使用压力表谱对毛质生殖系统的双轴基底音和被动测试

Bioengineering

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Summary

该协议使用市售的压力子宫内科系统对鼠阴道和子宫颈进行压力阴唇测试。利用有钙和无钙的介质,在估计的生理条件下,对器官分离出平滑肌细胞(SMC)基底色和被动细胞外基质(ECM)的贡献。

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White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

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Abstract

女性生殖器官,特别是阴道和子宫颈,由各种细胞成分和独特的细胞外基质(ECM)组成。平滑肌细胞在阴道和宫颈壁内表现出收缩功能。根据生化环境和器官壁的机械分裂,平滑肌细胞改变收缩条件。平滑肌细胞在基线生理条件下的贡献被归类为基底音。更具体地说,基础色调是在没有荷尔蒙和神经刺激的情况下平滑肌细胞的基线部分收缩。此外,ECM 为器官壁提供结构支持,并充当生化线索的储层。这些生化线索对各种器官功能至关重要,例如促进生长和维持平衡。每个器官的ECM主要由胶原纤维(主要是胶原蛋白I、III和V型)、弹性纤维和糖甘油糖/蛋白酶组成。ECM 的组成和组织决定了每个器官的机械特性。ECM成分的变化可能导致生殖疾病的发展,如骨盆器官脱垂或过早的宫颈重塑。此外,ECM微结构和刚度的变化可能会改变平滑肌细胞活动和表型,从而导致收缩力的丧失。

在这项工作中,报告的协议用于评估非怀孕的鼠阴道和宫颈在4-6个月大时在estrus的基础色调和被动机械特性。这些器官安装在市售的压力表上,并进行了压力直径和力长测试。包括用于生殖器官机械表征的样本数据和数据分析技术。这些信息可能有助于构建数学模型和合理设计治疗妇女健康病理的干预措施。

Introduction

阴道壁由四层组成,即上皮、拉米那皮、肌肉和新发。上皮主要由上皮细胞组成。拉米纳蛋白片有大量的弹性和纤维胶原纤维。肌肉也由乳原和胶原纤维组成,但有增加的平滑肌肉细胞量。Adventiia 由电子莱他、胶原蛋白和成纤维细胞组成,尽管与前一层相比浓度降低。平滑肌细胞对生物力学动机的研究组感兴趣,因为它们在器官的收缩性质中发挥作用。因此,量化平滑肌细胞面积分数和组织是理解机械功能的关键。先前的研究表明,阴道壁内的平滑肌含量主要组织在圆周和纵轴。组织学分析表明,1号墙近端和远端的平滑肌面积分数约为35%。

子宫颈是一种高度胶原蛋白的结构,直到最近,被认为有最小的平滑肌细胞含量2,3。然而,最近的研究表明,平滑肌细胞在子宫颈4,5中可能具有更大的丰度和作用。子宫颈显示平滑肌细胞的梯度。内部 os 包含 50-60% 平滑肌肉细胞,其中外部 os 仅包含 10%。然而,小鼠研究报告子宫颈由10-15%平滑肌肉细胞和85-90%纤维结缔组织组成,而没有提到区域差异6,7,8。鉴于鼠标模型不同于经常报告的人类模型,需要进一步调查小鼠子宫颈。

该协议的目的是阐明鼠阴道和子宫颈的机械特性。这是通过使用压力表线仪实现,该装置能够同时评估圆周和轴向的机械性能,同时保持原生细胞基质相互作用和器官几何。器官安装在两个定制管上,用丝质6-0缝合线固定。围绕估计的生理轴向拉伸进行压力直径测试,以确定符合性和切线莫杜利9。进行了力长度测试,以确认估计的轴向拉伸,并确保机械性能在生理范围内量化。实验方案在4-6个月大的非怀孕的鼠阴道和子宫颈上进行。

该协议分为两个主要的机械测试部分:基音和被动测试。基底色调被定义为平滑肌细胞的基线部分收缩,即使在没有外部局部,荷尔蒙和神经刺激10。阴道和子宫颈的这种基线收缩性质产生典型的机械行为,然后通过压力阴骨系统测量。被动特性通过去除维持收缩基线状态的细胞间钙进行评估,从而放松平滑肌细胞。在被动状态下,胶原蛋白和乳胶纤维为器官的机械特性提供主要贡献。

鼠模型被广泛用于研究妇女生殖健康的病理学。小鼠提供了几个优势,以量化ECM和免疫系统11,12,13,14中ECM和机械特性之间的演变关系。这些优势包括周期短、特征好、成本相对较低、操作方便、妊娠时间相对较短15。此外,实验鼠的基因组绘制良好,转基因小鼠是检验机械假说16、17、18的宝贵工具。

市售的压力表线系统被广泛用于量化各种组织和器官的机械反应。一些值得注意的结构分析的压力骨髓系统包括弹性动脉19,20,21,22,静脉和组织工程血管移植23,24,道25和大肠26。压力显影技术允许同时评估轴向和圆周方向的特性,同时保持原生细胞-ECM相互作用和体内几何体。尽管在软组织和器官力学中广泛使用了阴唇系统,但以前还没有为阴道和子宫颈开发过利用压力性阴唇技术的协议。先前对阴道和子宫颈的机械特性的调查被评估为单轴27,28。然而,这些器官在体内经历多轴负荷29,30,因此量化其双轴机械反应是重要的。

此外,最近的研究表明,平滑肌细胞可能在软组织病理学5,28,31,32中起到潜在的作用。这为利用压力肌图技术提供了另一个吸引力,因为它保留了原生细胞基质的相互作用,从而允许划定平滑肌细胞在生理和病理生理学中所起作用的贡献条件。在此,我们提出了一个协议,以量化阴道和子宫颈在基础音和被动条件下的多轴机械性能。

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Protocol

本研究使用雌性C57BL6J小鼠(29.4~6.8克)进行本研究。所有程序都得到杜兰大学动物护理和使用研究所委员会的批准。分娩后,小鼠在安乐死前适应一周,并处于标准条件下(12小时光/暗周期)。

1. 在埃斯特鲁斯的老鼠牺牲

  1. 确定周期:根据以前的研究15,33,34,通过视觉评估监测的周期。周期由四个阶段组成:孕原、丝丝、美特鲁斯和死龙。在孕期,生殖器肿胀、粉红色、潮湿和起皱。estrus 阶段是皱纹,但肿胀较少,粉红色和潮湿。梅斯特鲁斯和死龙都报告表现出没有肿胀和皱纹,缺乏粉红色的色调,和干34,35。
  2. 在 estrus 执行实验:所有机械测试都是在小鼠在 estrus 时进行的,因为这是最容易可视化的,并且提供了一致且可重复的时间点。
  3. 对于接受基底音测试的小鼠,通过断头台实施安乐死。对于仅在被动条件下试验的小鼠,使用二氧化碳(CO2)吸入进行安乐死。断头台用于保持生殖道平滑肌细胞的功能,因为CO2气体改变平滑肌细胞的收缩特性36,37,38, 39,40,41,42.必须在30分钟内进行解剖,以尽量减少细胞凋亡的机会。

2. 生殖系统解剖

  1. 设置:在工作站上放置吸水垫,用 4°C 汉克平衡盐溶液 (HBSS) 溶液填充培养皿和注射器。使用抹布处理脂肪组织。将鼠标腹腔侧向上放置,并用胶带将爪子和尾巴胶带上。打开显微镜灯,并设置微剪刀,剪刀,两对直钳,和两对弯曲的钳子。
  2. 使用倾斜的钳子和剪刀,抬起腹部周围的皮肤,并在腹部底部,阴骨上方进行切口。切口应足够浅,不会刺穿腹部肌肉壁。继续使用剪刀,以优越的切割对肋骨笼和深通过腹部肌肉。
  3. 用弯曲的钳子和微剪刀轻轻拉上脂肪,去除表面脂肪。脂肪组织会以闪闪发光的外观异质反射光线。将所有去除的脂肪和组织放在抹布上。识别子宫角和阴骨。
  4. 在阴道壁和阴骨之间放置封闭的剪刀。小心地切下阴骨的中间(阴骨)。在切割的阴骨的两端放置弯曲的钳子。横向拉两端,以便更好地进入生殖器官。
  5. 从阴道壁上取出膀胱和尿道。这可以通过使用直钳和微剪刀来完成。用直钳保持膀胱,以产生紧张,并使用钝解剖技术将周围组织与阴道分离。一旦膀胱和尿道被解剖走,切下底座,从体腔中取出。
  6. 确定生殖系统:子宫角从子宫颈分叉。由于几何形状和刚度的差异,子宫颈可以从阴道识别。子宫颈的外径比阴道小。子宫颈比阴道更硬,感觉类似于珠子(图1)。
  7. 使用墨水和卡钳沿器官标记 3 毫米点。从子宫管上的卵巢下方开始,并低劣地标记点以到达子宫颈。使用中心子宫颈点开始点到阴道介绍的点路径。
  8. 让墨水干燥,将生殖器官与周围的脂肪组织、结缔组织和结肠分离。清洁阴道尽可能靠近阴道介绍。使用剪刀,在阴道外向周围切开。
    注:在此过程中,器官可能会变干。如果这是一个问题,可以使用装有4°C HBSS的注射器向器官添加水分。
  9. 切子宫角立即不如卵巢。请注意,当结缔组织被移除和器官反冲时,器官将从植后长度中缩回。将解剖的生殖器官放入装有4°C HBSS的培养皿中。这种长度变化可用于计算估计体内长度(第 5 节)。
    注:我们已经确定,在解剖和可切除期间在此温度下使用HBSS不会影响平滑肌细胞的生存能力。然而,保持pH7.4对于维持平滑肌细胞的生存能力至关重要。在此温度下,HBSS 的 pH 级为 7.4。
  10. 在 4°C HBSS 中经过 15 分钟的平衡期后,使用卡钳测量点之间的空间。将每个距离的测量值记录到电子表格中。这些值将用于计算体内拉伸比(原始长度/外植长度)。
  11. 将含有腹部区域丢弃组织的抹布与小鼠体内的多余组织放在一起,然后浸泡在 4°C HBSS 中。将鼠标和多余的组织包裹在铝箔中,放入冷冻安全袋中,以在-20°C处存放。阴道的被动机械行为在一次冷冻解冻周期43后没有显著差异。所有测试的器官在安乐死后或冷冻解冻周期后立即使用。

3. 可调节

  1. 确定器官类型的正确管状尺寸。在典型的C57BL6J鼠标中,阴道使用直径为3.75毫米且铆接的管状。子宫颈使用一个导管,即阴道端为3.75毫米,子宫端直径为0.75毫米(图2),0.75毫米的导管是光滑的。
    注:上述直径尺寸用于典型的无效4-6个月C57BL6小鼠、C57BL6 x 129SvEv和7-9个月的非角小鼠。然而,某些情况,如脱垂或怀孕,可能需要更大的尺寸的管状。
  2. 在每个器官上,将宫颈侧安装在罐装置的力传感器部分。将器官的另一端(阴道或子宫)安装在设备的微米部分。用缝合线拧紧两端。
  3. 由于阴道和子宫颈的厚度和收缩程度不同,可以使用不同的技术来执行最有效的气罐。对于阴道,以"X"的方式在管的2和第3个铆钉之间放置2个缝合线。当可以宫颈,管状不铆接,所以器官最好放在管的背面与3水平缝合在子宫端和4缝合在外部os。对于两个器官,缝合线之间的最大长度不应超过 7 mm(图3)。

4. 压力表图设置

  1. 为了设置压力近影系统,打开测试系统电源,并在储液罐中填充200 mL的HBSS(图4)。将热量"打开",让储液罐中的 HBSS 加热。接下来,打开显微镜并打开计算机程序。确保可分管器官的图像、压力接口、流量计读数和定序器功能工具都可见(图5)。

5. 底音机械测试

注:子宫颈在测试的初期阶段表现出相位性质。但是,在预置后,这种情况就减少了。基底音测试是在DMT器件的盆地中利用克雷布斯环铃缓冲器(KRB)进行的。缓冲液加气,95% O2和 5% CO2。基础音部分完成后,使用无钙KRB。

  1. 查找未卸载的几何体:拉伸器官,使墙壁不处于张力状态。对于阴道,观察阴道壁上的凹槽。对于子宫颈,切在中央子宫颈标记上方和下方的墨点下方。这设计了一种可重复的方法,用于宫颈原位长度为6mm444。使用卡钳测量从缝合到缝合的长度
  2. 查找卸载压力 (UP):以 1 mmHg 的增量将压力从 0 增加到 10 mmHg。确定器官不再坍塌的压力。这可以确定为在给定压力下外径的最大跃进,如程序监视器上所展示的那样。记录压力和外径后,请注意,这是器官不折叠并使力归零的第一点。
  3. 体内拉伸估计:通过将体内测得的长度除以除植物后测量的长度来计算体内拉伸的估计:
    Equation 1
  4. 压力直径预调:将压力设置为 0 mmHg,将估计体内长度Equation 2和梯度设置为 1.5 mmHg/s。 运行一个序列,将压力从 0 mmHg 到体内压力 = 卸载 (表1),保持 30秒,并在 30 秒的保持周期下将压力降低到 0 mmHg。重复共 5 个循环后,在计算机程序中按"停止"并保存文件。
  5. 找到实验在体内拉伸:调整器官在估计体内长度,而在卸载的压力和按开始。评估从卸载压力到最大压力的压力值的压力与力值(表 1)。按计算机程序中的"停止"按钮并保存文件。
    注: 测量的拉伸值是原位计算的。这伴随着限制,它只能在分解阴性共生后测量。因此,自然系绳丢失,这可能会改变长度。然而,理论的延伸是基于先前引入的理论,即当暴露于生理压力以节省能量时,器官的力变化最小。在协议中,在体内拉伸中测量的拉伸值是使用实验确定的长度计算的拉伸值,其中在暴露于生理压力范围时,力变化最小。
  6. 压力直径预调理:将压力设置为 0 mmHg,将长度设置为实验体内长度,以及 1.5 mmHg/s 的梯度。 运行一个序列,将压力从 0 mmHg 到最大压力 + UP,保持 30 秒,然后通过广告返回 0 mmHgditional 30 秒的持有期。重复此项共 5 个周期后,按程序界面中的"停止"按钮并保存文件。
    注:5.4 对于在压力增大时实现更一致的轴向力读数至关重要。这一步有助于找到正确的体内拉伸,这往往被低估基于视觉线索。5.6 作为预防措施,以尽量减少迟滞,实现器官的一致、可重复、数学解释性的反应。
  7. 力长度预调节:输入 1/3 最大压力 + UP,用于进气和出口压力。将器官调整到体内长度的-2%,然后按"开始"。 将长度调整到体内长度为+2%,然后在 10 μm/s 时降至 -2%。 重复轴向延伸共 5 个周期。按计算机程序中的停止并保存文件。
  8. 平衡:在器官处于确定体内长度时,将入口和出口压力设置为最大压力的 1/3 = UP。将器官平衡10分钟。缓慢地将两个压力降低到 0 mmHg,梯度设置为 1.5 mmHg/s。
  9. 重新评估未卸载的几何形状:将器官设置为体内长度,将压力设置为卸载压力。以 10 μm/s 的速率减小估计卸载长度的轴向长度,直到力发生最小变化。这种相应的长度称为卸载长度,或器官不处于张力或压缩状态的地方。在将力归零之前,记录卸载的长度、外径和力值。
    注: 先前未加载的几何体由视觉提示确定,这是纯粹的定性。重新评估对于定量方法是必要的,并考虑到在预处理期间可能发生的长度变化。此几何体将在第 8 节中使用。
  10. 超声波设置:使用常规成像腹部包来可视化测试设备中的器官。(图6)在测试之前,尽量减少压力近影金属盆底部的伪影。将导管调节到与底部的最大距离的高度,组织仍完全浸没在测试解决方案中。自定义支架是 3D 打印,以在成像过程中将传感器稳定在垂直位置。
  11. 超声成像:识别力传感器附近的导管,并调整显微镜的台次,以沿组织的长度进行成像。在整个测试过程中,沿长度的中间区域被跟踪 (图6A,C)。成像后,查看由一系列 B 模式帧组成的图像"Cine 存储"循环,并识别外径最大的帧。所作的厚度计算将在第8节使用。
  12. 压力直径测试(2%在体内长度):按下启动并调整器官,使其为体内长度的-2%,将压力设置为0 mmHg,梯度设置为1.5 mmHg/s。将压力从0 mmHg增加到最大压力。在 20 秒的保持周期内将压力降低到 0 mmHg。重复 5 个循环。
  13. 压力直径测试(体内长度):按下启动并调整器官,使其处于活体长度,将压力设置为 0 mmHg,梯度设置为 1.5 mmHg/s。将压力从 0 mmHg 增加到最大压力。在 20 秒的保持周期内将压力降低到 0 mmHg。重复 5 个循环。
  14. 压力直径测试(体内长度为±2%):调整器官,使其在体内长度为±2%,将压力设置为0 mmHg,梯度为1.5 mmHg/s。将压力从0 mmHg增加到最大压力,然后在20秒的保持周期下降至0 mmHg。重复 5 个循环。所有三个长度的压力数据将在第 8 节中使用。
  15. 力长度测试(标称压力):将卸载压力和器官的压力设置为体内长度的-2%。将器官拉伸至体内长度的±2%,以10μm/s的速度恢复到体内长度的±2%。
  16. 力长度测试(1/3 最大压力 + UP):将压力设置为最大压力的 1/3 + UP,并将器官调整到体内长度的 -2%。按下"开始"后,将器官拉伸到体内长度的±2%,以10μm/s的速度将体内长度拉回到-2%。重复共 3 个循环后,按"停止"并保存数据。
  17. 力长度测试(2/3 最大压力 + UP):将压力设置为最大压力的 2/3 + UP,并将器官调整到体内长度的 -2%。按下启动并拉伸器官到+2%的体内长度和回-2%的体内长度以10μm/s的速度。重复共 3 个循环后,按"停止"并保存数据。
  18. 力长度测试(最大压力 + UP):将压力设置为最大压力 + UP,并将器官调整到体内长度的 -2%。以10μm/s的速度,将器官拉伸到体内长度的+2%,回到体内长度的-2%。重复共 3 个循环后,保存数据。所有力数据将在第 8 节中使用。
  19. 去除KRB测试介质,用无钙KRB清洗。用不含钙的KRB溶液更换介质,辅以2mM EGTA。孵育组织30分钟。取出溶液,用新鲜的无钙KRB更换介质。

6. 被动机械测试

注:如果从被动测试开始,则从步骤 1 开始。如果在步骤 6 被动启动之前执行基底音测试。如果从冷冻组织开始,在室温下留出30分钟的平衡期,然后使器官脱光。

  1. 找到未卸下的几何体:拉伸器官,使器官的墙壁不处于紧张状态。测量从缝合到缝合的可凝固器官,并将其记录为卸载长度。
  2. 查找卸载压力:按下"开始"后,将压力从 0 增加到 10 mmHg,增量为 1 mmHg。在进行此过程时,确定器官不处于紧张状态的压力。使用计算机程序监视器,可以从外径的最大跃点确定。将力归零后,记录此压力和外径,并记下为器官未折叠的第一个点。
  3. 估计体内拉伸:通过将体内测得的长度除以植物后测量的长度来计算体内拉伸的估计。
  4. 压力直径预调:按下"开始"后,将压力设置为0 mmHg,长度为估计体内长度,梯度为1.5 mmHg/s。开始运行一个序列,将压力从0 mmHg到最大压力,然后回到0毫米汞。在 30 秒的保持时间内重复此过程 5 个周期。
  5. 力长度预调:将器官调整到体内长度,并手动输入计算机程序中的卸载压力,以承受这两种压力。按下"开始"后,将梯度设置为 2 mmHg,将压力设置为最大值的 1/3。伸展器官高达+2%,在10μm/s下向下拉伸至-2%。重复此循环共5次,然后按停止。
  6. 查找体内实验长度:查找和绘制在体内长度的 -2%、体内长度和体内长度的 ±2% 的力值。在从 0 mmHg 到最大压力的均匀间隔压力下施加力。体内拉伸的实验将是拉伸值,在一系列压力上显示相对平坦的线。
  7. 在新的体内长度重复压力直径和轴向预调节步骤。
  8. 平衡:在器官处于确定体内长度时,将入口和出口压力设置为卸载压力。让器官重新平衡15分钟。15 分钟后,缓慢地将入口和出口压力降至 0 mmHg。
  9. 重新评估卸载配置:将器官带到卸载长度并重新估计卸载的长度。当压力为 0 mmHg 时,记录卸载的长度和外径,而卸载的压力为 1/3,最大压力为 1/3。在卸载压力处将力归零。卸载压力的直径是体内直径。
    注:重新估计卸载长度是必要的,因为以前在预处理后在软生物组织中观察到了小的塑性变形。此卸载配置将是第 8 节中使用的配置。
  10. 超声波:在未加载的长度和压力下执行超声波 B 模式成像。
  11. 压力直径测试:在实验确定的器官长度为 -2% 时,在 0 mmHg 处,按"开始"。 将压力从 0 mmHg 增加到最大压力,然后增加到 0 mmHg。按住 2-0 mmHg 步长 20 秒。重复共 5 次后,按界面中的"停止"按钮并保存文件。
    注:在实验体内长度重复,+2%的实验性体内长度。
  12. 力长度测试:将压力设定为标称压力,并将器官调节到体内长度的-2%。以10μm/s的速度将器官拉伸至体内长度的±2%,并回到体内长度的-2%。重复共 3 次后,保存数据。对 1/3 最大压力、2/3 最大压力和最大压力重复此操作。
  13. 计算超声波图像 B 模式图像中卸载的厚度。使用成像软件,绘制一条线来表示穿透深度。将刻度设置为线的长度(即 2000 μm,如图6B 和 6D所示)。
  14. 壁厚计算:使用计算机软件,跟踪和测量器官的内外直径。然后,绘制并测量直径之间的直线。共绘制 25 条跨壁画线。平均所有数据点,重复共 3 次。

7. 清理

  1. 确保压力为 0 mmHg 并关闭。关闭两个三向阀的主入口和出口。从罐化装置的盆地中吸出剩余的液体。
  2. 从舞台上取下器官,向储液罐中注满去离子水。使用注射器,用水冲洗管。连接油管以绕过管路。
  3. 打开压力和流量,将进气压力设置为 200 mmHg,出口压力设置为 0 mmHg,梯度为 10 mmHg/s,让流量运行 5 分钟。在储液罐瓶空时让系统运行,让空气运行 5 分钟或直到管路干燥。

8. 数据分析

  1. 对于压力直径测试,从压力开始从最小值到最大值处收集数据。对于力长度测试,从刚到最大生效的峰值以下收集数据,直到力停止减小。
  2. 打开每个压力直径测试的数据文件,然后选择平均压力选项卡。导航到最后一条曲线的加载区域,0 mmHg 到最大压力,并将数据放入电子表格中。在外径、入口压力、出口压力、力、温度、pH 和流量选项卡上选择相同的区域,将每个项目放在同一文档中。
  3. 打开每个力长度测试的数据。导航到曲线的加载区域,-2% 到 +2%,并将数据拖放到电子表格中。为其他测量变量选择相同的区域,并将每个项目放在同一电子表格中。
  4. 对于压力直径和力长度测试,从所有压力值中减去 UP。
  5. 每 1 mmHg 平均压力直径数据(即 0+/- 0.5、1+/-0.5、2+/- 0.5)。
  6. 找到器官的卸载体积 (V).公式1可用于查找V,因为R 02是显微镜测量的未卸载的外部半径,L是卸载长度,H是超声波检测到的卸载厚度。 不可压缩的假设被利用,这意味着器官在变形时保存体积。
    注: 卸载长度用卡钳从缝合到缝合进行测量。通过显微镜、照相机和软件测量卸载的直径,然后计算半径(图5),卸载的厚度是根据超声波图像计算的(图6)。
    Equation 3公式 1
  7. 使用不可压缩性假设,使用卸载体积、变形外半径()Equation 4和长度()Equation 5来确定变形的内半径。 Equation 6
    Equation 7公式 2
  8. 分别使用公式 3、4 和 5 计算每个应力。在方程 3-5 中,P 定义为电内压力,Ft是传感器测量的力。
    Equation 8公式 3
    Equation 9公式 4
    Equation 10公式 5
  9. 绘制压力-直径关系、力-压力关系、圆周应力-圆周拉伸关系以及轴向应力和圆周拉伸值(图 7,图 8)。可以使用中壁半径计算拉伸值。圆周应力和轴向应力的计算分别位于方程 6 和 7 中。
    Equation 11公式 6
    Equation 12公式 7
  10. 计算生理压力范围和体内拉伸的符合性。下压力边界 (LPB) 比均值测量压力低 1 个标准偏差。上压力边界 (UPB) 比平均测量压力9高出 1 个标准偏差。
    Equation 13
  11. 计算切线调节力以量化材料刚度。确定与下压力边界和上限压力对应的计算的圆周应力。将直线拟合到体内长度的确定应力范围内的圆周应力拉伸曲线。计算线9的斜率。

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Representative Results

女性生殖器官的机械特性的成功分析取决于适当的器官解剖、可分离和测试。有必要将子宫角切除阴道,没有任何缺陷(图1)。根据器官类型,管状大小会有所不同(图2)。必须进行排泄,使器官在实验期间不能移动,但不得在手术过程中损坏器官的墙壁(图3)。任一步骤的失败都会导致容器无法保持压力。测试程序标准化对于协议的成功至关重要,以便产生一致且可重复的结果。

一旦器官被解剖并正确分解,就对压力近视系统提供动力。压力近影系统的设置涉及控制器单元、流量计和阶段(图4)。压力表仪系统用于在进行机械测试时监控器官的各个方面(图5)。超声波系统,或等效,用于测量器官的厚度在卸载状态与和没有基础色调(图6)。机械测试后,可以计算圆周和轴向的切线调节(表2)。

基底色调测试和被动试验都产生了生殖道的关键机械特性,有和没有平滑肌细胞的收缩贡献(图7,图8)。器官之间的缩放需要对协议进行一些调整(表1),因为子宫颈和阴道在体内经历不同的负荷46-48。这种变异可以通过压力催化等技术进行监测。压力催化是以前用来监测阴道和子宫内体内状况的方法49-53。前一项研究的模型范围从老鼠、兔子和人类。同样的原则将同样适用于宫颈和阴道压力特定于鼠模型。虽然,无论哪个器官正在测试,协议都需要相同的材料(表3)。

Figure 1
图1:毛里断图。小鼠解剖生殖器官:子宫角,子宫颈和阴道。在图中,膀胱和尿道从阴道前部被移除。肠道和腹部肌肉反射得更出色。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:两根管的尺寸比较。用于生殖器官的两根管的尺寸比较。较大的管状 (D = 3.75 mm) 用于阴道组织 (A)。较小的管状 (D = 0.75 mm) 用于罐体宫颈组织 (B)。宫颈管是光滑的,而阴道管有两个凹槽。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:阴道和子宫颈的排泄方法。由于生殖器官的几何形状和厚度不同,它们最有效地以不同的方式可以进行。对于阴道,以"X"的方式放置两个缝合线。当子宫颈的缝合时,在子宫端放置3个水平缝合线,在外部os上放置4个缝合线。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:压力显影设备的设置。DMT 设备的设置用于基础测试和被动测试。DMT 由三个主要中心组成:阶段 (A)、控制器单元 (B) 和流量计 (C)。控制器单元内设有储液罐和废瓶。储液罐最初充满液体,在进行实验时排空。废物瓶最初是空的,它收集贯穿实验的液体。控制器单元与计算机上的 DMT 软件接口,并控制压力、温度和流量。控制器单元通过 VGA 接口电缆读取舞台上的力和压力传感器的输出。系统的阶段组件包含系统的入口和出口流。进气和出水流量具有系统测量的相应入口和出口压力。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:压力显影程序上的文件设置。计算机软件设置的显示。围绕感兴趣的区域绘制一个盒子,组织外径被实时(A )进行光学跟踪。在机械测试期间获得的数据记录并实时显示在外径、入口压力、出口压力、平均压力、力、温度、pH 和流量表符 (B) 中。在压力接口压力 (mmHg) 内,梯度 (mmHg/s) 和流量得到控制。此外,还显示由在线力传感器测量的轴向力 (mN)。流量 (μL/min) 在流量计选项卡 (C) 中报告。压力排序在音序器选项卡 (D) 中显示和控制在机械测试期间记录的数据记录并实时显示在外径、入口压力、出口压力、平均压力、力、温度、pH 和流量表符 (E )中。阴道的代表性压力直径测试显示在外径标签上显示外径作为时间的函数。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:超声成像。鼠生殖器官的超声成像。所有图像都是使用短轴-B模式下的超声波系统拍摄的。阴道在卸载的长度和压力 (A) 的代表性图像在ImageJ中计算了阴道壁厚。沿深度刻度 (mm) 绘制了一条垂直线,以校准每 μm 的像素数。多边形工具用于跟踪内径和外径。然后绘制跨壁画线来计算厚度和平均 (B)。这是执行3次。在卸载的长度和压力 (C) 处的子宫颈的代表性图像 。然后,使用图像 J 和多边形工具以与阴道 (D ) 类似的方式计算壁厚。在生殖复合体内,外径在两个不同的位置(E)被跟踪。在整个成像过程中,传感器由三维打印支架(F) 稳定。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:阴道试验的代表性结果。阴道基础和被动方案的代表性机械测试结果。通过DMT系统获得的数据,可以得出几种机械关系。A) 基底压力-直径,B) 被动压力-直径,C) Basal 力-压力,D) 被动力-压力,E) 基底圆周应力-圆周拉伸,F) 被动圆周应力圆周拉伸,G )基础轴向应力-圆周拉伸,H ) 被动轴应力圆周拉伸。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8:宫颈检测的代表性结果。宫颈基底和被动协议的代表性机械检测结果。通过DMT系统获得的数据,可以得出几种机械关系。A) 基底压力-直径,B) 被动压力-直径,C) Basal 力-压力,D) 被动力-压力,E) 基底圆周应力-圆周拉伸,F) 被动圆周应力圆周拉伸,G )基础轴向应力-圆周拉伸,H ) 被动轴应力圆周拉伸。请点击此处查看此图的较大版本。

在 Vivo 压力中 最大压力 1/3 最大压力 2/3 最大压力 轴向拉伸 卡坎纳尺寸 推荐编号
缝合
阴道 7 毫米汞柱 15 毫米汞柱 5 毫米汞柱 10 毫米汞柱 -2%,体内,±2% 3.75 毫米 2-- 以"X"的方式
宫颈 10 毫米汞柱 200 毫米汞柱 66 毫米汞柱 133 毫米汞柱 -2%,体内,±2% 0.75 毫米用于子宫端
3.75 毫米阴道端
3 个水平缝合线
子宫端
4 缝合
阴道外侧 os

表1:用于扩展每个器官的机械测试方法的信息摘要。在麻醉下使用催化技术测量未卸载的压力值(100%氧气中为 4% 的等值)。气球导管用于阴道测量和子宫颈的2F导管。

阴道 宫颈
基底
圆周(千帕)
127.94 188
基底
轴向 (kPa)
56.8 75.44
被动
圆周(千帕)
246.03 61.26
被动
轴向 (kPa)
112.74 19.26

表2:阴道和子宫颈切线调节的代表性结果。为基底和被动条件以及圆周和轴向计算切线调节。提供的所有测量均以 kPa 为单位。

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Discussion

本文提供的方案提出了一种测定鼠阴道和子宫颈的机械特性的方法。该协议分析的机械特性包括器官的被动和基底色调条件。被动和基底色调条件是通过改变器官被淹没的生化环境引起的。对于该协议,参与基础测试的介质含有钙。测试基础色调条件允许分离平滑肌细胞机械贡献在女性生殖器官54,55。执行被动机械测试时,介质不含钙。钙的缺乏会抑制平滑肌细胞的收缩。这允许阐明其他 ECM 组件,如胶原蛋白和弹性纤维,这在很大程度上决定了被动机械特性。当与生化和组织学分析相结合时,这些结果能够阐明ECM微结构组合物与机械功能之间的关系。这样就可以划定与妇女生殖健康有关的病理的结构和机制。

此前,阴道和子宫颈被单独测试27,28。阴道和子宫颈,然而,表现出各向异性的属性和体验多轴加载在体内29,30。因此,本文使用的压力近视仪系统提供有关多轴载荷的定量信息,有助于了解生殖病理的病因,以及后续的潜在治疗设计。此外 , 压力的造影允许评估多轴特性 , 同时保留体内器官几何和原生细胞基体相互作用 56 。在体内,细胞积极重塑周围的ECM,以响应生物力学和生化线索的变化57,58,59。本文中使用的协议是有利的,因为它允许在生理相关条件下监测大体器官特性的后续变化。这有助于提供一个平台来生成多轴有源和被动机械特性的系统数据集。此外,这些实验中收集的数据可用于制定和验证微结构动机的非线性构成模型,以描述和预测女性生殖器官在健康和病理状态16,60

另一个有利于该协议的系统组件是使用超声波成像来测量器官壁的厚度。厚度是计算在进行测试时经历的应力的关键信息。

对于任何实验设置,此过程都有一些限制。该协议目前只考虑阴道和子宫颈的弹性反应,而不考虑粘弹性反应。在未来,一种可能的方法可以减轻这种限制,方法是修改现有的协议,包括蠕变和应力松弛测定61。第二个限制是假设器官是不可压缩的。在这项研究中,厚度仅在卸载配置下测量,因为先前的研究表明,在渗透载荷62期间,非怀孕的鼠组织在体积上表现出最小的变化。此外,其他研究亦在同样假设的不可压缩性44、60、63下进行。理想情况下,将对整个实验进行超声波检查,以消除对不可压缩性假设的需要,并更好地为有限元模型提供信息。最后的限制是缺乏定量的宫颈压力来通知加载协议。文献表明,人类女性的宫颈压力为37毫米汞柱53。然而,老鼠可能表现出与人类不同的宫颈压力。鼠模型和人类样本64,65在阴道压力上的差异被证明。需要进一步的研究来量化非怀孕宫颈的压力。为此,子宫内压力最近报告在整个怀孕49。

本程序中使用的市售压力近影系统测量弹性、空心器官的力特性。通过修改沐浴中的化学添加剂、套管尺寸和缝合厚度,此方案可轻松适应其他各种器官和组织。

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Disclosures

没有。

Acknowledgments

这项工作由NSF CAREER奖授予#1751050资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

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