Metal Bağlama Oligopeptidlerinin Yapısı ve Mekanizmalarının Belirlenmesinde Iyon Hareketliliği-Kütle Spektrometresi Teknikleri ve Metal Bağlayıcı Oligopeptidlerin Redoks Aktivitesi

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Iyon hareketlilik-kütle spektrometresi ve moleküler modelleme teknikleri, tasarlanmış metal bağlayıcı peptidlerin ve bakır bağlayıcı peptid metanobakinin seçici metal şelat performansını karakterize edebilir. Metal şelat peptidler yeni sınıflar geliştirilmesi metal iyon dengesizliği ile ilişkili hastalıklar için terapötik yol yardımcı olacaktır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektrosprey iyonizasyonu (ESI), kütlesini, genel yükünü, metal bağlayıcı etkileşimlerini ve konformasyonel şeklini muhafaza ederken bir sulu faz peptid veya peptit kompleksini gaz fazına aktarabilir. IYON hareket-kütle spektrometresi (IM-MS) ile kaplin ESI, bir peptitin kütle-şarj (m/z) ve çarpışma kesitinin (CCS) eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak tanıyan ve stokiyometrisi, protonasyon durumu ile ilgili enstrümental bir teknik sağlar. ve konformasyonel şekil. Bir peptit kompleksinin genel yükü 1) peptidin asidik ve bazik bölgeleri ve 2) metal iyonun oksidasyon durumu ile kontrol edilir. Bu nedenle, bir kompleksin genel yük durumu peptidler metal iyon bağlama afinitesini etkileyen çözeltinin pH fonksiyonudur. ESI-IM-MS analizleri için, peptit ve metal iyonları çözeltileri sadece sulu çözeltilerden hazırlanır ve pH seyreltik sulu asetik asit veya amonyum hidroksit ile ayarlanır. Bu, pH bağımlılığı ve metal iyon seçiciliğinin belirli bir peptid için belirlenmesini sağlar. Ayrıca, bir peptid kompleksinin m/z ve CCS'si B3LYP/LanL2DZ moleküler modelleme ile metal iyon koordinasyonu ve kompleksin üçüncül yapısının bağlayıcı bölgelerini ayırt etmek için kullanılabilir. Sonuçlar, ESI-IM-MS'in bir dizi alternatif metanobakin peptidin seçici şelatif performansını nasıl karakterize ettiğini ve bakır bağlayıcı peptid metanobakin ile karşılaştırabileceğini göstermektedir.

Introduction

Bakır ve çinko iyonları canlı organizmalar için gereklidir ve oksidatif koruma, doku büyümesi, solunum, kolesterol, glikoz metabolizması ve genom okuma1dahil olmak üzere süreçler için çok önemlidir. Bu işlevleri etkinleştirmek için, Cys thiolate gibi gruplar, Onun imidazol, Onun2,3,(daha nadiren) metiyonin tiyoteter, ve Glu ve Asp karboksiat seçici aktif sitelere kofaktör olarak metaller dahil metalloenzimler. Bu koordinasyon gruplarının benzerliği, His ve Cys ligandlarının doğru işleyişi sağlamak için Cu(I/II) veya Zn(II) ile nasıl seçici olarak birleştirirler konusunda ilginç bir soru doğurmaktadır.

Seçici bağlama genellikle Zn(II) veya Cu(I/II) iyonkonsantrasyonlarınıkontrol eden peptidlerin elde edilmesi ve ticareti ile gerçekleştirilir 4. Cu(I/II) son derece reaktiftir ve enzimlere oksidatif hasara veya adventif bağlanmaya neden olur, bu nedenle serbest konsantrasyonu bakır şaperonlar ve bakır düzenleyici proteinler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir ve onu hücredeki çeşitli yerlere güvenli bir şekilde taşır ve sıkıca homeostaz isikontrol 5,6. Bakır metabolizması veya homeostaz bozulması doğrudan Menkes ve Wilson hastalığı7 yanı sıra kanserler7 ve nöral bozukluklar, prion8 ve Alzheimerhastalığı9 gibi karıştığı 9 .

Wilson hastalığı gözlerde artan bakır düzeyleri ile ilişkilidir, karaciğer ve beynin bölümleri, Cu redoks reaksiyonları reaktif oksijen türleri üretir nerede(I/II) reaktif oksijen türleri üretir, hepatolentiküler ve nörolojik dejenerasyona neden. Mevcut şelasyon tedavileri küçük tiyol amino asit penicillamine ve triethylenetetramine vardır. Alternatif olarak, metanotrofik bakır edinimi peptidler methanobactin (mb)10,11 cu (I)12için yüksek bağlayıcı yakınlık nedeniyle tedavi potansiyeli sergiler. Methylosinus trichosporium OB3b gelen metanobactin (mb-OB3b) Wilson hastalığının bir hayvan modeli nde incelendiğinde, bakır verimli karaciğer den çıkarıldı ve safra13ile atılır . In vitro deneyler mb-OB3b karaciğer sitosol bulunan bakır metallothionein bakır chelate olabileceğini doğruladı13. Lazer ablasyon endüktif plazma kütle spektrometresi görüntüleme teknikleri Wilson hastalığı karaciğer örneklerinde bakır mekansal dağılımı araştırılmış14,15,16 ve mb-OB3b gösterdi bakırı sadece 8 gün17kısa tedavi süreleri ile temizler.

Mb-OB3b ayrıca Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) ve Zn(II)18,19gibi diğer metal iyonlarıyla da bağlanacaktır. Fizyolojik Cu(I) bağlama alanı için rekabet Ag(I) tarafından sergilenmektedir, çünkü cu(I) mb-OB3b kompleksinden yerinden edebilir, hem Ag(I) hem de Ni(II) aynı zamanda Cu(I)19tarafından yerinden edilemeyen Mb'ye geri dönüşü olmayan bir bağlanma gösterir. Son zamanlarda, 2His-2Cys bağlayıcı motifi ile alternatif metanobactin (amb) oligopeptidler bir dizi incelenmiştir20,21, ve onların Zn(II) ve Cu (I/II) karakterize bağlama özellikleri. Birincil amino asit dizileri benzerdir ve hepsi 2His-2Cys motifi, Pro ve asetillenmiş N-terminus içerir. 2His-2Cys motifi mb-OB3b'nin iki enethiol oxazolone bağlama yerinin yerini aldığı için esas olarak mb-OB3b'den farklıdırlar.

Elektrosprey iyonizasyoniyoniyonizasyon iyon hareketlilik-kütle spektrometresi (ESI-IM-MS) ile birleştiğinde peptidlerin metal bağlayıcı özelliklerini belirlemek için güçlü bir araçtekniği sağlar, çünkü kütle-yük(m/z) ve çarpışmayı ölçer. çözelti fazından kütle, yük ve konformasyonel şekillerini muhafaza ederken kesit (CCS). m/z ve CCS peptidler stokiyometri, protonasyon durumu ve konformasyonel şekil ile ilgilidir. Stokiyometri, türde bulunan her elementin kimliği ve sayısı açıkça belirlendiği için belirlenir. Peptit kompleksinin genel yükü asidik ve bazik alanların protonlanma durumu ve metal iyonun oksidasyon durumu ile ilgilidir. CCS, kompleksin üçüncül yapısıyla ilgili dönme ortalama boyutunu ölçtebildiği için peptit kompleksinin konformasyonel şekli hakkında bilgi verir. Kompleksin genel yük durumu da pH bir fonksiyonudur ve karboksil gibi deprotonated temel veya asidik siteler, His, Cys ve Tyr da metal iyon için potansiyel bağlayıcı siteleri olduğu için peptid metal iyon bağlayıcı afinite etkiler. Analizler için, peptit ve metal iyon seyreltik sulu asetik asit veya amonyum hidroksit tarafından ayarlanmış pH ile sulu çözeltiler halinde hazırlanır. Bu, peptid için pH bağımlılığının ve metal iyon seçiciliğinin belirlenmesini sağlar. Ayrıca, ESI-IM-MS tarafından belirlenen m/z ve CCS, kompleksin metal iyon koordinasyonu ve üçüncül yapısını keşfetmek için B3LYP/LanL2DZ moleküler modelleme ile kullanılabilir. Bu makalede gösterilen sonuçlar, ESI-IM-MS'in bir dizi bir set peptidin seçici şelat performansını nasıl karakterize ettiğini ve bunları bakır bağlayıcı peptid mb-OB3b ile nasıl karşılaştırabileceğini ortaya koymaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reaktiflerin hazırlanması

  1. Kültür Methylosinus trichosporium OB3b, Cu(I)-free mb-OB3b18,22,23,dondurma-kuru örnek ve kullanılabilir hale gelene kadar -80 °C'de saklayın.
  2. Amb peptidleri sentezleyin (>amb1için %98 saflık , amb2, amb4; >amb 7 için%70saflık), numuneleri dondurup kurutun ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
  3. Satın alma >98% saflık manganez(II) klorür, kobalt(II) klorür, nile(II) klorür, bakır(II) klorür, bakır(II) nitrat, gümüş(I) nitrat, çinko(II) klorür, demir(III) klorür ve kurşun(II) klorür.
  4. Amb türlerinin çarpışma kesitlerini ve HPLC sınıfı veya daha yüksek amonyum hidroksit, buzul asetik asit ve asetonititin çarpışma kesitlerini ölçmek için kalibran olarak kullanılan poli-DL-alanin polimerleri satın alın.

2. Stok çözeltisinin hazırlanması

  1. Peptit stok çözeltisi
    1. Doğru tartmak, en az üç önemli rakamlar kullanarak, 10.0-20.0 mb-OB3b veya amb kütlesi 1.7 mL plastik şişe.
      NOT: Tartılmış kütle, 1,00 mL deiyonize (DI) su eklendiğinde, peptitin çözünürlüğe bağlı olarak 12,5 mM veya 1,25 mM verim vermelidir.
    2. Bir pipet kullanarak, tartılmış peptid numunesine 12,5 mM veya 1,25 mM çözeltisi vermek için 1,00 mL deiyonize su (>17,8 MΩ cm) ekleyin. Kapağı güvenli bir şekilde yerleştirin ve en az 20 ters çevirmeyle iyice karıştırın.
    3. Bir mikropipet kullanarak 50.0 μL aliquots peptit örnek ten ayrı etiketli 1.5 mL şişeler içine aliquots ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
  2. Metal iyon stok çözümleri
    1. Doğru tartmak, en az üç önemli rakamlar kullanarak, 1.7 mL şişe metal klorür veya gümüş nitrat 10.0-30.0 mg kütlesi.
      NOT: 1.00 mL DI su eklendiğinde tartılmış kütle 125 mM olmalıdır.
    2. 125 mM çözeltiyi verim vermek için 1,7 mL şişedeki tartılmış metal numuneye 1,00 mL DI su ekleyin. Kapağı güvenli bir şekilde yerleştirin ve en az 20 ters çevirmeyle iyice karıştırın.
  3. Amonyum hidroksit stok çözeltileri: DI suyu ile %99,5 asetik asit çözeltisinin 57 μL'sini 1,00 mL'lik son hacmine seyrelterek 1,0 M asetik asit çözeltisi hazırlayın. %21 amonyum hidroksit çözeltisinin 90 μL'sini DI suyuyla 1,00 mL'lik son hacmine seyrelterek 1,0 M amonyum hidroksit çözeltisi hazırlayın. 0,10 M ve 0,010 M asetik asit ve amonyum hidroksit çözeltisi hazırlamak için 1,0 M çözelti100 μL alarak her çözeltinin art arda iki seyreltme yapın.
  4. Poli-DL-alanin stok çözeltisi:1.0 0 mg PA tartılarak ve 1.0 mL DI suda eriterek 1.000 ppm vermek için poli-DL-alanin (PA) hazırlayın. Iyice karıştırın. Bir mikropipet kullanarak, 50,0 μL aliquots dağıtın ve her biri 1,7 mL şişe içine yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.

3. Elektrosprey-iyon hareketlilik-kütle spektrometresi analizi

  1. ESI giriş tüplerini ve iğne kılcal damarını yaklaşık 500 μL 0,1 M buzul asetik asit, 0,1 M amonyum hidroksit ve son olarak DA suyu ile iyice temizleyin.
  2. 1.000 ppm PA stok çözeltisinin 50.0 μL aliquot'unu eritin ve 100 ppm PA vermek için 450 μL DI su ile seyreltin. Bu çözeltinin 100,0 μL'lik pipet'i ve 10 ppm PA çözeltisi vermek için 500 μL DI su ve 500 μL asetonitril ile 1,00 mL'ye seyreltin.
  3. Tartışma bölümünde açıklandığı gibi yerel ESI-IM-MS koşullarını kullanarak her biri 10 dk için 10 ppm PA çözeltisinin negatif ve pozitif iyon IM-MS spektrumlarını toplayın.
  4. 12,5 mM veya 1,25 mM amb stok çözeltisinin 50,0 μL'lik bir aliquot'u eritin ve 0,125 mM amb'lik son konsantrasyonu vermek için DI suyu yla art arda seyreltmeler yapın. Her seyreltme iyice karıştırın.
  5. Pipet 100.0 μL 125 mM metal iyon stok çözeltisi, 1.7 mL şişe yerleştirin ve 12.5 mM metal iyon vermek için DI su ile 1.00 mL seyreltmek. Son 0,125 mM metal iyon konsantrasyonu vermek için art arda iki seyreltme ile tekrarlayın. Her seyreltme iyice karıştırın.
  6. Pipet 200.0 μL 0.125 mM amb içine 1.7 mL şişe içine, 500 μL DI su ile seyreltin ve iyice çözeltikarıştırın.
  7. 1,0 M asetik asit çözeltisi 50 μL ekleyerek numunenin pH'ını 3,0'a ayarlayın.
  8. PH ayarlı numuneye 0,125 mM metal iyonun 200,0 μL'sini ekleyin. Numunenin 1,00 mL'lik son hacmini elde etmek için DI suyu ekleyin, iyice karıştırın ve numunenin RT'de 10 dakika boyunca dengelemesine izin verin.
  9. Künt bir burun şırıngası kullanarak numunenin 500 μL'sini alın ve negatif ve pozitif iyon ES-IM-MS spektrumlarını her biri 5 dakika için toplayın. Kalibre edilmiş mikro pH elektrotunu kullanarak son pH'ını kaydetmek için numunenin kalan 500 μL'sini kullanın.
  10. PH'ı 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 veya 10.0 olarak ayarlamak için 3.6-3.9 adımlarını değiştirirken, 0,010 M, 0,10 M veya 1,0 M asetik asit veya amonyum hidroksit çözeltilerinin yeni hacimlerini ekleyerek tekrarlayın.
  11. Her biri 10 dakika boyunca 10 ppm PA çözeltisinin negatif ve pozitif iyon ESI-IM-MS spektrumlarını toplayın.

4. amb numunelerinin metal iyon titrasyonunun hazırlanması

  1. 3.1-3.5 adımlarında açıklanan adımları izleyin.
  2. Pipet 200.0 μL 0.125 mM amb içine 1.7 mL şişe içine, 500.0 μL DI su ile seyreltin ve iyice çözeltikarıştırın.
  3. 0,010 M amonyum hidroksit çözeltisinin 80 μL'sini ekleyerek numunenin pH =9,0'ı ayarlayın.
  4. Metal iyonunun 0,14 molar eşdeğeri vermek için 0,125 mM metal iyon çözeltisinin 28 μL'sini ekleyin, numunenin son hacmini 1,00 mL yapmak için DI su ekleyin, iyice karıştırın ve numunenin RT'de 10 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin.
  5. Künt bir burun şırıngası kullanarak numunenin 500 μL'sini alın ve negatif ve pozitif iyon ESI-IM-MS spektrumlarını her biri 5 dakika için toplayın. Kalibre edilmiş mikro pH elektrotunu kullanarak son pH'ını kaydetmek için numunenin kalan 500 μL'sini kullanın.
  6. 0.28, 0.42, 0.56, 0.70, 0.84, 0.98, 1.12, 1.26 veya 1.40 molar eşdeğerleri vermek için 0.125 mM metal iyon çözeltisinin uygun hacmini eklemek için adım 4.3'ü değiştirirken 4.2-4.5 adımLarını tekrarlayın.
  7. Her biri 10 dakika boyunca 10 ppm PA çözeltisinin negatif ve pozitif iyon IM-MS spektrumlarını toplayın.

5. ESI-IM-MS pH titrasyon verilerinin analizi

  1. IM-MS spektrumlarından hangi yüklü ambs türlerinin teorik m/z izotop desenleriyle eşleştirilerek mevcut olduğunu belirleyin.
    1. MassLynx'i açın ve Kromatogram penceresini açmak için Kromatogram'a tıklayın.
    2. IM-MS veri dosyasını bulmak ve açmak için Dosya menüsüne gidin ve Açın.
    3. Kromatogramı sağ tıklayıp sürükleyerek ve serbest bırakarak IM-MS spektrumu ayıklayın. Spektrum penceresi IM-MS spektrumu gösteren açılacaktır.
    4. Spektrum penceresinde, Araçlar ve Izotop modelinetıklayın. Izotop modelleme penceresinde, amb türünün moleküler formülünü girin, Yüklü iyon kutusunu Göster'i işaretleyin ve şarj durumunu girin. Tamam'ıtıklatın.
    5. IM-MS spektrumundaki tüm türleri tanımlamak ve m/z izotop aralıklarını kaydetmek için tekrarlayın.
  2. Her amb türü için, herhangi bir rastlantısal m/z türünü ayırın ve varış zamanı dağılımlarını (ATD) onları tanımlamak için m/z izotop desenlerini kullanarak ayıklayın.
    1. MassLynx'te programı açmak için DriftScope'a tıklayın. DriftScope'ta IM-MS veri dosyasını bulup açmak için Dosya ve Aç'ı tıklatın.
    2. Fareyi ve sol tıklatmayı kullanarak amb türünün m/z izotop desenini yakınlaştırın.
    3. Izotop deseni seçmek için Seçim aracını ve sol fare düğmesini kullanın. Geçerli seçimi kabul et düğmesini tıklatın.
    4. Herhangi bir rastlantısal m/z türünü ayırmak için seçim aracını ve sol fare düğmesini kullanarak amb türünün izotop deseniyle hizalanmış ATD zamanını seçin. Geçerli seçimi kabul et düğmesini tıklatın.
    5. ATD'yi dışa aktarmak için Dosyaya gidin | MassLynx'e dışa aktarın,ardından Drift Süresini Koru'u seçin ve dosyayı uygun klasöre kaydedin.
  3. ATD'nin merkezotosini belirleyin ve türün popülasyonunun bir ölçüsü olarak ATD eğrisi altındaki alanı entegre edin.
    1. MassLynx'in Kromatogram penceresinde kaydedilen dışa aktarılan dosyayı açın. İşlem e tıklayın | Menüden tümleştirin. ApexTrack Peak Tümleştirme kutusunu işaretleyin ve Tamam'ıtıklatın.
    2. Sentroid ATD 'yi (tA)ve kromatogram penceresinde gösterildiği gibi entegre alanı kaydedin. Kaydedilen tüm amb ve PA IM-MS veri dosyaları için tekrarlayın.
  4. Göreceli bir yüzde ölçeğine normalleştirmek için her titrasyon noktasındaki pozitif veya negatif iyonların tüm çıkarılan amb türleri için entegre ATD'yi kullanın.
    1. Amb türlerinin kimliklerini ve bunların tümleşik ATD'lerini her pH'ındaki kimliklerini bir elektronik tabloya girin.
    2. Her pH için, tek tek amb'nin ATD'sini yüzde ölçeğine normalleştirmek için tümleşik ATD'lerin toplamını kullanın.
    3. Her amb türün pH'a karşı yüzde lik yoğunluklarını bir grafikte çizin ve her türün popülasyonunun pH'ın bir fonksiyonu olarak nasıl değiştiğini gösterin.

6. Çarpışma kesitleri

  1. Bir elektronik tablo kullanarak, PA negatif25,26 ve pozitif27 iyonları CCSs (Ω) o tampon gaz28 ölçülen ccss (Ωc)aşağıdaki Denklem 1 kullanarak düzeltilmiş CCS , nerede dönüştürün: z = iyon yükü; e c = elektron yükü (1.602×10-19 C); m N 2 = N2 gazının kütlesi (Da); ve miyon = iyon kütlesi. 29.000

Equation 1

  1. Aşağıdaki Denklem 2'yi kullanarak PA kalibranlarının ve amb türlerinin ortalama varış sürelerini (tA)drift sürelerine (tD)dönüştürün: c = gelişmiş görev döngüsü gecikme katsayısı (1,41) ve m/z peptit iyonunun kütle-şarjıdır.

Equation 2

  1. Plan PA calibrants 'tD vs onların Ωc. Daha sonra, aşağıda gösterilen Denklem 3'ün en az karereyon uyumunu kullanarak, A' ve B değerlerini belirleyin: A' sıcaklık, basınç ve elektrik alanı parametreleri için düzeltmedir; ve B, IM aygıtının doğrusal olmayan etkisini telafi eder.

Equation 3

  1. Bu A' ve B değerlerini ve ambs ATD'den gelen merkezroid tD değerini kullanarak Denklem 3'ü kullanarak Ω c'lerini ve Denklem 1'ikullanarak Ωc'lerini belirlerler. Bu yöntemyaklaşık%2,26,27tahmini mutlak hataları ile peptit türleri için CCSs sağlar.

7. Hesaplama yöntemleri

  1. Becke 3-parametre hibrid fonksiyoneller oluşan teori B3LYP/ LanL2DZ düzeyini kullanın30 ve Dunning temelseti31 ve elektron çekirdek potansiyelleri32,33,34 bulmak için gözlemlenen m/z amb türlerinin tüm olası koordinasyon türleri için geometri için optimize edilmiş konfüçücüler35.
    NOT: Hesaplamaların nasıl oluşturup gönderilen ayrıntılar için Ek Dosya'dakiGaussView kullanımına bakın.
  2. Her bir konformosun öngörülen serbest enerjisini karşılaştırın ve Sigma programı36'dakiiyon ölçekli Lennard-Jones (LJ) yöntemini kullanarak teorik CCS'lerini hesaplayın.
  3. En düşük serbest enerji konforperlerinden, deneyde gözlenen conformrler için üçüncül yapıyı ve koordinasyon türünü belirlemek için IM-MS ölçülen CCS ile aynı fikirde olan LJ CCS'yi hangi konformasyoncuya sergiler belirleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

amb1 metal bağlama
Amb1'in 20 IM-MS çalışması(Şekil 1A)hem bakır hem de çinko iyonlarının pH'ya bağlı bir şekilde amb1'e bağlı olduğunu göstermiştir(Şekil 2). Ancak bakır ve çinko farklı koordinasyon bölgelerinde farklı reaksiyon mekanizmaları ile amb1'e bağlanır. Örneğin, Cu(II) amb1'e eklenmesi disülfit köprü oluşumu ile amb1 (amb1ox)oksidasyonu ile sonuçlandı ve >6'nın pH'ında [amb1ox−3H+Cu(II)] iyon (Şekil 2A) oluşturuldu. Bu iki imidazolyum, karboksil grubu ve Cu(II) koordine edildi iki ek sitelerin deprotonation gösterdi.

[amb1ox−3H+Cu(II)] B3LYP/LanL2DZ kullanılarak yapılan iyonun moleküler modellemesi, en düşük enerji kompleksinin Cu(II) olduğunu ve Omurga daki amid gruplarının Cys 2'nin deprotonasyonlu azotları ile koordine edildiğini belirledi. ve Gly3. Ancak, 6 pH'ın altında, amb1'e Cu(II) ekleyerek, sadece Cu(I) bağlanması yla hesaplanabilecek bir m/z izotop deseni oluşturarak [amb1ox+Cu(I)]+ iyon(Şekil 2B)oluşturur. Buna karşılık, 6'dan yüksek bir pH m/z izotop deseninin 1 m/z azalmasına neden oldu ve pozitif yüklü [amb1ox−H+Cu(II)]+ iyon tarafından hesaplandı. Zn(II) eklemek amb1'ioksitlemedi ve Zn(II) bağlaması >6 pH'ında gözlendi ve öncelikle [amb1−3H+Zn(II)] iyon (Şekil 2C)oluşturdu. Bu imidazolyumlar deprotonation gösterdi, tiyol, ve karboksil grupları. [amb1−3H+Zn(II)] iyonun moleküler modellemesi, en düşük enerji konforperlerinin 2His-2Cys veya His-2Cys ve C terminus'un karboksite ile dört yüzlü Zn(II) koordinasyonu olarak belirlendi.

Amb2'nin çoklu Cu(I) bağlaması
Cu(II) ve amb2 (Şekil 1B)arasındaki redoks reaksiyonları Cu(I) bağlanmasıile sonuçlandı. Bu im-MS, UV-Vis spektrofotometri ve B3LYP moleküler modelleme37kullanılarak daha ayrıntılı olarak çalışılmıştır. 5'li bir pH'da amb2'nin Cu(II) titrasyonunun ana ürünleri amb2 oksidasyonu (disülfür köprü oluşumu yoluyla) ve üç Cu(I) iyonunu koordine eden oksidasyonsuz amb2 türüdür.

B3LYP/LanL2DZ yöntemi kullanılarak yapılan bir aramada, 3Cu(I) eşgüdümlü türler için mücadele eden iki düşük enerji kompleksi tespit edildi. Bunlardan ilki Şekil 3A'dagösterilen komplekstir, 3Cu(I) iyonları38 Cys2 ve Cys 6 (O'nun1)'ininköprüleme tiyolojit grupları ile koordine edildi. ). İkinci kompleks (3c) protonlanmış His1 yan grubu ile C-terminal karboksilasyon grubu arasında bir tuz köprüsüne sahiptir. Bu sonuçlar, pH'ın 3.0-6.0'da, ana amb2+3Cu(I) kompleksinin, çözeltiden gaz fazına, ancak en az yapısal yeniden düzenleme ile başarıyla aktarılabilen tuz köprülü yapı olduğunu göstermektedir.

209 ± 6Å2'nin teorik LJ CCS'si, karmaşık 3c için Sigma programı36 kullanılarak hesaplanan, IM-MS ölçülen CCS ile kabul edilmiştir ve 3c'nin pH 3.0-6.0'da [amb 2 −2H+3Cu(I)]+ konformasyonu temsil ettiğini gösterir. Ancak, >6 pH'ında, bu kompleks IM-MS tarafından gözlenmemiştir, çünkü muhtemelen Onun1 'in daha fazla deprotonasyonu (pKa= 6.0) genel nötr bir komplekse neden olur. Onun1 imidazoleum grubu deprotonated sonra, 3Cu (I) koordinasyon Cys2 ve Cys6 köprü thiolate grupları yanı sıra δN1 ve δN5 O'nun1 ve Onun5, sırasıyla (3a).

amb4 Cu(I/II)-bağlayıcı ve redoks aktivitesinin pH bağımlılığı
IM-MS ve B3LYP teknikleri, amb4 (Şekil 1C)ve tanımlanmış monomer, dimer, düzeltici ve tetramer komplekslerini araştırmak için kullanılmıştır 4en fazla üç Cu(I) iyonları veya iki Cu(II) ) her monomer alt birim için iyonlar39. Kompleksler de çeşitli sayıda disülfit köprü içeriyordu ve bu ürünler amb4 ile Cu(II) reaksiyonları anaerobik veya aerobik sulu çözeltiler içinde yapılmış olsun ya da olmasın üretildi.

IM-MS tekniği kullanılarak, bu türler geliş sürelerindeki farklılıklar nedeniyle üst üste gelen izotop desenlerine sahip olsalar bile ayrılabilecekleri ve ölçülebildikleri gösterilmiştir(Şekil 4). Bu yakından ilişkili türlerin tanımlanması ve sayısallaştırılması başka hiçbir enstrümantal veya analitik tekniğin elde edilemeyecek bir görevdir. Bu IM-MS çalışmaları, pH'ya bağlı redoks reaksiyonları hakkında önemli bir içgörü sağlar ve moleküler veya intra-moleküler disülfür köprülerinin sayısını, Cu(I) veya Cu(II) iyonlarının sayısını ve komplekslerin her birinde deprotonasyon alanı sayısını tam olarak belirletir ( Şekil 5).

Ayrıca, kompleksleri CCS ölçme de her bir tür konformasyonel boyutu, geniş bir B3LYP / LanL2DZ arama ile hem doğru moleküler ile kabul yapıları ile conformers bulmak için kullanılan belirlenmesine izin stokiyometri ve CCS IM-MS ile ölçülür. Bu yöntem le çeşitli komplekslerin Cu(I/II) koordinasyonu tanımlanmıştır. Cu(II) ve amb4 arasındaki reaksiyonlar, çözeltinin pH'ına bağlı olarak, cu(I) veya Cu(II) koordine eden dimer, düzeltici ve tetrameroluşumunu içeriyordu.

Örneğin, hafif asidik olan çözeltilerde (pH = 3.0-6.0), öncelikle Cu(I) iyonlarını bağladılar ve oksideddeğillerdi, hafif temel çözeltilerde ise (pH = 8.0-11.0), öncelikle Cu(II) iyonlarını bağladılar ve disülfür oluşturan tüm Kisler tarafından oksitlendiler. tahviller (Şekil 6). B3LYP/LanL2DZ, Cu(I) iyonlarının doğrusal olduğunu ve tiyolve imidazol grupları tarafından köprülenerek, Cu(II) iyonlarının ise bir imidazol ve deated omurga azotları ile bozulmuş T şeklinde veya kare düzlemsel geometriler yoluyla şelatedildiğini belirledi. amid grupları.

MB-OB3b'nin IM-MS analizi
IM-MS çalışmaları19,40 mb-OB3b (Şekil 1D) gaz fazında, Cu(I)-free mb-OB3b üç negatif yüklü tür olarak var olduğunu gösterdi: [mb-OB3b-H]– ,[mb-OB3b–2H]2–ve [mb-OB3b-3H] 3–,beklenen çözüm-faz davranışı ile tutarlı. Mb-OB3b'nin metal iyon seçiciliğini belirlemek için19 ayrı metal iyon titrasyonları yapıldı. Şekil 7 seçilen metal iyon titrasyonlarının sonuçlarını gösterir ve mb-OB3b'nin belirgin bağlayıcı seçiciliğinin üç ana grup olarak sınıflandırılabileni gösterir: 1) Cu(I) ve Ag(I); 2) Ni(II), Zn(II) ve Co(II); ve 3) Pb(II), Fe(II) ve Mn(II). Bağlayıcı seçicilik Bu sıral19 floresan söndürme deneyleri19 ve izoversmal titrasyon kalorimetre18bulundu ile genel uyum içinde olduğu gösterilmiştir.

mb-OB3b ve amb karşılaştırması 7.000 metal bağlama seçiciliği
MB-OB3b'nin belirgin bağlayıcı seçiciliği, pH 7'deki amb7'nin bağlayıcı seçiciliği ile karşılaştırıldı. Amb7 mb-OB3b ile aynı amino asit dizisi ile tasarlanmıştır, ancak iki enethiol oxazolone grupları ile iki His-Cys grupları ile değiştirilir. Amb7 (Şekil 1E) Cys6 ve Cys12arasında tek bir disülfür bağı vardır. Negatif yüklü komplekslerin oluşumunun sonuçları(Şekil 8)amb7'nin Ni(II) ve Zn(II) (%60) için bağlayıcı seçiciliği tercih ettiğini, bunu Co(II) ve Pb(II) (%40) ile izlediğini göstermiştir. Ayrıca, yaklaşık% 20 Cu (II) bağlayıcı oldu. Ag(I), Mn(II) veya Fe(II) arasında ya iz ya da amb7 bağlayıcısı yoktu. Bu, Cu(I) ve Ag(I) bağlama için MB-OB3b'nin tercih edilen bağlayıcı seçiciliği ile karşılaştırıldığında %90'ın üzerindedir.

Figure 1
Şekil 1: Alternatif metanobakin (amb) ve metanobactin (mb-OB3b) peptidlerin primer yapıları. (A) Asetil-His1-Cys2-Gly3-Pro4-His5-Cys6 (amb1); (B) asetil-His1-Cys2-Tyr3-Pro4-His5-Cys6 (amb2); (C) asetil-His1-Cys2-Gly3-Ser4-Tyr5-Pro6-His7-Cys8-Ser9 (amb4); (D) 1-[mercapto-(5-oxo-2-(3-metilbutanoyl)oxazol-(Z)-4-ylidene)metil]-Gly1–Ser2–Cys3–Tyr4)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-[5-oxo-oxazol-(Z)-4-ylidene Sere-5]5]5 –Cys6–Met7 (mb-OB3b); ve (E) asetil-Leu1-His2-Cys3-Gly4-Ser5-Cys6-Tyr7-Pro8-His9-Cys10-Ser11-Cys12-Met 13 (amb7). Gölgeleme gösterir: 2His-2Cys veya enethiol-oxazoloneIconbağlama siteleri ( ); proin veya pirrolidinIconmenteşeleri ( ); asetil veya metilbutanol grubu N-terminus (Icon); ve tirozin, ikinci bir solvation kabuk π-katyon etkileşimiIconile metal iyon koordinasyonu stabilize edebilirsiniz ( ). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Alternatif metanobakin ortalama göreceli yoğunlukları (amb1) asetil-His1-Cys2-Gly3-Pro4-His5-Cys6 ve metal bağlı kompleks (amb1+X)(nerede X = Cu veya Zn). Amb'nin 1:1 molar oranı çözeltisi olanXCl2'nin pH aralığı üzerinde 3.0-11.0 arasında negatif ve pozitif iyon kütle spektrometresi analizleri sırasında gözlemler yapıldı. Hata çubukları, üç çoğaltma pH titrasyon deneyinden hem göreli yoğunluk hem de pH araçlarının standart sapmalarını gösterir. Amb:CuCl2'nin 1:1 azı çözeltisi, cys2 ve Cys6ile disülfit köprü oluşturan amb (ambox)oksidasyonu ile sonuçlandı. (A) Amb negatif iyon analizi:CuCl2 gösteren [amböküz−H] ve [amböküz−3H+Cu(II)]. (B) amb pozitif iyon analizi:CuCl2 gösteren [ambox]+ ve [amböküz+Cu(I/II)]+ ; kompleksteki Cu oksidasyon durumu pH'ya bağımlıydı, [ambox+Cu(I)]+ ;  8 ve [amböküz−H+Cu(II)]+ altında; pH'ın üzerinde 8. (C) Amb:ZnCl2'nin negatif iyon analizi [amb]n− ve [amb+Zn(II)]n−. (D) amb pozitif iyon analizi:ZnCl2 gösteren [amb]n+ ve [amb+Zn(II)]n+. Bu rakam bir önceki yayın dan uyarlanmıştır20. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: B3LYP/LanL2DZ teorisi düzeyinden bulunan en düşük enerji ve geometri için optimize edilmiş yapılar kullanılarak önerilen [amb2+3Cu(I)]+ yapıları. (A) 3 Cu(I) ile koordinasyon δN1δN5 Onun1 ve Onun5 ve thiolate arasında 217 ± 6 Å2teorik kesiti ile Cys2 ve Cys6 thiolate grupları köprüleme . (B) ΔN1δN5 ve thiolate köprüleme koordinasyonunun çizimi. (C) 3 Cu(I) koordinasyonunu karboksilat terminali (Cys6), δN5ve 209 ± 6Å2 teorik kesiti ile köprüleme ile gösteren tuz köprülü yapı . (D) Karboksilat terminali, δN5ve thiolate köprüleme koordinasyonu nun çizimi. A, B, C, D, E ve F bağlama mesafeleri Å biriminde gösterilir. Bu rakam önceki bir yayın37uyarlanmıştır . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: pH =4.4'teamb 4 :Cu(II) karışımının 1:1 karışımının IM-MS analizi.  (A) [amb4−2H+3Cu(I)]+, [diamb4−4H+6Cu(I)]2+için ayıklanmış izotop desenleri , [triamb4−6H+9Cu(I)]3+ ve [tetraamb4−8H+12Cu(I)]4+ tür. (B) [amb4−2H+3Cu(I)]+, [diamb4−4H+6Cu(I)]2+ayıklanan geliş saatlerinin entegrasyonu, [triamb4−6H+9Cu(I)]3+ ve [tetraamb4−8H+12Cu(I)]4+ göreceli yoğunluklarını hesaplamak için kullanılmıştır. Yüzde göreceli yoğunlukları hesaplamak için, her titrasyon noktası için çıkarılan tüm türler için tüm entegre alanın toplamı yüzde ölçeğine normalleştirmek için kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Cu(II):amb4 pH = 4.04, 6.02 ve 9.98 molar eşdeğerlerinin pH titrasyonu sırasında gözlenen tekli Cu(I/II) bağlı amb4 için izotop deseni değiştirme. pH = 4.04'te deneysel sonuç öncelikle [amb4+Cu(I)]+için izotop modeliyle eşleşir. pH = 6.02'de disülfür köprüsünün oluşumunu (amb4oxoksidasyonu olarak gösterilir) ve [amb4ox+Cu(I)]+için izotop deseni ile anlaşma yı işaret eden -2 m/z'lik bir kayma vardır. pH = 9.98'de Cu(II) bağlanması ve +1 yük durumunu korumak için bir protonun çıkarılması anlamına gelen -1 m/z'nin daha fazla kayması vardır, bu da [amb4ox−H+Cu(II)]+için izotop deseniyle eşleşir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: PH aralığı 3.0-11.0 üzerinden amb4'ün monomer, dimer ve trimer'inCu(I/II) komplekslerinin kimliklerinin göreceli yoğunluklarının değiştirilmesi.  (A) Bir Cu(I/II) iyonlu monomer, (B) 2 Cu(I/II) iyonlu dimer ve (C) 3 Cu(I/II) iyonlu düzeltici. Başlıklar, komplekste kaç tane disülfür bağı bulunduğuna dikkat çekiyor. Bu rakam önceki bir yayın dan uyarlanmıştır39. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Cu(I), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) veya Fe(II) metanobactin komplekslerinin oluşum yüzdesi. Methanobactin bireysel metal iyon titrasyonları sırasında gözlenen. Cu(I) bağlamanın Cu(II) ve Fe(II) bağlanmasının Fe(III) eklenmesinden kaynaklandığı unutulmamalıdır. Bu rakam bir önceki yayın19uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Cu(I/II), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) veya Fe(II) şelasyon unun mb-OB3b ve pH =7'deamb ile karşılaştırılması. Karşılaştırma negatif yüklü iyonların oluşumu içindir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary File
Ek Dosya. GaussView kullanımı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritik adımlar: ESI-IM-MS ile inceleme için çözüm fazı davranışlarının muhafaza edilmesi
Peptidlerin stokiyometrisini, şarj durumunu ve konformasyonel yapısını korumak için yerli ESI enstrümantal ayarları kullanılmalıdır. Yerel koşullar için, KONI gerilimleri, sıcaklıklar ve gaz akışları gibi ESI kaynağındaki koşulların optimize edilmesi gerekir. Ayrıca, kaynak, tuzak, iyon hareketliliği ve transfer dalgalarındaki (özellikle IM hücresine enjeksiyon gerilimini kontrol eden DC tuzak önyargısı) basınç ve gerilimlerin şarj durumu ve iyon hareketliliği dağılımları üzerindeki etkileri kontrol edilmelidir.

Bu çalışmada kullanılan tipik çalışma koşulları şunlardır. Sulu peptid örnekleri 10 μL-1 akış hızı, pozitif iyonlar için 2,0 kV kılcal gerilim (+) veya negatif iyonlar için −1,8 kV (-), 130 °C kaynak sıcaklığı, 250 °C desolvation, 20 V örnekleme konisi ve 4,0 V v şırınga kullanılarak enjekte edildi. çıkarma konisi. IM bölümü, 1,5 mL/dk akış hızı kullanılarak 2,25 x 10-2 mbar argon basıncı ile kapan hücreye 6,0 V giriş gerilimi ile çalıştırıldı. İmD m hücreiçine iyonenjekte iyonları (tuzak DC önyargı) için gerilim 12 V onlar başlangıçta azot tampon gaz ile çarpıştı olarak iyonların bölünmesini önlemek için ayarlandı. IM hücresi iyonları şarj ve çarpışma kesitlerine göre ayırdı ve 0,52 mbar azot basıncı ve 20,0 mL mn−1 akış hızı kullandı. IM, 12.0-20.0 V (+) veya 8.0-30.0 V (−) seyahat dalga yükseklikleri ile çalıştırıldı ve IM seyahat dalgasının hücresi ne kadar her süpürme için 800-1.500 ms −1 (+) veya 250-1.000 ms −1 (−) hızları artırdı. Transfer hücresi tuzak hücresi ile aynı argon basıncı ile çalıştırıldı ve IM kararlı iyonları ortogonal zaman-of-flight kütle-şarj analizörü ne yönlendirdi. İyon hareketliliği-kütle spektrumları, iyonların im hücresine kapılı salınımını uçuş süresi kütle-şarj analizörü ile senkronize ederek elde edildi.

Yerel ESI koşulları kullanılarak, IM-MS analizleri sırasında şarj durumu ve konformasyonel durum gibi çözüm fazı özellikleri korunur. Örneğin, IM-MS analizleri sırasında gözlenen mb-OB3b ve ambs şarj durumları20,37 çözümfazı 40'tabeklenen yük durumları ile yakından ilişkilidir. MB-OB3b peptid tetraprotiktir ve IM-MS analizi40sırasında sadece negatif yüklü iyonlar oluşturur , cu(I)-bağlı veya Cu(I)-ücretsiz, c-terminus içerdiğinden (pKa < 1.7), iki enethiol oksazolon grubu (pKa = 5.0 ve 9.7) ve Tyr grubu (pKa = 11.0)42. Tam protonlanmış formdaki ambs C-terminus (pKa 』 2), iki His (pKa = 6.0), iki Cys (pKa = 8.3) ve Tyr (pKa = 11.0) siteleri19,41nedeniyle genel bir ücrete sahip olacaktır . Bu nedenle genellikle pH <6'da pozitif yüklü iyonlar ve pH >6'da negatif yüklü iyonlar oluştururlar.

Ambs ayrıca, düşük pH'da Cu(I)-bağlamanın daha yüksek bir pH'da Cu(II) bağlanmasına geçtiği açık pH bağımlı Cu(I/II) bağlama davranışı ve redoks aktivitesi gösterdi. Cu(I/II) reaksiyonları disülfür bağları ve çeşitli multimerler ve birden fazla Cu(I/II) bağlayıcısı içeren oksitlenmiş amb türlerinin (ambox)oluşumunu içeriyordu(Şekil 5 ve Şekil 6). Bu redoks reaksiyonları zamana bağlıdır ve numune hazırlama ve IM-MS analizleri arasındaki zaman aralığı (210 dk'ya kadar) ne kadar uzun sayılsa o kadar oksitlenmiş ürünler de gözlenmiştir37. Bu nedenle, ürünlerin gözlemine tepki süresi bağımlılığının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi de gereklidir.

Sınırlamalar: IM-MS ve teorik çarpışma kesitleri her metal iyonunun hangi koordinasyonu tercih edeceğini belirler
IM-MS m/z ve CCS verilerinin yorumlanmasına yardımcı olmak için B3LYP/LanL2DZ teorisi düzeyi kullanılarak kapsamlı bir arama yapılmıştır. Farklı koordinasyon alanlarına sahip geometri için optimize edilmiş konşimanörler, öngörülen serbest enerji leri ile IM-MS ile ölçülen CCS ile yapılan anlaşma ile karşılaştırıldı. bu nispeten büyük sistemlere uygulanabilecek yapı hesaplamaları. Çalışılan veya önerilen diğer yöntemler Arasında Truhlar ve ark.43,M05-2X en iyi DFT fonksiyonel ve PM7 ve MNDO / d zn (II) içeren bileşikler 44 içeren iyi NDDO yarı ampirik yöntemler olduğunu bulundu tarafından çalışmaları içerir44. Bu peptidler büyük bir konformasyonel alan ve en düşük enerji konfortaminleri bulmak için ayrıntılı bir araştırma çeşitli metal şelat siteleri, çeşitli cis- ve trans-peptid bağları, tuz-köprüler, hidrojen bağı ve π-katyon karşılaştırarak içermelidir aromatik Tyr yan grubu ve metal katyon arasındaki etkileşim.

Mevcut yöntemlere göre önemi: Cu(I/II) ve mb-OB3b ve ambs arasında karşılaştırıldığında diğer seçilmiş metal iyon bağlama
X-ışını kristalografisi ve NMR spektroskopisi peptidlerin üçüncül yapısının atomik çözünürlüğünü belirlemek için kullanılan en yaygın tekniklerdir. Ancak, metallopeptidlerin X-ışını kristalografisi çalışmaları bu komplekslerin kristalizasyonu ile ilgili sorunlar nedeniyle kıt45. NMR ayrıca yakından ilişkili bireysel oligopeptid türlerinin bulunduğu bir örneğin yorumlanması için de uygun değildir46. Bu nedenle, IM-MS ve DFT moleküler modelleme peptit reaksiyonları özellikle karmaşık redoks ve Cu (I/II)-bağlayıcı reaksiyonlar20,37,40kaynaklanan çalışma için alternatif teknikler vardır, 47- IM-MS'nin gücü, stokiyometri, protonasyon durumu ve konformasyonel yapı ile ilgili m/z ve varış sürelerini eş zamanlı olarak ölçerek her bir ürünü çözebilmek ve moleküler bileşimlerini tanımlayabilmektir.

Örneğin, mb-OB3b çeşitli metal iyonlarını ikame eder ve her iyona yönelik seçiciliği IM-MS metal iyon titrasyonları tarafından gösterilmiştir (Şekil 7). Sonuçlar, cu(I) ve Ag(I) bağlama için mb-OB3b tercihini gösterirken, 7 pH'taki sonuçları amb7ile karşılaştırır. Şekil 8 amb7 tercihen chelates Zn(II) ve Ni(II) gösterir. Genel olarak, amb çalışmaları 2His-2Cys ile iki enethiol-oksazolonların değiştirilmesinin Cu(I/II)-bağlayıcıyı dışlamadığını, ancak tek nükleer Cu(I) yerine doğrusal köprüleme koordinasyonu(Şekil 3)yoluyla birden fazla Cu(I)-bağlayıcı ile sonuçlandığını göstermiştir. mb-OB3b'nin tetrahedral koordinasyonunun bağlanması48. Cu(II) redüksiyonu, apo-mb-OB3b'deki mevcut disülfür köprüsünün aksine tiyol oksidasyonu ve disülfür köprü oluşumu ve cu(I) 49 için güçlü tercihi destekleyen bakır yüklü mb-OB3b için yüksek redüksiyon potansiyeli ile aracılık edilerek .

Gelecekteki uygulamalar
Amb peptidlerin daha fazla IM-MS çalışmaları devam etmektedir, hangi onların birincil sırası Gly veya Asp ile His veya Cys değiştirerek değiştirilir, Tyr kalıntı gly veya Phe ile değiştirilir iken. Bu çalışmalar ayrıca 10.0 mM amonyum asetat içinde, pH amonyum hidroksit (pH = 7, 8 ve 9 için) her örnek için toplam iyonik mukavemet sabittutmak için modifiye ile yapılmaktadır. Bu sonuçlar kısa süre içinde yayınlanacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu materyal, 1764436, NSF enstrüman desteği (MRI-0821247), Welch Vakfı (T-0014) ve Enerji Bakanlığı (TX-W-20090427-0004-50) ve L3 Communications'ın bilgi işlem kaynakları altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. . Biz California Üniversitesi Bower grubu teşekkür ederiz - Santa Barbara Sigma programı ve Ayobami Ilesanmi video tekniği göstermek için paylaştığı için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114, (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256, (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107, (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30, (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256, (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305, (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80, (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7, (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25, (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19, (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51, (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261, (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14, (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141, (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84, (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26, (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50, (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98, (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88, (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18, (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4, (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5, (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43, (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96, (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17, (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50, (4), 1378-1391 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics