Técnicas de Espectrometría de Masa de Movilidad de Iones para Determinar la Estructura y Mecanismos de Reconocimiento de Iones Metálicos y Actividad Redox de Oligopéptidos de Unión De Metal

Chemistry

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Summary

Las técnicas de modelado molecular y espectrometría de masas de movilidad ión pueden caracterizar el rendimiento selectivo de quelantes metálicos de los péptidos de unión a metales diseñados y el péptido de unión de cobre methanobactin. El desarrollo de nuevas clases de péptidos quelantes metálicos ayudará a llevar a terapias para enfermedades asociadas con el desequilibrio de iones metálicos.

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Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

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Abstract

La ionización por electrospray (ESI) puede transferir un péptido de fase acuosa o un complejo de péptidos a la fase gaseosa, al tiempo que conserva su masa, carga general, interacciones de unión de metales y forma de conformación. El acoplamiento ESI con espectrometría de masas de movilidad ión (IM-MS) proporciona una técnica instrumental que permite la medición simultánea de la sección transversal de masa a carga (m/z) y de colisión (CCS) de un péptido que se relacionan con su estequiometría, estado de protonación, y forma conformacional. La carga general de un complejo de péptidos se controla mediante la protonación de 1) los sitios ácidos y básicos del péptido y 2) el estado de oxidación de los iones metálicos. Por lo tanto, el estado de carga general de un complejo es una función del pH de la solución que afecta a los péptidos de la afinidad de unión de iones metálicos. Para los análisis ESI-IM-MS, las soluciones de péptidos e iones metálicos se preparan a partir de soluciones solo acuosas, con el pH ajustado con ácido acético acuoso diluido o hidróxido de amonio. Esto permite determinar la dependencia del pH y la selectividad de iones metálicos para un péptido específico. Además, el m/z y el CCS de un complejo de péptidos se pueden utilizar con el modelado molecular B3LYP/LanL2DZ para discernir los sitios de unión de la coordinación de iones metálicos y la estructura terciaria del complejo. Los resultados muestran cómo ESI-IM-MS puede caracterizar el rendimiento de quelación selectiva de un conjunto de péptidos alternativos de methanobactina y compararlos con el péptido de unión de cobre methanobactin.

Introduction

Los iones de cobre y zinc son esenciales para los organismos vivos y cruciales para procesos como la protección oxidativa, el crecimiento del tejido, la respiración, el colesterol, el metabolismo de la glucosa y la lectura del genoma1. Para habilitar estas funciones, grupos como el tiolato de Cys, el imidazol de Su2,3, (más raramente) tioéter de metionina, y carboxilato de Glu y Asp incorporan selectivamente metales como cofactores en los sitios activos de metaloenzimas. La similitud de estos grupos de coordinación plantea una pregunta intrigante sobre cómo los ligandos Suyos y De Los Cys incorporan selectivamente Cu(I/II) o Zn(II) para asegurar el correcto funcionamiento.

La unión selectiva se realiza a menudo mediante la adquisición y el tráfico de péptidos, que controlan las concentraciones iónquires de Zn(II) o Cu(I/II)4. Cu(I/II) es altamente reactivo y causa daño oxidativo o unión adventicia a las enzimas, por lo que su concentración libre está estrechamente regulada por chaperones de cobre y proteínas reguladoras de cobre que lo transportan de forma segura a varios lugares de la célula y estrechamente controlar su homeostasis5,6. La interrupción del metabolismo del cobre o la homeostasis está directamente implicada en la enfermedad de Menkes y Wilson7, así como en los cánceres7 y trastornos neuronales, como el prión8 y la enfermedad de Alzheimer9.

La enfermedad de Wilson se asocia con el aumento de los niveles de cobre en los ojos, el hígado y las secciones del cerebro, donde las reacciones redox de Cu(I/II) producen especies reactivas de oxígeno, causando degeneración hepatolenticular y neurológica. Las terapias de quelación existentes son el pequeño aminoácido tiol penicilamina y trietiletetramina. Alternativamente, los péptidos metanotropoficos de adquisición de cobre methanobactin (mb)10,11 exhiben potencial terapéutico debido a su alta afinidad de unión para Cu(I)12. Cuando el methanobactin (mb-OB3b) de Methylosinus trichosporium OB3b fue estudiado en un modelo animal de la enfermedad de Wilson, el cobre fue eliminado eficientemente del hígado y excretado a través de la bilis13. Los experimentos in vitro confirmaron que mb-OB3b podría quelar el cobre del metalotionino de cobre contenido en el citosol hepático13. Las técnicas de imágenes de espectrometría de masas plasmáticas acopladas inductivamente de ablación láser han investigado la distribución espacial del cobre en las muestras hepáticas de la enfermedad de Wilson14,15,16 y han demostrado que mb-OB3b elimina el cobre con períodos de tratamiento cortos de sólo 8 días17.

El mb-OB3b también se unirá a otros iones metálicos, incluidos Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) y Zn(II)18,19. La competencia por el sitio de unión fisiológico Cu(I) es exhibida por Ag(I) porque puede desplazar a Cu(I) del complejo mb-OB3b, con Ag(I) y Ni(II) mostrando también unión irreversible a Mb que no puede ser desplazada por Cu(I)19. Recientemente, se han estudiado una serie de oligopéptidos alternativos de methanobactina (amb) con el motivo de unión 2His-2Cys20,21,y sus propiedades de unión Zn(II) y Cu(I/II) caracterizadas. Sus secuencias de aminoácidos primarios son similares, y todas contienen el motivo 2His-2Cys, Pro y un cesación acetilado N-terminus. Se diferencian principalmente de mb-OB3b porque el motivo 2His-2Cys reemplaza los dos sitios de unión de oxazolona de enethiol de mb-OB3b.

La ionización por electrospray junto con la espectrometría de masas de movilidad ión (ESI-IM-MS) proporciona una poderosa técnica instrumental para determinar las propiedades de unión al metal de los péptidos porque mide su masa a carga (m/z) y la colisión sección transversal (CCS) conservando su masa, carga y forma de conformación de la fase de solución. El m/z y el CCS se relacionan con los péptidos etoquiometría, estado de protonación y forma de conformación. La estequiometría se determina porque la identidad y el número de cada elemento presente en la especie se identifican explícitamente. La carga general del complejo de péptidos se relaciona con el estado de protonación de los sitios ácidos y básicos y el estado de oxidación de los iones metálicos. El CCS proporciona información de la forma conformacional del complejo peptídico porque mide el tamaño medio rotacional que se relaciona con la estructura terciaria del complejo. El estado de carga general del complejo también es una función del pH y afecta a la afinidad de unión de iones metálicos del péptido porque los sitios básicos o ácidos desprotonados como el carboxilo, His, Cys y Tyr son también los sitios de unión potenciales para el ion metálico. Para los análisis, el péptido y el ion metálico se preparan en soluciones acuosas con el pH ajustado por ácido acético acuoso diluido o hidróxido de amonio. Esto permite determinar la dependencia del pH y la selectividad de iones metálicos para el péptido. Además, el m/z y el CCS determinados por ESI-IM-MS se pueden utilizar con el modelado molecular B3LYP/LanL2DZ para descubrir el tipo de coordinación de iones metálicos y la estructura terciaria del complejo. Los resultados mostrados en este artículo revelan cómo ESI-IM-MS puede caracterizar el rendimiento de quelación selectiva de un conjunto de péptidos amb y compararlos con el péptido de unión de cobre mb-OB3b.

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Protocol

1. Preparación de reactivos

  1. Cultivo Methylosinus trichosporium OB3b, aislar el Cu(I) libre de mb-OB3b18,22,23, congelar-secar la muestra y almacenar a -80 oC hasta su uso.
  2. Sintetizar los péptidos amb (>98% pureza para amb1, amb2, amb4; >70% pureza para amb7), congelar-secar las muestras, y almacenarlas a -80 oC hasta su uso.
  3. Compra >98% de cloruro de manganeso de pureza(II), cloruro de cobalto (II), cloruro de nickle(II), cloruro de cobre(II), nitrato de cobre(II), nitrato de plata(I), cloruro de zinc(II), cloruro de hierro (III) y cloruro de plomo(II).
  4. Comprar los polímeros de poli-DL-alanina utilizados como calibradores para medir las secciones transversales de colisión de la especie amb y el hidróxido de amonio de grado HPLC o superior, ácido acético glacial y acetonitrilo.

2. Preparación de la solución de stock

  1. Solución de stock de péptidos
    1. Pesar con precisión, utilizando al menos tres cifras significativas, la masa de 10,0–20,0 mg del mb-OB3b o amb en un vial de plástico de 1,7 ml.
      NOTA: La masa pesada debe producir 12,5 mM o 1,25 mM, dependiendo de la solubilidad del péptido, cuando se añade 1,00 ml de agua desionizada (DI).
    2. Con un pipeta, añada 1,00 ml de agua desionizada (>17,8 M cm) a la muestra de péptido pesado para producir la solución de 12,5 mM o 1,25 mM. Coloque la tapa firmemente y mezcle bien con al menos 20 inversiones.
    3. Usando un micropipete dispensa alícuotas de 50,0 l a partir de la muestra de péptido en viales de 1,5 ml etiquetados individualmente y guárdelas a -80 oC hasta su uso.
  2. Soluciones de stock de iones metálicos
    1. Pesar con precisión, utilizando al menos tres cifras significativas, la masa de 10,0–30,0 mg del cloruro metálico o nitrato de plata en un vial de 1,7 ml.
      NOTA: La masa pesada debe producir 125 mM cuando se añade 1,00 mL de agua DI.
    2. Añadir los 1,00 ml de agua DI a la muestra de metal pesada en el vial de 1,7 ml para producir la solución de 125 mM. Coloque la tapa firmemente y mezcle bien con al menos 20 inversiones.
  3. Soluciones de stock de hidróxido de amonio:preparar una solución de ácido acético de 1,0 M diluyendo 57 ml de la solución de ácido acético del 99,5% con agua DI a un volumen final de 1,00 ml. Preparar una solución de hidróxido de amonio de 1,0 M diluyendo 90 ml de la solución de hidróxido de amonio del 21% con agua DI a un volumen final de 1,00 ml. Realice dos diluciones sucesivas de cada solución tomando 100 ml de las soluciones de 1,0 M para preparar soluciones de ácido acético y hidróxido de amonio de 0,10 M y 0,010 M.
  4. Solución de stock de poli-DL-alanina:preparar la poli-DL-alanina (PA) pesando 1,0 mg de PA y disolviendo en 1,0 ml de agua DI para dar 1.000 ppm. Homogeneizar. Con un micropipete, dispensar alís 50,0 l y colocar cada una en un vial de 1,7 ml y almacenar a -80 oC.

3. Análisis de espectrometría de masas de movilidad de iones electrospray

  1. Limpie a fondo el tubo de entrada ESI y el capilar de la aguja con aproximadamente 500 ml de ácido acético glacial de 0,1 M, hidróxido de amonio de 0,1 M y, finalmente, agua DI.
  2. Descongelar una alícuota de 50,0 l de la solución de stock PA de 1.000 ppm y diluirla con 450 ml de agua DI para dar un PA de 100 ppm. Pipet 100.0 l de esta solución y diluirla a 1,00 ml con 500 ml de agua DI y 500 ml de acetonitrilo para dar 10 ppm de solución PA.
  3. Recopile los espectros IM-MS de iones negativos y positivos de la solución PA de 10 ppm durante 10 minutos cada uno utilizando condiciones nativas de ESI-IM-MS como se describe en la sección de discusión.
  4. Descongelar una alícuota de 50,0 l de la solución de stock de 12,5 mM o 1,25 mM y realizar diluciones sucesivas con agua DI para dar una concentración final de 0,125 mM amb. Mezcle bien cada dilución.
  5. Pipet 100.0 l de la solución de material de iones metálicos de 125 mM, colocar en un vial de 1,7 ml y diluir a 1,00 ml con agua DI para dar 12,5 mM de iones metálicos. Repita con dos diluciones sucesivas más para dar una concentración final de iones metálicos de 0,125 mM. Mezcle bien cada dilución.
  6. Pipet 200.0 l de la 0,125 mM amb en un vial de 1,7 ml, diluir con 500 ml de agua DI y mezclar bien la solución.
  7. Ajuste el pH de la muestra a 3,0 añadiendo 50 ml de solución de ácido acético de 1,0 M.
  8. Añadir 200,0 l de un ion metálico de 0,125 mM a la muestra ajustada al pH. Añadir agua DI para producir un volumen final de 1,00 ml de la muestra, mezclar a fondo, y permitir que la muestra se equilibre durante 10 minutos en RT.
  9. Con una jeringa de nariz contundente, tome 500 ml de la muestra y recoja los espectros de iones negativos y positivos ES-IM-MS durante 5 min cada uno. Utilice los 500 ml restantes de la muestra para registrar su pH final utilizando un electrodo de micro pH calibrado.
  10. Repita los pasos 3.6–3.9, mientras modifica el paso 3.7 para ajustar el pH a 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 o 10.0 agregando nuevos volúmenes de las soluciones de ácido acético o hidróxido de amonio de 0.010 M, 0.10 M o 1.0 M.
  11. Recoja los espectros ESI-IM-MS de iones negativos y positivos de la solución PA de 10 ppm durante 10 minutos cada uno.

4. Preparación de la valoración de iones metálicos de muestras de amb

  1. Siga los pasos descritos en los pasos 3.1–3.5.
  2. Pipet 200.0 l de la amb de 0,125 ml en un vial de 1,7 ml, diluir con 500,0 l de agua DI y mezclar la solución a fondo.
  3. Ajuste el pH de la muestra a pH a 9,0 agregando 80 ml de la solución de hidróxido de amonio de 0,010 M.
  4. Añadir 28 ml de la solución de iones metálicos de 0,125 mM para dar 0,14 equivalentes molares del ion metálico, añadir agua DI para hacer el volumen final de la muestra 1,00 ml, mezclar a fondo, y permitir que la muestra se equilibre durante 10 minutos a RT.
  5. Con una jeringa de nariz contundente, tome 500 ml de la muestra y recoja los espectros esI-IM-MS de iones negativos y positivos durante 5 minutos cada uno. Utilice los 500 ml restantes de la muestra para registrar su pH final utilizando un electrodo de micro pH calibrado.
  6. Repita los pasos 4.2–4.5, mientras modifica el paso 4.3 para agregar un volumen apropiado de la solución de iones metálicos de 0.125 mM para dar equivalentes molares de 0.28, 0.42, 0.56, 0.70, 0.84, 0.98, 1.12, 1.26 o 1.40.
  7. Recoja los espectros IM-MS de iones negativos y positivos de la solución PA de 10 ppm durante 10 minutos cada uno.

5. Análisis de los datos de valoración del pH ESI-IM-MS

  1. A partir de los espectros IM-MS identifican qué especies cargadas de ambs están presentes emparejándolas con sus patrones teóricos de isótopos m/z.
    1. Abra MassLynx y haga clic en Cromatogram para abrir la ventana de Cromatograma.
    2. Vaya al menú Archivo y Abrir para localizar y abrir el archivo de datos IM-MS.
    3. Extraiga el espectro IM-MS haciendo clic con el botón derecho y arrastrando a través del cromatograma y liberando. Se abrirá la ventana de espectro que muestra el espectro IM-MS.
    4. En la ventana de espectro, haga clic en Herramientas y modelo isótopo. En la ventana de modelado de isótopos, ingrese la fórmula molecular de la especie amb, marque la casilla Mostrar iones cargados e ingrese el estado de carga. Haga clic en Aceptar.
    5. Repita para identificar todas las especies en el espectro IM-MS y registre su rango de isótopos m/z.
  2. Para cada especie amb, separe cualquier especie de m/z coincidente y extraiga sus distribuciones de tiempo de llegada (ATD) utilizando sus patrones de isótopos m/z para identificarlas.
    1. En MassLynx haga clic en DriftScope para abrir el programa. En DriftScope haga clic en Archivo y Abrir para localizar y abrir el archivo de datos IM-MS.
    2. Utilice el ratón y el botón izquierdo para acercar el patrón de isótopos m/z de la especie amb.
    3. Utilice la herramienta Selección y el botón izquierdo del ratón para seleccionar el patrón de isótopos. Haga clic en el botón Aceptar selección actual.
    4. Para separar cualquier especie de m/z coincidente, utilice la herramienta Selección y el botón izquierdo del ratón para seleccionar el patrón de tiempo ATD alineado con el patrón de isótopos de la especie amb. Haga clic en el botón Aceptar selección actual.
    5. Para exportar el ATD, vaya a Archivo . Exportar a MassLynx, a continuación, seleccione Conservar tiempo de deriva y guardar el archivo en la carpeta adecuada.
  3. Determinar el centroide del ATD e integrar el área bajo la curva ATD como una medida de la población de especies.
    1. En la ventana Chromatogram de MassLynx abra el archivo exportado guardado. Haga clic en Proceso de la página de trabajo de la página de trabajo Integre desde el menú. Marque la casilla ApexTrack Peak Integration (Integración de picos de ApexTrack) y haga clic en Aceptar.
    2. Registre el ATD centroide (tA)y el área integrada como se muestra en la ventana Decrotograma. Repita el proceso para todos los archivos de datos amb y PA IM-MS guardados.
  4. Utilice el ATD integrado para todas las especies de amb extraídas de los iones positivos o negativos en cada punto de valoración para normalizarla a una escala porcentual relativa.
    1. Introduzca las identidades de la especie amb y su ATD integrado en cada pH en una hoja de cálculo.
    2. Para cada pH, utilice la suma de los ATD integrados para normalizar el ATD del amb individual a una escala porcentual.
    3. Trazar las intensidades porcentuales de cada especie amb frente al pH en un gráfico para mostrar cómo la población de cada especie varía en función del pH.

6. Secciones transversales de colisión

  1. Usando una hoja de cálculo, convierta los CCS (o) de PA negativo25,26 y27 iones positivos medidos en gas tampón He28 a CCS corregido(c) usando la Ecuación 1 a continuación, donde: z - carga iónda; e c - carga de electrones (1.602-10-19 C); m N 2 - masa de N2 gas (Da); y mion á masa iónda. 29

Equation 1

  1. Convierta los tiempos de llegada promedio (tA) de los calibradores PA y las especies amb en tiempos de deriva (tD) utilizando la Ecuación 2 a continuación, donde: c - el coeficiente de retardo de ciclo de trabajo mejorado (1.41), y m/z es la carga masiva del ion péptido.

Equation 2

  1. Trazar el tD de los calibradores PA frente a suc. A continuación, utilizando un ajuste de regresión de mínimos cuadrados de la Ecuación 3 que se muestra a continuación, determine los valores A' y B, donde: A' es la corrección para los parámetros de temperatura, presión y campo eléctrico; y B compensa el efecto no lineal del dispositivo IM.

Equation 3

  1. Usando estos valores A' y B y el valor centroide tD del ATD de los ambs determinan suc usando la Ecuación 3 y su - usando la Ecuación 1. Este método proporciona CCS para las especies de péptidos con errores absolutos estimados de alrededor de 2%25,26,27.

7. Métodos computacionales

  1. Utilice el nivel de teoría B3LYP/LanL2DZ, que comprende las funciones híbridas Becke de 3 parámetros30 y la base de reclamación establecen31 y los potenciales de núcleo de electrones32,33,34 para localizar conformadores optimizados para geometría para todos los tipos posibles de coordinaciones de la especie m/z amb observada35.
    NOTA: Para obtener más información sobre cómo crear y enviar cálculos, consulte el uso de GaussView en Archivo complementario.
  2. Compare la energía libre pronosticada de cada uno de los conformadores y calcule sus CCS teóricos utilizando el método Lennard-Jones (LJ) a escala ióndel programa Sigma36.
  3. De los conformadores de energía libre más bajos determinan qué conformador exhibe el LJ CCS que está de acuerdo con el IM-MS medido CCS para identificar la estructura terciaria y el tipo de coordinación para los conformadores observados en el experimento.

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Representative Results

Encuadernación metálica de amb1
El estudio IM-MS20 de amb1 (Figura 1A) mostró que tanto los iones de cobre como los de zinc se unen a amb1 de manera dependiente del pH(Figura 2). Sin embargo, el cobre y el zinc se unen a amb1 a través de diferentes mecanismos de reacción en diferentes sitios de coordinación. Por ejemplo, la adición de Cu(II) a amb1 dio lugar a la oxidación de amb1 (amb1ox)por formación de puente de disulfuro, y a un pH de >6, se formó elion [amb1ox3H+Cu(II)] (Figura 2A). Esto indicaba la desprotonación de dos imidazoliums, el grupo carboxilo y dos sitios adicionales que coordinaban Cu(II).

El modelado molecular del ion [amb1ox-3H+Cu(II)]con B3LYP/LanL2DZ determinó que el complejo energético más bajo fue Cu(II) coordinado a través del imidazol N de su1 y los nitrógenos desprotonados de los grupos de la columna vertebral de Cys2 y Gly3. Sin embargo, debajo de un pH de 6, la adición de Cu(II) a amb1 formó un patrón de isótopos m/z que sólo podía ser contabilizado por la unión Cu(I), formando el [amb1ox+Cu(I)]+ ion (Figura 2B). Por el contrario, un pH superior a 6 hizo que el patrón de isótopos m/z disminuyera 1 m/z, dado cuenta por eliónico cargado positivamente [amb1ox-H+Cu(II)]. La adición de Zn(II) no oxidó amb1, y la unión Zn(II) se observó a un pH de >6, formando principalmente el ion [amb1x 3H+Zn(II)]( Figura 2C). Esto indicaba la deprotonación de los grupos de imidazoliums, thiol y carboxilo. El modelado molecular del ion [amb1x 3H+Zn(II)]determinó que los conformadores de energía más bajos son la coordinación tetraédrico Zn(II) a través de 2His-2Cys o His-2Cys y el carboxilato del Término C.

Múltiple Senación Cu(I) de amb2
Las reacciones redox entre Cu(II) y amb2 (Figura 1B)dieron lugar a la unión De Cu(I). Esto fue estudiado con más detalle utilizando IM-MS, espectrofotometría UV-Vis, y modelado molecular B3LYP37. Los principales productos de la valoración Cu(II) de amb2 a un pH de 5 fueron la oxidación amb2 (a través de la formación del puente del disulfuro) y la especie amb2 no oxidada que coordinaba tres iones Cu(I).

Una búsqueda utilizando el método B3LYP/LanL2DZ localizó dos complejos de baja energía que luchan por las especies coordinadas 3Cu(I). El primero fue el complejo que se muestra en la Figura 3A, donde los iones 3Cu(I) fueron coordinados a través de los grupos tiolatopuente38 de Cys2 y Cys6 (de su1), así como n1 yN 5 (de su5 ). El segundo complejo (3c) tiene un puente de sal entre el protón dotó Su grupo lateralde 1 y el grupo de carboxilato C-terminal. Estos resultados sugieren que a un pH de 3.0–6.0, el complejo principal amb2+3Cu(I) es la estructura puenteada por sal, que se puede transferir con éxito de la solución a la fase gaseosa con sólo una reorganización estructural mínima.

El LJ CCS teórico de 209 a 6 o2, calculado utilizando el programa Sigma36 para el complejo 3c, acordado con el CCS medido IM-MS, indicando que 3c representa [amb2x 2H +3Cu(I)]+ conformación a pH 3.0-6.0. Sin embargo, a un pH de >6, este complejo no fue observado por IM-MS, probablemente porque una mayor deprotonación de su1 (pKa6.0) resulta en un complejo neutral general. Una vez que el grupo imidazolum de Su1 es deprotonado, 3Cu(I) coordinación puede convertira a los grupos tiolatopuente puente de Cys2 y Cys6, así como n1 y N5 de su1 y su5, respectivamente (3a).

La dependencia del pH de la actividad de unión y redox amb4 Cu(I/II)
Las técnicas IM-MS y B3LYP se han utilizado para investigar las valoraciones Cu(II) y pH de amb4 (Figura 1C) e complejos de monómeros, dimer, recortadores y tetrameros identificados de amb4 que contienen hasta tres iones Cu(I) o dos Cu(II ) iones para cada subunidad de monómero39. Los complejos también contenían varios números de puentes de disulfuro, y estos productos se produjeron independientemente de si las reacciones Cu(II) con amb4 se llevaron a cabo en soluciones acuosas anaeróbicas o aeróbicas.

Utilizando la técnica IM-MS, se demostró que estas especies individuales podían separarse y cuantificarse incluso si tenían patrones de isótopos superpuestos debido a las diferencias en sus tiempos de llegada(Figura 4). La identificación y cuantificación de estas especies estrechamente relacionadas es una tarea que ninguna otra técnica instrumental o analítica puede lograr. Estos estudios IM-MS proporcionan una visión considerable de las reacciones redox dependientes del pH e identifican exactamente el número de puentes de disulfuro intermoleculares o intramoleculares, el número de iones Cu(I) o Cu(II) y el número de sitios de desprotonación en cada uno de los complejos ( Figura 5).

Además, la medición de los complejos CCS también permitió la determinación de cada una de las especies individuales de tamaño conformación, que se utilizó con una extensa búsqueda B3LYP/LanL2DZ para localizar a los conformadores con estructuras que coincidieron tanto con el estoquiometría y CCS medidos por IM-MS. A través de este método, se identificó la coordinación Cu(I/II) de los diversos complejos. Las reacciones entre Cu(II) y amb4 incluyeron la formación de dimers, recortadores y tetrámeros que coordinaban Cu(I) o Cu(II), dependiendo del pH de la solución.

Por ejemplo, en soluciones ligeramente ácidas (pH 3,0–6,0), se unieron principalmente los iones Cu(I) y no se oxidaron, mientras que en soluciones ligeramente básicas (pH a 8,0 a 11,0), se unieron principalmente iones Cu(II) y se oxidaron por todos los Cys que formaban disulfide bonos(Figura 6). El B3LYP/LanL2DZ determinó que los iones Cu(I) eran lineales y puenteados por los grupos tiolato e imidazol, mientras que los iones Cu(II) fueron quelados a través de geometrías planas cuadradas en forma de T o cuadradas por un imidazol, así como los grupos de amidas.

Análisis IM-MS de mb-OB3b
Los estudios IM-MS19,40 de mb-OB3b(Figura 1D) mostraron que en la fase gaseosa, Cu(I)-libre mb-OB3b existe como tres especies cargadas negativamente: [mb-OB3b–H], [mb-OB3b–2H]2–y [mb-OB3b–3H] 3–, de acuerdo con el comportamiento esperado de la fase de solución. Se realizaron valoraciones individuales de iones metálicos19 para determinar la selectividad de iones metálicos de mb-OB3b. La Figura 7 muestra los resultados de las valoraciones de iones metálicos seleccionadas y muestra que la selectividad de unión aparente de mb-OB3b se puede clasificar como tres grupos principales: 1) Cu(I) y Ag(I); 2) Ni(II), Zn(II) y Co(II); y 3) Pb(II), Fe(II) y Mn(II). Este orden de selectividad vinculante demostró ser en general de acuerdo con el encontrado por los experimentos de enfriamiento por fluorescencia19 y calorimetría de valoración isotérmica18.

Comparación de mb-OB3b y amb 7 selectividad de encuadernación metálica
La selectividad de enlace aparente de mb-OB3b se comparó con la selectividad vinculante de amb7 a un pH de 7. El amb7 fue diseñado con la misma secuencia de aminoácidos que mb-OB3b, pero con los dos grupos de oxazolona de enethiol reemplazados por dos grupos His-Cys. El amb7 (Figura 1E) tiene un único enlace de disulfuro entre Cys6 y Cys12. Los resultados de la formación de complejos cargados negativos(Figura 8) mostraron que amb7 prefirió la selectividad vinculante para Ni(II) y Zn(II) (60%), seguido de Co(II) y Pb(II) (40%). Además, había aproximadamente un 20% de encuadernación Cu(II). Hubo rastro o no amb7 de encuadernación de Ag(I), Mn(II) o Fe(II). Esto se compara con la selectividad de enlace preferida de mb-OB3b de más del 90% para el enlace Cu(I) y Ag(I).

Figure 1
Figura 1: Estructuras primarias de los péptidos alternativos de methanobactina (amb) y methanobactina (mb-OB3b). (A) Acetil-Su1-Cys2-Gly3-Pro4-Su5-Cys6 (amb1); (B) acetil-Su1-Cys2-Tyr3-Pro4-Su5-Cys6 (amb2); (C) acetil-Su1-Cys2-Gly3-Ser4-Tyr5-Pro6-Su7-Cys8-Ser9 (amb4); (D) 1-(N-[mercapto-(5-oxo-2-(3-methylbutanoyl)oxazol-(Z)-4-ylidene)methyl]-Gly1–Ser2–Cys3–Tyr 4)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-[5-oxo-oxazol-(Z)-4-y-Serlidene)-5- –Cys6–Met7 (mb-OB3b); y (E) acetil-Leu1-Su2-Cys3-Gly4-Ser5-Cys6-Tyr7-Pro8-Su9-Cys10-Ser11-Cys12-Met 13 (amb7). Sombreado muestra: 2His-2Cys o enethiol-oxazolone sitiosIconde unión ( ); prolina o bisagras deIconpirrolidina ( ); grupo de acetil o metilbutanol N-terminus (Icon); y tirosina, que puede estabilizar la coordinación de iones metálicos aIcontravés de una segunda cáscara de solvación - interacción de catonión ( ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Intensidades relativas medias de la methanolatina alternativa (amb1) acetil-Su1-Cys2-Gly3-Pro4-Su5-Cys6 y complejo ligado a metal (amb1+X) (donde X - Cu o Zn). Las observaciones se realizaron durante los análisis de espectrometría de masas de iones negativos y positivos de la solución de relación molar 1:1 de amb:XCl2 sobre el rango de pH de 3.0–11.0. Las barras de error muestran desviaciones estándar de las medias tanto de la intensidad relativa como del pH de tres experimentos de valoración de pH de réplica. La solución molar 1:1 de amb:CuCl2 resultó en la oxidación de amb(bueyamb) con Cys2 y Cys6,formando un puente de disulfuro. (A) Análisis iónico negativo de amb:CuCl2 que muestra[bueyamb -H]y [bueyamb 3H+Cu(II)]. (B) Análisis iónico positivo de amb:CuCl2 que muestra [ambox]+ y [ambox+Cu(I/II)]+; el estado de oxidación de Cu en el complejo dependía del pH, siendo[amb ox+Cu(I)]+;  por debajo de un pH de 8 y[amb buey-H+Cu(II)]+; por encima de un pH de 8. (C) Análisis iónico negativo de amb:ZnCl2 que muestra [amb]n y [amb+Zn(II)]n. (D) Análisis positivo de iones de amb:ZnCl2 que muestra [amb]n+ y [amb+Zn(II)]n+. Esta cifra ha sido adaptada de una publicación anterior20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Estructuras propuestas de [amb2+3Cu(I)]+ utilizando la energía más baja y estructuras optimizadas para geometría ubicadas desde el nivel de teoría B3LYP/LanL2DZ. (A) 3 Coordinación Cu(I) a través de n1N5 de su1 y sus5 y grupos tiolatos de puente de Cys2 y Cys6 con una sección transversal teórica de 217 a 6 o2. (B) Ilustración de la coordinación de puente sn1N5 y tiolado. (C) Estructura puenteada salina que muestra la coordinación 3 Cu(I) a través de la terminal de carboxilato (Cys6), N5, y puente tiolado con una sección transversal teórica de 209 a 6 a2. (D) Ilustración de la terminal de carboxilato, N5, y la coordinación de puente tiolado. Las distancias de unión A, B, C, D, E y F se muestran en la unidad de . Esta cifra ha sido adaptada de una publicación anterior37. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis IM-MS de los productos de la mezcla 1:1 de amb4:Cu(II) a pH a 4.4.  (A) Patrones de isótopos extraídos para los [amb4x 2H+3Cu(I)]+, [diamb4x 4H+6Cu(I)]2+, [triamb4x 6H + 9Cu(I)]3+ y [tetraamb4x 8H+12Cu(I)]4+ especies. (B) Integración de los tiempos de llegada extraídos de [amb4x 2H+3Cu(I)]+, [diamb4x 4H +6Cu(I)]2+, [triamb4x 6H + 9Cu(I)]3+ y [tetraamb4x 8H +12Cu(I)]4+ se utilizaron para calcular sus intensidades relativas. Para calcular el porcentaje de intensidades relativas, se utilizó la suma del área integrada para todas las especies extraídas para cada punto de valoración para normalizar la escala porcentual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cambio del patrón de isótopos para amb4 encuadernado por separado Cu(I/II) observado durante la valoración del pH de los equivalentes molares de Cu(II):amb4 a pH a 4.04, 6.02 y 9.98. En pH 4,04, el resultado experimental coincide principalmente con el modelo de isótopo para [amb4+Cu(I)]+. A pH 6,02, hay un desplazamiento de -2 m/z, lo que significa la formación del puente del disulfuro (mostrado como oxidación deamb 4ox)y acuerdo con el patrón de isótopos para [amb4ox+Cu(I)]+. En el pH 9,98, hay un cambio adicional de -1 m/z, lo que significa la unión Cu(II) y la eliminación de un protón para mantener el estado de carga +1, que luego coincide con el patrón de isótopo para [amb4ox-H+Cu(II)]+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Cambio de las intensidades relativas de las identidades de los complejos Cu(I/II) del monómero, dimero y recortador de amb4 sobre el rango de pH de 3.0–11.0.  (A) Monómero con un dimer Cu(I/II), (B) con 2 iones Cu(I/II) y (C) recortador con 3 iones Cu(I/II). Los subtítulos señalan cuántos bonos de disulfuro estaban presentes en el complejo. Esta cifra ha sido adaptada de una publicación anterior39. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Porcentaje de formación de los complejos Cu(I), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) o Fe(II) de methanobactin. Observado durante las valoraciones individuales de iones metálicos de methanobactin. Cabe señalar que la vinculación Cu(I) resultó de la adición de Cu(II) y Fe(II) vinculante de la adición de Fe(III). Esta cifra ha sido adaptada de una publicación anterior19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Comparación del porcentaje de quelación de Cu(I/II), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) o Fe(II) por mb-OB3b y amb7 a pH a 7. La comparación es para la formación de iones cargados negativamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Pasos críticos: conservación de comportamientos en fase de solución para su examen a través de ESI-IM-MS
Se deben utilizar ajustes instrumentales nativos ESI que conserven la estequiometría de los péptidos, el estado de carga y la estructura de conformación. Para condiciones nativas, las condiciones en la fuente ESI tales como los voltajes del cono, las temperaturas y los flujos de gas tienen que ser optimizados. Además, las presiones y voltajes en la fuente, la trampa, la movilidad iónica y las ondas de viaje de transferencia (especialmente el sesgo de trampa de CC que controla el voltaje de inyección en la célula IM) deben comprobarse para ver si sus influencias en las distribuciones de movilidad de iones y estado de carga.

Las siguientes son las condiciones de funcionamiento típicas que se utilizaron en este trabajo. Las muestras de péptidos acuosos se inyectaron utilizando una jeringa de nariz contundente de 1,0 ml utilizando un caudal de 10 ml mina 1, 2,0 kV de tensión capilar para iones positivos (+) o 1,8 kV para iones negativos (-), temperatura de fuente de 130 oC, desolación de 250 oC, cono de muestreo de 20 V y 4,0 V cono de extracción. La sección IM fue operada con una tensión de entrada de 6.0 V a la célula trampa con una presión de argón de 2.25 x 10x 2 mbar usando una velocidad de flujo de 1.5 mL/min. El voltaje para inyectar iones (sesgo de CC de trampa) en la célula IM se estableció en 12 V para evitar la disociación de iones, ya que inicialmente colisionaron con el gas tampón de nitrógeno. La célula IM separó los iones en función de su sección transversal de carga y colisión y utilizó una presión de nitrógeno de 0,52 mbar y una velocidad de flujo mínimade 20,0 ml. El IM fue operado con alturas de onda de desplazamiento rampadas de 12,0–20,0 V (+) o 8,0–30,0 V (o) y aumentó 800–1.500 m s1 (+) o 250–1.000 m s1 (o) velocidades por cada barrido a través de la celda de la onda itinerante IM. La celda de transferencia fue operada con la misma presión de argón que la célula de trampa y guió los iones resueltos de mensajería instantánea al analizador ortogonal de tiempo de vuelo de masa a carga. Los espectros de masa de movilidad ión se adquirieron sincronizando la liberación cerrada de iones en la célula de mensajería instantánea con el analizador de carga a carga de tiempo de vuelo.

Mediante condiciones ESI nativas, las propiedades de fase de solución, como el estado de carga y el estado de conformación, se conservan durante los análisis de IM-MS. Por ejemplo, los estados de carga de mb-OB3b y ambs observados durante los análisis IM-MS20,37 estaban estrechamente relacionados con los estados de carga esperados en la fase de solución40. El péptido mb-OB3b es tetrapropético y forma sólo iones cargados negativamente durante el análisis IM-MS40, ya sea Cu(I)-bound o Cu(I)-free, porque contiene el C-terminus (pKa < 1.7), dos grupos de oxazolona de enethiol (pKa 5.0 y 9,7), y el grupo Tyr (pKa a 11,0)42. Los ambs en su forma totalmente protestada tendrán una carga general de +2 debido al Término C (pKa 2), dos Suyos (pKa 6.0), dos Cys (pKa 8.3), y Tyr (pKa 11.0) sitios19,41. Por lo tanto, generalmente forman iones cargados positivamente a un pH de <6 y iones cargados negativamente a un pH de >6.

Los ambs también mostraron un comportamiento claro de unión Cu(I/II) dependiente del pH y actividad redox en la que Cu(I)-binding a un pH bajo pasó a la unión Cu(II) a un pH más alto. Las reacciones Cu(I/II) incluyeron la formación de la especie de amb oxidada(bueyamb) que contenía enlaces de disulfuro y varios multimers y múltiples enlaces Cu(I/II)(Figura 5 y Figura 6). Estas reacciones redox dependen del tiempo y se demostró que cuanto más largo sea el intervalo de tiempo (hasta 210 min) entre la preparación de la muestra y los análisis IM-MS, los productos más oxidados se observaron37. Por lo tanto, también es necesario considerar cuidadosamente la dependencia del tiempo de reacción en la observación de los productos.

Limitaciones: Las secciones transversales im-MS y de colisión teórica identifican qué tipo de coordinación prefiere cada ion metálico
Para ayudar a interpretar los datos IM-MS m/z y CCS, se llevó a cabo una búsqueda exhaustiva utilizando el nivel de teoría B3LYP/LanL2DZ. Los conformadores optimizados para geometría con diferentes sitios de coordinación se compararon entre su energía libre prevista y el acuerdo con el CCS medido por IM-MS. El modelado molecular de estos péptidos y sus complejos está limitado por el tipo de electrónica cálculos de estructura que se pueden aplicar a estos sistemas relativamente grandes. Otros métodos que han sido estudiados o recomendados incluyen el trabajo de Truhlar et al.43, quienes encontraron que M05-2X era el mejor DFT funcional y PM7 y MNDO/d eran buenos métodos semiempíricos NDDO para Compuestos que contienen Zn(II)44. Estos péptidos tienen un gran espacio de conformación y una investigación exhaustiva para localizar los conformadores de energía más bajos deben incluir la comparación de los diversos sitios quelantes de metales, varios enlaces de cis y péptidos trans, puentes de sal, unión de hidrógeno y interacción entre el grupo lateral aromático de Tyr y el catión de metal.

Importancia con respecto a los métodos existentes: Cu(I/II) y otros iones metálicos seleccionados en cuadrat en comparación entre mb-OB3b y ambs
La cristalografía de rayos X y la espectroscopia de RMN son las técnicas más comunes utilizadas para determinar la resolución atómica de la estructura terciaria de los péptidos. Sin embargo, los estudios de cristalografía de rayos X de metalopéptidos son escasos debido a problemas con la cristalización de estos complejos45. La RMN tampoco es adecuada para la interpretación de una muestra en la que las especies de oligopéptidos individuales estrechamente relacionadas están presentes46. Por lo tanto, el modelado molecular IM-MS y DFT son técnicas alternativas para estudiar las reacciones peptídicas, especialmente las que resultan de reacciones complejas de unión redox y Cu(I/II)20,37,40, 47. La fuerza de IM-MS es que puede resolver cada uno de los productos e identificar su composición molecular midiendo simultáneamente sus tiempos de m/z y llegada que se relacionan con la estequiometría, el estado de protonación y la estructura conformación.

Por ejemplo, el mb-OB3b quelará una variedad de iones metálicos, y su selectividad hacia cada ion fue mostrada por las valoraciones de iones metálicos IM-MS (Figura 7). Los resultados mostraron la preferencia mb-OB3b por la unión de Cu(I) y Ag(I), mientras que compararon los resultados a un pH de 7 con amb7. La Figura 8 muestra amb7 quelatos preferentemente Zn(II) y Ni(II). En general, los estudios amb mostraron que la sustitución de los dos enethiol-oxazolones por 2His-2Cys no excluyó cu(I/II)-binding, pero dio lugar a múltiples Cu(I)-binding vía coordinación de puente lineal (Figura 3) en comparación con el Cu(I) mononuclear(I) unión de la coordinación tetraédricos de mb-OB3b48. La reducción de Cu(II) también fue mediada por la oxidación tiol y la formación de puentes de disulfuro en contraste con el puente de disulfuro existente en apo-mb-OB3b y el alto potencial de reducción de mb-OB3b cargado de cobre, que apoya la fuerte preferencia por Cu(I)49 .

Aplicaciones futuras
Otros estudios IM-MS de péptidos amb están en marcha, en los que su secuencia primaria se modifica reemplazando el Suyo o Cys por Gly o Asp, mientras que el residuo Tyr se sustituye por Gly o Phe. Estos estudios también se están llevando a cabo en acetato de amonio de 10,0 mM, con el pH modificado con hidróxido de amonio (para pH 7, 8 y 9) para mantener la resistencia iónica total constante para cada muestra. Estos resultados se publicarán en breve.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este material se basa en el trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo 1764436, el apoyo a instrumentos NSF (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014) y recursos informáticos del Departamento de Energía (TX-W-20090427-0004-50) y L3 Communications . Agradecemos al grupo Bower de la Universidad de California - Santa Bárbara por compartir el programa Sigma y Ayobami Ilesanmi por demostrar la técnica en el video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

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