وضع العلامات المناعية للفخاخ خارج الخلية البشرية ومورين العدلات في الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ

Medicine
 

Summary

الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) هي هياكل ثلاثية الأبعاد ولدت من قبل المحببات العدلات حفز. وقد أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن الـ NETs تشارك في مجموعة واسعة من الأمراض. وقد يكون للكشف عن الـ NETs في الأنسجة أهمية تشخيصية، ولذلك يلزم وضع بروتوكولات موحدة لوضع العلامات على مكونات الشبكة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue. J. Vis. Exp. (151), e60115, doi:10.3791/60115 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

المحببات العدلات، وتسمى أيضا الكريات البيض متعددة الأشكال النووية (PMN) بسبب نواة الفصية، هي النوع الأكثر وفرة من الكريات البيض. وهي تنضج في نخاع العظم وتُطلق في الدم المحيطي، حيث تدور لمدة تنحو 6-8 ح. ومع ذلك، في الأنسجة، فإنها يمكن أن البقاء على قيد الحياة لعدة أيام. عن طريق الانحلال من خلال البطانة ، فإنها تترك مجرى الدم ، وتدخل الأنسجة ، وتهاجر نحو موقع العدوى بعد التدرجات الكيميائية. يمكن للالعدلات مكافحة الكائنات الحية الدقيقة الغازية عن طريق الفيروسيتو، وإزالة التحبيب، وتوليد الفخاخ خارج الخلايا العدلات (NETs). سيساعد هذا البروتوكول على الكشف عن الـ NETs في الأنسجة المضمنة بالبارافين. الـ NETs هي نتيجة لعملية تسمى NETosis، مما يؤدي إلى إطلاق المكونات النووية، الحبيبية، والسيتوبلازمية إما من العيش (NETosis الحيوية) أو الموت (NETosis الانتحارية) العدلات. في المختبر، تشكل الـ NETs هياكل تشبه السحابة، والتي تشغل مساحة أكبر عدة مرات من مساحة الخلايا التي نزلوا منها. العمود الفقري للNETs هو الكروماتين، والتي ترتبط بها مجموعة مختارة من البروتينات والببتيدات الناشئة من حبيبات والسيتوبلازم. وبالتالي، يتم الحفاظ على تركيز محلي عال من المركبات السامة بحيث يمكن للتكنولوجيات الجديدة التقاط وتعطيل مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات والطفيليات، في حين أن انتشار مكونات NET عالية النشاط مما يؤدي إلى الضرر في الأنسجة المجاورة محدودة. ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن الـ NETs، إذا تم توليدها بوفرة أو تطهيرها بشكل غير كاف، لديها إمكانات مرضية تتراوح بين أمراض المناعة الذاتية والسرطان. وهكذا، فإن الكشف عن الـ NETs في عينات الأنسجة قد يكون له أهمية تشخيصية، ويمكن أن يؤثر الكشف عن الـ NETs في الأنسجة المريضة على علاج المرضى. وبما أن عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين هي العينة القياسية المستخدمة في التحليل المرضي، فقد طُلب إنشاء بروتوكول لتلطيخ الفلورسنت لمكونات الشبكة في الأنسجة المضمنة بالبارافين باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجارياً.

Introduction

الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) لديها بنية معقدة ثلاثية الأبعاد. كشف التحليل المجهري للمسح الإلكتروني عالي الدقة أنها تتألف من ألياف ناعمة يبلغ قطرها 15-20 نانومتر (كروماتين) مرصعة بمجالات كروية من > 25 نانومتر والتي يفترض أنها تتكون من مجموعة متنوعة من حوالي 30 الحبيبية والسيتوبلازمية البروتينات والببتيدات1،2. عندما يتم إنشاؤها في المختبر من العدلات المعزولة، يمكن تحديد NETs عن طريق تلطيخ اثنين أو أكثر من مكوناتها عن طريق الفلورة المناعية (على سبيل المثال، الهيستونات والعدلات elastase [NE]). في الكريات البيض متعددة الأشكال غير المحفزة (PMN)، تقع النغمات حصرا في النواة، في حين يتم احتواء NE في حبيبات. خلال NETosis، NE يدخل النواة، حيث يعالج النغمات3،4. تتميز الـ NETs بالتوطين المشترك للمكونات، والتي يتم فصلها بوضوح في العدلات غير المحفزة. وبما أنه لا توجد حالياً أجسام مضادة تكشف حصراً عن الepitopes اتّهيّة محددة من NET (أي لا تتفاعل مع العدلات السذاجة)، فإن الكشف عن التوطين المشترك لبروتينات العدلات في الـ NETs هو السبيل الوحيد لتحديد الـ NETs.

في الأنسجة، لا يمكن الكشف عن الـ NETs بواسطة البقع النسيجية التقليدية (على سبيل المثال، عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين/يوسين [H&E]، الذي يصور الـ NETs على أنه مسحة مزرق شاحبة منتشرة). فقط عندما وفيرة للغاية، NETs يمكن تمييزها بوضوح مع H & E تلطيخ، كما هو الحال في thrombi5. وبما أن الـ NETs منتشرة في حد ذاتها، يجب الحفاظ على بنية الأنسجة على النحو الأمثل، لذلك فإن المستحضرات بالتبريد التي هي عرضة للحث على تجميد القطع الأثرية هي دون المستوى الأمثل لتحليل الـ NETs في الأنسجة. بدلا من ذلك، وقد ثبت تثبيت الفورمالديهايد وتضمين البارافين للحفاظ على بنية NET في الأنسجة جيدا2. (المناعية)الفحص النسيجي لأقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين هو الأسلوب القياسي للتحليل المرضي. كما يتم الحفاظ على الأنسجة في كتل البارافين حتى في درجة حرارة الغرفة (RT)، يمكن مقارنة عينات الأنسجة من العمل التشخيصي اليومي مع العينات التي تم إعدادها منذ سنوات، مع الأسئلة والتقنيات التي نشأت مؤخرا. لم يتم الكشف عن الـ NETs في الأنسجة حتى وقت قريب، وقد يؤدي التحليل المفصل لتكوين NET وإزالتها أثناء سير الأمراض إلى رؤى جديدة في مسببات الأمراض. استخدام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين له ميزة لا تقدر بثمن للسماح بتحليل المواد الأرشيفية وإجراء دراسات بأثر رجعي6. ومما لا شك فيه أن هذه الفوائد تأتي بتكلفة. قبل التضمين في البارافين، يجب أن تكون الأنسجة الفورمالديهايد ثابتة، وجافة وساخنة فوق 50 درجة مئوية. هذه الإجراءات تحفز الفلورة الذاتية الأنسجة، فضلا عن إخفاء الظهارة.

للحد من القطع الأثرية التثبيت، يجب أن تبقى فترة التثبيت إلى الحد الأدنى، لذلك يجب أن لا يتجاوز حجم عينات الأنسجة مساحة 20 مم × 30 ملم مع سمك ~ 3 ملم. يتم إصلاح عينات من هذا الحجم تماما بعد حضانة بين عشية وضحاها في RT في الفورمالديهايد، تليها بشكل مثالي الجفاف المباشر وتضمين البارافين. بدلاً من ذلك، يمكن تخزين عينات ثابتة لمدة 1 أو 2 أيام في المخزن المؤقت. بالنسبة لدراسات الفلورة المناعية، ينبغي إعداد المثبت طازجًا من البارافورمالهايد المذاب في مخزن مؤقت مناسب (على سبيل المثال، المالحة المخزنة بالفوسفات [PBS] أو المالحة المترسبة [TBS]). أثناء التحضير المثبت، يجب أن تبقى درجة الحرارة أقل من 60 درجة مئوية لمنع تشكيل حمض الفورميك. الفورماين، وهو المثبت القياسية لعلم الأمراض، لا ينبغي أن تستخدم لأنه يحتوي على الميثانول، والألدهيدات الأخرى، الكيتونات، وحمض الفورميك. هذه الشوائب تؤدي إلى زيادة النعت اخفاء والأنسجة الذاتية كبيرة.

لعلامات المناعة الناجحة، يجب أن يعود إخفاء الظهارة في عملية تسمى استرداد مستضد. يتم تسخين أقسام الأنسجة في عازلة مناسبة، والتي يعتقد أن كسر جسور الميثيلين، حتى تصبح epitopes في متناول الأجسام المضادة7. للكشف عن الـ NETs، يفضل استرجاع الظهارة الناجم عن الحرارة (HIER) على طرق أخرى مثل استخدام الإنزيمات البروتيوليتيكية. بشكل روتيني، يتم وضع العلامات المناعية لأقسام البارافين مع جسم مضاد واحد متبوعاً بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة بيروكسيداز، والذي يتم اكتشافه بالركيزة المعجّلة. بالمقارنة مع الفلورة المناعية، وأساليب الكشف المستندة إلى الإنزيم لديها أقل الدقة المكانية بسبب انتشار الركيزة يعجل، وعموما، الكشف في وقت واحد من أكثر من مستضد واحد محدود6.

كما لا توجد حاليا الأجسام المضادة التي ترتبط حصرا إلى NETs، ويستخدم هذا البروتوكول لتسمية اثنين من البروتينات، الهيستون 2B، وهو نووي، وelastase العدلات، والتي يتم توطينها في حبيبات. في العدلات غير المحفزة، يتم فصل هذه البروتينات، ولكن يتم توطينها في العدلات التي تمر بـ NETosis وفي NETs. ويمكن الكشف المتزامن عن مستضدين بهيئتين مضادتين رئيسيتين رُفعا في مضيفين مختلفين وأجسامان مضادتان ثانويتان خاصتان بالأنواع يحملان علامات مختلفة من الفلوروكروم. هذا التقرير هو توحيد للبروتوكول8 الذي نُشر سابقاً ويستخدم مزيجاً من أجساممضادة متاحة تجارياً تلطيخ مكونات NET بشكل موثوق به في الأنسجة المضمنة بالبارافين، الطازجة منها والأرشيفية على حد سواء، من أصل بشري ومورين.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكولات الأنسجة من قبل Landesamt für Gesundheit und Soziales، برلين، ألمانيا (G0121/16). وأجريت التجارب وفقا للتوجيه الأوروبي 2010/63/EU بشأن رعاية الحيوانات ورفاهها ومعالجتها.

1. التثبيت، والجفاف، وتضمين البارافين، والقسم، وتركيب المقاطع

  1. إعداد 2٪ محلول الفورمالديهايد عن طريق حل البارافورمالهايد في TBS (الحموضة 7.4). تجنب التدفئة فوق 60 درجة مئوية. بارد لRT. يمكن تخزين محلول الفورمالديهايد في -20 درجة مئوية.
  2. ضع الأنسجة الطازجة (هنا: رئة الماوس) في طبق بيتري زجاجي مع TBS. مع مشرط، تشريح إلى قطع لا تتجاوز 20 مم × 30 مم × 3 ملم في الحجم. تزج عينة في 2٪ محلول الفورمالديهايد في TBS.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم المثبت 20x على الأقل من الأنسجة.
  3. إصلاح في RT لمدة 8-20 ح. نقل العينات إلى TBS. مكان في أشرطة.
  4. الجفاف باستخدام سلسلة من الإيثانول (70٪، 80٪، 90٪، 96٪، 100٪، 100٪)، مع كل خطوة تدوم 1 ساعة.
  5. عينات واضحة 2X في 100٪ إكسيلين (ثنائي ميثيل البنزين)، كل خطوة 1 ح.
  6. نقع في البارافين 2X في 60 درجة مئوية (درجة حرارة ذوبان 54-56 درجة مئوية)، كل خطوة 1 ح.
  7. قم بتركيب العينات باستخدام قوالب التضمين، واستخدم أسفل الدرج كغطاء.
  8. اسمحوا البارافين ترسيخ وإزالة قوالب التضمين.
  9. إعداد 3 أقسام الأنسجة م، والسماح لهم تطفو على حمام المياه 37 درجة مئوية.
  10. تعويم أقسام على سطح الماء على الشرائح الزجاجية لاصقة(جدول المواد).
  11. أقسام الحضانة على الشرائح الزجاجية بين عشية وضحاها في 40 درجة مئوية لربط الأنسجة إلى الزجاج.

2. الإماهة، والحرارة الناجمة عن الإزالة، وتلطيخ، وتصاعد، والتحليل المجهري

  1. وضع أقسام على الشرائح الزجاجية في الرفوف وغمرها في وسائل الإعلام المستخدمة للجفاف والمقاصة، في ترتيب عكسي، مع كل خطوة لمدة 5 دقائق: 2X 100٪ إكسيلين، سلسلة الإيثانول (2X 100٪، 96٪، 90٪، 80٪، 70٪).
  2. يُسخّن حمام الماء مع طبق ساخن يتم التحكم في درجة حرارته إلى 70 درجة مئوية. وضع جرة مليئة باسترجاع الظهارة الناجمة عن الحرارة (HIER)-العازلة (درجة الحموضة 9؛ جدول المواد)،التي تحتوي على 10٪ الجلسرين كحاجز درجة الحرارة، في حمام مائي. عندما يصل المخزن المؤقت HIER إلى 70 درجة مئوية، ضع الحامل مع الشرائح في جرة المخزن المؤقت.
  3. حضانة الشرائح لمدة 120 دقيقة عند 70 درجة مئوية.
  4. إزالة جرة من حمام الماء والسماح لها باردإلى RT. شطف أقسام 3X مع الماء منزوع الأيونات ومرة واحدة مع TBS (درجة الحموضة 7.4).
  5. قم بإزالة السائل بعناية من الشرائح بين المقاطع مع ورق فلتر ملفوف أو مسحة قطنية، مما يترك المقاطع رطبة.
  6. إنشاء حاجز حول أقسام مع قلم حاجز الكاره للماء.
  7. أقسام الحضانة في حظر العازلة (1٪ الزلال المصل البقري [BSA]، 2٪ مصل الحمار العادي، 5٪ الجيلاتين الأسماك المياه الباردة والمنظفات [جدول المواد]في TBS) في RT لمدة 30 دقيقة لمنع الربط غير محددة.
  8. تخفيف الأجسام المضادة الأولية بتركيز 1 ميكروغرام/مل في المخزن المؤقت للحجب.
    ملاحظة: بالنسبة للأجسام NETs البشرية والماوس، يمكن استخدام مزيج من الأجسام المضادة للأرنب ضد الاستازه العدلات والأجسام المضادة للدجاج ضد الهيستون 2B(جدول المواد).
  9. ضع الشرائح في غرفة رطبة. إزالة حظر العازلة وإضافة الأجسام المضادة الأولية المخففة دون غسل إلى المقاطع باستخدام حجم كاف لمنع التجفيف. ختم غرفة رطبة مع فيلم البارافين وحضانة بين عشية وضحاها في RT.
  10. اغسل المقاطع 3x مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  11. إعداد حل العمل من الأجسام المضادة الثانوية في حظر المخزن المؤقت. للكشف عن الأجسام المضادة الأولية ، استخدم الأجسام المضادة الثانوية التي أثيرت في الحمير وممتصة مسبقا ضد بروتينات المصل من أنواع متعددة (جدول المواد). تغطية أقسام الأنسجة مع حل العمل من الأجسام المضادة الثانوية. نقل الشرائح إلى غرفة رطبة، وختم مع فيلم البارافين. حضانة لمدة ساعة واحدة في RT.
    ملاحظة: حمار المضادة الأرنب المترافقة مع Cy2 وحمار المضادة للدجاج المترافقة مع Cy3 يمكن الجمع بين مع مضاد الحمض النووي.
  12. اغسل المقاطع 3x لمدة 5 دقائق لكل منها مع TBS، ثم مرة واحدة لمدة 5 دقائق مع الماء منزوع الأيونات.
  13. تغطية أقسام مع تصاعد المتوسطة(جدول المواد)وتطبيق غطاء الزجاج تجنب تشكيل فقاعة.
  14. اسمحوا تصاعد تعزيز المتوسطة، ثم تحليل الفلورة المناعية باستخدام المجهر واسعة المجال مع مرشحات تمرير الفرقة المناسبة أو المجهر البؤري.

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن مكونات NET بنجاح في الأنسجة المضمنة البارافين على حد سواء من أصل الإنسان وmurine. في العدلات غير المحفزة، يقع H2B حصرا في النواة وelastase العدلات في حبيبات. وبالتالي، فإن إشارات الفلورة الخاصة بهم لا تتداخل. على النقيض من ذلك، خلال NETosis وبعد تشكيل NET، NE، H2B، والحمض النووي جزئيا colocalize. إذا تم تصويرها على أنها إشارات خضراء وحمراء وزرقاء، يتم تصوير مناطق التعريب على أنها تراكب أبيض(الشكل 1G، الشكل 2D، والشكل 3D). يمكن أيضًا تحديد هذا التراكب كمياً باستخدام برنامج تحليل الصور. تم استخدام وحدات البكسل من الإشارات المتداخلة الإيجابية للأخضر والأحمر والأزرق لإنشاء تراكب أرجواني يصور مناطق NET في الشكل 1Gوالشكل 2Dوالشكل 3D. بعض الخلايا في الشكل 1 والشكل 2 قد تم الناوية lobulated ولكن سلبية لNE. ويعتقد أن هذه الخلايا هي المحببات الحمضات.

إذا كانت أقسام الأنسجة لديها سمك 2-3 ميكرومتر، يمكن تحليلها عن طريق الفحص المجهري على نطاق واسع باستخدام أهداف 10x أو 20x. ومن الأمثلة على ذلك الشكل 1، الذي يصور قسما من أنسجة التهاب الزائدة الدودية البشرية ملطخة NE (الأخضر)، H2B (الأحمر) وهويشت 33342 (الأزرق). الأفرقة A و C وE و G هي من منطقة من القسم تحتوي على الـ NETs، في حين أن اللوحات B و D وF وH هي من منطقة مختلفة من نفس القسم، الذي يحتوي على العديد من العدلات(الشكل 1B،NE) ولكن لا NETs. يمكن العثور على المناطق ذات التشكيل الضخمة NET بسهولة حتى في التكبير منخفضة، منذ جميع مكونات NET الثلاثة colocalize، في كثير من الأحيان في هياكل خارج الخلية الوترية، والتي تظهر في تراكب القنوات الثلاث كألياف خارج الخلية بيضاء(الشكل 1G )، تراكب الأرجواني في الشكل 1G'.

أنماط تلطيخ كل من مناطق الأنسجة مختلفة بوضوح، مع NE الواردة في حبيبات(الشكل 1B)والحمض النووي في النوى(الشكل 1F). ومن المثير للاهتمام، وتلطيخ لH2B ضعيفة إلى حد ما في المناطق الغنية العدلات(الشكل 1D)مقارنة مع الأنسجة التي تحتوي على صافي(الشكل 1C). وهذا يمكن أن يكون بسبب حجم الأجسام المضادة (IgY لديه 180 كيلوD مقارنة مع 150 كيلوD لIgG)، والتي قد تمنع ربط الكروماتين المدمجة في النوى سليمة، في حين يتم تسهيل الوصول إلى H2B إذا تم إزالة المكثفات الكروماتين كما هو الحال في NETs (الشكل 1C).

للحصول على دقة أعلى، يجب استخدام المجاهر البؤرية أو المجاهر العريضة مع الإنقوبة لتقليل الضبابية خارج التركيز. يصور الشكل 2 منطقة غنية بالشبكة من نفس عينة التهاب الزائدة الدودية البشرية. وهو إسقاط الحد الأقصى لمكدس البؤري. NE (الأخضر، الشكل 2A)موجود في حبيبات ولكن أيضا وفيرة خارج الخلية، حيث أنه يكمب مع H2B (الأحمر، الشكل 2B)والحمض النووي (الأزرق، الشكل 2C). يؤدي التعريب خارج الخلية إلى مزيج من الألوان البيضاء(الشكل 2D). وقد استخدمت هذه البيكسلات الإيجابية للأخضر والأحمر والأزرق لإنشاء تراكب الأرجواني تقديم NETs في الشكل 2D'.

الشكل 3 هو تفصيل لقسم مركزي من رئة فأر مصابة بالسل المتفطر (M. tb). حالة استرجاع المستضد وتلطيخها هي نفسها بالنسبة للشكل 1 والشكل 2. مرة أخرى، التعريب المشترك لجميع مكونات NET الثلاثة واضحة للعيان كمناطق بيضاء بين العدلات، والتي تم استخدامها لإنشاء طبقة أرجوانية تشير إلى NETs في الشكل 3D'.

وتتجلى خصوصية تلطيخ في الشكل التكميلي 1، الذي يصور تلطيخ لا يكاد يذكر مع الأجسام المضادة للتحكم ، والشكل التكميلي 1A ، B يصور مصل الأرنب غير المناعي (الأخضر) والدجاج المضادة لGFP IgY (الأحمر). الشكل 1 C، D يظهر تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية وحدها، وكان الجمع نفسه كما كان يستخدم في الشكل الشكل 2، والشكل 3. ويبين الشكل التكميلي 1ألف،(ج) قسماً من التهاب الزائدة الدودية البشري مشابهاً للشكل 1 والشكل 2. الشكل التكميلي 1B، D هو أنسجة الرئة الماوس مماثلة للشكل 3. الحمض النووي ملطخ بـ Hoechst 33342. شريط مقياس يمثل 25 ميكرومتر.

Figure 1
الشكل 1: الفحص المجهري الفلوري الواسع النطاق لقسم البارافين من عينة التهاب الزائدة الدودية البشرية.
تصور اللوحات A وC وE وG منطقة الأنسجة مع الـ NETs، في حين تظهر اللوحات B وD وF وH منطقة مختلفة من نفس القسم الغني في العدلات ولكن بدون تكوين NET. تلطيخ ضد NE(A, B; الأخضر), H2B(C, D; الأحمر), والحمض النووي(E, F; الأزرق). الشكل 1G،H يمثل تراكب جميع القنوات الثلاث. تمثل البيكسلات التي تتراوح شدتها بين 80 و256 في جميع الألوان مناطق تلطيخ متداخلة لـ NE وH2B وDNA وتعتبر مشتقة من الـ NETs أو العدلات التي تخضع لـ NETosis. وقد تم هذه بكسل الزائفة اللون الأرجواني في لوحة G '، حيث أنها تشكل مساحة كبيرة. وفي اللوحة H'، حيث يتم العثور على بقع صغيرة فقط. وقد التقطت الصور بمجهر واسع النطاق باستخدام هدف 20 x، ويمثل شريط المقياس 25 ميكرومتر.

Figure 2
الشكل 2: الفحص المجهري للفلورة البؤرية لمكونات الشبكة في عينة من التهاب الزائدة الدودية البشرية.
تم استخدام نفس قسم الأنسجة المستخدم في الشكل 1. (أ)تلطيخ ضد NE،(ب) تصوير H2B، و(ج)Hoechst 33342 تلطيخ الحمض النووي. (D)تراكب القنوات الثلاث جميعها. التعريب من جميع الإشارات الثلاث هو الزائفة اللون الأرجواني في لوحة D'. لهذا، تم الكشف عن بكسل مع كثافة >80 في جميع الألوان الثلاثة باستخدام Volocity 6.3. تُصوّر المنطقة الأرجوانية الـ NETs أو العدلات التي تخضع لـ NETosis. وقد التقطت الصور مع مجهرية البؤرية كما Z-مداخن وقدمت كإسقاط الحد الأقصى. شريط مقياس يمثل 25 درجة.

Figure 3
الشكل 3: الفحص المجهري للفلورة البؤرية لمكونات الشبكة في رئة فأر مصابة بالسل M.
هو تفصيل من الجزء مركزية من قسم من رئة كاملة مع ضخمة [العدلروفل] تسلل. (أ)NE تلطيخ،(ب)H2B تلطيخ، و(C)تلطيخ الحمض النووي. (D)تراكب القنوات الثلاث جميعها. يشير التراكب الأرجواني في اللوحة D' إلى وحدات البكسل ذات قيم الكثافة >80 في جميع الألوان الثلاثة التي تشير إلى العدلات التي تخضع لـ NETosis وكذلك NETs. وقد التقطت الصور كأكوام Z مع المجهر البؤري وقدمت كإسقاط الحد الأقصى. شريط مقياس يمثل 25 درجة.

الشكل التكميلي 1: التحكم في تلطيخ الأجسام المضادة الأولية غير ذات الصلة. الإنسان(A, C)والأنسجة المورين(B, D)كما كان يستخدم للشكل 1 و الشكل 2، والشكل 3،على التوالي، كانت ملطخة بالأجسام المضادة الأولية لا علاقة لها(A, B)أو بدون الأجسام المضادة الأولية(C, D). كما السيطرة على الأجسام المضادة الأولية في الألواح A و B، تم تطبيق المصل من أرنب غير محصنة والدجاج IgY ضد GFP. وكانت الأجسام المضادة الثانوية هي نفسها كما هو مبين في جميع تلطيخ الأخرى وتستخدم أيضا في لوحات C و D. وكما هو متوقع، في جميع الظروف، تم الكشف عن تلطيخ خلفي لا يُذكر، مما يوضح خصوصية الأجسام المضادة المستخدمة في الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3. وقد التقطت الصور مع المجهر البؤري، الحمض النووي ملطخة Hoechst 33342، وشريط مقياس يمثل 25 م. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الرقم.

Discussion

مع تزايد الوعي بدور NETs خلال مسببات الأمراض9، الكشف عنها في الأنسجة من المرضى أو الحيوانات التجريبية تكتسب أهمية متزايدة. عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين لديها عدد من المزايا بالمقارنة مع غيرها من المستحضرات الأنسجة (على سبيل المثال، أقسام من العينات المحفوظة بالتبريد). ومن الواضح أن الحفاظ على الأنسجة في العينات المضمنة بالبارافين متفوق، وبمجرد أن يتم دمجها، يتم الحفاظ على العينات لعقود، مما يتيح إجراء دراسات رجعية. للكشف عن الـ NETs، التي هي هياكل التخريم، حفظ عينة جيدة هو شرط مسبق يستبعد استخدام المواد المحمية بالتبريد، والتي هي عرضة لتلف الأنسجة بسبب تشكيل الكريستال الجليد التي يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية تشبه شكليا شبكات.

للحفظ الأمثل، يجب إصلاح الأنسجة من الحيوانات التجريبية بعد وقت قصير من الموت، من الناحية المثالية عن طريق التسريب، لتجنب الانلل التلقائي. كما المثبتة، أعدت حديثا أو الحلول الطازجة من البارافورمالهايد في عازلة مناسبة مثل TBS أو خام PBS الأمثل. يتم تعريف هذا كيميائيا على النقيض من الاستعدادات formalin المستخدمة في الأنسجة القياسية، ويحفز أقل الأنسجة autofluorescence. على النقيض من ذلك، لا يتم إصلاح الأنسجة البشرية في كثير من الأحيان مباشرة بعد الختان، وكما المثبتة، وعادة ما يتم استخدام تخفيف 10٪ من formalin الذي يحتوي على 10٪ إلى 15٪ من الميثانول كمثبت لمنع البلمرة، فضلا عن حمض الفورميك، والألدهيدات الأخرى، والكيتونات . في كثير من الأحيان، يتم تخزين الأنسجة في هذا المثبت لفترات طويلة من الوقت قبل التضمين. يمكن أن تكون النتيجة الانلل التلقائي (اعتمادا على الوقت بين الختان والتثبيت)، وتشكيل مفرط من جسور الميثيلين بسبب الإفراط. تثبيت الفورمالديهايد يحفز تغييرات في الهيكل الثالثي للبروتينات عن طريق تشكيل جسور الميثيلين داخل وبين الجزيئية10. مكونات الخلايا غير البروتينية مثل الأحماض النووية والكربوهيدرات والدهون ليست ثابتة مباشرة، ولكن هائجة في شبكة البروتين ثلاثي ة الأبعاد. وللحصول على وضع العلامات الناجحة، يتعين كسر روابط الميثيلين لفضح الأوطاب في عملية استرجاع المستضد. ويتم ذلك عن طريق تسخين أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح المجهر في مناسبة الحرارة الناجمة عن مستضد المستضد العازلة (HIER العازلة)11. قامت دراستنا السابقة بتحليل تأثير درجة الحموضة ودرجة حرارة المخازن المؤقتة HIER على الكشف عن مكونات NET في الأنسجة المفبرة، ووجد أن المعالجة المسبقة الناجحة للأنسجة لمكون واحد غالبا ً ما تكون دون المستوى الأمثل للمكون الثاني8.

في هذه الأثناء، تم العثور على أن تسخين الأنسجة إلى 70 درجة مئوية في المخزن المؤقت HIER في درجة الحموضة من 9 هو حل وسط جيد لكثير من مكونات NET وسوف تحتفظ الحفاظ على الأنسجة جيدة، والتي غالبا ما تتعرض للخطر في درجات حرارة أعلى. ويُقترح استخدام وقت الاسترجاع المشار إليه كنقطة انطلاق، ولكن لا سيما مع عينات المحفوظات من بارامترات التثبيت غير المعروفة، يمكن أن تكون شدة التلطيخ غير مرضية. في هذه الحالة، يمكن إطالة أو ارتفاع درجة الحرارة أثناء إجراء الاسترجاع تحسين كفاءة تلطيخ. وهذا يمكن أن تؤثر أيضا على تلطيخ الهيستون 2B من الأجسام المضادة IgY المستخدمة في بروتوكولنا. كما هو مبين في الشكل 1، يمكن العثور على الكروماتين منزوع المكثف في العدلات التي تمر NETosis وكذلك في البقع NETs أقوى بكثير مع هذا الجسم المضاد مقارنة مع الكروماتين في العدلات يستريح. هذا ربما يرجع إلى تقييد الوصول إلى جزيء IgY 180 كيلودا إلى نوى مدمجة، وقد تختلف بعد زيادة الانتعاش الظهاري. وهذا قد يكثف كفاءة ملزمة حتى في مجالات الكروماتين المكثف، والتي سوف تؤدي إلى الفلورة أقوى في النوى العادية من العدلات وغيرها من الخلايا. الفرق في تلطيخ الكفاءة بين العدلات التي تمر NETosis والعدلات غير محفزيمكن أن تكون أقل وضوحا مما هو موضح في الشكل 1. ولا يزال من المقرر تحديد مناطق تكوين الشبكة من خلال التوطين المشترك لـ NE وH2B وDNA.

يمكن إجراء التثبيت أيضا أن يؤدي إلى الفلورة الذاتية كبيرة من الأنسجة، أساسا في الجزء المزرق / الأخضر من الطيف. من المهم تجنب معظم هذه الفلورة باستخدام مجموعات كافية من فلتر الفلورة الضيقة (المجال الواسع) أو إعدادات الكشف (البؤرة) التي تتطابق مع الحد الأقصى للانبعاثات من الفلوروكروم المستخدم مع الإثارة الزرقاء، على سبيل المثال، Cy2، Alexafluor 488- وفي الحالات القصوى من الفلورة الذاتية، ينبغي تجنب الجزء المزرق/الأخضر من الطيف. بدلاً من ذلك، يمكن الكشف عن إشارات الفلورة أسهل في الجزء الأحمر البعيد من الطيف (على سبيل المثال، الأجسام المضادة الثانوية المقترنة Cy 5 أو Alexafluor 635)، ولكن هذا يتطلب كاميرات سوداء/بيضاء غير مرشحة أو مجاهر بؤرية. وبما أن العين البشرية غير حساسة إلى حد ما تتجاوز 600 نانومتر، لا يمكن اكتشاف إشارات الفلورة الحمراء البعيدة باستخدام العين. وعلى أية حال، من المهم استخدام عناصر التحكم السلبية (مثل ضوابط سيرا/إيسوتيبي غير المناعية بدلاً من الأجسام المضادة الأولية أو حذف الأجسام المضادة الأولية) لتحديد أوقات التعرض المناسبة أو إعدادات الكاشف.

يمكن تحليل مقاطع الأنسجة من 1-2 ميكرومتر باستخدام مجاهر واسعة باستخدام أهداف 10x أو 20x. توفر هذه العدسات عمق بؤري كبير، لذلك (تقريبا) قسم الأنسجة بأكمله سيكون في التركيز. ويمكن استخدام هذا لمسح أقسام الأنسجة بسرعة لمناطق تكوين NET إذا كانت كبيرة بما فيه الكفاية (كما هو الحال في الشكل 1). التعريب المشترك للقنوات الخضراء (NE) والأحمر (H2B) والأزرق (DNA) يؤدي إلى تلطيخ أبيض يشير إلى مناطق تشكيل NET(الشكل 1G). بالنسبة للتكبيرات الأعلى، من الضروري وجود مجاهر مجهر ذات بؤرية أو واسعة مع deconvolution. ويبين الشكل 2 تفاصيل عينة التهاب الزائدة الدودية البشرية المستخدمة أيضاً في الشكل 1. في الشكل 2A، NE توطين إلى نقاط صغيرة (حبيبات) ، ولكن نسبة كبيرة خارج الخلية ، وغالبا ما تشكل المشارب التي تتداخل مع H2B(الشكل 2B) والحمض النووي(الشكل 2C). ينتج عن هذا التعريب المشترك تراكب أبيض يشير إلى NETs(الشكل 2D). ويمكن العثور على نمط مماثل جدا في قسم الرئة من فأر مصاب بالسل M. (الشكل 3).

وتتميز العينات المعروضة هنا بمناطق ذات درجة عالية من تكوين NET التي يمكن تحديدها حتى عند التكبير المنخفض. اعتمادا على كثافة الأنسجة والتحفيز ذات الصلة، تشكيل NET يمكن أن يكون أقل وضوحا بكثير، وصولا إلى تشكيل صافي من مجموعات صغيرة من العدلات (على سبيل المثال في التهاب عضلة القلب، انظر منشور سابق12). ويُعتقد أن هذا البروتوكول سيساعد على تعزيز المزيد من البحوث بشأن الـ NETs في الأنسجة، ونأمل أن يساعد في كشف الأدوار غير المعترف بها للأمراض غير المعترف بها في تكوين الأمراض أو الوقاية منها.

Disclosures

ومصدر تمويل هذا العمل هو جمعية ماكس بلانك. نشكر أرتورو زيكلينسكي على قراءة المخطوطة بشكل نقدي وفيليب سايكالي على أنسجة الفأر.

Acknowledgments

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bovine serum albumine Sigma A7906
chicken anti Histone 2B antibody Abcam ab 134211
cold water fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 703-165-155
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 711-225-152 alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152
embedding cassettes Roth K116.1
embedding molds Sakura 4162
embedding station Microm AP280
ethanol Roth 9065.4
filter paper, rolled OCB
forceps Dumont 7a
glass cylinder with 20 cm diameter VWR 216-0075
glycerol Roth 3783.1
HIER buffer pH 9 Scytek TES999
Hoechst 33342 Sigma 14533
incubator (dry, up to 40 °C) Memmert MMIPP30
moist chamber (plastic box with tight lid) Emsa 508542
Mowiol 40-88 Aldrich 32.459-0
normal donkey serum Merck S30
PAP-pen ImmEdge Vector Lab H-4000
paraffin microtome Microm 355S water bath included
paraformaldehyde Aldrich 16005
petri dishes Schubert /Weiss 7020051
rabbit anti ELANE antibody Atlas HPA068836
racks, jars for microscope slides Roth H554.1 H552.1
scalpel Braun Fig.22
Superfrost Plus glass slides Thermo Scientific J1800AMNZ
temperature-controlled hot plate NeoLab D6010
tissue processor for paraffin embedding Leica TP1020
Tris buffered saline TBS VWR 788
Triton X100 Roth 3051.4
Tween 20 Fluka 93773
water bath 37 °C GFL 1052
widefield or confocal microscope Leica DMR, SP8
xylene (dimethylbenzene) Roth 9713.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5, (10), e1000639 (2009).
  3. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176, (2), 231-241 (2007).
  4. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191, (3), 677-691 (2010).
  5. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69, (2), 181-182 (2016).
  6. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
  7. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84, (3), 300-306 (2004).
  8. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  9. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, (2), 134-147 (2018).
  10. Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171, (2), 83-98 (1993).
  11. Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53, (1), 13-21 (2005).
  12. Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216, (2), 350-368 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics