Jon mobilitet-masspektrometri tekniker för att bestämma strukturen och mekanismerna för metall Jon igenkänning och redox aktivitet av metall bindning Oligopeptides

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Jon mobilitet-masspektrometri och molekylära modelleringstekniker kan karakterisera den selektiva metallkelaterande prestandan hos designade metallbindande peptider och den kopparbindande peptiden methanobactin. Utveckla nya klasser av metallkelerande peptider kommer att bidra till att leda till Therapeutics för sjukdomar som förknippas med metall Jon obalans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektrospray jonisering (ESI) kan överföra en vatten-fas peptid eller peptid komplex till gas-fas samtidigt bevara sin massa, total laddning, metall-bindande interaktioner, och kon Formations form. Koppling ESI med Jon mobilitet-masspektrometri (im-MS) ger en instrumentell teknik som möjliggör samtidig mätning av en peptid Mass-to-Charge (m/z) och kollision tvärsnitt (CCS) som relaterar till dess stökiometri, protonering tillstånd, och kon Formations form. Den totala laddningen av en peptid komplex styrs av protonationen av 1) peptidens sura och grundläggande platser och 2) oxidationstillståndet hos metall Jon (er). Därför, den totala laddningsstatus för ett komplex är en funktion av pH i lösningen som påverkar peptider metall jonbindning tillhörighet. För ESI-IM-MS-analyser bereds lösningar av peptid-och metalljoner från vattenlösningar med pH-värdet justerat med utspädd, vattenbaserad ättiksyra eller ammoniumhydroxid. Detta möjliggör pH beroende och metall Jon selektivitet fastställas för en specifik peptid. Dessutom kan m/z och CCS av en peptid komplex användas med B3LYP/LanL2DZ molekylär modellering för att urskilja bindningsställen av metall Jon koordination och tertiärstruktur av komplexet. Resultaten visar hur ESI-IM-MS kan karakterisera selektiv kelatbildningsprestanda för en uppsättning alternativa methanobactin peptider och jämföra dem med kopparbindande peptid methanobactin.

Introduction

Koppar och zink joner är viktiga för levande organismer och avgörande för processer inklusive oxidativ skydd, vävnad tillväxt, andning, kolesterol, glukosmetabolism, och genomläsning1. För att möjliggöra dessa funktioner, grupper som thiolate av CYS, Imidazol av hans2,3, (mer sällan) tioeterlänken av metionin, och karboxylat av GLU och ASP införliva selektivt metaller som kofaktorer i den aktiva platser av metalloenzymer. Likheten mellan dessa samordningsgrupper väcker en spännande fråga om hur hans och CYS ligander selektivt införliva antingen Cu (I/II) eller Zn (II) för att säkerställa korrekt funktion.

Selektiv bindning sker ofta genom förvärv och människohandel peptider, som kontrollerar Zn (II) eller Cu (I/II) jonkoncentrationer4. Cu (I/II) är mycket reaktiv och orsakar oxidativ skada eller oavsiktlig bindning till enzymer, så dess fria koncentration är tätt reglerad av koppar Chaperones och koppar reglerande proteiner som transporterar det säkert till olika platser i cellen och tätt kontrollera dess homeostas5,6. Störningar av kopparmetabolism eller homeostas är direkt inblandad i Menkes och Wilsons sjukdom7 samt cancer7 och neurala sjukdomar, såsom prionsjukdomar8 och Alzheimers sjukdom9.

Wilsons sjukdom är förknippad med ökade koppar nivåer i ögonen, levern och delar av hjärnan, där redoxreaktionerna av Cu (I/II) producerar reaktiva syreradikaler, orsakar hepatolentikulär och neurologiska degeneration. Befintliga kelering terapier är den lilla tiol aminosyran penicillamin och trietylenetetramine. Alternativt, den methanotrophic koppar-förvärv peptider methanobactin (MB)10,11 uppvisar terapeutisk potential på grund av deras hög bindning affinitet för Cu (I)12. När methanobactin (MB-OB3b) från Methylosinus trichosporium OB3b studerades i ett djurmodell av Wilsons sjukdom, koppar effektivt bort från levern och utsöndras genom galla13. In vitro-experiment bekräftade att MB-OB3b kunde kelat koppar från kopparmetallothionein som finns i levern Cytosol13. Laser ablation induktivt kopplade plasma masspektrometri Imaging tekniker har undersökt den rumsliga distributionen av koppar i Wilsons sjukdom leverprover14,15,16 och visade att MB-OB3b tar bort koppar med korta behandlingsperioder på endast 8 dagar17.

Den MB-OB3b kommer också att binda med andra metalljoner, inklusive AG (I), au (III), PB (II), mn (II), Co (II), Fe (II), ni (II), och Zn (II)18,19. Konkurrensen om den fysiologiska Cu (I) bindningsstället ställs ut av AG (I) eftersom den kan tränga undan Cu (I) från MB-OB3b-komplexet, med både AG (I) och ni (II) som också visar oåterkallelig bindning till MB som inte kan förskjutas av Cu (I)19. Nyligen har en rad alternativa methanobactin (amb) oligopeptider med 2his-2cys bindande motiv har studerats20,21, och deras Zn (II) och Cu (I/II) bindningsegenskaper kännetecknas. Deras primära aminosyresekvenser är likartade, och alla innehåller 2His-2Cys motiv, Pro och en Acetylerad N-Terminus. De skiljer sig främst från MB-OB3b eftersom 2His-2Cys motiv ersätter de två enethiol oxazolon bindningsställen av MB-OB3b.

Elektrospray jonisering tillsammans med Jon Mobility-masspektrometri (ESI-IM-MS) ger en kraftfull instrumentell teknik för att bestämma metallbindande egenskaper peptider eftersom det mäter deras massa-till-laddning (m/z) och kollision tvärsnitt (CCS) samtidigt som de bevara sin massa, laddning och kon Formations form från lösningsfasen. M/z och CCS relaterar till peptider stoichiometry, protonering State, och kon Formations form. Stökiometrin bestäms på grund av att identiteten och numret för varje beståndsdel som finns i arten är tydligt identifierade. Den totala laddningen av peptidkomplexet relaterar till protonationstillståndet för de sura och grundläggande platserna och oxidationstillståndet hos metall Jon (s). CCS ger information om den kon Formations form av peptid komplex eftersom den mäter den rotations genomsnittliga storleken som hänför sig till den tertiära strukturen av komplexet. Den totala laddningstillstånd av komplexet är också en funktion av pH och påverkar peptiden metall jonbindning tillhörighet eftersom deprotonerade grundläggande eller sura områden såsom karboxyl, hans, Cys och Tyr är också de potentiella bindningsställen för metall Jon. För analyserna bereds peptiden och metall Jon lösningen i vattenlösningar med pH-värdet justerat genom utspädd vatten ättiksyra eller ammoniumhydroxid. Detta gör det möjligt för pH beroende och metall Jon selektivitet fastställas för peptiden. Dessutom, m/z och CCS bestäms av ESI-im-MS kan användas med B3LYP/LanL2DZ molekylär modellering för att upptäcka vilken typ av metall Jon koordination och tertiärstruktur av komplexet. De resultat som visas i denna artikel avslöjar hur ESI-IM-MS kan karakterisera selektiv kelatbildningsprestanda för en uppsättning av amb peptider och jämföra dem med kopparbindande peptid MB-OB3b.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av reagenser

  1. Kultur methylosinus trichosporium OB3b, isolera Cu (I)-gratis MB-OB3b18,22,23, frys-torka provet och förvara vid-80 ° c fram till användning.
  2. Syntetisera amb peptider (> 98% renhet för amb1, amb2, amb4; > 70% renhet för amb7), frys-torka proverna, och förvara dem vid-80 ° c tills användning.
  3. Inköp > 98% renhetsgrad mangan (II) klorid, kobolt (II) klorid, nickle (II) klorid, koppar (II) klorid, koppar (II) nitrat, silver (I) nitrat, zink (II) klorid, järn (III) klorid och bly (II) klorid.
  4. Köpa Poly-DL-alanin polymerer som används som kalibranter för mätning av kollisionstvärsnitt av amb arter och HPLC-kvalitet eller högre ammoniumhydroxid, isättika, och acetonitril.

2. beredning av stamlösning

  1. Peptid stamlösning
    1. Väg exakt, med hjälp av minst tre signifikanta siffror, massan av 10,0 – 20,0 mg av MB-OB3b eller amb i en 1,7 mL injektionsflaska av plast.
      Anmärkning: den vägda massan bör ge antingen 12,5 mM eller 1,25 mM, beroende på peptidlösligheten, när 1,00 mL avjoniserat (DI) vatten tillsätts.
    2. Använd ett pipet och tillsätt 1,00 mL avjoniserat vatten (> 17,8 MΩ cm) till det vägda peptidprovet för att ge antingen 12,5 mM-eller 1,25 mM-lösningen. Placera locket ordentligt och blanda ordentligt med minst 20 inversioner.
    3. Med hjälp av en micropipet dispensera 50,0 μL alikvoter från peptid provet i individuellt märkta 1,5 mL injektionsflaskor och förvara dem vid-80 ° c tills de används.
  2. Metall Jon lagerlösningar
    1. Väg noggrant med minst tre signifikanta siffror, massan på 10,0 – 30,0 mg av metallklorid eller silvernitrat i en 1,7 mL injektionsflaska.
      Märk: den vägda massan skall ge 125 mM när 1,00 mL DI-vatten tillsätts.
    2. Tillsätt 1,00 mL DI-vatten till det vägda metall provet i 1,7 mL-flaskan för att ge lösningen på 125 mM. Placera locket ordentligt och blanda ordentligt med minst 20 inversioner.
  3. Ammoniumhydroxidlösningar: bered en 1,0 M ättiksyralösning genom att späda 57 μl av den 99,5-procenta ÄTTIKSYRALÖSNING med di-vatten till en slutlig volym på 1,00 ml. Bered en 1,0 M ammoniumhydroxidlösning genom att späda 90 μL av 21-procentig ammoniumhydroxidlösning med DI-vatten till en slutlig volym på 1,00 mL. Gör två successiva utspädningar av varje lösning genom att ta 100 μL av 1,0 M lösningar för att förbereda 0,10 M och 0,010 M ättiksyra och ammoniumhydroxidlösningar.
  4. Poly-dl-alanin stamlösning: Förbered Poly-dl-ALANIN (PA) genom att väga 1,0 mg PA och upplösning i 1,0 ml di vatten för att ge 1 000 ppm. Blanda noga. Använd en micropipet, fördela 50,0 μL alikvoter, och placera varje i en 1,7 mL injektionsflaska och förvara vid-80 ° c.

3 elektrospray-Jon mobilitet-masspektrometri analys

  1. Rengör ESI ingångs slangen och nål kapillär grundligt med ca 500 μL av 0,1 M isättika, 0,1 M ammoniumhydroxid, och slutligen DI vatten.
  2. Tina en 50,0 μL alikvot av 1 000 ppm PA-lagerlösningen och späd den med 450 μL DI-vatten för att ge en 100 ppm PA. Pipet 100,0 μL av denna lösning och späd den till 1,00 mL med 500 μL av DI-vatten och 500 μL acetonitril för att ge 10 ppm PA-lösning.
  3. Samla in de negativa och positiva Jon IM-MS Spectra av 10 ppm PA lösning för 10 min vardera med hjälp av Native ESI-IM-MS villkor som beskrivs i diskussionsavsnittet.
  4. Tina en 50,0 μL alikvot av den 12,5 mM eller 1,25 mM amb stamlösning och göra successiva utspädningar med DI vatten för att ge en slutlig koncentration av 0,125 mM amb. Blanda noggrant varje spädning.
  5. Pipet 100,0 μL av 125 mM metall Jon stamlösning, placera i en 1,7 mL injektionsflaska och späd till 1,00 mL med DI vatten för att ge 12,5 mM metall Jon. Upprepa med två successiva utspädningar för att ge en slutlig 0,125 mM metall jonkoncentration. Blanda noggrant varje spädning.
  6. Pipet 200,0 μL av 0,125 mM amb i en flaska med 1,7 mL, späd med 500 μL DI-vatten och blanda lösningen noggrant.
  7. Justera pH-värdet i provet till 3,0 genom att tillsätta 50 μL 1,0 M ättiksyralösning.
  8. Tillsätt 200,0 μL av 0,125 mM metall Jon till det pH-justerade provet. Tillsätt di vatten för att ge en slutlig volym på 1,00 ml av provet, blanda grundligt, och låt provet att jämvikt för 10 min vid RT.
  9. Med hjälp av en trubbig näsa spruta ta 500 μL av provet och samla in de negativa och positiva Jon ES-IM-MS Spectra för 5 min vardera. Använd de återstående 500 μL av provet för att registrera det slutliga pH-värdet med en kalibrerad mikroph-elektrod.
  10. Upprepa steg 3.6 – 3.9, medan du ändrar steg 3,7 för att justera pH till 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 eller 10,0 genom att lägga till nya volymer av 0,010 m, 0,10 M, eller 1,0 M ättiksyra-eller ammoniumhydroxidlösningar.
  11. Samla in de negativa och positiva Jon ESI-IM-MS Spectra av 10 ppm PA-lösning för 10 min vardera.

4. beredning av metalljontitrering av amb-prover

  1. Följ stegen som beskrivs i steg 3.1 – 3.5.
  2. Pipet 200,0 μL av 0,125 mM amb i en flaska med 1,7 mL, späd med 500,0 μL av DI-vatten och blanda lösningen noggrant.
  3. Justera pH-värdet i provet till pH = 9,0 genom att tillsätta 80 μL av lösningen på 0,010 M ammoniumhydroxid.
  4. Tillsätt 28 μl av 0,125 mm metall Jon lösning för att ge 0,14 molar motsvarigheter av metall Jon, tillsätt di vatten för att göra den slutliga volymen av provet 1,00 ml, blanda grundligt, och låt provet att jämvikt för 10 min vid RT.
  5. Med hjälp av en trubbig näsa spruta ta 500 μL av provet och samla in de negativa och positiva Jon ESI-IM-MS Spectra för 5 min vardera. Använd de återstående 500 μL av provet för att registrera det slutliga pH-värdet med en kalibrerad mikroph-elektrod.
  6. Upprepa steg 4.2 – 4.5, medan du ändrar steg 4,3 för att lägga till en lämplig volym på 0,125 mM metall Jon lösning för att ge antingen 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26 eller 1,40 molar motsvarigheter.
  7. Samla in de negativa och positiva Jon IM-MS Spectra av 10 ppm PA lösning för 10 min vardera.

5. analys av ESI-IM-MS pH-titreringsdata

  1. Från IM-MS Spectra identifiera vilka laddade arter av Ambs är närvarande genom att matcha dem till deras teoretiska m/z isotop mönster.
    1. Öppna MassLynx och klicka på kromatogram för att öppna fönstret kromatogram.
    2. Gå till Arkiv -menyn och Öppna för att hitta och öppna im-MS datafilen.
    3. Extrahera IM-MS spektrum genom att högerklicka och dra över kromatogrammet och släppa. Spektrum fönstret öppnas och visar IM-MS-spektrumet.
    4. Klicka på verktyg och isotop modelli fönstret spektrum. I fönstret isotop modellering anger du den molekylära formeln för amb-arten, markerar kryssrutan Visa laddad Ion och anger laddningsstatus. Klicka på OK.
    5. Upprepa för att identifiera alla arter i IM-MS spektrum och registrera deras m/z isotop sortiment.
  2. För varje amb-art, separera alla tillfälliga m/z-arter och extrahera deras ankomst tids fördelningar (ATD) med hjälp av deras m/z-isotopmönster för att identifiera dem.
    1. I MassLynx Klicka på Driftscope att öppna programmet. I DriftScope Klicka på Arkiv och Öppna för att hitta och öppna im-MS datafilen.
    2. Använd musen och Vänsterklicka för att zooma in på m/z isotop mönster av amb arter.
    3. Använd markeringsverktyget och vänster MUSKNAPP för att välja isotop mönstret. Klicka på knappen acceptera aktuell markering .
    4. För att separera någon tillfällighet m/z arter använda markeringsverktyget och vänster MUSKNAPP för att välja ATD tid i linje med isotop mönster av amb arter. Klicka på knappen acceptera aktuell markering .
    5. För att exportera ATD, gå till fil | Exportera till MassLynx, välj sedan Behåll drift tid och spara filen i lämplig mapp.
  3. Bestäm ATD-axelcentroid och integrera området under ATD-kurvan som ett mått på Art populationen.
    1. I fönstret kromatogram i MassLynx öppnar du den sparade exporterade filen. Klicka på process | Integrera från menyn. Kontrollera den ApexTrack Peak integration rutan och klicka på OK.
    2. Spela in axelcentroid ATD (ta) och det integrerade området som visas på kromatogramfönstret . Upprepa för alla sparade amb och PA IM-MS datafiler.
  4. Använd den integrerade ATD för alla extraherade amb arter av antingen positiva eller negativa joner vid varje titreringspunkt att normalisera till en relativ procentuell skala.
    1. Ange identiteter för amb arter och deras integrerade ATD vid varje pH i ett kalkylblad.
    2. För varje pH, Använd summan av de integrerade ATDs att normalisera enskilda amb: s ATD till en procentuell skala.
    3. Rita upp de procentuella intensiteterna för varje amb-Art kontra pH i ett diagram för att visa hur populationen av varje art varierar som en funktion av pH.

6. kollisionstvärsnitt

  1. Använda ett kalkylblad, omvandla CCSS (ω) av PA negativ25,26 och positiva27 joner mätt i he buffert gas28 till korrigerade CCS (ωc) med hjälp av ekvation 1 nedan, där: z = Jon laddning; e c = elektron laddning (1.602 × 10-19 c); m N 2 = massan av N2 -gas (da). och mIon = Jon massan. 29

Equation 1

  1. Omvandla den genomsnittliga ankomsttiden (tA) av PA-kalibranter och amb-arter till drifttider (tD) med hjälp av ekvation 2 nedan, där: c = den förstärkta intermittensfaktorn (1,41), och m/z är massan-till-laddning av peptid Jon.

Equation 2

  1. Plotta den PA kalibranter ' tD vs. deras Ωc. Sedan, med hjälp av en minsta kvadrat Regressions anpassning av ekvation 3 visas nedan, bestämma a ' och B värden, där: a ' är korrigeringen för temperatur, tryck, och elektriska fält parametrar; och B kompenserar för den olinjära effekten av IM-enheten.

Equation 3

  1. Med hjälp av dessa A ' och B värden och axelcentroid tD värdet från ATD av Ambs bestämma deras ωc med hjälp av ekvation 3 och deras ω med hjälp av ekvation 1. Denna metod ger CCSS för peptidarten med uppskattade absoluta fel på ca 2%25,26,27.

7. beräkningsmetoder

  1. Använda B3LYP/LanL2DZ nivå av teorin, bestående av becke 3-parameter hybrid funktionaler30 och Dunning basis uppsättning31 och elektron kärna potentialer32,33,34 för att lokalisera geometrisk-optimerade överensstämningar för alla möjliga typer av samordningsformer av observerade m/z amb-arter35.
    Anmärkning: information om hur du skapar och skicka beräkningar finns i GaussView användning i kompletterande fil.
  2. Jämför den förutspådda fria energin för var och en av dem och beräkna deras teoretiska CCSs med Jon-skalade Lennard-Jones (LJ) metod från Sigma-programmet36.
  3. Från den lägsta fria energi överensstämmar avgöra vilken conformer uppvisar LJ CCS som håller med IM-MS mätt CCS att identifiera tertiärstruktur och typ av samordning för de överensstämdare observeras i experimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metall bindning av amb1
IM-MS studie20 av amb1 (figur 1a) visade att både koppar och zink joner bundet till amb1 på ett pH-beroende sätt (figur 2). Men koppar och zink bundet till amb1 genom olika reaktionsmekanismer på olika samordnings platser. Till exempel, lägga Cu (II) till amb1 resulterade i oxidation av amb1 (amb1ox) av disulfid Bridge formation, och vid ett pH i > 6, [amb1OX− 3H + Cu (II)] ion (figur 2a) bildades. Detta indikerade att deprotonering av två imidazoliums, karboxylgruppen, och två ytterligare platser som var samordnande Cu (II).

Molekylär modellering av [amb1ox− 3H + Cu (II)] Jon med B3LYP/LanL2DZ fastställt det lägsta energi komplexet var Cu (II) som samordnades via Imidazol Δn av hans1 och deprotonerade nitrogener av stamnäts amidgrupperna CYS2 och GLY3. Under ett pH på 6 bildade dock Cu (II) till amb1 ett m/z-isotopmönster som endast kunde redovisas med Cu (i)-bindningen, som utgjorde [amb1ox+ Cu (i)]+ ion (figur 2B). Ett pH högre än 6 orsakade däremot att m/z -isotopmönstret minskade med 1 m/z, vilket motsvarade det positiva laddade [amb1ox− H + Cu (II)]+ Ion. Tillsats av Zn (II) oxiderar inte amb1, och Zn (II) bindning observerades vid ett pH på > 6, vilket i första hand utgjorde [amb1− 3H + Zn (II)] ion (figur 2C). Detta indikerade deprotonering av imidazoliums, tiol, och Karboxylgrupper. Molekylmodellering av [amb1− 3H + Zn (II)] Jon fastställde att de lägsta energi formarna skulle vara antingen tetraedriska Zn (II) koordination via 2his-2cys eller his-2cys och karboxylatet av C-Terminus.

Multipel Cu (I) bindning av amb2
Redoxreaktionerna mellan Cu (II) och amb2 (figur 1B) resulterade i Cu (i) bindning. Detta studerades mer i detalj med hjälp av IM-MS, UV-VIS spektrofotometri, och B3LYP Molecular Modeling37. De viktigaste produkterna av Cu (II) titrering av amb2 vid ett pH på 5 var amb2 oxidation (genom disulfid Bridge formation) och unoxiderade amb2 arter samordna tre Cu (I) joner.

En sökning med hjälp av B3LYP/LanL2DZ metod ligger två låg energi komplex som strider för 3Cu (I) samordnade arter. Den första var det komplex som visas i figur 3A, där 3cu (i)-joner samordnades via de överbryggande tiolatgrupperna38 CYS2 och CYS6 (av hans1) samt Δn1 och Δn5 (av hans5 ). Den andra komplex (3c) har en saltbro mellan protonerade hans1 sida grupp och C-Terminal karboxylate grupp. Dessa resultat tyder på att vid ett pH på 3,0 – 6,0, den huvudsakliga amb2+ 3cu (I) komplex är salt-bryggade struktur, som kan framgångsrikt överföras från lösning till gas-fas med endast minimal strukturell omordning.

Den teoretiska LJ CCS på 209 ± 6 Å2, beräknad med hjälp av Sigma-programmet36 för Complex 3c, överens med im-MS mätt CCS, vilket indikerar att 3c representerar [amb2− 2H + 3cu (I)]+ konformation vid pH 3.0-6.0. Men vid ett pH i > 6, detta komplex observerades inte av im-MS, förmodligen för att ytterligare deprotonering av hans1 (pKa= 6,0) resulterar i en övergripande neutral komplex. När imidazoleum-gruppen av hans1 är deprotonated, kan 3cu (I) samordning konvertera till de överbryggande thiolate grupperna av CYS2 och CYS6 samt Δn1 och Δn5 av hans1 och hans5, respektive (3a).

PH-beroende av amb4 Cu (I/II)-bindande och redox aktivitet
IM-MS och B3LYP tekniker har använts för att undersöka Cu (II) och pH titreringar av amb4 (figur 1C) och identifierade monomer, dimer, Trimer, och tetramer komplex av amb4 som innehåller upp till tre Cu (I) joner eller två Cu (II ) joner för varje monomersubenhet39. Komplexen innehöll också olika antal disulfid broar, och dessa produkter producerades oavsett om Cu (II) reaktioner med amb4 utfördes i anaeroba eller aeroba vattenlösningar.

Med hjälp av IM-MS-tekniken visades att dessa enskilda arter kunde separeras och kvantifieras även om de hade överlappande isotopmönster på grund av skillnader i deras ankomsttider (figur 4). Identifieringen och kvantifieringen av dessa närbesläktade arter är en uppgift som ingen annan instrumentell eller analytisk teknik kan åstadkomma. Dessa im-MS studier ger stor insikt i pH-beroende redoxreaktioner och exakt identifierade antalet Inter-eller intra-molekylära disulfid broar, antal Cu (I) eller Cu (II) joner, och antalet deprotonering platser i varje komplex ( Figur 5).

Dessutom, mätning av komplexen CCS tillät också bestämning av var och en av de enskilda arterna kon Formations storlek, som användes med en omfattande B3LYP/LanL2DZ sökning för att lokalisera överensstämdare med strukturer som överenskommits med både rätt molekyl stoichiometri och CCS mätt med IM-MS. Genom denna metod identifierades Cu (I/II) samordningen av de olika komplexen. Reaktionerna mellan Cu (II) och amb4 inkluderade bildandet av dimers, trimers och tetramer som koordinerar antingen Cu (I) eller Cu (II), beroende på lösningens pH.

Till exempel, i lösningar som var milt sura (pH = 3,0-6,0), de främst bundna Cu (I) joner och var ooxiderade, medan i lösningar som var något grundläggande (pH = 8,0 – 11,0), de främst bundna Cu (II) joner och var oxiderade av alla CYS bildar disulfid obligationer (diagram 6). Den B3LYP/LanL2DZ fastställt att Cu (i) joner var linjära och överbryggas av thiolate och Imidazol grupper, medan Cu (II) joner kelaterade via förvrängd T-formade eller kvadratiska plana geometrier av en Imidazol samt deprotonerade ryggraden nitrogener av Amid-grupper.

IM-MS analys av MB-OB3b
IM-MS Studies19,40 MB-OB3b (figur 1D) visade att i gas-fas, Cu (I)-gratis MB-OB3b existerar som tre negativt laddade arter: [MB-OB3b-H]-, [MB-OB3b-2H]2-, och [MB-OB3b-3H] 3 –i enlighet med förväntat lösnings fasbeteende. Enskilda metall Jon titreringar utfördes19 för att bestämma metall Jon selektivitet MB-OB3b. Figur 7 visar resultaten av de valda metalljontitreringar och visar att den skenbara bindnings selektiviteten hos MB-OB3b kan kategoriseras som tre huvudgrupper: 1) Cu (i) och AG (i); 2) ni II, Zn II och co II. och 3) PB (II), Fe (II) och mn (II). Denna ordning av bindande selektivitet visade sig vara i allmänt samförstånd med den som hittades genom fluorescenskylning experiment19 och isotermisk titrering calorimetri18.

Jämförelse av MB-OB3b och amb 7 metallbindande selektivitet
Den skenbara bindnings selektiviteten hos MB-OB3b jämfördes med den bindande selektiviteten hos amb7 vid ett pH på 7. Den amb7 var utformad med samma aminosyran sekvens som MB-OB3b, men med de två enethiol oxazolon grupper ersätts med två hans-CYS grupper. Den amb7 (figur 1E) har en enda disulfid bindning mellan CYS6 och CYS12. Resultaten av bildandet av negativa laddade komplex (figur 8) visade att amb7 föredrog bindande selektivitet för ni (II) och Zn (II) (60%), följt av Co (II) och PB (II) (40%). Dessutom fanns det ca 20% Cu (II) bindning. Det fanns antingen trace eller No amb7 bindning av AG (I), mn (II), eller FE (II). Detta jämfört med MB-OB3b's föredrog bindande selektivitet på över 90% för Cu (I) och AG (I) bindning.

Figure 1
Figur 1: primära strukturer för alternativa methanobactin (amb) och methanobactin (MB-OB3b) peptider. (A) acetyl-hans1-CYS2-GLY3-Pro4-hans5-CYS6 (amb1); (B) acetyl-hans1-CYS2-Tyr3-Pro4-hans5-CYS6 (amb2); (C) acetyl-hans1-CYS2-GLY3-ser4-Tyr5-Pro6-hans7-CYS8-ser9 (amb4); (D) 1-(N-[mercapto-(5-oxo-2-(3-metylbutanoyl) oxazol-(Z) -4-ylidene) metyl]-GLY1– ser2– CYS3– Tyr4)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-[5-oxo-oxazol-(Z) -4-ylidene] metyl) – ser5 – CYS6– met7 (MB-OB3b); och (E) acetyl-Leu1-hans2-CYS3-GLY4-ser5-CYS6-Tyr7-Pro8-hans9-CYS10-ser11-CYS12-met 13 (amb7). Skuggning visar: 2His-2Cys eller enethiol-oxazolon bindningsställen (Icon); prolin-eller pyrrolidingångjärnIcon(); acetyl eller methylbutanol grupp N-Terminus (Icon); och tyrosin, som kan stabilisera metall Jon koordination via en andra solvatbildningsreaktioner Shell π-cation interaktionIcon(). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: medel relativa intensiteter av alternativa methanobactin (amb1) acetyl-hans1-CYS2-GLY3-Pro4-hans5-CYS6 och metallbundna komplex (amb1+X) (där X = cu eller Zn). Observationer gjordes under negativa och positiva Jon masspektrometri analyser av 1:1 molar ratio lösning av amb:Xcl2 över pH-intervallet 3,0 – 11,0. Felstaplar visar standardavvikelser av medel för både relativ intensitet och pH från tre replikat pH-titreringsexperiment. Den 1:1 molar lösning av amb: CuCl2 resulterade i oxidation av amb (ambOX) med CYS2 och CYS6, bildar en disulfid bro. (A) negativ jonanalys av amb: cucl2 som visar [ambOX− H] och [ambOX− 3H + Cu (II)]. B) positiv jonanalys av amb: cucl2 som visar [ambOX]+ och [ambOX+ Cu (I/II)]+; oxidationstillståndet för cu i komplexet var pH-beroende, att vara [ambOX+ Cu (I)]+;  under ett pH på 8 och [ambOX− H + Cu (II)]+; över ett pH på 8. C) negativ jonanalys av amb: ZnCl2 som visar [amb]n − och [amb + Zn (II)]n −. D) positiv jonanalys av amb: ZnCl2 som visar [amb]n + och [amb + Zn (II)]n +. Denna siffra har anpassats från en tidigare publikation20. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: föreslagna strukturer för [amb2+ 3cu (I)]+ med hjälp av lägsta energi-och geometri-optimerade strukturer som ligger från B3LYP/LanL2DZ nivå av teori. A) 3 cu i) samordning via Δn1Δn5 av hans1 och hans5 -och tiolatöverbryggande tiolatgrupper av cys2 och CYS6 med ett teoretiskt tvärsnitt på 217 ± 6 Å2. Billustration av Δn1Δn5 och thiolate överbryggnings koordination. C) salt bryggad struktur som visar 3 Cu (I)-koordinationen via karboxylatterminalen (CYS6), Δn5och tiolatbryggning med ett teoretiskt tvärsnitt på 209 ± 6 Å2. Dillustration av karboxylatterminalen Δn5och tiolat överbryggnings koordination. Limnings avstånd A, B, C, D, E och F visas i enheten Å. Denna siffra har anpassats från en tidigare publikation37. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: IM-MS-analys av produkter av 1:1-blandningen av amb4: Cu (II) vid pH = 4,4.  (A) extraherade isotop mönster för [amb4− 2H + 3cu (i)]+, [Diamb4− 4h + 6cu (i)]2 +, [triamb4− 6H + 9cu (i)]3 + och [tetraamb4− 8h + 12cu (i)]4 + arter. (B) integrering av de extraherade ankomsttiderna för [amb4− 2H + 3cu (I)]+, [Diamb4− 4h + 6cu (i)]2 +, [triamb4− 6H + 9cu (I)]3 + och [tetraamb4− 8h + 12cu (i)]4 + användes för att beräkna deras relativa intensiteter. För att beräkna de procentuella relativa intensiteterna användes summeringen av det integrerade området för alla extraherade arter för varje titreringspunkt för att normalisera till procent skalan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: ändra isotopmönster för ensamma Cu (I/II) bundet amb4 observerades vid pH-titrering av molar ekvivalenter av Cu (II): amb4 vid pH = 4,04, 6,02 och 9,98. Vid pH = 4,04 matchar det experimentella resultatet främst isotopmodellen för [amb4+ Cu (I)]+. Vid pH = 6,02, det finns en förskjutning av-2 m/z, betecknar bildandet av disulfid Bridge (visas som oxidation av amb4ox) och avtal med isotopen mönstret för [amb4ox+ Cu (I)]+. Vid pH = 9,98, det finns en ytterligare förskjutning av-1 m/z, betecknar Cu (II) bindning och avlägsnande av en Proton att bibehålla + 1 laddningstillstånd, som sedan matchar isotopen mönstret för [amb4ox− H + Cu (II)]+. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: ändra relativa intensiteter av identiteter för Cu (I/II) komplexen av monomeren, dimer och Trimer av amb4 över pH-intervallet 3,0 – 11,0.  A) monomer med en Cu (i/II) Jon, (B) dimer med 2 Cu (i/II) joner, och (C) Trimer med 3 Cu (i/II) joner. Bildtexterna notera hur många disulfid obligationer var närvarande i komplexet. Denna siffra har anpassats från en tidigare publikation39. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: procentuell bildning av Cu (i), AG (i), Zn (II), ni (II), Co (II), mn (II), PB (II) eller FE (II)-komplex av metanobaktin. Observerades under de enskilda metalljontitrationerna av methanobactin. Det bör noteras att Cu (I) bindning berodde på tillsats av Cu (II) och FE (II) bindning från tillägg av FE (III). Denna siffra har anpassats från en tidigare publikation19. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: jämförelse av andelen Cu (i/II), AG (i), Zn (II), ni (II), Co (II), mn (II), PB (II) eller FE (II) kelering med MB-OB3b och amb7 vid pH = 7. Jämförelsen är för bildandet av negativt laddade joner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary File
Tilläggsfil. GaussView användning. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg: bevara lösnings fas beteenden för undersökning via ESI-IM-MS
Native ESI instrumentella inställningar måste användas som bevarar peptiderna stoichiometry, laddningstillstånd, och överensstämde struktur. För inhemska förhållanden måste villkoren i ESI-källan såsom kon spänningar, temperaturer och gasflöden optimeras. Också, trycket och spänningar i källan, fälla, Jon rörlighet, och överföra resande vågor (särskilt DC trap bias som styr insprutnings spänningen i IM-cell) måste kontrolleras för deras påverkan på laddning-stat och Jon rörlighet distributioner.

Följande är de typiska driftsförhållanden som användes i detta arbete. De vattenhaltiga peptidproverna injicerades med en trubbig näsa 1,0 mL-spruta med ett 10 μL min− 1 -flöde, 2,0 kv kapillärspänning för positiva joner (+) eller − 1,8 kv för negativa joner (-), 130 ° c käll temperatur, 250 ° c desolvation, 20 V provtagnings kon och 4,0 V utsugs kon. IM-sektionen drevs med 6,0 V ingångsspänning till trap-cellen med ett argon-tryck på 2,25 x 10− 2 mbar med en flödeshastighet på 1,5 ml/min. Spänningen för injicering av joner (trap DC bias) i IM-cellen var inställd på 12 V för att undvika dissociation av joner som de initialt kolliderade med kvävgasbuffert. IM-cellen separerade joner baserat på deras laddning och kollision tvärsnitt och utnyttjade en 0,52 mbar kväve tryck och 20,0 mL min− 1 flöde. IM drevs med ramped 12,0-20.0 V (+) eller 8.0-30,0 V (−) reser våghöjder och ramped 800-1500 m s− 1 (+) eller 250-1000 m s− 1 (−) hastigheter för varje Svep genom cellen i im resande våg. Överföringen cellen drevs med samma argon tryck som fällan cellen och guidade IM löst joner till ortogonala tid-of-Flight massa-till-Charge Analyzer. Jon Mobility-Mass Spectra förvärvades genom att synkronisera gated frisättning av joner i IM-cellen med tid-för-flygning massa-till-laddning Analyzer.

Med hjälp av interna ESI-villkor, lösnings fas egenskaper som laddningsstatus och kon Formations läge bevaras under IM-MS-analyser. Till exempel var laddnings tillstånden för MB-OB3b och Ambs observerade under im-MS-analyser20,37 nära relaterade till de avgifts tillstånd som förväntades i lösningsfasen40. Den MB-OB3b peptid är tetraprotic och bildar endast negativt laddade joner under IM-MS analys40, om Cu (i)-bunden eller Cu (i)-fri, eftersom den innehåller C-terminus (pka < 1,7), två enethiol oxazolon grupper (pka = 5,0 och 9,7), och Tyr Group (pKa = 11,0)42. De Ambs i sin fullt protonerade form kommer att ha en total laddning av 2 på grund av C-terminus (pka ≈ 2), två hans (pka = 6,0), två CYS (pka = 8,3), och Tyr (pka = 11,0) platser19,41. Sålunda bildar de i allmänhet positivt laddade joner vid ett pH på < 6 och negativt laddade joner vid ett pH i > 6.

De Ambs visade också tydliga pH-beroende Cu (I/II) bindande beteende och redox aktivitet där Cu (I)-bindning vid ett lågt pH övergår till Cu (II) bindning till ett högre pH. De Cu (I/II) reaktioner inkluderade bildar den oxiderade amb arter (ambOX) som innehöll disulfid obligationer och olika multimers och flera Cu (i/II) bindning (figur 5 och figur 6). Dessa redoxreaktioner är tidsberoende och det visades att ju längre tidsintervall (upp till 210 min) mellan provberedning och IM-MS analyser mer oxiderade produkter observerades37. Därför krävs också noggrann bedömning av reaktionstiden beroende av observation av produkter.

Begränsningar: IM-MS och teoretisk kollision tvärsnitt identifiera vilken typ av samordning varje metall Jon föredrar
För att tolka IM-MS m/z och CCS data, en omfattande sökning genomfördes med hjälp av B3LYP/LanL2DZ nivå av teori. Geometrisk-optimerade överensstämmandeapparater med olika koordinations platser jämfördes mellan deras förutspådda fria energi och avtal med CCS mätt med IM-MS. molekylmodellering av dessa peptider och deras komplex begränsas av den typ av elektronisk struktur beräkningar som kan tillämpas på dessa relativt stora system. Andra metoder som har studerats eller rekommenderas inkluderar arbete av Truhlar et al.43, som fann att m05-2x var den bästa DFT funktionella och PM7 och mndo/d var bra nddo semi-empiriska metoder för Zn (II)-innehållande föreningar44. Dessa peptider har en stor kon Formations utrymme och grundlig utredning för att lokalisera de lägsta energiöverensstämmen måste innefatta att jämföra de olika metallkelat platser, olika CIS-och trans-peptid obligationer, salt-broar, vätebindning, och π-cation interaktion mellan den aromatiska Tyr-sidogruppen och metall katjon.

Betydelse med avseende på befintliga metoder: Cu (I/II) och annan vald metall jonbindning jämfört mellan MB-OB3b och Ambs
Röntgenkristallografi och NMR-spektroskopi är de vanligaste teknikerna som används för att bestämma den atomära upplösningen av peptider tertiärstruktur. Men röntgenkristallografi studier av metallopeptides är knappa på grund av problem med kristallisation av dessa komplex45. NMR lämpar sig inte heller för tolkningen av ett prov där närbesläktade enskilda oligopeptidarter finns46. Därför är im-MS och DFT molekylär modellering alternativa tekniker för att studera peptidreaktioner, särskilt sådana som beror på komplexa redox och Cu (I/II)-bindande reaktioner20,37,40, 47. styrkan hos im-MS är att den kan lösa var och en av produkterna och identifiera deras molekylära sammansättning genom att samtidigt mäta deras m/z och ankomsttider som relaterar till stoichiometri, protonering tillstånd, och kon Formations struktur.

Till exempel kommer MB-OB3b kelat en mängd olika metalljoner, och dess selektivitet mot varje Jon visades av im-MS metall Jon titreringar (figur 7). Resultaten visade MB-OB3b preferens för bindning Cu (I) och AG (I), medan jämföra resultaten vid ett pH på 7 med amb7. Figur 8 visar amb7 företrädesvis KELATER Zn (II) och ni (II). I allmänhet, amb studier visade att ersätta de två enethiol-oxazolones med 2His-2Cys utesluter inte Cu (I/II)-bindning, men det resulterade i flera Cu (I)-bindande via linjär-bryggning samordning (figur 3) i motsats till mononukleära Cu (i) bindning av MB-OB3b's tetraedriska koordination48. Cu (II) reduktion medierades också av tiol oxidation och disulfid Bridge formation i motsats till den befintliga disulfid Bridge i APO-MB-OB3b och den höga reduktions potentialen för kopparbelastad MB-OB3b, som stöder den starka preferensen för Cu (I)49 .

Framtida tillämpningar
Ytterligare IM-MS studier av amb peptider pågår, där deras primära sekvens ändras genom att ersätta hans eller CYS med GLY eller ASP, medan Tyr återstoden ersätts med antingen GLY eller Phe. Dessa studier genomförs också i 10,0 mM ammoniumacetat, med pH modifierat med ammoniumhydroxid (för pH = 7, 8 och 9) för att hålla den totala Joniska hållfasthets konstanten för varje prov. Dessa resultat kommer att publiceras inom kort.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under 1764436, NSF instrument support (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014), och datorresurser från Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) och L3 Communications . Vi tackar Bower grupp University of California-Santa Barbara för att dela Sigma-programmet och Ayobami Ilesanmi för att demonstrera tekniken i videon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114, (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256, (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107, (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30, (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256, (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305, (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80, (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7, (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25, (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19, (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51, (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261, (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14, (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141, (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84, (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26, (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50, (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98, (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88, (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18, (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4, (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5, (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43, (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96, (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17, (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50, (4), 1378-1391 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics