पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में मानव और मूत्र न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्यूलर ट्रैप्स का इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग

Medicine
 

Summary

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (नेट) प्रेरित न्यूट्रोफिल ग्रैन्युलोसाइट्स द्वारा उत्पन्न तीन आयामी संरचनाएं हैं। हाल के वर्षों में यह स्पष्ट हो गया है कि एनआईटी विभिन्न प्रकार की बीमारियों में शामिल हैं। ऊतक में एनेट की जांच नैदानिक प्रासंगिकता हो सकती है, इसलिए नेट घटकों लेबलिंग के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।

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Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue. J. Vis. Exp. (151), e60115, doi:10.3791/60115 (2019).

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Abstract

न्यूट्रोफिल ग्रैन्युलोसाइट्स, जिसे पॉलीमॉर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स (पीएमएन) भी कहा जाता है, उनके लॉबीकृत नाभिक के कारण, ल्यूकोसाइट्स का सबसे प्रचुर मात्रा में प्रकार है। वे अस्थि मज्जा में परिपक्व और परिधीय रक्त में जारी कर रहे हैं, जहां वे के बारे में 6 के लिए प्रसारित 8 ज; हालांकि, ऊतक में, वे दिनों के लिए जीवित रह सकते हैं. एंडोथेलियम के माध्यम से डायपेडिसिस द्वारा, वे रक्त प्रवाह को छोड़ देते हैं, ऊतकों में प्रवेश करते हैं, और कीमोटेक्टिक ग्रेडिएंट्स के बाद संक्रमण की साइट की ओर पलायन करते हैं। न्यूट्रोफिल ्स-वे पर हमला करने वाले सूक्ष्मजीवों का मुकाबला फैगोसाइटोसिस, विग्रेनुलन और न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप्स (एनईटीएस) से कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में एन्ट का पता लगाने में मदद करेगा। NETs NETosis नामक एक प्रक्रिया का परिणाम है, जो या तो रहने से परमाणु, दानेदार, और कोशिकाद्रव्यी घटकों की रिहाई की ओर जाता है (महत्वपूर्ण NETosis) या मर (आत्मघाती NETosis) न्यूट्रोफिल. इन विट्रो में, एननईटीएस क्लाउड जैसी संरचनाओं का निर्माण करती है, जो उन कोशिकाओं की तुलना में कई गुना बड़ी जगह पर कब्जा करती है, जहां से वे उतरी थीं। एनटीएस की रीढ़ क्रोमैटिन है, जिसके लिए कण ों और कोशिकाद्रव्य से निकलने वाले प्रोटीन और पेप्टाइड्स का चयन बाध्य होता है। इस प्रकार, विषाक्त यौगिकों की एक उच्च स्थानीय एकाग्रता बनाए रखा है ताकि NETs पर कब्जा कर सकते हैं और बैक्टीरिया सहित रोगजनकों की एक किस्म निष्क्रिय, कवक, वायरस, और परजीवी, जबकि अत्यधिक सक्रिय नेट घटकों के प्रसार में नुकसान के लिए अग्रणी पड़ोसी ऊतक सीमित है. फिर भी, हाल के वर्षों में यह स्पष्ट हो गया है कि NETs, अगर बहुतायत में उत्पन्न या अपर्याप्त मंजूरी दे दी, autoimmune रोगों से कैंसर को लेकर रोग की क्षमता है. इस प्रकार, ऊतक नमूनों में एनईटीएस का पता लगाने का नैदानिक महत्व हो सकता है, और रोगग्रस्त ऊतकों में एनईटीएस का पता लगाने से रोगियों के उपचार को प्रभावित किया जा सकता है। चूंकि पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक के नमूने पैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक नमूने हैं, इसलिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में नेट घटकों के फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने की मांग की गई थी।

Introduction

न्यूट्रोफिल बाह्यकोशिकीय जाल (नेट) की एक जटिल त्रि-आयामी संरचना होती है। उच्च संकल्प स्कैनिंग-इलेक्ट्रोन सूक्ष्म विश्लेषण से पता चला कि वे 15 डिग्री 20 एनएम (क्रोमाटिन) के एक व्यास के साथ चिकनी फाइबर से मिलकर बनता है के गोलाकार डोमेन के साथ जड़ी और 25 एनएम जो संभवतः के बारे में एक वर्गीकरण से मिलकर बनता है 30 दानेदार और cytoplasmic प्रोटीन और पेप्टाइड्स1,2. अलग न्यूट्रोफिल से इनट्रो में उत्पन्न होने पर, NETs इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अपने दो या अधिक घटकों के धुंधला द्वारा पहचाना जा सकता है (जैसे, हिटोन्स और न्यूट्रोफिल इलैस्टेज [NE])। अउत्तेजित बहुरूपानोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स (पीएमएन) में, हिटोन्स विशेष रूप से नाभिक में स्थित होते हैं, जबकि एनई कणिकाओं में निहित होता है। NETosis के दौरान, एनई नाभिक में प्रवेश करती है, जहां यह अपने tones3,4प्रक्रियाओं. NETs घटकों के सहस्थानीकरण की विशेषता है, जो स्पष्ट रूप से unstimulated न्यूट्रोफिल में अलग कर रहे हैं. चूंकि वर्तमान में कोई एंटीबॉडी मौजूद है कि विशेष रूप से नेट विशिष्ट epitopes का पता लगाने (यानी, भोले न्यूट्रोफिल के साथ प्रतिक्रिया नहीं है), NETs में न्यूट्रोफिल प्रोटीन के colocalization का पता लगाने के लिए एक ही रास्ता है NETs की पहचान है.

ऊतक में, NETs शायद ही पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल दाग द्वारा पता लगाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, hematoxylin/eosin [एच एंड ई] के साथ धुंधला द्वारा, जो एक फैलाना पीला नीला रंग के रूप में NETs दर्शाया गया है). केवल जब अत्यधिक प्रचुर मात्रा में, NETs स्पष्ट रूप से एच एंड ई धुंधला के साथ प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जैसे थ्रोम्बी5में . चूंकि एनटीएस प्रति से फैलाना कर रहे हैं, ऊतक संरचना को बेहतर संरक्षित किया जाना है, इसलिए क्रायो-तैयारी जो ठंड कलाकृतियों को प्रेरित करने के लिए प्रवण हैं ऊतक में एनईटीएस के विश्लेषण के लिए suboptimal हैं। इसके बजाय, फार्मेल्डिहाइड निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग को ऊतक में नेट संरचना को अच्छी तरह से2को संरक्षित करने के लिए दिखाया गया है। (इम्युनो-) पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक के वर्गों का शास्त्रीय निरीक्षण पैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए मानक विधि है। के रूप में पैराफिन ब्लॉक में ऊतक भी कमरे के तापमान (आरटी) में संरक्षित है, दैनिक नैदानिक काम से ऊतक नमूनों नमूनों कि साल पहले तैयार किया गया है के साथ तुलना की जा सकती है, सवाल और तकनीक है कि हाल ही में पैदा हुई है के साथ. ऊतक में NETs हाल ही में जब तक पता नहीं किया गया है, और रोगों के दौरान नेट गठन और हटाने के विस्तृत विश्लेषण रोगजनन में नई अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक के उपयोग का अमूल्य लाभ है ताकि अभिलेखीय सामग्री के विश्लेषण की अनुमति दी जा सके और पूर्वव्यापी अध्ययन6किया जा सके। इसमें कोई शक नहीं कि ये लाभ एक कीमत पर आते हैं। पैराफिन में एम्बेड करने से पहले, ऊतक को फॉर्मेल्डिहाइड-फिक्स्ड, निर्जलित और 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गर्म करना होगा। इन प्रक्रियाओं ऊतक autofluorscence के रूप में के रूप में अच्छी तरह से epitope मास्किंग प्रेरित.

निर्धारण कलाकृतियों को सीमित करने के लिए, निर्धारण समय को कम से कम रखा जाना चाहिए, इसलिए ऊतक नमूनों का आकार $ 3 मिमी मोटाई के साथ 20 मिमी x 30 मिमी के क्षेत्र से अधिक नहीं होना चाहिए। इस आकार के नमूने पूरी तरह से formaldehyde में आरटी में रात भर ऊष्मायन के बाद तय कर रहे हैं, आदर्श प्रत्यक्ष निर्जलीकरण और पैराफिन embedding द्वारा पीछा किया. वैकल्पिक रूप से, निश्चित नमूने बफर में 1 या 2 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसींस अध्ययन के लिए, फिक्सेटिव को एक उपयुक्त बफर (उदाहरण के लिए, फॉस्फेट-बफर नमकीन [पीबीएस] या ट्रिस-बफर नमकीन [टीबीएस] में भंग पैराफॉर्मेल्डिहाइड से ताजा तैयार किया जाना चाहिए। स्थिर तैयारी के दौरान, फोरमिक एसिड के गठन को रोकने के लिए तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखा जाना चाहिए। फॉर्मेलिन, जो पैथोलॉजी के लिए एक मानक स्थिर है, का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इसमें मेथनॉल, अन्य एल्डिहाइड, कीटोन, और फॉर्मिक एसिड होता है। इन अशुद्धियों से एपिटोप मास्किंग और महत्वपूर्ण ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि होती है।

सफल इम्यूनोलेबलिंग के लिए, एंटीजन रिट्रीवल नामक प्रक्रिया में एपिटोप मास्किंग को वापस करना होगा। ऊतक वर्गों एक उपयुक्त बफर में गर्म कर रहे हैं, जो मेथिलीन पुलों को तोड़ने के लिए माना जाता है, तो प्रतीक एंटीबॉडी7के लिए सुलभ हो जाते हैं. NETs का पता लगाने के लिए, गर्मी प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति (HIER) proteolytic एंजाइमों के उपयोग के रूप में अन्य तरीकों के लिए पसंद किया जाता है. नियमित रूप से, पैराफिन वर्गों के इम्यूनोलेबलिंग एक एकल एंटीबॉडी के साथ किया जाता है जिसके बाद एक peroxidase-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी, जो एक precipating सब्सट्रेट के साथ पता चला है। इम्यूनोफ्लोरेसी की तुलना में, एंजाइम-आधारित पता लगाने के तरीकों में सब्सट्रेट वेग के प्रसार के कारण कम स्थानिक संकल्प होता है, और आम तौर पर, एक से अधिक प्रतिजन का एक साथ पता लगाने सीमित6होता है।

वर्तमान में कोई एंटीबॉडी मौजूद है कि विशेष रूप से NETs के लिए बाध्य के रूप में, इस प्रोटोकॉल दो प्रोटीन लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है, histone 2B, जो परमाणु है, और न्यूट्रोफिल elastase, जो granules में स्थानीयकृत है. अउत्तेजित न्यूट्रोफिल में, ये प्रोटीन अलग हो जाते हैं, लेकिन वे NETosis के दौर से गुजर रहे न्यूट्रोफिल में सहस्थानीकृत होते हैं। दो एंटीजन का एक साथ पता लगाने के दो प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न मेजबानों में उठाया और दो प्रजातियों-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी विभिन्न fluorchromes के साथ लेबल के साथ प्राप्त किया जा सकता है. यह रिपोर्ट हमारे पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल8 का मानकीकरण है और दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग करता है जो कि मानव और मरिन मूल दोनों ताजा और अभिलेखीय, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में नेट घटकों को मज़बूती से दागते हैं।

Protocol

ऊतक प्रोटोकॉल Landesamt f]r Gesundheit und Soziales, बर्लिन, जर्मनी (G0121/ पशुओं की देखभाल, कल्याण और उपचार पर यूरोपीय निर्देश 2010/63/ईयू के अनुसार प्रयोग किए गए थे।

1. फिक्सेशन, निर्जलीकरण, पैराफिन एम्बेडिंग, अनुभागीकरण, वर्गों के बढ़ते

  1. टीबीएस (पीएच 7.4) में पैराफॉर्मेल्डिहाइड को भंग करके 2% फॉर्मेल्डिहाइड समाधान तैयार करें। 60 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गर्म करने से बचें। RT. Formaldehyde समाधान करने के लिए कूल -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. टीबीएस के साथ एक गिलास पेट्री डिश में ताजा ऊतक (यहाँ: माउस फेफड़े) रखें। एक स्केलपेल के साथ, आकार में 20 मिमी x 30 मिमी x 3 मिमी से अधिक नहीं टुकड़ों में विच्छेदन। टीबीएस में 2% फार्मेल्डिहाइड समाधान में नमूना विसर्जित करें।
    नोट: fixative की मात्रा कम से कम 20x कि ऊतक के होना चाहिए.
  3. 8 डिग्री 20 ज के लिए आरटी पर फिक्स टीबीएस के लिए नमूनों स्थानांतरण. कैसेट में जगह.
  4. इथेनॉल की एक श्रृंखला का उपयोग निर्जलीकरण (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), प्रत्येक कदम 1 ज स्थायी के साथ.
  5. 100% xylene (dimethylbenzene) में नमूनों 2x साफ़ करें, प्रत्येक चरण 1 ज.
  6. पैराफिन 2x में 60 डिग्री सेल्सियस (मेलिंग तापमान 54 डिग्री 56 डिग्री सेल्सियस) में भिगो दें, प्रत्येक चरण 1 ज।
  7. embedding मोल्ड का उपयोग कर नमूना माउंट, एक कवर के रूप में कैसेट नीचे का उपयोग करें.
  8. पैराफिन को ठोस करने दें और एम्बेडिंग मोल्ड्स को हटा दें।
  9. 3 डिग्री मीटर ऊतक खंड ों को तैयार की, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर तैरने दें।
  10. जल की सतह पर फ्लोट सेक्शन्स को चिपकने वाले कांच की स्लाइडों पर(सामग्री की सारणी) पर ले जाता है।
  11. कांच स्लाइड पर वर्गों को कांच के लिए ऊतक को बांधने के लिए रात भर 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट वर्गों।

2. पुनर्जलीकरण, गर्मी प्रेरित epitope पुनर्प्राप्ति, धुंधला, बढ़ते, सूक्ष्म विश्लेषण

  1. रैक में कांच स्लाइड पर वर्गों प्लेस और उन्हें निर्जलीकरण और समाशोधन के लिए इस्तेमाल किया मीडिया में submerse, रिवर्स क्रम में, के लिए प्रत्येक कदम के साथ 5 मिनट: 2x 100% xylene, इथेनॉल श्रृंखला (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
  2. 70 डिग्री सेल्सियस के लिए एक तापमान नियंत्रित गर्म थाली के साथ एक पानी के स्नान गर्मी। गर्मी प्रेरित एपिटोप रिट्रीवल (एचआईआर)-बफर (पीएच 9) से भरा एक जार रखें; सामग्री की तालिका), एक तापमान बफर के रूप में 10% ग्लिसरोल युक्त, एक पानी के स्नान में. जब HIER बफर 70 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच गया है, बफर जार में स्लाइड के साथ रैक जगह है.
  3. 70 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिनट के लिए इनक्यूबेट स्लाइड।
  4. पानी के स्नान से जार निकालें और इसे आरटी को ठंडा होने दें। डीनीकृत पानी के साथ 3x और एक बार टीबीएस (पीएच 7.4) के साथ।
  5. ध्यान से लुढ़का फिल्टर कागज या कपास झाड़ू के साथ वर्गों के बीच स्लाइड से तरल निकालें, वर्गों हाइड्रेटेड छोड़ने.
  6. एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ वर्गों के आसपास बाधा बनाएँ.
  7. बफर अवरुद्ध में इनक्यूबेट वर्गों (1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [BSA], 2% सामान्य गधा सीरम, 5% ठंडे पानी मछली जिलेटिन और डिटर्जेंट [सामग्री की तालिका] टीबीएस में 30 मिनट के लिए विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए.
  8. बफर को अवरुद्ध करने में 1 g/mL की सांद्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
    नोट: मानव और माउस NETs के लिए, न्यूट्रोफिल elastase और Histone 2B के खिलाफ चिकन एंटीबॉडी के खिलाफ खरगोश एंटीबॉडी का एक संयोजन इस्तेमाल किया जा सकता है(सामग्री की तालिका).
  9. एक नम कक्ष में स्लाइड प्लेस. बफर अवरुद्ध निकालें और सुखाने को रोकने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोग कर वर्गों को धोने के बिना पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। पैराफिन फिल्म के साथ सील नम कक्ष और आरटी में रात भर इनक्यूबेट।
  10. 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस के साथ वर्गों 3x धोएं।
  11. बफर को अवरुद्ध करने में द्वितीयक एंटीबॉडी का कार्य समाधान तैयार करें। प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए, गधे में उठाए गए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें और कई प्रजातियों से सीरम प्रोटीन के खिलाफ पूर्व अवशोषित(सामग्री की तालिका)। द्वितीयक एंटीबॉडी के कार्य समाधान के साथ ऊतक खंडों को कवर करें। स्थानांतरण स्लाइड नम कक्ष के लिए, पैराफिन फिल्म के साथ सील. आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: गधा विरोधी खरगोश Cy2 और गधा विरोधी चिकन Cy3 के लिए संयुग्मी को एक डीएनए counterstain के साथ जोड़ा जा सकता है.
  12. टीबीएस के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 3x धो, तो एक बार deionized पानी के साथ 5 मिनट के लिए.
  13. बढ़ते माध्यम के साथ कवर वर्गों (सामग्री की तालिका)और बुलबुला गठन से बचने कवर ग्लास लागू होते हैं।
  14. बढ़ते मध्यम ठोस करते हैं, तो उचित बैंड पास फिल्टर या एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ एक विस्तृत क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का विश्लेषण।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, नेट घटकों को सफलतापूर्वक मानव और murine मूल दोनों के पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में पाया जा सकता है। अउत्तेजित न्यूट्रोफिल में, एच 2 बी विशेष रूप से नाभिक और न्यूट्रोफिल इलैस्टेज में ग्रैन्युल्स में स्थित है; फलस्वरूप, उनके फ्लोरोसेंट संकेत ओवरलैप नहीं करते हैं। इसके विपरीत, NETosis के दौरान और नेट गठन के बाद, एनई, H2B, और डीएनए आंशिक रूप से colocalize. यदि इसे हरे, लाल और नीले संकेतों के रूप में चित्रित किया गया है, तो सहस्थानीकरण के क्षेत्रों को सफेद ओवरले के रूप में दर्शाया गया है (चित्र 1जी, चित्र 2D, और चित्र 3D) . इस ओवरले भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हरे, लाल और नीले रंग के लिए सकारात्मक होने वाले ओवरलैपिंग संकेतों के पिक्सेल का उपयोग चित्र 1जी, चित्र 2 डीऔर चित्र 3 डी' में नेट क्षेत्रों को दर्शाने के लिए बैंगनी ओवरले बनाने के लिए किया गया है . चित्र 1 और चित्र 2 में कुछ कोशिकाओं में लोभी नाभिक है परंतु एनई के लिए ऋणात्मक है। ऐसा माना जाता है कि ये कोशिकाएं इओसिनोफिल ग्रैन्युलोसाइट्स हैं।

यदि ऊतक खंडों की मोटाई 2-3 डिग्री है, तो 10x या 20x उद्देश्यों का उपयोग करके विस्तृत क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा उनका विश्लेषण किया जा सकता है। चित्र 1में एक उदाहरण प्रस्तुत किया गया है, जिसमें मानव पथरी ऊतक के एक भाग को दर्शाया गया है जो एनई (हरा), एच 2 बी (लाल) और होकस्ट 33342 (नीला) के लिए दागित है। पैनल ए, सी, ई, और जी NETs युक्त अनुभाग के एक क्षेत्र से हैं, जबकि पैनल बी, डी, एफ, और एच एक ही खंड के एक अलग क्षेत्र से हैं, जो कई न्यूट्रोफिल शामिल हैं (चित्र 1B, पूर्वोत्तर) लेकिन कोई NETs. बड़े पैमाने पर नेट गठन के साथ क्षेत्रों को आसानी से भी कम आवर्धन पर पाया जा सकता है, के बाद से सभी तीन नेट घटकcolocalize, अक्सर stringy extracellular संरचनाओं में, जो तीन चैनलों के ओवरले में सफेद extracellular फाइबर के रूप में दिखाई देते हैं (चित्र 1G ), चित्र 1Gमें बैंगनी ओवरले'.

दोनों ऊतक क्षेत्रों के दाग पैटर्न स्पष्ट रूप से भिन्न होते हैं, जिसमें एनई कणिकाओं में निहित होता है (चित्र 1ख) और नाभिक में डीएनए (चित्र 1 एफ) . दिलचस्प बात यह है कि नेट युक्त ऊतक की तुलना में एच 2 बी का दाग न्यूट्रोफिल समृद्ध क्षेत्रों में कमजोर होता है(चित्र 1D) यह एंटीबॉडी के आकार के कारण हो सकता है (आईजीवाई में आईजीजी के लिए 150 केडी की तुलना में 180 केडी है), जो बरकरार नाभिक में क्रोमैटिन को कॉम्पैक्ट करने के लिए बाध्यकारी को रोक सकता है, जबकि एच 2 बी तक पहुंच को सुविधाजनक बनाया जाता है यदि क्रोमैटिन को विसंघंठीकृत किया जाता है जैसा कि एनआईटी (चित्र 1C) में मामला है।

उच्च संकल्प के लिए, deconvolution के साथ confocal माइक्रोस्कोप या widefield माइक्रोस्कोप बाहर के फोकस कलंक को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए है। चित्र 2 एक ही मानव पथरी नमूना से एक नेट समृद्ध क्षेत्र को दर्शाया गया है. यह एक confocal ढेर की एक अधिकतम प्रक्षेपण है. एनई (हरा, चित्र 2क) कणिकाओं में पाया जाता है, लेकिन यह प्रचुर मात्रा में कोशिकाक्षक भी पाया जाता है, जहां यह एच 2 बी (लाल, चित्र 2ख) और डीएनए (नीला, चित्र 2ब्)के साथ सहस्थानित होता है। बाह्यकोशिकीय सहस्थानीकरण का परिणाम सफेद रंग संयोजन होता है (चित्र 2D) हरे, लाल और नीले रंग के लिए सकारात्मक इन पिक्सल का उपयोग चित्र 2 Dमें NETs को प्रस्तुत करने के लिए एक बैंगनी ओवरले बनाने के लिए किया गया है।

चित्र 3 माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एम टी बी) से संक्रमित माउस फेफड़ों से एक केंद्रीय खंड का एक विस्तार है। प्रतिजन पुनः प्राप्ति और दाग लगाने की स्थितिचित्र 1 और चित्र 2के समान होतीहै। फिर, नेट के सभी तीन घटकों का सहस्थानीकरण न्यूट्रोफिल के बीच सफेद क्षेत्रों के रूप में स्पष्ट रूप से दिखाई देता है, जिसका उपयोग चित्र 3 डीमें एनईटी को इंगित करने वाली बैंगनी परत बनाने के लिए किया गया है।

दाग की विशिष्टता अनुपूरक चित्र 1में प्रदर्शित की गई है, जो नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ नगण्य धुंधला दर्शाया गया है, और अनुपूरक चित्र 1A,B खरगोश गैर प्रतिरक्षा सीरम (हरा) और चिकन विरोधी GFP IgY (लाल) को दर्शाया गया है. चित्र 1 C,D में केवल द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दाग को दिखाया गया है, संयोजन वही था जिसका प्रयोग चित्र 1, चित्र 2और चित्र 3में किया गया था। अनुपूरक चित्र 1क, ग मानव पथरी के एक भाग को चित्र 1 और चित्र 2के समान दर्शाता है। अनुपूरक चित्र 1B,D माउस फेफड़ों का ऊतक चित्र 3के समान है। डीएनए Hoechst 33342 के साथ दाग है. स्केल बार 25 डिग्री मीटर का प्रतिनिधित्व करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक मानव पथरी के नमूने के एक पैराफिन अनुभाग की वाइड-फील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी।
पैनल ए, सी, ई, और जी NETs के साथ एक ऊतक क्षेत्र को दर्शाती है, जबकि पैनल बी, डी, एफ, और एच एक ही खंड है कि न्यूट्रोफिल में समृद्ध है, लेकिन नेट गठन के बिना एक अलग क्षेत्र दिखा. दाग एनई(ए, बी; हरे), एच 2 बी(सी, डी; लाल) और डीएनए(ई, एफ; नीले) के खिलाफ है। चित्र 1G, H तीनों चैनलों के ओवरले का प्रतिनिधित्व करता है। सभी रंगों में 80 और 256 के बीच एक तीव्रता के साथ पिक्सल एनई, H2B, और डीएनए के लिए ओवरलैपिंग धुंधला के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं और NETs या NETosis के दौर से गुजर न्यूट्रोफिल से प्राप्त किया जा करने के लिए माना जाता है। ये पिक्सेल पैनल जीमें बैंगनी रंग के रूप में छद्म रंग का किया गया है, जहां वे एक बड़े क्षेत्र के रूप में; और पैनल एचमें, जहां केवल छोटे धब्बे पाए जाते हैं। छवियाँ एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था, और पैमाने पर पट्टी का प्रतिनिधित्व करता है 25 m. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 2
चित्र 2: एक मानव पथरी के नमूने में नेट घटकों की Confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी.
चित्र 1 में प्रयुक्त एक ही ऊतक अनुभाग का उपयोग किया गया था। (A) एनई के विरुद्ध दाग लगाना,(B) एच 2 बी का वर्णन, और(C) होचस्ट 33342 डीएनए का धुंधला करना. (डी)तीनों चैनलों का ओवरले। सभी तीन संकेतों का सहस्थानीकरण पैनल डीमें छद्म रंग का बैंगनी है। इस के लिए, एक तीव्रता के साथ पिक्सल और सभी तीन रंगों में 80 Volocity 6.3 का उपयोग कर पाया गया. बैंगनी क्षेत्र में नीट या न्यूट्रोफिलों को दर्शाया गया है जो नेटोसिस से गुजर रहे हैं। छवियों को एक confocal माइक्रोस्कोपी के साथ लिया गया था के रूप में $-स्टैक और अधिकतम प्रक्षेपण के रूप में प्रस्तुत किया. स्केल बार 25 m का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एम.टी.बी.से संक्रमित माउस फेफड़े में नेट घटकों की कॉनफोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी ।
यह बड़े पैमाने पर न्यूट्रोफिल घुसपैठ के साथ एक पूर्ण फेफड़ों के एक खंड के मध्य भाग से एक विस्तार है. (A) एई धुंधला , () H2B धुंधला, और (C) डीएनए धुंधला. (डी)तीनों चैनलों का ओवरले। पैनल डी में बैंगनी ओवरले सभी तीन रंगों में की तीव्रता मूल्यों के साथ पिक्सल इंगित करता है, जो NETosis के साथ-साथ NETs के दौर से गुजर रहे न्यूट्रोफिल का संकेत देता है। छवियों को एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ एक $-स्टैक के रूप में लिया गया और अधिकतम प्रक्षेपण के रूप में प्रस्तुत किया गया. स्केल बार 25 m का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: असंबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नियंत्रण दाग. मानव (ए , सी) और मौरीन ऊतक ( बी ,डी) जैसा कि चित्र 1 और चित्र 2के लिए प्रयोग किया गया था , और चित्र 3, क्रमशः असंबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी ( ए ,बी) या बिना प्राथमिक एंटीबॉडी ( सी, डी) के साथ दागे गए थे। पैनल ए और बी में नियंत्रण प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में, एक गैर प्रतिरक्षित खरगोश से सीरम और GFP के खिलाफ एक चिकन IgY लागू किए गए थे. माध्यमिक एंटीबॉडी अन्य सभी धुंधला में दिखाया गया है और यह भी पैनल सी और डी में इस्तेमाल के रूप में ही थे। जैसा कि आशा की जाती है, सभी स्थितियों में, नगण्य पृष्ठभूमि अभिरंजन का पता लगाया गया, चित्र 1, चित्र 2और चित्र 3के लिए प्रयुक्त एंटीबॉडी की विशिष्टता का चित्रण करते हुए। छवियों को एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया, डीएनए Hoechst 33342 के साथ दाग, और पैमाने पर पट्टी का प्रतिनिधित्व करता है 25 m. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए.

Discussion

रोगजनन9के दौरान एन.टी.टी. की भूमिका के बारे में बढ़ती जागरूकता के साथ , रोगियों या प्रयोगात्मक जानवरों से ऊतकों में उनका पता लगाने का महत्व बढ़ रहा है। पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक के नमूनों में अन्य ऊतक तैयारियों की तुलना में कई फायदे होते हैं (उदाहरण के लिए, क्रायोप्रेड नमूनों के अनुभाग)। पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों में ऊतक संरक्षण स्पष्ट रूप से बेहतर है, और एक बार एम्बेडेड, नमूने दशकों के लिए संरक्षित कर रहे हैं, प्रतिगामी अध्ययन को सक्षम करने. NETs, जो figree संरचनाओं रहे हैं का पता लगाने के लिए, अच्छा नमूना संरक्षण एक पूर्व शर्त cryopreserved सामग्री है, जो बर्फ क्रिस्टल गठन है कि कलाकृतियों morphologically समान रूप से वृद्धि दे सकते हैं के कारण ऊतक क्षति के लिए प्रवण है के उपयोग से बाहर सत्तारूढ़ है जाल.

इष्टतम संरक्षण के लिए, प्रयोगात्मक जानवरों से ऊतक मृत्यु के बाद शीघ्र ही तय किया जाना चाहिए, आदर्श perfusion द्वारा, autolysis से बचने के लिए. टीबीएस या पीबीएस अयस्क इष्टतम की तरह एक उपयुक्त बफर में paraformaldehyde के ताजा तैयार या ताजा thawed समाधान के रूप में. यह रासायनिक मानक ऊतक विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया औपचारिक तैयारी के विपरीत में परिभाषित किया गया है, और कम ऊतक autofluorence लाती है. इसके विपरीत, मानव ऊतक अक्सर सीधे चीरा के बाद तय नहीं है, और fixative के रूप में, आम तौर पर एक 10% formalin के कमजोर पड़ने का उपयोग किया जाता है जो एक स्थिरीकरण को रोकने के लिए एक स्टेबलाइजर के रूप में मेथनॉल के 10% करने के लिए 15% शामिल हैं, साथ ही formic एसिड, अन्य ऐल्डिहाइड, और कीटोन . अक्सर, ऊतक embedding से पहले समय की विस्तारित मात्रा के लिए इस fixative में संग्रहीत किया जाता है. परिणाम autolysis हो सकता है (विसर्जन और निर्धारण के बीच समय पर निर्भर करता है), और overfixation के कारण मेथिलीन पुलों के अत्यधिक गठन. फॉर्मेल्डिहाइड निर्धारण प्रोटीन की तृतीयक संरचना में अंतर-अणुक मेथिलीनपुलों केगठन से 10 में परिवर्तन लाता है। न्यूक्लिक एसिड, कार्बोहाइड्रेट और लिपिड जैसे गैर प्रोटीनयुक्त कोशिका घटक सीधे तय नहीं कर रहे हैं, लेकिन तीन आयामी प्रोटीन नेटवर्क में स्थिर. सफल लेबलिंग के लिए, मेथिलीन बांड को एंटीजन रिट्रीवल की प्रक्रिया में प्रतीक को बेनकाब करने के लिए तोड़ना होगा। यह एक उपयुक्त गर्मी प्रेरित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति बफर (एचआईईआर बफर) 11 में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार ऊतक वर्गों के हीटिंग द्वारा पूराकिया है। हमारे पिछले अध्ययन के paraffinized ऊतक में नेट घटकों का पता लगाने पर पीएच और HIER बफ़र्स के तापमान के प्रभाव का विश्लेषण किया, और यह पाया गया कि सफल ऊतक एक घटक के लिए pretreatment अक्सर एक दूसरे घटक8के लिए suboptimal है.

इस बीच, यह पाया गया है कि 9 के पीएच पर HIER बफर में 70 डिग्री सेल्सियस के लिए ऊतक हीटिंग कई नेट घटकों के लिए एक अच्छा समझौता है और अच्छा ऊतक संरक्षण, जो अक्सर उच्च तापमान पर समझौता किया है बनाए रखेंगे. यह एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में संकेत पुनः प्राप्ति समय का उपयोग करने का प्रस्ताव है, लेकिन विशेष रूप से अज्ञात निर्धारण मानकों के अभिलेखीय नमूनों के साथ, धुंधला तीव्रता असंतोषजनक हो सकता है. इस मामले में, पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया के दौरान या उच्च तापमान का विस्तार धुंधला दक्षता में सुधार कर सकते हैं। यह भी हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल IgY एंटीबॉडी के histone 2B धुंधला प्रभावित कर सकते हैं. जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है, विसंवहित क्रोमैटिन NETosis के साथ-साथ NETs में आराम न्यूट्रोफिल में क्रोमैटिन की तुलना में इस एंटीबॉडी के साथ बहुत मजबूत दाग के दौर से गुजर न्यूट्रोफिल में पाया जा सकता है। यह शायद कॉम्पैक्ट नाभिक के लिए 180 kDa IgY अणु के प्रतिबंधित उपयोग के कारण है और वृद्धि हुई epitope वसूली के बाद अलग हो सकता है. यह संघनित क्रोमैटिन के क्षेत्रों में भी बाध्यकारी दक्षता को तेज कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूट्रोफिल और अन्य कोशिकाओं के सामान्य नाभिक में तीव्र फ्लोरोसेंट होगा। नेटोसिस और गैर-उत्तेजित न्यूट्रोफिल के दौर से गुजर रहे न्यूट्रोफिलों के बीच अभिरंजन दक्षता में अंतर चित्र 1में दर्शाए गए से कम स्पष्ट हो सकता है। नेट गठन के क्षेत्रों अभी भी एनई, H2B, और डीएनए के सह-स्थानीयकरण द्वारा पहचान की जाएगी।

निर्धारण प्रक्रिया भी ऊतक के महत्वपूर्ण autofluorscence प्रेरित कर सकते हैं, मुख्य रूप से स्पेक्ट्रम के नीले / यह पर्याप्त संकीर्ण bandpass फ्लोरोसेंट फिल्टर सेट (व्यापक क्षेत्र) या डिटेक्टर सेटिंग्स (confocal) है कि नीले उत्तेजना के साथ इस्तेमाल किया फ्लोरोक्रोम के उत्सर्जन अधिकतम मैच का उपयोग करके इस autofluorence के अधिकांश से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, उदा., Cy2, Alexafluor 488. ऑटोफ्लोरेसेंस के चरम मामलों में, स्पेक्ट्रम के नीले/ इसके बजाय, फ्लोरोसेंट संकेतों को स्पेक्ट्रम के अब तक के लाल भाग में आसानी से पता लगाया जा सकता है (जैसे, माध्यमिक एंटीबॉडी साइ 5 या एलेक्साफ्लोर 635 के साथ मिलकर), लेकिन इसके लिए फ़िल्टरलेस ब्लैक/व्हाइट कैमरा या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। चूंकि मानव आंख 600 एनएम से परे बल्कि असंवेदनशील है, दूर लाल फ्लोरोसेंट संकेतों शायद ही नेत्र का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है. किसी भी मामले में, उपयुक्त जोखिम समय या डिटेक्टर सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण (उदा., प्राथमिक एंटीबॉडी के बजाय गैर-प्रतिरक्षा सेरा/आइसोटाइप नियंत्रण) का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

1 डिग्री 2 डिग्री मीटर के ऊतक वर्गों का विश्लेषण 10x या 20x उद्देश्यों का उपयोग करके चौड़े क्षेत्र के माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है। इन लेंस एक बड़े फोकल गहराई प्रदान करते हैं, तो (लगभग) पूरे ऊतक अनुभाग ध्यान में होगा. यह जल्दी से नेट गठन के क्षेत्रों के लिए ऊतक वर्गों को स्कैन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर वे पर्याप्त रूप से बड़े हैं (चित्र 1के रूप में) . हरे (एनई), लाल (एच 2 बी) और नीले (डीएनए) चैनलों का सहस्थानीकरण एक सफेद दाग में परिणाम देता है जो नेट गठन के क्षेत्रों को दर्शाता है (चित्र 1जी)। उच्च आवर्धन के लिए, deconvolution के साथ confocal या विस्तृत क्षेत्र माइक्रोस्कोप आवश्यक हैं. चित्र 2 में चित्र 1के लिए प्रयुक्त मानव पथरी के नमूने का विवरण दिखाया गया है। चित्र 2क में,एनई छोटे बिंदुओं (कणों) को स्थानीयकृत करता है, लेकिन एक बड़ा अनुपात बाह्यकोशिकीय होता है, जो प्रायः धारियों का निर्माण करता है जो एच 2 बी (चित्र 2ख) और डीएनए (चित्र 2 ब्) के साथ ओवरलैप होते हैं . इस सहस्थानीकरण का परिणाम एनईटीएस (चित्र 2डी) को इंगित करने वाले एक श्वेत अधिव्यापन में होता है . एम तपेदिक से संक्रमित माउस के फेफड़ों के भाग में एक बहुत ही समान पैटर्न पाया जा सकता है (चित्र 3) ।

यहाँ प्रस्तुत नमूनों नेट गठन जो भी कम आवर्धन पर पहचाना जा सकता है की एक उच्च डिग्री के साथ क्षेत्रों की विशेषता है. ऊतक घनत्व और संबंधित उत्तेजना पर निर्भर करता है, नेट गठन बहुत कम स्पष्ट किया जा सकता है, न्यूट्रोफिल के छोटे समूहों के नेट गठन के लिए नीचे (मायोकार्डिटिस में एक उदाहरण के लिए, एक पिछले प्रकाशन12देखें). यह माना जाता है कि इस प्रोटोकॉल ऊतक में NETs पर अधिक अनुसंधान को बढ़ावा और उम्मीद है कि गठन या रोगों की रोकथाम में NETs की अपरिचित भूमिकाओं unravelling में सहायता करेगा.

Disclosures

इस काम के वित्त पोषण स्रोत मैक्स प्लैंक सोसायटी है. हम माउस के ऊतकों के लिए पांडुलिपि और फिलिप सैकाली को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए आर्टुरो ज़ेक्लिंस्की का धन्यवाद करते हैं।

Acknowledgments

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bovine serum albumine Sigma A7906
chicken anti Histone 2B antibody Abcam ab 134211
cold water fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 703-165-155
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 711-225-152 alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152
embedding cassettes Roth K116.1
embedding molds Sakura 4162
embedding station Microm AP280
ethanol Roth 9065.4
filter paper, rolled OCB
forceps Dumont 7a
glass cylinder with 20 cm diameter VWR 216-0075
glycerol Roth 3783.1
HIER buffer pH 9 Scytek TES999
Hoechst 33342 Sigma 14533
incubator (dry, up to 40 °C) Memmert MMIPP30
moist chamber (plastic box with tight lid) Emsa 508542
Mowiol 40-88 Aldrich 32.459-0
normal donkey serum Merck S30
PAP-pen ImmEdge Vector Lab H-4000
paraffin microtome Microm 355S water bath included
paraformaldehyde Aldrich 16005
petri dishes Schubert /Weiss 7020051
rabbit anti ELANE antibody Atlas HPA068836
racks, jars for microscope slides Roth H554.1 H552.1
scalpel Braun Fig.22
Superfrost Plus glass slides Thermo Scientific J1800AMNZ
temperature-controlled hot plate NeoLab D6010
tissue processor for paraffin embedding Leica TP1020
Tris buffered saline TBS VWR 788
Triton X100 Roth 3051.4
Tween 20 Fluka 93773
water bath 37 °C GFL 1052
widefield or confocal microscope Leica DMR, SP8
xylene (dimethylbenzene) Roth 9713.3

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References

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