Ion Mobility-massespektrometri teknikker til bestemmelse af strukturen og mekanismerne for metal Iongenkendelse og Redoxaktivitet af metal bindende oligopeptider

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ion Mobility-massespektrometri og molekylære modelleringsteknikker kan karakterisere den selektive metal chelaterende ydeevne af designede metal bindende peptider og kobber bindende peptid methanobactin. Udvikling af nye klasser af metal Chelat peptider vil hjælpe med at føre til terapeutisk for sygdomme forbundet med metal ionfejl balance.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektro spray ionisering (ESI) kan overføre en vandig fase peptid eller peptid kompleks til gas-fase samtidig bevare sin masse, samlede ladning, metal bindende interaktioner, og konformationel form. Kobling ESI med ion Mobility-massespektrometri (IM-MS) giver en instrumental teknik, der giver mulighed for samtidig måling af et peptid's Mass-to-Charge (m/z) og kollision tværsnit (CCS), der relaterer til sin støkiometri, protonation tilstand, og konformationel form. Den samlede ladning af et peptidkompleks styres af protonation af 1) peptid's sure og grundlæggende sites og 2) oxidations tilstanden af metal ion (s). Derfor er den samlede opladningstilstand for et kompleks en funktion af pH-værdien af opløsningen, som påvirker peptider metal ionbindende affinitet. For ESI-IM-MS-analyser fremstilles peptid-og metaliumiopløsninger ud fra vandige opløsninger med pH justeret med fortyndet vandig eddikesyre eller ammoniumhydroxid. Dette gør det muligt at fastgøre pH-afhængighed og metal ionselektiviteten for et specifikt peptid. Desuden kan m/z og CCS af et peptidkompleks anvendes med B3LYP/LanL2DZ Molekylær modellering til at skelne mellem bindingssteder af metal ionkoordineringen og den tertiære struktur i komplekset. Resultaterne viser, hvordan ESI-IM-MS kan karakterisere den selektive chelerende præstation af et sæt af alternative methanobactin peptider og sammenligne dem med kobber bindende peptid methanobactin.

Introduction

Kobber og zink ioner er afgørende for levende organismer og afgørende for processer, herunder oxidativ beskyttelse, vævsvækst, respiration, kolesterol, glukose metabolisme og genom læsning1. For at muliggøre disse funktioner inkorporerer grupper som cys, imidazol i2,3, (sjældnere) thioether af methionin og carboxylat af Glu og ASP selektivt metaller som cofaktorer i de aktive steder i metalloenzymer. Ligheden mellem disse koordinationsgrupper rejser et spændende spørgsmål om, hvordan hans og cys ligander selektivt indarbejde enten cu (I/II) eller Zn (II) for at sikre korrekt funktion.

Selektiv binding opnås ofte ved opkøb og handel med peptider, som kontrollerer Zn (II) eller cu (I/II) ionkoncentrationerne4. Cu (I/II) er meget reaktiv og forårsager oxidativ skader eller utilsigtet binding til enzymer, så dens frie koncentration er stramt reguleret af kobber chaperoner og kobber-regulerende proteiner, der transporterer det sikkert til forskellige steder i cellen og stramt styre sin homøostase5,6. Afbrydelse af kobber metabolisme eller homøostase er direkte impliceret i Menkes og Wilsons sygdom7 samt kræft7 og neurale lidelser, såsom prionsygdomme8 og Alzheimers sygdom9.

Wilsons sygdom er forbundet med øget kobber niveauer i øjnene, leveren og dele af hjernen, hvor redox reaktioner af cu (I/II) producerer reaktive ilt arter, forårsager hepatolloulære og neurologiske degeneration. Eksisterende chelationterapier er den lille thiol aminosyre penicillamin og triethylenetetramin. Alternativt udviser methanotrophic kobber-overtagelses peptider methanobactin (MB)10,11 terapeutisk potentiale på grund af deres høje bindingsaffinitet for cu (I)12. Når methanobactin (MB-OB3b) fra Methylosinus trichosporium OB3b blev undersøgt i en dyremodel af Wilsons sygdom, blev kobber effektivt fjernet fra leveren og udskilles gennem galde13. In vitro forsøg bekræftede, at MB-OB3b kunne Chelat kobber fra kobber metallothionein indeholdt i leveren cytosol13. Laser ablation induktions koblede plasma massespektrometri Imaging teknikker har undersøgt den rumlige fordeling af kobber i wilson's sygdom leverprøver14,15,16 og vist, at MB-OB3b fjerner kobber med korte behandlingsperioder på kun 8 dage17.

MB-OB3b vil også binde med andre metalioner, herunder AG (I), AU (III), PB (II), MN (II), Co (II), fe (II), ni (II), og Zn (II)18,19. Konkurrence om den fysiologiske cu (I) binding site er udstillet af AG (I) fordi det kan fortrænge cu (I) fra MB-OB3b kompleks, med både AG (I) og ni (II) også viser irreversibel binding til MB, som ikke kan fordrevet af cu (I)19. For nylig er en række alternative methanobactin (Amb) oligopeptider med 2his-2cys bindende motiv blevet undersøgt20,21, og deres Zn (II) og cu (I/II) bindingsegenskaber karakteriseret. Deres primære aminosyresekvenser er ens, og de indeholder alle 2His-2Cys Motif, Pro og en acetyleret N-endestation. De adskiller sig hovedsageligt fra MB-OB3b, fordi 2His-2Cys Motif erstatter de to enethiol oxazolone bindingssteder af MB-OB3b.

Elektro spray ionisering kombineret med ion Mobility-massespektrometri (ESI-IM-MS) giver en kraftfuld instrumental teknik til bestemmelse af de metal bindende egenskaber af peptider, fordi det måler deres masse-til-ladning (m/z) og kollision tværsnit (CCS) og samtidig bevare deres masse, ladning og konformationsmæssige form fra løsnings fasen. M/z og CCS relaterer til peptider støkiometri, protonation tilstand, og konformationel form. Støkiometri bestemmes, fordi identiteten og antallet af hvert element, der er til stede i arterne, udtrykkeligt identificeres. Den samlede ladning af peptidkomplekset vedrører protonationtilstanden for de sure og grundlæggende steder og oxidations tilstanden for metal ionerne. CCS giver oplysninger om peptidkompleksets kropsbygnings form, fordi det måler den roterende gennemsnit størrelse, der vedrører kompleksets tertiære struktur. Den samlede opladningstilstand af komplekset er også en funktion af pH og påvirker peptid's metal ion binding affinitet, fordi deprotonated grundlæggende eller sure steder som carboxyl, hans, cys og tyr er også de potentielle bindende steder for metal ion. Til analyserne tilberedes peptid og metal ion i vandige opløsninger med pH justeret ved fortyndet vandig eddikesyre eller ammoniumhydroxid. Dette gør det muligt at fastgøre pH-afhængigheden og metal ionselektiviteten for peptid. Desuden kan m/z og CCS bestemt af ESI-im-MS bruges sammen med B3LYP/LanL2DZ molecular modeling til at opdage typen af metal ion koordination og tertiær struktur af komplekset. Resultaterne vist i denne artikel afslører, hvordan ESI-IM-MS kan karakterisere den selektive chelerende præstation af et sæt Amb peptider og sammenligne dem med kobber bindende peptid MB-OB3b.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. klargøring af reagenser

  1. Kultur methylosinus trichosporium OB3b, Isoler cu (i)-fri MB-OB3b18,22,23, fryse-tør prøven og opbevar ved-80 °c indtil brug.
  2. Syntetisere Amb peptider (> 98% renhed for Amb1, Amb2, amb4; > 70% renhed for Amb7), fryse-tørre prøverne, og opbevar dem ved-80 °c indtil brug.
  3. Køb > 98% renhed mangan (II) chlorid, cobalt (II) chlorid, Nickle (II) chlorid, kobber (II) chlorid, kobber (II) nitrat, sølv (I) nitrat, zink (II) chlorid, jern (III) chlorid og bly (II) chlorid.
  4. De poly-DL-alanin-polymerer, der anvendes som kalibranter til måling af kollisions tværsnit af Amb-arterne og HPLC-kvalitet eller højere ammoniumhydroxid, iseddike og acetonitril, købes.

2. klargøring af stamopløsning

  1. Peptid stamopløsning
    1. Veje nøjagtigt, ved hjælp af mindst tre signifikante tal, massen af 10.0-20.0 mg af MB-OB3b eller Amb i et 1,7 mL plastik hætteglas.
      Bemærk: den vejede masse skal give enten 12,5 mM eller 1,25 mM, afhængigt af peptidopløselighed, når der tilsættes 1,00 mL deioniseret (DI) vand.
    2. Ved hjælp af et pipet tilsættes 1,00 mL deioniseret vand (> 17.8 MΩ cm) til den vejede peptidprøve for at give enten 12,5 mM eller 1,25 mM opløsning. Placer hætten sikkert og bland grundigt med mindst 20 inversioner.
    3. Ved hjælp af et mikropipet dispenserer 50,0 μL aliquoter fra peptidprøven til individuelt mærkede 1,5 mL hætteglas og opbevares ved-80 °C indtil brug.
  2. Metal ion stamopløsninger
    1. Afvejes nøjagtigt med mindst tre betydende cifre, massen på 10,0 – 30.0 mg af metal klorid eller sølvnitrat i et 1,7 mL hætteglas.
      Bemærk: den vejede masse skal give 125 mM, når der tilsættes 1,00 mL DI vand.
    2. Tilsæt 1,00 mL DI vand til den vejede metal prøve i 1,7 mL hætteglasset for at give opløsningen på 125 mM. Placer hætten sikkert og bland grundigt med mindst 20 inversioner.
  3. Ammonium hydroxid stamopløsninger: forbered en 1,0 M eddikesyre opløsning ved at fortynde 57 μL af 99,5% eddikesyre opløsning med di vand til en endelig volumen på 1,00 ml. Der fremstilles en 1,0 M ammoniumhydroxidopløsning ved fortynding af 90 μL af den 21% ammoniumhydroxidopløsning med DI-vand til en endelig volumen på 1,00 mL. Der fremstilles to på hinanden følgende fortyndinger af hver opløsning ved at tage 100 μL af 1,0 M-løsningerne for at tilberede 0,10 M og 0,010 M eddikesyre og ammoniumhydroxid opløsninger.
  4. Poly-DL-alanin stamopløsning: forberede poly-DL-alanin (PA) ved vejning 1,0 mg PA og opløses i 1,0 ml di vand til at give 1.000 ppm. Bland grundigt. Brug en mikropipet, dispensere 50,0 μL Aliquots, og Placer hver i et 1,7 mL hætteglas og opbevar ved-80 °C.

3. Elektro spray-ion Mobility-massespektrometri analyse

  1. Rengør ESI-indgangs slangen og kanyle kapillær grundigt med ca. 500 μL 0,1 M iseddike, 0,1 M ammoniumhydroxid og endelig DI vand.
  2. Der tø en 50,0 μL alikvot af 1.000 ppm PA stamopløsningen og fortyndes med 450 μL DI vand for at give en 100 ppm PA. Pipet 100,0 μL af denne opløsning og fortyndes til 1,00 mL med 500 μL DI vand og 500 μL acetonitril for at give 10 ppm PA opløsning.
  3. Saml de negative og positive ion IM-MS Spectra af 10 ppm PA-opløsningen i 10 min hver ved hjælp af Native ESI-IM-MS-betingelser som beskrevet i diskussionsafsnittet.
  4. Der tø en 50,0 μL alikvot af opløsningen 12,5 mM eller 1,25 mM Amb, og der fremlægges på hinanden følgende fortyndinger med DI-vand for at give en endelig koncentration på 0,125 mM Amb. Bland grundigt hver fortynding.
  5. Pipet 100,0 μL af 125 mM metal ionstam opløsningen, Anbring i et 1,7 mL hætteglas og fortynd til 1,00 mL med DI vand for at give 12,5 mM metal ion. Gentag med to på hinanden følgende fortyndinger for at give en endelig 0,125 mM metal ionkoncentration. Bland grundigt hver fortynding.
  6. Pipet 200,0 μL af 0,125 mM Amb i et 1,7 mL hætteglas, fortyndes med 500 μL DI vand og bland opløsningen grundigt.
  7. Prøvens pH justeres til 3,0 ved tilsætning af 50 μL 1,0 M eddikesyre opløsning.
  8. Tilsæt 200,0 μL af 0,125 mM metal ion til den pH-justerede prøve. Tilsæt DI vand til at give en endelig volumen på 1,00 mL af prøven, Bland grundigt, og lad prøven til at ækvibrere i 10 min ved RT.
  9. Brug en stump næse sprøjte tage 500 μL af prøven og indsamle de negative og positive ion ES-IM-MS Spectra for 5 min hver. Brug de resterende 500 μL af prøven til at registrere den endelige pH-værdi ved hjælp af en kalibreret mikro-pH-elektrode.
  10. Gentag trin 3.6 – 3.9, mens du ændrer trin 3,7 for at justere pH til 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 eller 10,0 ved at tilføje nye volumener af 0,010 m, 0,10 M eller 1,0 M eddikesyre eller ammoniumhydroxid opløsninger.
  11. Den negative og positive ion-ESI-IM-MS Spectra af 10 ppm PA-opløsningen opsamles i hver 10 min.

4. klargøring af metaliontitrering af Amb-prøver

  1. Følg trinene beskrevet i trin 3.1 – 3.5.
  2. Pipet 200,0 μL af 0,125 mM Amb i et 1,7 mL hætteglas, fortyndes med 500,0 μL DI vand og bland opløsningen grundigt.
  3. PH-værdien af prøven justeres til pH = 9,0 ved tilsætning af 80 μL af den 0,010 M ammoniumhydroxidopløsning.
  4. Tilsæt 28 μL af 0,125 mM metal ionopløsningen for at give 0,14 udlignende Molar-ækvivalent af metallet ion, tilsæt DI vand for at gøre den endelige volumen af prøven 1,00 mL, Bland grundigt, og lad prøven til at ækvibrere i 10 min ved RT.
  5. Ved hjælp af en stump næse sprøjte udtages 500 μL af prøven, og de negative og positive ion-IM-MS Spectra opsamles i 5 min. hver. Brug de resterende 500 μL af prøven til at registrere den endelige pH-værdi ved hjælp af en kalibreret mikro-pH-elektrode.
  6. Gentag trin 4.2 – 4.5, mens du ændrer trin 4,3 for at tilføje en passende mængde 0,125 mM metal ionopløsning, som giver enten 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26 eller 1,40 molære ækvivalenter.
  7. Den negative og positive ion IM-MS Spectra af 10 ppm PA opløsningen opsamles i 10 min. hver.

5. analyse af pH-titrerings data for ESI-IM-MS

  1. Fra IM-MS Spectra identificere, hvilke opkrævede arter af Ambs er til stede ved at matche dem til deres teoretiske m/z isotop mønstre.
    1. Åbn MassLynx og klik på kromatogrammet for at åbne kromatogrammet vinduet.
    2. Begive sig til den fil menu og lukke op hen til lokalisere og lukke op den im-MS data fil.
    3. Udpak IM-MS spektret ved at højreklikke og trække over kromatogrammet og frigive. Spektret vinduet vil åbne viser IM-MS spektrum.
    4. I spektret vindue, klik på værktøjer og isotop model. I vinduet isotop modellering skal du indtaste molekylformlen for Amb-arterne, kontrollere feltet Vis opladet ion og indtaste opladningstilstanden. Klik på OK.
    5. Gentag for at identificere alle arterne i IM-MS-spektret og registrere deres m/z-isotop område.
  2. For hver Amb-art adskilles alle tilfældige m/z-arter, og deres ankomsttids fordelinger (ATD) udtrækkes ved hjælp af deres m/z-isotop mønstre for at identificere dem.
    1. I MassLynx Klik på Drivscope for at åbne programmet. I drift Scope Klik på fil og åbne for at finde og åbne im-MS data File.
    2. Brug musen og venstre-klik for at zoome ind på m/z isotop mønster af Amb arter.
    3. Brug markeringsværktøjet og venstre museknap til at vælge isotop mønsteret. Klik på knappen Accepter aktuelt valg .
    4. For at adskille eventuelle tilfældige m/z-arter skal du bruge markeringsværktøjet og venstre museknap til at vælge ATD-tids justeret med isotop mønster af Amb-arterne. Klik på knappen Accepter aktuelt valg .
    5. Hvis du vil eksportere ATD, skal du gå til fil | Eksporter til MassLynx, vælg derefter Bevar drift tid og Gem fil i den relevante mappe.
  3. Bestemme atd's barycentrum og integrere arealet under ATD-kurven som et mål for Arts populationen.
    1. I kromatogrammet vindue af MassLynx åbne den gemte eksporterede fil. Klik på proces | Integrer fra menuen. Markér feltet ApexTrack peak integration, og klik på OK.
    2. Indfør barycentrum ATD (tA) og det integrerede område som vist på kromatogrammet . Gentag for alle gemte Amb-og PA IM-MS-datafiler.
  4. Brug den integrerede ATD til alle ekstraherede Amb-arter af enten de positive eller negative ioner ved hvert titrerings punkt for at normalisere til en relativ procentuel skala.
    1. Angiv identiteten af Amb-arterne og deres integrerede ATD ved hver pH-værdi i et regneark.
    2. For hver pH-værdi anvendes summen af de integrerede Atd'er til at normalisere den enkelte amb's ATD til en procentuel skala.
    3. Afbilde procent intensiteterne for hver Amb-art vs. pH i en graf for at vise, hvordan populationen af hver art varierer som en funktion af pH.

6. kollision tværsnit

  1. Ved hjælp af et regneark, konvertere CCSS (ω) af PAnegative 25,26 ogpositive 27 ioner målt i han buffer gas28 til korrigeret CCS (ωc) ved hjælp af ligning 1 nedenfor, hvor: z = ion Charge; e c = elektron ladning (1.602 × 10-19 c); m N 2 = masse af N2 gas (da); og mion = ion-masse. 29

Equation 1

  1. Konverter de gennemsnitlige ankomsttider (tA) af PA kalibranter og Amb arter til drift gange (tD) ved hjælp af ligning 2 nedenfor, hvor: c = den forbedrede sats cyklus forsinkelses koefficient (1,41), og m/z er masse-til-ladning af peptidion.

Equation 2

  1. Plottet PA kalibranterne ' tD vs. deres Ωc. Derefter, ved hjælp af en mindste-kvadrater regression pasform af ligning 3 vist nedenfor, bestemme a ' og B værdier, hvor: a ' er korrektionen for temperatur, tryk, og elektriske feltparametre; og B kompenserer for den ikke-lineære effekt af IM-enheden.

Equation 3

  1. Ved hjælp af disse A ' og B værdier og barycentrum tD værdi fra ATD af Ambs bestemme deres ωc ved hjælp af ligning 3 og deres ω ved hjælp af ligning 1. Denne metode giver CCSS for peptidarterne med anslåede absolutte fejl på ca. 2%25,26,27.

7. beregningsmæssige metoder

  1. Brug B3LYP/LanL2DZ niveau af teori, bestående af becke 3-parameterens hybrid Funktionaler30 og Dunning basis set31 og Electron Core potentialer32,33,34 for at finde geometri-optimerede konstellationer til alle mulige typer af koordineringer af de observerede m/z Amb-arter35.
    Bemærk: for nærmere oplysninger om, hvordan du opbygger og indsender beregninger, henvises til brugen af GaussView i den supplerende fil.
  2. Sammenlign den forventede frie energi for hver af de konformatorer og beregne deres teoretiske CCSs ved hjælp af ion-skaleret Lennard-Jones (LJ) metode fra Sigma-programmet36.
  3. Fra den laveste frie energi konformatorer afgøre, hvilke konformer udstiller LJ CCS, som er enig med im-MS målt CCS til at identificere den tertiære struktur og type af koordination for de sammen føjere observeret i forsøget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metal binding af Amb1
IM-MS-studiet20 af Amb1 (figur 1A) viste, at både kobber og zink ioner bundet til Amb1 på en pH-afhængig måde (figur 2). Imidlertid er kobber og zink bundet til Amb1 gennem forskellige reaktionsmekanismer på forskellige koordinations steder. For eksempel resulterede tilsætning af cu (II) til Amb1 i oxidation af Amb1 (Amb1ox) ved disulfidbrodannelse, og ved en pH-værdi på > 6 blev [Amb1OX− 3h + cu (II)] ion (figur 2a) dannet. Dette indikerede Deprotoneringsligevægten af to imidazoliums, carboxylgrupper gruppe, og to yderligere steder, der var koordinerende cu (II).

Molekylær modellering af [Amb1ox− 3h + cu (II)] ion ved hjælp af B3LYP/LanL2DZ bestemt det laveste energi kompleks var cu (II) koordineret via imidazol δn af hans1 og de deprotonerede nitrogener i backbone AMID grupperne af cys2 og Gly3. Under en pH-værdi på 6, dannede cu (II) til Amb1 imidlertid et m/z-isotop mønster, som kun kunne regnskabsmæssigt behandles med cu (i) binding, og som dannede [Amb1ox+ cu (i)]+ ion (figur 2B). I modsætning hertil medførte en pH-værdi på over 6, at m/z -isotop mønsteret faldt med 1 m/z, hvilket svarede til den positive ladede [Amb1ox− H + cu (II)]+ ion. Tilsætning af Zn (II) oxider ikke Amb1, og der blev observeret Zn (II) binding ved en pH-værdi på > 6, som primært dannede [Amb1− 3H + Zn (II)] ion (figur 2C). Dette indikerede Deprotoneringsligevægten af imidazoliums-, thiol-og carboxylgrupperne. Molekylær modellering af [Amb1− 3h + Zn (II)] ion fastsatte de laveste energi konformatorer som enten tetraeder Zn (II) koordination via 2his-2cys eller hans-2cys og carboxylat af C-Terminus.

Flere cu (I) binding af Amb2
Redox-Reaktionerne mellem cu (II) og Amb2 (figur 1B) resulterede i Cu (I) binding. Dette blev undersøgt mere detaljeret ved hjælp af IM-MS, UV-Vis spektrofotometri, og B3LYP molecular modeling37. De vigtigste produkter af cu (II) titrering af Amb2 ved en pH-værdi på 5 var Amb2 oxidation (gennem disulfidbrodannelse) og de uoxiderede Amb2 arter, der koordinerer tre cu (I) ioner.

En søgning ved hjælp af B3LYP/LanL2DZ metode placeret to lavenergi komplekser idet for 3CU (I) koordinerede arter. Den første var det kompleks, der er vist i figur 3A, hvor 3CU (I) ionerne blev koordineret via bridging oxygen grupperne38 af cys2 og cys6 (af hans1) samt δn1 og δn5 (af hans5 ). Den anden kompleks (3c) har en salt bro mellem den protoniserede deraf hans1 sidegruppe og C-Terminal carboxylat gruppe. Disse resultater tyder på, at ved en pH på 3,0 – 6,0, den vigtigste Amb2+ 3CU (i) kompleks er salt-bridged struktur, som kan med held overføres fra løsning til gas-fase med kun minimal strukturel omorganisering.

Den teoretiske LJ CCS på 209 ± 6 Å2, beregnet ved hjælp af Sigma-programmet36 for Complex 3C, aftalt med im-MS målt CCS, hvilket indikerer, at 3c repræsenterer [Amb2− 2H + 3CU (I)]+ kropsbygning ved pH 3.0-6.0. Men ved en pH-værdi på > 6 blev dette kompleks ikke observeret af im-MS, sandsynligvis fordi yderligere Deprotoneringsligevægten af hans1 (pKa= 6,0) resulterer i et overordnet neutralt kompleks. Når imidazoleum gruppen af hans1 er deprotoneret, 3CU (I) koordination kan konvertere til bridging oxygen grupper af cys2 og cys6 samt δn1 og δn5 af hans1 og hans5, henholdsvis (3a).

PH-afhængigheden af Amb4 cu (I/II)-bindings-og redox-aktivitet
IM-MS og B3LYP teknikker er blevet anvendt til at undersøge cu (II) og ph titreringer af Amb4 (figur 1C) og identificerede monomer, dimer, trimer, og transthyretin komplekser af Amb4 indeholdende op til tre cu (I) ioner eller to cu (II ) for hver monomer underenhed39. Komplekserne indeholdt også forskellige antal disulfid broer, og disse produkter blev produceret, uanset om cu (II) reaktionerne med Amb4 blev udført i anaerobe eller aerobe vandige opløsninger.

Ved hjælp af IM-MS-teknikken blev det påvist, at disse individuelle arter kunne adskilles og kvantificeres, selv om de havde overlappende isotop mønstre på grund af forskelle i deres ankomsttider (figur 4). Identifikationen og kvantificeringen af disse nært beslægtede arter er en opgave, som ingen anden instrumental eller analytisk teknik kan opnå. Disse im-MS-undersøgelser giver betydelig indsigt i de pH-afhængige redox-reaktioner og nøjagtigt identificerede antallet af Inter-eller intra-molekylære disulfid broer, antal cu (I) eller cu (II) ioner, og antallet af Deprotoneringsligevægten steder i hver af komplekser ( Figur 5).

Desuden tillod måling af komplekser CCS også bestemmelse af hver af de enkelte arter konformationsmæssige størrelse, som blev brugt med en omfattende B3LYP/LanL2DZ søgning for at finde konformatorer med strukturer, der er aftalt med både den korrekte molekylære støkiometri og CCS målt ved IM-MS. Gennem denne metode blev cu (I/II) koordination af de forskellige komplekser identificeret. Reaktionerne mellem cu (II) og Amb4 inkluderede dannelsen af dimere, trimers og tetramers, der samordner enten cu (I) eller cu (II), afhængigt af pH-værdien af opløsningen.

For eksempel, i opløsninger, der var mildt sure (pH = 3,0 – 6,0), de primært bundet cu (I) ioner og var uoxideret, mens i opløsninger, der var lidt grundlæggende (pH = 8.0 – 11.0), de primært bundet cu (II) ioner og blev oxideret af alle cys danner disulfid obligationer (figur 6). B3LYP/LanL2DZ fastslået, at cu (I)-ionerne var lineære og bridged af thiolat-og imidazolgrupperne, mens cu (II)-ionerne blev Chelateret via forvrængede T-formede eller firkantede planar geometrier af en imidazol samt de deprotonerede backbone-nitrogener af AMID grupper.

IM-MS analyse af MB-OB3b
IM-MS Studies19,40 af MB-OB3b (figur 1D) viste, at i gasfasen, cu (i)-fri MB-OB3b eksisterer som tre negativt ladede arter: [MB-OB3b – H], [MB-OB3b – 2H]2 –, og [MB-OB3b – 3h] 3 –, i overensstemmelse med forventet løsning-fase adfærd. Individuelle metal iontitreringer blev udført19 for at bestemme metalionselektiviteten for MB-OB3b. Figur 7 viser resultaterne af de udvalgte metal iontitreringer og viser, at den tilsyneladende bindende selektivitet for MB-OB3b kan kategoriseres som tre hovedgrupper: 1) cu (i) og AG (i); 2) ni (II), Zn (II) og Co (II); og 3) PB (II), fe (II) og MN (II). Denne rækkefølge af bindende selektivitet viste sig generelt at være i enighed med den, der blev fundet ved fluorescens dæmper-eksperimenter19 og isotermisk titrering hele kroppen vha18.

Sammenligning af MB-OB3b og Amb 7 metal bindings selektivitet
Den tilsyneladende bindende selektivitet for MB-OB3b blev sammenlignet med den bindende selektivitet af Amb7 ved en pH-værdi på 7. Amb7 blev designet med samme aminosyresekvens som MB-OB3b, men med de to enethiol oxazolone grupper erstattet med to hans-cys grupper. Amb7 (figur 1E) har et enkelt disulfid-bånd mellem cys6 og cys12. Resultaterne af dannelsen af negative ladede komplekser (figur 8) viste, at Amb7 foretrak bindende SELEKTIVITET for ni (II) og Zn (II) (60%), efterfulgt af Co (II) og PB (II) (40%). Desuden var der ca. 20% cu (II) binding. Der var enten spor eller ingen Amb7 binding af AG (I), MN (II), eller FE (II). Dette sammenlignet med MB-OB3b's foretrukne bindende selektivitet på over 90% for cu (I) og AG (I) binding.

Figure 1
Figur 1: primære strukturer for de alternative methanobactin (Amb) og methanobactin (MB-OB3b) peptider. (A) acetyl-hans1-cys2-Gly3-Pro4-hans5-cys6 (Amb1); (B) acetyl-hans1-cys2-tyr3-Pro4-hans5-cys6 (Amb2); (C) acetyl-hans1-cys2-Gly3-ser4-tyr5-Pro6-hans7-cys8-ser9 (Amb4); D) 1-(N-[mercapto-(5-oxo-2-(3-methylbutanoyl) oxazol-(Z) -4-ylidene) methyl]-Gly1– ser2– cys3– tyr4)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-[5-oxo-oxazol-(Z) -4-ylidene] methyl) – ser5 – Cys6– mødte7 (MB-OB3b); og (E) acetyl-leu1-hans2-cys3-Gly4-ser5-cys6-tyr7-Pro8-hans9-cys10-ser11-cys12-met 13 (Amb7). Skygger viser: 2His-2Cys eller enethiol-oxazolone bindingssteder (Icon); prolin-eller pyrrolidinhængsler (Icon); Acetyl-eller methylbutanol-gruppe N-Iconendestation (); og tyrosin, som kan stabilisere metal ionkoordineringen via en anden solsikke-Shell π-kationIconinteraktion (). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: gennemsnitlig relativ intensitet af den alternative methanobactin (Amb1) acetyl-hans1-cys2-Gly3-Pro 4-hans5-cys6 og metal-bundne kompleks (Amb1+X) (hvor X = cu eller Zn). Observationer blev foretaget under negative og positive ion massespektrometri analyser af 1:1 Molar ratio opløsning af Amb:XCL2 over pH-intervallet 3,0-11.0. Fejllinjer viser standardafvigelser for både den relative intensitet og pH fra tre replikate pH-titrerings eksperimenter. 1:1 molær opløsning af Amb: CuCl2 resulterede i oxidation af Amb (AmbOx) med cys2 og cys6, danner en disulfidbro. A) negativ ionanalyse af Amb: CuCl2 , der viser [AmbOx− H] og [AmbOx− 3h + cu (II)]. B) positiv ionanalyse af Amb: CuCl2 , der viser [AmbOx]+ og [AmbOx+ cu (I/II)]+; oxidations tilstanden for cu i komplekset var pH-afhængig, idet den var [AmbOx+ cu (I)]+;  under en pH-værdi på 8 og [AmbOx− H + cu (II)]+; over en pH-værdi på 8. C) negativ ionanalyse af Amb: zncl2 , der viser [Amb]n − og [Amb + Zn (II)]n −. D) positiv ionanalyse af Amb: zncl2 , der viser [Amb]n + og [Amb + Zn (II)]n +. Dette tal er blevet tilpasset fra en tidligere publikation20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: foreslåede strukturer af [Amb2+ 3CU (I)]+ ved hjælp af laveste energi og geometri-OPTIMEREDE strukturer placeret fra B3LYP/LanL2DZ niveau af teori. A) 3 cu (i) koordination via δn1δn5 af hans1 og hans5 og thiolat bridging oxygen grupper af cys2 og cys6 med et teoretisk tværsnit på 217 ± 6 Å2. B) illustration af δn1δn5 og thiolatkoordination. C) salt broget struktur, der viser 3 cu (I) koordination via carboxylatterminalen (cys6), δn5og thiolat bridging med et teoretisk tværsnit på 209 ± 6 Å2. D) illustration af carboxylat-terminalen, δn5og thiolatkoordinat koordination. Bindings afstanden A, B, C, D, E og F vises i enheden Å. Dette tal er blevet tilpasset fra en tidligere publikation37. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: IM-MS-analyse af produkter af 1:1 blandingen af Amb4: cu (II) ved pH = 4,4.  A) ekstraherede isotop mønstre for [Amb4− 2H + 3CU (I)]+[Diamb4− 4h + 6cu (i)]2 +, [triamb4− 6h + 9cu (i)]3 + og [tetraamb4− 8h + 12cu (i)]4 + arter. B) integrering af de udtrukne ankomsttider for [Amb4− 2H + 3CU (i)]+, [Diamb4− 4h + 6cu (i)]2 +, [triamb4− 6h + 9cu (i)]3 + og [tetraamb4− 8h + 12cu (i)]4 + blev anvendt til at beregne deres relative intensiteter. For at beregne procent relative intensiteter blev summationen af det integrerede areal for alle udtrukne arter for hvert titrerings punkt anvendt til at normalisere til procent skalaen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: skiftende isotop mønster for enkelt cu (I/II) bundet Amb4 observeret under ph-titrering af molær ækvivalenter af cu (II): Amb4 ved pH = 4,04, 6,02 og 9,98. Ved pH = 4,04 svarer det eksperimentelle resultat primært til isotop modellen for [Amb4+ cu (I)]+. Ved pH = 6,02 er der et skift på-2 m/z, hvilket betyder dannelsen af disulfidbroen (vist som oxidation af Amb4ox) og en aftale med isotop mønsteret for [Amb4ox+ cu (I)]+. Ved pH = 9,98 er der en yderligere forskydning på-1 m/z, hvilket betyder cu (II) binding og fjernelse af en proton for at opretholde + 1 opladningstilstanden, som derefter matcher isotop mønsteret for [Amb4ox− H + cu (II)]+. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: skiftende relative intensiteter af identiteter af cu (I/II) komplekser af monomer, dimer, og trimer af Amb4 over pH-intervallet 3,0-11.0.  (A) monomer med en cu (i/II) ion, (B) dimer med 2 cu (i/II) ioner, og (C) TRIMER med 3 cu (i/II) ioner. Billedteksterne note hvor mange disulfid obligationer var til stede i komplekset. Dette tal er blevet tilpasset fra en tidligere publikation39. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: procentdel af dannelsen af cu (i), AG (i), Zn (II), ni (II), Co (II), MN (II), PB (II) eller FE (II) komplekser af methanobactin. Observeret under de enkelte metal iontitreringer af methanobactin. Det skal bemærkes, at cu (I) binding skyldtes tilføjelsen af cu (II) og FE (II) bindende fra tilføjelsen af FE (III). Dette tal er blevet tilpasset fra en tidligere publikation19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: sammenligning af procentdelen af cu (i/II), AG (i), Zn (II), ni (II), Co (II), MN (II), PB (II) eller FE (II) Chelat med MB-OB3b og Amb7 ved pH = 7. Sammenligningen er for dannelsen af negativt ladede ioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary File
Supplerende fil. Brug af GaussView. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin: bevaring af løsnings fase adfærd til undersøgelse via ESI-IM-MS
Native ESI instrumentale indstillinger skal anvendes, der bevarer peptider støkiometri, opladningstilstand, og konformationsmæssige struktur. For de indfødte forhold skal forholdene i ESI-kilden, såsom kegle spændinger, temperaturer og gasstrømme, optimeres. Også presset og spændinger i kilden, fælde, Ion mobilitet, og overføre rejser bølger (især DC Trap bias, der styrer injektion spænding i IM-cellen) skal kontrolleres for deres påvirkninger på Charge-State og ion mobilitet distributioner.

Følgende er de typiske driftsbetingelser, der blev anvendt i dette arbejde. De vandige peptidprøver blev injiceret ved hjælp af en stump næse 1,0 mL sprøjte med en 10 μL min− 1 strømningshastighed, 2,0 kV kapillar spænding for positive ioner (+) eller − 1,8 kV for negative ioner (-), 130 °c kilde temperatur, 250 °c desolvation, 20 V prøvetagnings kegle og 4,0 V ekstraktions kegle. IM-sektionen blev opereret med 6,0 V indgangsspænding til fælde cellen med et argon Tryk på 2,25 x 10− 2 mbar ved hjælp af en 1,5 ml/min strømningshastighed. Spændingen for intravenøse ioner (Trap DC bias) i IM-cellen blev indstillet til 12 V for at undgå dissociation af ioner, da de oprindeligt kolliderede med nitrogen stødpude gassen. IM-celle separerede ioner baseret på deres ladning og kollisions tværsnit og udnyttede et 0,52 mbar nitrogentryk og 20,0 mL min− 1 strømningshastighed. IM blev opereret med ramped 12.0 – 20.0 V (+) eller 8.0 – 30.0 V (−) rejser bølgehøjder og ramped 800 – 1500 m s− 1 (+) eller 250 – 1000 m s− 1 (−) hastigheder for hver feje gennem cellen af im rejse bølge. Overførsels cellen blev opereret med det samme argon-tryk som diffuse Rings cellen og styrede IM-løste ioner til den ortogonale Time-of-Flight-analyse af masse til opladning. Ion Mobility-Mass Spectra blev erhvervet ved at synkronisere den gated frigivelse af ioner i IM-cellen med tidspunktet for flyvningen masse-til-ladning analysator.

Ved hjælp af oprindelige ESI-betingelser bevares løsnings fasens egenskaber, såsom opladningstilstand og konformationtilstand, under IM-MS-analyserne. For eksempel, de Charge stater MB-OB3b og Ambs observeret under im-MS analyser20,37 var tæt forbundet med de Charge stater forventes i løsnings fasen40. MB-OB3b peptid er tetraprotic og danner kun negativt ladede ioner under IM-MS analyse40, uanset om cu (i)-bundet eller cu (i)-fri, fordi det indeholder C-Terminus (pka < 1,7), to enethiol oxazolone grupper (pka = 5,0 og 9,7) og tyr-gruppen (pKa = 11,0)42. De Ambs i deres fuldt protonerede form vil have en samlet afgift på + 2 på grund af C-Terminus (pka ≈ 2), to hans (pka = 6,0), to cys (pka = 8,3), og tyr (pka = 11,0) sites19,41. Således danner de generelt positivt ladede ioner ved en pH-værdi på < 6 og negativt ladede ioner ved en pH-værdi på > 6.

De Ambs viste også klar pH-afhængig cu (I/II) bindende adfærd og redox aktivitet, hvor cu (I)-binding ved en lav pH overført til cu (II) binding ved en højere pH. Cu (I/II)-Reaktionerne inkluderede dannelse af de oxiderede Amb-arter (AmbOx), som indeholdt disulfid-bindinger og forskellige multimere og multiple cu (I/II)-binding (figur 5 og figur 6). Disse redox-reaktioner er tidsafhængige, og det blev påvist, at jo længere tidsintervallet (op til 210 min) mellem prøve præparatet og IM-MS-analyser de mere oxiderede produkter blev observeret37. Derfor er der også behov for omhyggelig overvejelse af reaktionstiden afhængighed af observation af produkter.

Begrænsninger: IM-MS og teoretiske kollisions tværsnit identificerer, hvilken type koordination hver metal ion foretrækker
For at hjælpe med at fortolke data fra IM-MS m/z og CCS blev en omfattende søgning gennemført ved hjælp af teorien om B3LYP/LanL2DZ niveau. Geometri-optimerede konformatorer med forskellige koordinations steder blev sammenlignet mellem deres forventede frie energi og aftale med CCS målt af IM-MS. Molekylær modellering af disse peptider og deres komplekser er begrænset af typen af elektronisk struktur beregninger, der kan anvendes på disse relativt store systemer. Andre metoder, der er blevet undersøgt eller anbefalet omfatter arbejde af Truhlar et al.43, der fandt, at M05-2x var den bedste DFT funktionelle og PM7 og mndo/d var gode nddo semi-empiriske metoder til Zn (II)-holdige forbindelser44. Disse peptider har et stort konformationelt rum og grundig undersøgelse for at finde de laveste energi konformatorer skal omfatte sammenligning af de forskellige metal chelaterende steder, forskellige CIS-og Trans-peptid obligationer, salt-broer, brint binding, og π-kation interaktion mellem den aromatiske tyr sidegruppe og metal kation.

Betydning i forhold til eksisterende metoder: cu (I/II) og andre udvalgte metal ion bindende sammenlignet mellem MB-OB3b og Ambs
X-ray krystallografi og NMR spectroskopi er de mest almindeligt anvendte teknikker til bestemmelse af den atomare opløsning af peptider tertiær struktur. Men, røntgen-krystallografi undersøgelser af metallopeptider er knappe på grund af problemer med krystalliseringen af disse komplekser45. NMR er heller ikke egnet til fortolkning af en prøve, hvor nært beslægtede individuelle oligopeptid arter er til stede46. Derfor er im-MS og DFT molekyl modellering alternative teknikker til at studere peptidreaktioner, især dem, der skyldes komplekse redox-og cu (I/II)-bindende reaktioner20,37,40, 47. styrken af im-MS er, at det kan løse hvert af produkterne og identificere deres molekylære sammensætning ved samtidig at måle deres m/z og ankomsttider, der vedrører støkiometri, protonation tilstand, og konformationsmæssige struktur.

For eksempel vil MB-OB3b Chelat en række metalioner, og dens selektivitet over for hver ion blev vist ved im-MS metal ion titreringer (figur 7). Resultaterne viste MB-OB3b præference for binding cu (I) og AG (I), mens sammenligne resultaterne ved en pH på 7 med Amb7. Figur 8 viser, at Amb7 fortrinsvis CHELATER Zn (II) og ni (II). Generelt viste Amb-undersøgelserne, at udskiftning af de to enethiol-oxazoloner med 2His-2Cys ikke udelukkede cu (I/II)-binding, men det resulterede i flere cu (I)-binding via lineær-bridging koordination (figur 3) i modsætning til mononukleære cu (I) binding af MB-OB3b's tetraeder koordination48. Cu (II) reduktion blev også medieret af thiol oxidation og disulfid brodannelse i modsætning til den eksisterende disulfidbro i APO-MB-OB3b og det høje reduktionspotentiale for kobber-loaded MB-OB3b, som understøtter den stærke præference for cu (I)49 .

Fremtidige ansøgninger
Yderligere IM-MS-undersøgelser af Amb peptider er i gang, hvor deres primære sekvens er modificeret ved at erstatte hans eller cys med Gly eller ASP, mens tyr rest er erstattet med enten Gly eller Phe. Disse undersøgelser udføres også i 10,0 mM ammonium acetat, med pH modificeret med ammoniumhydroxid (til pH = 7, 8 og 9) for at bevare den totale ionstyrke konstant for hver prøve. Disse resultater vil blive offentliggjort inden længe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under 1764436, NSF instrument Support (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014), og computing ressourcer fra Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) og L3 Communications . Vi takker Bower ' s gruppe af University of California-Santa Barbara for at dele Sigma-programmet og Ayobami Ilesanmi for at demonstrere teknikken i videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114, (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256, (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107, (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30, (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256, (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305, (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80, (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7, (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25, (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19, (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51, (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261, (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14, (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141, (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84, (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26, (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50, (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98, (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88, (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18, (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4, (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5, (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43, (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96, (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17, (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50, (4), 1378-1391 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics