5 мМ, либо 1,25 мМ, в зависимости от растворимости пептида, когда добавляется 1,00 мл деионированной (DI) воды.
    2. Используя трубу, добавьте 1,00 мл деионированной воды (17,8 МТ см) к взвешенному пептидному образцу, чтобы дать раствор 12,5 мМ или 1,25 мм. Поместите крышку надежно и тщательно перемешать с по крайней мере 20 инверсий.
    3. Использование микропипета распределять 50,0 qL aliquots из пептида образца в индивидуально помечены 1,5 мл флаконов и хранить их на -80 градусов по Цельсию до использования.
  2. Металлические ионные фондовые решения
    1. Взвесьте точно, используя по крайней мере три значимые цифры, масса 10,0-30,0 мг хлорида металла или нитрата серебра в 1,7 мл флакона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взвешенная масса должна дать 125 мМ при добавлении 1,00 мл воды DI.
    2. Добавьте 1,00 мл воды DI в взвешенный металлический образец в флакон 1,7 мл, чтобы дать раствор 125 мМ. Поместите крышку надежно и тщательно перемешать с по крайней мере 20 инверсий.
  3. Растворы гидроксида аммония:подготовьте раствор уксусной кислоты 1,0 м, разбавив 57 л уксусной кислоты раствором с водой DI до конечного объема 1,00 мл. Подготовьте раствор гидроксида аммония 1,0 М, разбавив 90 л гидроксида аммония с водой DI до конечного объема 1,00 мл. Сделайте два последовательных разбавления каждого раствора, принимая 100 л растворов 1,0 М для подготовки 0,10 М и 0,010 М растворов уксусной кислоты и гидроксида аммония.
  4. Поли-DL-аланина бульон решение: подготовить поли-DL-аланина (PA) весом 1,0 мг ПА и растворения в 1,0 мл воды DI дать 1000 промилле. Тщательно перемешайте. Используя микропипелет, распределите 50,0 аликотов, и поместите каждый в 1,7 мл флакон и хранить при -80 градусов по Цельсию.

3. Анализ электроспрей-ионной мобильности-массы спектрометрии

  1. Очистите ESI вход трубки и капиллярии иглы тщательно около 500 л 0,1 М ледниковой уксусной кислоты, 0,1 М гидроксид аммония, и, наконец, DI воды.
  2. Оттепель 50,0 л аликут 1000 промилле PA бульона раствора и разбавить его 450 л воды DI, чтобы дать 100 промилле PA. Pipet 100.0 л этого раствора и разбавить его до 1,00 мл с 500 л воды DI и 500 л ацетонитрила, чтобы дать 10 ppm PA раствор.
  3. Соберите отрицательные и положительные ионные спектры IM-MS 10 ppm PA решения в течение 10 минут каждый с помощью родной ESI-IM-MS условиях, описанных в разделе обсуждения.
  4. Оттепель 50,0 мл аликут 12,5 мм или 1,25 мм amb бульонного раствора и сделать последовательные разбавления с di воды, чтобы дать окончательную концентрацию 0,125 мм amb. Тщательно перемешайте каждое разбавление.
  5. Пипетка 100,0 л металлического ионного бульона 125 мм, поместите во флакон 1,7 мл и разбавьте до 1,00 мл с водой DI, чтобы дать 12,5 мм металлического иона. Повторите еще два последовательных разбавления, чтобы дать окончательную концентрацию иона 0,125 мМ. Тщательно перемешайте каждое разбавление.
  6. Пипет капот 200,0 л из 0,125 мм в флакон 1,7 мл, разбавьте 500 л воды DI и тщательно перемешайте раствор.
  7. Отрегулируйте рН образца до 3,0, добавив 50 кл. раствора уксусной кислоты.
  8. Добавьте 200,0 л металлического иона 0,125 мМ в скорректированный рН образец. Добавьте DI воду, чтобы получить окончательный объем 1,00 мл образца, тщательно перемешайте и дайте образцу уравновеситься в течение 10 минут на RT.
  9. Используя тупой нос шприц принять 500 зл и собирать отрицательные и положительные ионные ES-IM-MS спектра в течение 5 минут каждый. Используйте оставшиеся 500 л образца для записи его окончательного рН с помощью откалиброватого микро-рН электрода.
  10. Повторите шаги 3.6-3.9, при изменении шага 3.7 для регулировки рН до 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, или 10.0 путем добавления новых томов растворов 0.010 M, 0.10 M, или 1.0 M уксусной кислоты или гидроксида аммония.
  11. Соберите отрицательные и положительные спектры ESI-IM-MS из 10 ppm PA решение для 10 минут каждый.

4. Подготовка металлического иона титрации образцов амба

  1. Следуйте шагам, описанным в шагах 3.1-3.5.
  2. Пипет капот 200,0 л из 0,125 мм в флакон 1,7 мл, разбавьте 500,0 л воды DI и тщательно перемешайте раствор.
  3. Отрегулируйте рН образца до рН 9,0, добавив 80 qL раствора гидроксида аммония 0,010 М.
  4. Добавьте 28 мл металлического ионного раствора 0,125 мМ, чтобы дать 0,14 молярных эквивалента металлического иона, добавьте воду DI, чтобы сделать окончательный объем образца 1,00 мл, тщательно перемешайте и дайте образцу уравновесить в течение 10 мин на РТ.
  5. Использование тупого носшшшного шприца возьмите 500 зл и соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS в течение 5 мин каждый. Используйте оставшиеся 500 л образца для записи его окончательного рН с помощью откалиброватого микро-рН электрода.
  6. Повторите шаги 4.2-4.5, при изменении шага 4.3, чтобы добавить соответствующий объем ионного раствора 0,125 мМ, чтобы дать либо 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26, или 1,40 молярового эквивалента.
  7. Соберите отрицательные и положительные ионные спектры IM-MS из 10 ppm PA решение для 10 минут каждый.

5. Анализ данных титрации ESI-IM-MS pH

  1. Из IM-MS спектра определить, какие заряженные виды амбприсутствуют присутствуют, сопоставляя их с их теоретическими м / z изотопных моделей.
    1. Откройте MassLynx и нажмите на Chromatogram, чтобы открыть окно Chromatogram.
    2. Перейдите в меню файла и откройте для поиска и открытия файла данных IM-MS.
    3. Извлеките спектр IM-MS путем right-clicking и волочить через chromatogram и выпускать. Окно спектра откроется, показывая спектр IM-MS.
    4. В окне спектра нажмите на модели Tools и Isotope. В окне изотопного моделирования введите молекулярную формулу вида amb, проверьте заряженную ионную коробку Show и введите состояние заряда. Нажмите OK.
    5. Повторите, чтобы идентифицировать все виды в спектре IM-MS и зафиксировать их диапазон изотопов м/з.
  2. Для каждого вида amb, отделить любые случайные м / z видов и извлечь их время прибытия распределения (ATD) с использованием их м / z изотопных моделей для их идентификации.
    1. В MassLynx нажмите на DriftScope, чтобы открыть программу. В DriftScope нажмите на файл и открыть, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS.
    2. Используйте мышь и левый щелчок, чтобы увеличить на м / z изотопный узор видов amb.
    3. Используйте инструмент «Выбор» и кнопку левой мыши для выбора изотопов. Нажмите кнопку текущего выбора Accept.
    4. Чтобы отделить любые случайные виды м/з, используйте инструмент «Выбор» и кнопку левой мыши, чтобы выбрать время, выровненные по времени ATD, с изотопным узором видов amb. Нажмите кнопку текущего выбора Accept.
    5. Для экспорта ATD, перейдите в файл Экспорт в MassLynx,затем выберите Сохранить время дрейфа и сохранить файл в соответствующей папке.
  3. Определите центроид ATD и интегрируйте область под кривой ATD как измерение населенности вида.
    1. В окне Chromatogram MassLynx открывается сохраненный экспортированный файл. Нажмите на процесс Интеграция из меню. Проверьте apexTrack Пик Интеграция поле и нажмите OK.
    2. Запись центроида ATD (tA)и интегрированной области, как показано на окне Chromatogram. Повторите для всех сохраненных amb и PA IM-MS файлов данных.
  4. Используйте интегрированный ATD для всех извлеченных видов амба либо положительных или отрицательных ионов в каждой точке титрования, чтобы нормализовать относительную процентную шкалу.
    1. Введите идентичности видов amb и их интегрированной ATD на каждом рН в электронную таблицу.
    2. Для каждого рН используйте сумму интегрированных ATD, чтобы нормализовать ATD отдельного amb в процентной шкале.
    3. Участок процент интенсивности каждого вида amb против рН в графике, чтобы показать, как популяция каждого вида варьируется в зависимости от рН.

6. Поперечные сечения столкновения

  1. Используя электронную таблицу, преобразуйте CCS (я) ПА отрицательных25,26 и положительных27 ионов, измеренных в буферном газеОн 28, в исправленный CCS(c)с помощью уравнения 1 ниже, где: z ионный заряд; e c - электрон-заряд (1.602-10-19 C); м N 2 - масса газа N2 (Da); и мионная ионная масса. 29

Equation 1

  1. Преобразуйте среднее время прибытия (tA) калибрантов и видов amb в время дрейфа (tD)используя уравнение 2 ниже, где: c - увеличенный коэффициент задержки цикла пошлины (1.41), и m/z масса-к-заряда иона пептида.

Equation 2

  1. Участок PA калибрантов 'тD против их Qc. Затем, используя регрессию наименьших квадратов в соответствии с уравнением 3, показанную ниже, определите значения A' и B, где: A' является коррекцией параметров температуры, давления и электрического поля; и B компенсирует нелинейный эффект устройства для вхасжей.

Equation 3

  1. Используя эти значения A' и B и значение centroid tD от ATD амбов, определяющих их значениеq c с помощью Equation 3 и их значение с помощью Equation 1. Этот метод обеспечивает CCS для пептидных видов с оценками абсолютные ошибки около 2%25,26,27.

7. Вычислительные методы

  1. Используйте b3LYP / LanL2D уровне теории, состоящий из Беке 3-параметр гибридных функций30 и Даннинг базы набор31 и электрон потенциалов ядра32,33,34, чтобы найти геометрические оптимизированные конформисты для всех возможных типов координации наблюдаемых видов м/з 35.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о том, как построить и представить расчеты относятся к использованию GaussView в дополнительном файле.
  2. Сравните предсказанную свободную энергию каждого из конформистов и вычислите их теоретические УХУ с помощью метода Ионного леннарда-Джонса (LJ) из программы Sigma36.
  3. Из самых низких свободных энергии конформисты определить, какой конформер экспонатов LJ CCS, который согласен с IM-MS измеряется CCS для определения третичной структуры и типа координации для конформаторов наблюдается в эксперименте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Металлический переплетамб1
IM-MS исследование20 из amb1 (Рисунок 1A) показали, что как медь и цинк ионов связаны с amb1 в рН-зависимым образом (Рисунок 2). Тем не менее, медь и цинк связаны с amb1 через различные механизмы реакции на различных участках координации. Например, добавление Cu(II) к amb1 привело к окислению amb1 (amb1ox) путем образования просульфидного моста, и на рН nos;6, «amb1ox»3H'Cu (II)»ион (рисунок 2A) был сформирован. Это свидетельствовало о депротонации двух имидазолий, карбоксиловой группы и двух дополнительных участках, которые координировали Cu(II).

Молекулярное моделирование «amb1ox»Cu(II)»ион с использованием B3LYP/LanL2D, определив, что самым низким энергетическим комплексом был Cu(II), координируемый через имидазол «N Его и депротонные азоты позвоночника на фоне групп ыиданок Cys2 и Gly3. Тем не менее, ниже рН 6, добавив Cu (II) к amb1 формируется м / z изотопный шаблон, который может быть учтен только Cu (I) связывания, образуя "Amb1ox"Cu (I)) ион (Рисунок 2B). В отличие от этого, рН выше 6 привелк к снижению изотопов м/з на 1 м/з, что объясняется положительным заряженным ионом.amb 1ox(H'Cu (II) ион. Добавление n (II) не окисляет amb1, и связывание n (II) было отмечено на рН no 6, в первую очередь образуя «amb(II)ион (рисунок 2C). Это указывает на депротонацию имидазолиев, тиол и карбоксилов. Молекулярное моделирование «amb(3H))ионы определили, что самые низкие энергетические конформисты — либо тетраэдральное «n»(II) координация через 2His-2Cys или His-2Cys и карбоксилат C-термина.

Несколько Cu (I) связывание amb2
Реакции Redox между Cu(II) и amb2 (Рисунок 1B) привели к cu(I) связыванию. Это было изучено более подробно с помощью IM-MS, УФ-Vis спектрофотометрии, и B3LYP молекулярного моделирования37. Основными продуктами Ку (II) титрации amb2 при рН 5 были окисление amb2 (через образование моста дисульфидного) и неокисленный amb2 видов, координирующих три ионов Cu (I).

Поиск с использованием метода B3LYP/LanL2D' обнаружил два низкоэнергетических комплекса, борющихся за скоординированные виды 3Cu(I). Первый был комплекс показан на рисунке 3A, где 3Cu (I) ионы были скоординированы через преодоление тиолатгруппы 38 Из Cys2 и Cys6 (его1), а также No1 и No5 (его5 ). Второй комплекс (3c) имеет соляной мост между протонной его1 боковой группой и C-терминалом карбоксилатной группы. Эти результаты показывают, что при рН 3,0-6,0 основным комплексом amb2no3Cu(I) является соляная структура, которая может быть успешно перенесена из раствора в газовую фазу с минимальным истечением конструкции.

Теоретический LJ CCS 209 и 6 No2, рассчитанный с использованием программы Sigma36 для сложных 3c, согласован с IM-MS измеряется CCS, указывая, что 3c представляет собой "amb2"2H 3Cu (I) - конформация на pH 3.0-6.0. Тем не менее, на рН из No gt;6, этот комплекс не наблюдался IM-MS, вероятно, потому, что дальнейшая депротонация его1 (стрKa6.0) приводит к общему нейтральному комплексу. После того, как группа imidazoleum Его1 является депротонным, 3Cu(I) координация может преобразовать в преодоление тиолатовых групп Cys2 и Cys6, а также No1 и No5 Его1 и Его5, соответственно (3a).

Зависимость pH amb4 Cu(I/II)-связывающая и редокс-активность
Методы IM-MS и B3LYP были использованы для исследования Cu (II) и рН титров amb4 (Рисунок 1C) и определены мономер, димер, тример, и тетрамер комплексы amb4, содержащий до трех Ку (I) ионов или два Cu(II ) ионы для каждого мономера субъединицы39. Комплексы также содержали различное количество дисульфидных мостов, и эти продукты были произведены ли или не реакции Cu(II) с amb4 были проведены в анаэробных или аэробных aqueous разрешениях.

Используя технику IM-MS, было показано, что эти отдельные виды могут быть разделены и количественно, даже если они перекрывающихся изотопов из-за различий в их времени прибытия (Рисунок 4). Идентификация и количественная оценка этих близкородственных видов является задачей, которую не может достичь никакой другой инструментальный или аналитический метод. Эти IM-MS исследования обеспечивают значительное понимание рН-зависимых реакций редокса и точно определили количество межмолекулярных дисульфидных мостов, количество ионов Cu(I) или Cu(II) и количество мест депротонации в каждом из комплексов ( Рисунок 5).

Кроме того, измерение комплексов CCS также позволило определить каждый из отдельных видов конформационного размера, который был использован с обширным поиском B3LYP/LanL2D, чтобы найти конформисты со структурами, которые согласились с обоими правильными молекулярными стоихиометрия и CcS измеряется IM-MS. С помощью этого метода была определена координация различных комплексов Cu(I/II). Реакции между Cu(II) и amb4 включали в себя образование димеров, тримеров и тетрамеров, координирующих либо Cu(I) или Cu(II), в зависимости от рН раствора.

Например, в растворах, которые были слегка кислыми (pH 3.0-6.0), они в первую очередь связаны Ку (I) ионами и были неокислены, в то время как в решениях, которые были немного основные (pH 8.0-11.0), они в первую очередь связаны Ку (II) ионы и были окислены всеми Cys формирования дисульфид облигаций(рисунок 6). B3LYP/LanL2D' определили, что ионы Cu(I) были линейными и смостили группами тиола и имидазола, в то время как ионы Cu(II) были хелатированы с помощью искаженной Т-образной или квадратной планарной геометрии имидазола, а также депротонных азотных азотов наивных групп.

IM-MS анализ mb-OB3b
IM-MS исследования19,40 mb-OB3b(Рисунок 1D) показали, что в газовой фазе, Cu (I)-бесплатно mb-OB3b существует как три отрицательно заряженных видов: "mb-OB3b-H"-, "mb-OB3b-2H" 2-и "mb-OB3b-3H" 3 -в соответствии с ожидаемым поведением фазы решения. Индивидуальные металлические ионные титрации были выполнены19 для определения селективности металлического иона mb-OB3b. На рисунке 7 показаны результаты выбранных ионных титров металла и показано, что кажущаяся связывающая избирательность mb-OB3b может быть классифицирована как три основные группы: 1) Cu(I) и Ag (I); 2) Ни (II), Зн(II) и Ко (II); и 3) Pb (II), Fe (II), и Mn (II). Этот порядок обязательной избирательности было показано, что в общем согласии с тем, что нашли флуоресценции утоления экспериментов19 и изотермальной титрорационности калоремии18.

Сравнение mb-OB3b и amb 7 (г. селективность связывания металла
Очевидная связывающая селективность mb-OB3b была сравнена с связывающей избирательностью amb7 при рН 7. Amb7 был разработан с той же аминокислотной последовательности, как mb-OB3b, но с двумя группами энетиола оксазолон заменены двумя его-Cys групп. Amb7 (Рисунок 1E) имеет одну дисульфидную связь между Cys6 и Cys12. Результаты формирования отрицательных заряженных комплексов(рисунок 8)показали, что amb7 предпочитал связывающую селективность для Ni (II) и n(II) (60%), за которыми следовали Co(II) и Pb (II) (40%). Кроме того, было около 20% Cu (II) связывания. Существовал либо след или нет amb7 связывания Ag (I), Mn (II), или Fe (II). Это по сравнению с предпочтительной связывающей избирательностью mb-OB3b более 90% для связывания Cu(I) и Ag(I).

Figure 1
Рисунок 1: Первичные структуры альтернативных пептидов метанобактина (амб) и метанобактина (mb-OB3b). (A) Ацетил-Его1-Cys2-Gly3-Pro4-Его5-Cys6 (amb1); (B) ацетил-Его1-Cys2-Tyr3-Pro4-Его5-Cys6 (amb2); (C) ацетил-Его1-Cys2-Gly3-Ser4-Тир5-Pro6-Его7-Cys8-Ser9 (amb4); (D) 1-(N--меркапто-(5-оксо-2-(3-метилбутаноил)оксазол-(З)-4-илиден)метил-Гли11-1Ser2-Cys3-Тир4)-пирролидин-2-yl-(меркапто-5-оксо-оксазол-(З)-4-ylidene-метил)-Сер5 -Cys6-Met7 (mb-OB3b); и (E) ацетил-Леу1-Его2-Cys3-Gly4-Ser5-Cys6-Тир7-Pro8-Его9-Cys10-Ser11-Cys12-Met 13 (амб7). Затенение показывает: 2His-2Cys или энетиол-оксазолон связывания сайтов (Icon); пролин или пирролидин петли (Icon); ацетил или метилбутанол группы N-терминус (Icon); и тирозин, который может стабилизировать координацию ионов металла черезIconвторую растворимую оболочку и взаимодействие с катианами (). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Средняя относительная интенсивность альтернативного метанобактина (amb1) ацетил-Его1-Cys2-Gly3-Pro4-Его5-Cys6 и металлосвязанный комплекс (amb1и X) (где Х и Ку или Зн). Наблюдения были сделаны во время анализа отрицательной и положительной ионной масс-спектрометрии 1:1 молярного соотношения раствора amb:XCl2 над диапазоном рН 3.0-11.0. Ошибки бары показывают стандартные отклонения средств как относительной интенсивности и рН от трех повторить рН титрации экспериментов. 1:1 молярный раствор amb:CuCl2 привел к окислению amb (ambox)с Cys2 и Cys6,образуя мост дисульфид. (A) Отрицательный ионный анализ amb:CuCl2, показывающий «ambбык»H» и «ambбык» (AMB-бык)». (B) Положительный ионный анализ amb:CuCl2, показывающий «ambбык»и «ambox»(Cu(I/II)»; состояние окисления Cu в комплексе было рН-зависимым, будучи «ambбык»Cu (I)»  ниже рН 8 и «амббык»(H'Cu(II)) выше рН 8. (C) Отрицательный ионный анализ amb: «nCl с указанием «amb» и «amb»n (II)». (D) Положительный ионный анализ amb: «nCl с указанием «amb» и «amb»n (II)»n . Эта цифра была адаптирована из предыдущей публикации20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Предлагаемые структуры «amb2»3Cu(I)с использованием низкой энергии и геометрии оптимизированных структур, расположенных с уровня теории B3LYP/LanL2D. (A) 3 Cu (I) координация через NoN 1No5 Его1 и его5 и тилата цилатных групп Cys2 и Cys6 с теоретическим сечением 217 и 6 No2. (B) Иллюстрация координации зН1ЗН5 и тилата. (C) Соль мостовой структуры, показывающие 3 Cu (I) координации через карбоксилат терминала (Cys6), No5, и тилат апорирования с теоретическим сечением 209 и 6 no2. (D)Иллюстрация терминала карбоксилата, NoN 5, и тилата координации преодоления. Расстояние скрепления A, B, C, D, E и F отображается в единице К. Эта цифра была адаптирована из предыдущей публикации37. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: IM-MS анализ продуктов 1:1 смесь amb4:Cu (II) при рН 4,4.  (A) Извлеченные изотопные узоры для «amb4»2H3Cu (I)», «диамб4»6Cu(I)»,2 ,«триамб(6H'9Cu(I)»3 » и «тетраамб 4 . (B) Интеграция извлеченных времен прибытия в размере 4 ХМ4 (Amb 4H'3Cu(I)), «diamb 4H»6Cu (I)» 2 » , «триамб(6H'9Cu (I)»3 » и «тетраамб4»8H»12Cu (I)»4» были использованы для расчета их относительной интенсивности. Для расчета процентной относительной интенсивности для нормализации к процентной шкале использовалось суммирование интегрированной области для всех извлеченных видов для каждой точки титрования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Изменение изотопов шаблон для познавательный Cu (I/II) связаны Amb4 наблюдается во время рН титрование моляровских эквивалентов Cu (II): amb4 на рН 4,04, 6,02, и 9,98. При рН 4,04, экспериментальный результат в первую очередь соответствует изотопной модели для «Amb4»Cu (I)». При рН 6,02, есть сдвиг -2 м/з, означающий образование дисульфидного моста (показано как окисление amb4ox)и соглашение с изотопной картиной для «amb4ox»Cu (I)). При рН 9,98, есть дальнейший сдвиг -1 м /z, означающий Cu (II) связывание и удаление протона для поддержания состояния заряда No1, который затем соответствует изотопной модели для "amb4ox"H'Cu(II). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Изменение относительной интенсивности идентичности комплексов Cu(I/II) мономеров, димеров и тримераamb 4 над диапазоном рН 3.0-11.0.  (A) Мономер с одним Cu(I/II) ионом, (B) dimer с 2 ионами Cu(I/II) и (C) trimer с 3 ионами Cu(I/II). В подписях отмечается, сколько дисульфидных облигаций присутствовало в комплексе. Эта цифра была адаптирована из предыдущей публикации39. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Процент формирования Cu (I), Ag (I), Зн (II), Ни (II), Ко (II), Mn (II), Pb (II), или Fe (II) комплексов метанобактина. Наблюдается во время отдельных металлических ионных титров метанокактина. Следует отметить, что Cu(I) связывание в результате добавления Cu (II) и Fe (II) связывания от добавления Fe (III). Эта цифра была адаптирована из предыдущей публикации19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Сравнение процентной доли Cu (I/II), Ag (I), N (II), Ni (II), Co (II), Mn (II), Pb (II), pb (II), или Fe (II) chelation mb-OB3b и amb7 на рН No 7. Сравнение для образования отрицательно заряженных ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary File
Дополнительный файл. Использование GaussView. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги: сохранение поведения на фазе решения для обследования через ESI-IM-MS
Родные инструментальные настройки ESI должны быть использованы, которые сохраняют пептид ытоихиометрии, состояние заряда и конформационную структуру. Для местных условий необходимо оптимизировать условия в источнике ESI, такие как напряжения конуса, температуры и газовые потоки. Кроме того, давление и напряжение в источнике, ловушка, ионная мобильность, и передачи путешествия волн (особенно DC ловушки смещения, который контролирует напряжение инъекций в ячейку) должны быть проверены на их влияние на заряд состояния и ионных распределений мобильности.

Ниже приведены типичные условия эксплуатации, которые были использованы в этой работе. Образцы водного пептида были введены с помощью тупого носа 1,0 мл шприца с использованием 10 мл мин1 скорость потока, 2,0 кВ капиллярного напряжения для положительных ионов (к) или 1,8 кВ для отрицательных ионов (-), 130 градусов по Цельсию, 250 градусов по Цельсию, 20 C выборки конуса, и 4,0 В извлечение конуса. Секция IM была прооперирована с 6,0 V входным напряжением в ячейку ловушки с аргоновым давлением 2,25 х 10мбар с использованием скорости потока 1,5 мл/мин. Напряжение для инъекционных ионов (ловушка DC смещения) в ячейку im был установлен на 12 V, чтобы избежать диссоциации ионов, как они первоначально столкнулись с азотным буферным газом. IM-клетка отделяла ионы в зависимости от их заряда и поперечного сечения и использовала давление азота 0,52 мбар и скорость потока 20,0 млмин.1. ИМбыл в эксплуатации с увеличенными 12,0-20,0 V (я) или 8,0-30.0 V (яп. ) высотой движения и увеличенным на 800–1500 мс 1 (я) или 250–1000 мскоростей no1 (я) для каждой развертки через ячейку передвижной волны. Ячейка передачи работала с тем же давлением аргона, что и клетка-ловушка, и направляла ионы IM к ортогональном анализатору массы к зарядке. Спектры подвижности ионов были приобретены путем синхронизации закрытого выпуска ионов в ячейку для вхождения с анализатором массы к зарядке.

Используя родные условия ESI, свойства фазы решения, такие как состояние заряда и конформационное состояние, сохраняются во время анализа IM-MS. Например, состояния заряда mb-OB3b и ambs, наблюдаемые во время анализа IM-MS20,37 были тесно связаны с состояниями заряда, ожидаемыми на этапе решения40. Пептид mb-OB3b является тетрапротическим и образует только отрицательно заряженные ионы во время анализа IM-MS40, будь то Cu(I)-связанный или Cu(I)-бесплатно, потому что он содержит C-терминус (pKa lt; 1.7), две группы энетиола оксазолон (pKa 5.0 и 9.7), и группа Тир(стр. Ka 11.0)42. Ambs в их полностью протонной форме будет иметь общий заряд в размере 2 фунтов стерлингов из-за C-термина (стрKa 2), два Его (рKa 6.0), два Ки (рKa 8.3), и Тир (рКа 11.0) сайты19,41. Таким образом, они, как правило, образуют положительно заряженных ионов на рН в размере 6 и отрицательно заряженных ионов на рН в размере 6.

Ambs также показали четкое рН-зависимых Cu (I/II) связывающее поведение и redox деятельности, в которой Cu (I)-связывания при низком рН перешли к Cu (II) связывания на более высоком рН. Cu (I/II) реакции включены формирования окисленных видов amb (ambбык),который содержал дисульфидные связи и различные мультимеры и несколько Cu (I/II) связывания (Рисунок 5 и Рисунок 6). Эти реакции redox зависят от времени, и было показано, что чем дольше интервал времени (до 210 мин) между подготовкой к образу и IM-MS анализы более окисленных продуктов наблюдались37. Поэтому также требуется тщательное рассмотрение зависимости времени реакции от наблюдения за продуктами.

Ограничения: IM-MS и теоретические поперечные сечения столкновения определяют, какой тип координации каждый металлический ион предпочитает
Чтобы помочь интерпретировать данные IM-MS m/z и CCS, был проведен обширный поиск с использованием уровня теории B3LYP/LanL2D. Оптимизированные с геометрией конформисты с различными координационными участками сравнивались между их прогнозируемой свободной энергией и соглашением с CCS, измеренным IM-MS. Молекулярное моделирование этих пептидов и их комплексов ограничено типом электронных расчеты структуры, которые могут быть применены к этим относительно крупным системам. Другие методы, которые были изучены или рекомендованы включают работу Truhlar и др.43, который обнаружил, что M05-2X был лучшим DFT функциональных и PM7 и MNDO / d были хорошие NDDO полуэмпирических методов для N (II)-содержащих соединений44. Эти пептиды имеют большое конформационное пространство и тщательное исследование, чтобы найти самые низкие энергии конформисты должны включать в себя сравнение различных металлических хелатинг сайтов, различных cis- и транс-пептидных связей, соляных мостов, водородных связей, и кация взаимодействия между ароматической группой стороны Tyr и металлическим катионом.

Значение по отношению к существующим методам: Cu(I/II) и другие выбранные металлические ионные привязки по сравнению между mb-OB3b и амбс
Рентгеновская кристаллография и спектроскопия ЯМР являются наиболее распространенными методами, используемыми для определения атомного разрешения пептидов третичной структуры. Однако рентгеновские кристаллографии металлопептидов скудны из-за проблем с кристаллизацией этих комплексов45. ЯМР также не подходит для интерпретации выборки, где тесно связанных отдельных видов олигопептида присутствуют46. Таким образом, IM-MS и DFT молекулярное моделирование являются альтернативными методами для изучения пептидных реакций, особенно те, которые являются результатом сложных redox и Cu (I/II) --обязательных реакций20,37,40, 47. Сила IM-MS заключается в том, что он может решить каждый из продуктов и определить их молекулярный состав, одновременно измеряя их м /z и время прибытия, которые относятся к стоихиометрии, состоянию протонации и конформационной структуре.

Например, mb-OB3b будет хеляции различных ионов металла, и его избирательность по отношению к каждому иону был показан IM-MS металлических ионных титров(рисунок 7). Результаты показали, mb-OB3b предпочтение для связывания Cu (I) и Ag (I), сравнивая результаты на рН 7 с amb7. На рисунке 8 показана амб7 преимущественно хелатов Зн(II) и Ни (II). В целом, amb исследования показали, что замена двух enethiol-oxazolones с 2His-2Cys не исключает Cu (I/II)-связывания, но это привело к нескольким Cu (I)-связывания через линейный преодоление координации (Рисунок 3) в отличие от моноядерной Cu (I) связывание тетраэдральной координации mb-OB3b48. Cu(II) сокращение было также опосредовано тиол окисления и дисульфидного моста формирования в отличие от существующих дисульфидный мост в apo-mb-OB3b и высокий потенциал сокращения для меди загружены mb-OB3b, который поддерживает сильное предпочтение Cu(I)49 .

Будущие приложения
Дальнейшие IM-MS исследования амб пептидов ведутся, в котором их основная последовательность модифицируется путем замены Его или Cys с Gly или Asp, в то время как остаток Тир заменяется либо Gly или Phe. Эти исследования также проводятся в ацетате аммония 10,0 мм, при этом рН модифицируется с гидроксидом аммония (для рН No 7, 8 и 9), чтобы сохранить общую ионную прочность постоянной для каждого образца. Эти результаты будут опубликованы в ближайшее время.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Этот материал основан на работе, поддерживаемой Национальным научным фондом в соответствии с 1764436, поддержкой инструментов NSF (MRI-0821247), Фондом Уэлча (T-0014) и вычислительными ресурсами Министерства энергетики (TX-W-20090427-0004-50) и L3 Communications . Мы благодарим группу Бауэра Калифорнийского университета - Санта-Барбара за то, что они поделились программой Sigma и Айобами Илесанми за демонстрацию техники в видео.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114, (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256, (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107, (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30, (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256, (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305, (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80, (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7, (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25, (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19, (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51, (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261, (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14, (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141, (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84, (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26, (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50, (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98, (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88, (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18, (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4, (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5, (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43, (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96, (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17, (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50, (4), 1378-1391 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics