Biaxial बेसल टोन और Murine प्रजनन प्रणाली के निष्क्रिय परीक्षण एक दबाव मायोग्राफ का उपयोग

Bioengineering

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Summary

इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दबाव मायोग्राफ प्रणाली का उपयोग करने के लिए murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा पर दबाव मायोग्राफ परीक्षण प्रदर्शन. कैल्शियम के साथ और बिना मीडिया का उपयोग, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एसएमसी) बेसल टोन और निष्क्रिय extracellular मैट्रिक्स (ECM) के योगदान अनुमानित शारीरिक स्थितियों के तहत अंगों के लिए अलग थे.

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White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

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Abstract

मादा प्रजनन अंग, विशेष रूप से योनि और गर्भाशय ग्रीवा, विभिन्न सेलुलर घटकों और एक अद्वितीय extracellular मैट्रिक्स (ईसीएम) से बना रहे हैं. चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं योनि और गर्भाशय ग्रीवा दीवारों के भीतर एक संकुचन समारोह प्रदर्शन. जैव रासायनिक वातावरण और अंग दीवारों के यांत्रिक तनाव पर निर्भर करता है, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं संकुचन शर्तों को बदल. आधारभूत शारीरिक स्थितियों के तहत चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के योगदान को बेसल टोन के रूप में वर्गीकृत किया गया है। अधिक विशेष रूप से, एक बेसल टोन हार्मोनल और तंत्रिका उत्तेजना की अनुपस्थिति में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के आधारभूत आंशिक संकुचन है. इसके अलावा, ईसीएम अंग दीवारों और जैव रासायनिक संकेतों के लिए एक जलाशय के रूप में कार्यों के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान करता है. ये जैव रासायनिक संकेत विभिन्न अंग कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे विकास को भड़काने और homeostasis को बनाए रखने के रूप में. प्रत्येक अंग के ECM मुख्य रूप से कोलेजन फाइबर से बना है (ज्यादातर कोलेजन प्रकार मैं, III, और वी), लोचदार फाइबर, और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन / ईसीएम की संरचना और संगठन प्रत्येक अंग के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करता है। ईसीएम संरचना में परिवर्तन से प्रजनन रोगों के विकास का कारण बन सकता है, जैसे श्रोणि अंग पतन या समय से पहले गर्भाशय ग्रीवा remodeling। इसके अलावा, ईसीएम माइक्रोस्ट्रक्चर और कठोरता में परिवर्तन चिकनी मांसपेशी सेल गतिविधि और फीनोटाइप को बदल सकता है, जिसके परिणामस्वरूप संकुचन बल की हानि होती है।

इस काम में, रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग एस्ट्रस में 4-6 महीने की उम्र में nonpregnant murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा के बेसल टोन और निष्क्रिय यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए किया जाता है। अंगों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दबाव मायोग्राफ में रखा गया था और दोनों दबाव व्यास और बल लंबाई परीक्षण किया गया. प्रजनन अंगों की यांत्रिक विशेषता के लिए नमूना डेटा और डेटा विश्लेषण तकनीकों को शामिल किया गया है। इस तरह की जानकारी गणितीय मॉडल के निर्माण और तर्कसंगत महिलाओं के स्वास्थ्य रोगों के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप डिजाइन करने के लिए उपयोगी हो सकता है.

Introduction

योनि दीवार चार परतों से बना है, उपकला, लेमिना प्रोपरिया, मांसपेशियों, और adventitia. उपकला मुख्य रूप से उपकला कोशिकाओं से बना है। लेमिना प्रोपरिया में लोचदार और फाइब्रिलर कोलेजन फाइबर की एक बड़ी मात्रा होती है। मांसपेशियों को भी elastin और कोलेजन फाइबर से बना है, लेकिन चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की एक वृद्धि हुई राशि है. adventitia elastin, कोलेजन, और फाइब्रोब्लास्ट्स के शामिल है, हालांकि पिछले परतों की तुलना में कम सांद्रता में. चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं biomechanically प्रेरित अनुसंधान समूहों के लिए ब्याज के रूप में वे अंगों के संकुचन प्रकृति में एक भूमिका निभा तेहैं. इस तरह के रूप में, चिकनी मांसपेशी सेल क्षेत्र अंश और संगठन परिमाणीकरण यांत्रिक समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. पिछले जांच का सुझाव है कि योनि दीवार के भीतर चिकनी मांसपेशियों की सामग्री मुख्य रूप से परिधीय और अनुदैर्घ्य अक्ष में आयोजित किया जाता है. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चलता है कि चिकनी मांसपेशी क्षेत्र अंश दीवार1के समीपस्थ और दूरस्थ दोनों वर्गों के लिए लगभग 35% है .

गर्भाशय ग्रीवा एक उच्च कोलेजन संरचना है, कि हाल ही में जब तक, कम से कम चिकनी मांसपेशियों की कोशिका सामग्री2,3है सोचा था. तथापि, हाल के अध्ययनों से यह पता चला है किचिकनी पेशियों की कोशिकाओं में गर्भाशय 4,5में अधिक बहुतायत और भूमिका हो सकती है . गर्भाशय ग्रीवा चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की एक ढाल दर्शाती है. आंतरिक ओएस 50-60% चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं जहां बाहरी ओएस केवल 10% शामिल होते हैं. माउस अध्ययन, तथापि, cervix रिपोर्ट 10-15% चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और 85-90% रेशेदार संयोजी ऊतक क्षेत्रीय मतभेदों का कोई उल्लेख के साथ से बना हो6,7,8. यह देखते हुए कि माउस मॉडल अक्सर रिपोर्ट मानव मॉडल से अलग है, माउस गर्भाशय ग्रीवा के विषय में आगे की जांच की जरूरत है.

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा के यांत्रिक गुणों को स्पष्ट करने के लिए किया गया था. यह एक दबाव मायोग्राफ डिवाइस है कि परिधीय और अक्षीय दिशाओं में एक साथ यांत्रिक गुणों के आकलन में सक्षम बनाता है, जबकि देशी सेल मैट्रिक्स बातचीत और अंग ज्यामिति को बनाए रखने का उपयोग करके पूरा किया गया था. अंगों दो कस्टम cannulas पर रखा गया था और रेशम 6-0 टांके के साथ सुरक्षित. अनुपालन तथा स्पर्शज्या मोडुली9का निर्धारण करने के लिए अनुमानित शारीरिक अक्षीय खंड के चारों ओर दाब-व्यास परीक्षण किए गए। अनुमानित अक्षीय खंड की पुष्टि करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि यांत्रिक गुणों को शारीरिक श्रेणी में मात्रा निर्धारित किया गया था, बल-लंबाई परीक्षण किए गए थे। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल estrus में उम्र के 4-6 महीने में nonpregnant murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा पर किया गया था.

प्रोटोकॉल दो मुख्य यांत्रिक परीक्षण वर्गों में विभाजित है: बेसल टोन और निष्क्रिय परीक्षण. एक बेसल टोन चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के आधारभूत आंशिक संकुचन के रूप में परिभाषित किया गया है, यहां तक कि बाहरी स्थानीय, हार्मोनल, और तंत्रिका उत्तेजना की अनुपस्थिति में10. योनि और गर्भाशय ग्रीवा के इस आधारभूत संकुचन प्रकृति विशेषता यांत्रिक व्यवहार जो तो दबाव मायोग्राफ प्रणाली द्वारा मापा जाता है पैदावार. निष्क्रिय गुण intercellular कैल्शियम है कि संकुचन की आधारभूत स्थिति का कहना है हटाने के द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की छूट में जिसके परिणामस्वरूप. निष्क्रिय राज्य में, कोलेजन और elastin फाइबर अंगों की यांत्रिक विशेषताओं के लिए प्रमुख योगदान प्रदान करते हैं.

murine मॉडल बड़े पैमाने पर महिलाओं के प्रजनन स्वास्थ्य में रोगों का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। माउस प्रजनन प्रणाली 11,12,13,14के भीतर ईसीएम और यांत्रिक गुणों के बीच विकसित संबंधों की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई फायदे प्रदान करता है . इन लाभों में छोटे और अच्छी तरह से विशेषता estrous चक्र, अपेक्षाकृत कम लागत, हैंडलिंग में आसानी, और एक अपेक्षाकृत कम गर्भावधि समय15शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, प्रयोगशाला चूहों के जीनोम अच्छी तरह से मैप किया गया है और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों मशीनी hypotheses16,17,18का परीक्षण करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं।

वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध दाब मायोग्राफ प्रणालियों का उपयोग विभिन्न ऊतकों और अंगों की यांत्रिक प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए बड़े पैमाने पर किया जाता है। दाब मायोग्राफ प्रणाली पर विश्लेषण की गई कुछ उल्लेखनीय संरचनाओं में लोचदार धमनियों में19,20,21,22, नसें और ऊतक इंजीनियर संवहनी कलम23,24, घेघा25, और बड़ी आंतों26. दबाव मायोग्राफ प्रौद्योगिकी अक्षीय और परिधीय दिशाओं में गुणों का एक साथ मूल्यांकन परमिट जबकि देशी सेल-ECM बातचीत को बनाए रखने और विवो ज्यामिति में. नरम ऊतक और अंग यांत्रिकी में मायोग्राफ सिस्टम के व्यापक उपयोग के बावजूद, दबाव मायोग्राफ प्रौद्योगिकी का उपयोग करने वाला एक प्रोटोकॉल पहले योनि और गर्भाशय ग्रीवा के लिए विकसित नहीं किया गया था। योनि और ग्रीवा के यांत्रिक गुणों की पूर्व जांच कामूल्यांकन किया गया. तथापि, ये अंग शरीरकेभीतर 29,30के भीतर बहुअक्षीय लदान का अनुभव करते हैं, इस प्रकार उनकी द्विअक्षीय यांत्रिक प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करना महत्वपूर्ण है।

इसके अलावा , हाल के काम से पता चलता है चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं नरम ऊतक रोगों में एक संभावित भूमिका निभा सकते हैं5,28,31,32. यह दबाव मायोग्राफ प्रौद्योगिकी का उपयोग करने का एक और आकर्षण प्रदान करता है, क्योंकि यह देशी सेल-मैट्रिक्स बातचीत को बरकरार रखता है, इस प्रकार योगदान की वर्णन की अनुमति देता है कि चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को शारीरिक और pathophysiological में खेलते हैं शर्तों. इसमें, हम योनि के बहुअक्षीय यांत्रिक गुणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं और बेसल टोन और निष्क्रिय परिस्थितियों दोनों के तहत गर्भाशय ग्रीवा हैं।

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Protocol

इस अध्ययन के लिए एस्ट्रस में 4-6 महीने की मादा C57BL6J चूहे (29.4 - 6.8 ग्राम) का उपयोग किया गया। सभी प्रक्रियाओं Tulane विश्वविद्यालय में संस्थान पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. प्रसव के बाद, चूहों इच्छामृत्यु से पहले एक सप्ताह के लिए acclimateऔर और मानक शर्तों के तहत रखे गए थे (12 घंटे प्रकाश /

1. एस्ट्रस में माउस बलिदान

  1. ज्वारचक्र का निर्धारण करें: पूर्व अध्ययन15,33,34के अनुसार विजुअल मूल्यांकन द्वारा ज्वारचक्र की निगरानी की गई थी . ज्वारचक्र में चार चरण होते हैं: प्रोएस्ट्रस, एस्ट्रस, मेट्ट्रस, और डेस्ट्रस। प्रोएस्ट्रस चरण के दौरान जननांगों सूजन, गुलाबी, नम, और झुर्रियों वाले होते हैं। ज्वारनदमुखी चरण wrinkly लेकिन कम सूजन, गुलाबी, और नम है. Metestrus और diestrus दोनों कोई सूजन और wrinkling प्रदर्शन के रूप में सूचित कर रहे हैं, एक गुलाबी रंग में कमी है, और सूखी34,35.
  2. estrus पर प्रयोग करें: सभी यांत्रिक परीक्षण किया गया, जबकि चूहों estrus पर थे, के रूप में यह कल्पना करने के लिए सबसे आसान है और एक सुसंगत और repeatable timepoint प्रदान करता है.
  3. बेसल टोन परीक्षण के दौर से गुजर चूहों के लिए, गिलोटिन के माध्यम से ethanize. केवल निष्क्रिय परिस्थितियों में परीक्षण किए गए चूहों के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) इनहेलेशन का उपयोग करके इच्छामृत्यु करें। गिलोटिन प्रजनन पथ की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के समारोह को संरक्षित करने के लिए कार्य करता है, क्योंकि सीओ2 गैस चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के संकुचन गुणों को बदल देती है36,37,38, 39,40,41,42. सेल एपोप्टोसिस की संभावना को कम करने के लिए 30 मिनट के भीतर विच्छेदन करना आवश्यक है।

2. प्रजनन प्रणाली विच्छेदन

  1. सेट अप करें: कार्य केंद्र पर एक शोषक पैड रखें और 4 डिग्री सेल्सियस हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) समाधान के साथ एक पेट्री डिश और सिरिंज भरें। वसा ऊतक निपटान के लिए एक पोंछ का प्रयोग करें. माउस अधर पक्ष ऊपर रखें और पंजे और पूंछ टेप. पर माइक्रोस्कोप रोशनी मुड़ें और सूक्ष्म कैंची, कैंची, सीधे चने के दो जोड़े, और घुमावदार चम्मियों के दो जोड़े बाहर सेट.
  2. angled गुईएज और कैंची का उपयोग करना, पेट के चारों ओर त्वचा उठा और पेट के आधार पर एक चीरा बनाने, जघन हड्डी के ऊपर. चीरा पेट की मांसपेशियों की दीवार को पंचर नहीं करने के लिए पर्याप्त उथले होना चाहिए। कैंची का उपयोग जारी रखने के लिए रिब पिंजरे की ओर बेहतर कटौती और पेट की मांसपेशियों के माध्यम से गहरी.
  3. घुमावदार चम्मितर और माइक्रो-scissors के साथ वसा पर हल्के से खींच कर सतही वसा निकालें. वसा ऊतक एक चमक की तरह उपस्थिति के साथ हल्के विषमता को प्रतिबिंबित करेगा। पोंछे पर सभी हटा वसा और ऊतक रखें. गर्भाशय के सींग और जघन हड्डी दोनों की पहचान करें।
  4. जगह योनि दीवार और जघन हड्डी के बीच बंद कैंची. ध्यान से जघन हड्डी (पबिक सिम्फिसिस) के बीच में कटौती। कट जघन हड्डी के दोनों सिरों पर घुमावदार मांद रखें। दोनों कटौती खींच बाद में समाप्त होता है प्रजनन अंगों के लिए बेहतर पहुँच के लिए अनुमति देने के लिए.
  5. योनि दीवार से मूत्राशय और मूत्रमार्ग निकालें। यह सीधे चम्मितजीवक और माइक्रो-स्किजर का उपयोग करके किया जा सकता है। तनाव पैदा करने और योनि से आसपास के ऊतकों को अलग करने के लिए कुंद विच्छेदन तकनीकों का उपयोग करने के लिए सीधे चितर्ई के साथ मूत्राशय को पकड़ो। एक बार मूत्राशय और मूत्रमार्ग को काट दिया जाता है, आधार में कटौती करें और शरीर गुहा से निकालें।
  6. प्रजनन प्रणाली की पहचान करें: गर्भाशय के सींग गर्भाशय से विभाजित होते हैं। ज्यामिति और कठोरता में अंतर के कारण गर्भाशय ग्रीवा योनि से पहचाना जा सकता है। गर्भाशय ग्रीवा का बाहरी व्यास योनि से छोटा होता है। गर्भाशय योनि की तुलना में कठोर होता है और मनका के समान प्रतीत होता है (चित्र 1)।
  7. अंगों के साथ 3 मिमी डॉट्स चिह्नित करने के लिए स्याही और कैलिपर्स का उपयोग करें। गर्भाशय ट्यूबों पर अंडाशय के नीचे शुरू करें और गर्भाशय ग्रीवा तक पहुंचने के लिए डॉट्स को अवर रूप से चिह्नित करें। योनि अंतर्मुखता के लिए नीचे एक डॉट पथ शुरू करने के लिए केंद्र गर्भाशय ग्रीवा डॉट का प्रयोग करें.
  8. स्याही को प्रजनन अंगों को वसा के आस-पास के ऊतकों, संयोजी ऊतक और बृहदान्त्र से अलग करने की अनुमति दें। संभव के रूप में योनि introitus के करीब के रूप में योनि साफ. कैंची का उपयोग करना, योनि अंतर्मुखी के आसपास काट.
    नोट: यह अंगों के लिए इस प्रक्रिया के दौरान बाहर शुष्क करने के लिए संभव है। यदि यह एक चिंता का विषय है, तो अंगों में नमी जोड़ने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस एचबीएसएस से भरा सिरिंज का उपयोग किया जा सकता है।
  9. गर्भाशय के सींगों को अंडाशय से तुरंत कम करें। ध्यान दें कि अंगों के बाद explant लंबाई से वापस ले जाएगा के रूप में संयोजी ऊतक हटा दिया जाता है और अंग recoils. 4 डिग्री सेल्सियस एचबीएस से भरा एक पेट्री डिश में विच्छेदित प्रजनन अंगों को रखें। लंबाई में यह परिवर्तन vivo लंबाई में अनुमानित गणना के लिए में इस्तेमाल किया जा सकता है (अनुभाग 5).
    नोट: हम विच्छेदन के दौरान इस तापमान पर HBSS का उपयोग कर और cannulation चिकनी मांसपेशी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है कि की पहचान की है. 7.4 के पीएच बनाए रखने, तथापि, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. इस तापमान पर, HBSS का पीएच स्तर 7.4 है।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस एचबीएस में 15 मिनट की समसंबंध अवधि के बाद, कैलिपर्स का उपयोग करके डॉट्स के बीच की जगह को मापें। स्प्रैडशीट में प्रत्येक दूरी के लिए माप रिकॉर्ड करें. इन मानों का उपयोग विवो खंड अनुपात (मूल लंबाई/प्रतिरोपणित लंबाई) की गणना करने के लिए किया जाएगा।
  11. पोंछे कि माउस के अंदर का सामना करना पड़ अतिरिक्त ऊतक के साथ पेट क्षेत्र पर खारिज ऊतक शामिल सेट और 4 डिग्री सेल्सियस HBSS में पोंछ लेना. पन्नी में माउस और अतिरिक्त ऊतक लपेटें और एक फ्रीजर सुरक्षित बैग में जगह -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा करने के लिए। योनि पर निष्क्रिय यांत्रिक व्यवहार एक फ्रीज-थॉ व चक्र43के बाद काफी अलग नहीं पाया गया था। परीक्षण किए गए सभी अंगों का उपयोग इच्छामृत्यु के तुरंत बाद या एक फ्रीज-थॉव चक्र के बाद किया गया था।

3. कैनालकरना

  1. अंग प्रकार के लिए उचित कैनुला आकार निर्धारित करें। एक ठेठ C57BL6J माउस में, योनि cannulas कि दोनों 3.75 मिमी व्यास और riveted में हैं का उपयोग करता है. गर्भाशय ग्रीवा एक cannula कि योनि के अंत के लिए 3.75 मिमी है और गर्भाशय के अंत के लिए व्यास में एक cannula 0.75 मिमी का उपयोग करता है (चित्र 2) 0.75 मिमी cannula चिकनी है.
    नोट: ऊपर उल्घ व्यास आकार ठेठ nulliparous के लिए उपयोग किया जाता है 4-6 महीने C57BL6 चूहों, C57BL6 x 129Sv, और 7-9 महीने आयु वर्ग के nonparous चूहों. हालांकि, कुछ परिस्थितियों, जैसे पतन या गर्भावस्था, एक बड़े आकार के कैनुला की आवश्यकता हो सकती है।
  2. प्रत्येक अंग के साथ, कैनुलेशन डिवाइस के बल ट्रांसड्यूसर भाग पर गर्भाशय ग्रीवा की ओर माउंट करें। डिवाइस के माइक्रोमीटर भाग पर अंग (योनि या गर्भाशय) के विपरीत छोर पर माउंट करें। टांके के साथ दोनों सिरों को कस लें।
  3. मोटाई और योनि और गर्भाशय ग्रीवा के बीच संकुचन की डिग्री में अंतर के कारण, अलग तकनीक सबसे प्रभावी cannulation प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. योनि के लिए, एक "एक्स" फैशन में कैनुला के 2एन डी और 3आरडी rivets के बीच में 2 टांके रखें। जब गर्भाशय ग्रीवा canulating, cannula riveted नहीं है तो अंग सबसे अच्छा गर्भाशय के अंत पर 3 क्षैतिज टांके और बाहरी ओएस पर 4 टांके के साथ cannula के पीछे रखा जाता है. दोनों अंगों के लिए अधिकतम लंबाई टांके के बीच 7 मिमी से अधिक नहीं होनी चाहिए (चित्र 3)।

4. दबाव मायोग्राफ की स्थापना

  1. दाब मायोग्राफ प्रणाली स्थापित करने के लिए, परीक्षण प्रणाली पर विद्युत तथा जलाशय की बोतल को एचबीएसएस के 200 एमएल से भरना (चित्र 4)। "पर" करने के लिए गर्मी मुड़ें और जलाशय की बोतल में HBSS गर्मी के लिए अनुमति देते हैं. इसके बाद, माइक्रोस्कोप चालू करें और कंप्यूटर प्रोग्राम खोलें। सुनिश्चित करें कि कैनन्यूल्ड अंग, दबाव इंटरफ़ेस, प्रवाह मीटर रीडिंग, और अनुक्रमक फ़ंक्शन उपकरण की छवि सभी दृश्यमान हैं (चित्र 5)।

5. बेसल टोन यांत्रिक परीक्षण

नोट: गर्भाशय ग्रीवा परीक्षण की शुरुआत चरणों के दौरान एक phasic प्रकृति का प्रदर्शन किया. हालांकि, यह preconditioning के बाद कम हो गया. बेसल टोन परीक्षण DMT डिवाइस के बेसिन में Krebs रिंगर बफर (KRB) का उपयोग किया जाता है. बफर 95% हे2 और 5% सीओ2के साथ वातित है। बेसल टोन भाग पूरा होने के बाद, कैल्शियम मुक्त KRB का उपयोग किया जाता है।

  1. अनलोड ज्यामिति ढूँढना: अंग खिंचाव इतना है कि दीवार तनाव में नहीं है. योनि के लिए, योनि दीवार पर खांचे का निरीक्षण करें। गर्भाशय ग्रीवा के लिए, तुरंत स्याही डॉट्स कि ऊपर और केंद्रीय गर्भाशय ग्रीवा चिह्न के नीचे स्थित नीचे कटौती. यह 6 उम44की सीटू लंबाई में ग्रीवा के लिए एक दोहरावीय विधि तैयार करता है . कैलिपर्स के साथ सीवन तक की लंबाई को मापने
  2. अनलोड दबाव ढूँढना (UP): 1 mmHg की वृद्धि में 0 से 10 mmHg करने के लिए दबाव बढ़ाएँ. उस दबाव का निर्धारण करें जिसमें अंग अब ढह गया है। यह एक दिए गए दबाव पर बाहरी व्यास में सबसे बड़ी कूद के रूप में निर्धारित किया जा सकता है, के रूप में कार्यक्रम की निगरानी पर प्रदर्शित. दाब और बाहरी व्यास को रिकॉर्ड करने के बाद, इसे उस प्रथम बिंदु के रूप में नोट की जाए जिसमें अंग न गिरे और बल को शून्य कर दें।
  3. विवो खंड में अनुमानित: लंबाई मापा पोस्ट explant द्वारा विवो में मापा लंबाई विभाजित करके vivo खंड में अनुमानित गणना:
    Equation 1
  4. दबाव-व्यास पूर्व कंडीशनिंग: 0 mmHg करने के लिए दबाव सेट, vivo लंबाईEquation 2में अनुमानित करने के लिए लंबाई और 1.5 mmHg/s करने के लिए ढाल एक अनुक्रम है कि 0 mmHg से दबाव लेता है में विवो दबाव + अनलोड ( तालिका1),30 के लिए पकड़ सेकंड, और एक 30 सेकंड पकड़ अवधि के साथ 0 mmHg करने के लिए दबाव ले। 5 चक्रों की कुल के लिए दोहराने के बाद, कंप्यूटर प्रोग्राम में बंद करें दबाएँ और फ़ाइल सहेजें.
  5. विवो खंड में प्रयोगात्मक ढूँढना: अंग को विवो लंबाई में अनुमानित रूप से समायोजित करें, जबकि अनलोड दबाव और प्रेस प्रारंभकरें । अनलोड दाब से लेकर अधिकतम दाब (सारणी1) तक दाब मानों के लिए दाब मानों का आकलन करें। कंप्यूटर प्रोग्राम में रोकें बटन दबाएँ और फ़ाइल सहेजें.
    नोट: मापा खिंचाव मूल्य situ में गणना की है. यह सीमा है कि यह केवल जघन symphysis disarticulating के बाद मापा जा सकता है के साथ है. एक परिणाम के रूप में, प्राकृतिक tethering खो दिया है, जो लंबाई को संशोधित कर सकते हैं. तथापि, सैद्धांतिक खंड पहले से शुरू किए गए सिद्धांत पर आधारित है किऊर्जाके संरक्षण के लिए शारीरिक दबावों के संपर्क में आने पर अंग बल में कम से कम परिवर्तन का अनुभव करेगा। प्रोटोकॉल में, विवो खंड में मापा खिंचाव मूल्य प्रयोगात्मक पहचान की लंबाई का उपयोग कर की गणना की है जिसमें बल में कम से कम परिवर्तन जब दबाव की एक शारीरिक रेंज के संपर्क में होगा.
  6. दबाव-व्यास पूर्व कंडीशनिंग: 0 mmHg करने के लिए दबाव सेट करें, vivo लंबाई में प्रयोगात्मक करने के लिए लंबाई, और 1.5 mmHg/s. की ढाल एक अनुक्रम है कि अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश के लिए 0 mmHg से दबाव लेता है भागो, 30 सेकंड के लिए पकड़, और वापस करने के लिए 0 mmHg एक विज्ञापन के साथ 30 सेकंड होल्ड अवधि। 5 चक्रों की कुल के लिए यह दोहराने के बाद, प्रोग्राम इंटरफ़ेस में रोकें बटन दबाएँ और फ़ाइल सहेजें.
    नोट: 5.4 बढ़ते दबाव के साथ एक और अधिक सुसंगत अक्षीय बल पढ़ने को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. यह कदम विवो खंड में सही खोजने में सहायता करता है, जो अक्सर दृश्य संकेतों के आधार पर कम करके आंका जाता है। 5.6 हिस्टेरिसिस को कम करने के लिए और अंग की एक सुसंगत, दोहराने योग्य, गणितीय व्याख्या योग्य प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए एक एहतियाती कदम के रूप में कार्य करता है।
  7. बल-लंबाई पूर्व कंडीशनिंग: प्रवेश और आउटलेट दबाव दोनों के लिए 1/3 अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश दर्ज करें। अंग को इन विवो लंबाई के -2% तक समायोजित करें और प्रारंभ करें. विवो लंबाई में +2% की लंबाई समायोजित करें फिर वापस करने के लिए -2% पर 10 m/ कंप्यूटर प्रोग्राम में रोकें दबाएँ और फ़ाइल सहेजें.
  8. समानता: विवो लंबाई में निर्धारित अंग के साथ, अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश के 1/3 पर इनलेट और आउटलेट दबाव दोनों सेट करें। 10 मिनट के लिए अंग बराबर. धीरे धीरे दोनों दबाव वापस लाने के लिए 0 mmHg ढाल सेट के साथ 1.5 mmHg /
  9. अनलोड ज्यामिति का पुन: मूल्यांकन करें: अंग को विवो लंबाई में सेट करें और अनलोड दबाव के दबाव पर रखें। जब तक बल में न्यूनतम परिवर्तन नहीं होता, तब तक अक्षीय लंबाई को 10 उध/उ की दर से अनुमानित अनलोड लंबाई की ओर घटाएं। इस इसी लंबाई अनलोड लंबाई के रूप में जाना जाता है, या जहां अंग तनाव और न ही संपीड़न में नहीं है. बल शून्य करने से पहले, अनलोड लंबाई, बाहरी व्यास, और बल मान रिकॉर्ड करें।
    नोट: पूर्व अनलोड ज्यामिति दृश्य संकेतों, जो विशुद्ध रूप से गुणात्मक है द्वारा निर्धारित किया गया था. एक फिर से मूल्यांकन एक मात्रात्मक विधि के लिए आवश्यक है और लंबाई में संभावित परिवर्तन है कि preconditioning के दौरान हो सकता है के लिए खाते में. इस ज्यामिति अनुभाग 8 में इस्तेमाल किया जाएगा.
  10. अल्ट्रासाउंड सेटअप: परीक्षण डिवाइस में अंगों कल्पना करने के लिए सामान्य इमेजिंग पेट पैकेज का उपयोग करें। (चित्र 6) . परीक्षण से पहले, दबाव मायोग्राफ धातु बेसिन के नीचे से कलाकृतियों को कम से कम. एक ऊंचाई है कि ऊतक अभी भी पूरी तरह से परीक्षण समाधान में जलमग्न किया जा रहा है के साथ नीचे से अधिकतम दूरी है करने के लिए cannula समायोजित करें. एक कस्टम धारक इमेजिंग के दौरान एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में ट्रांसड्यूसर को स्थिर करने के लिए मुद्रित 3 डी है।
  11. अल्ट्रासाउंड इमेजिंग: बल ट्रांसड्यूसर के पास कैनुला की पहचान करें और ऊतक की लंबाई के साथ छवि के लिए माइक्रोस्कोप के चरण को समायोजित करें। परीक्षण प्रक्रिया के दौरान, लंबाई के साथ मध्य क्षेत्र ट्रैक किया जाता है (चित्र 6A,C)। इमेजिंग के बाद, बी-मोड फ्रेम की एक श्रृंखला के होते हैं और सबसे बड़ा बाहरी व्यास के साथ फ्रेम की पहचान है कि छवि "सिने की दुकान" पाश की समीक्षा करें। किए गए मोटाई गणना अनुभाग 8 में इस्तेमाल किया जाएगा।
  12. दबाव व्यास परीक्षण (-2% विवो लंबाई में): प्रेस प्रारंभ करें और अंग को समायोजित करें ताकि यह विवो लंबाई में -2% हो, दबाव को 0 mmHg और ढाल को 1.5 mmHg/ एक 20 सेकंड पकड़ अवधि के साथ 0 mmHg करने के लिए नीचे दबाव लाओ. 5 चक्र के लिए इस दोहराएँ.
  13. दबाव व्यास परीक्षण (विवो लंबाई में): अंग को प्रारंभ करें और समायोजित करें ताकि यह विवो लंबाई में हो, दबाव को 0 मिमीएचजी पर सेट करें, और 1.5 mmHg/s करने के लिए ग्रेडिएंट को 0 mmHg से अधिकतम दबाव में बढ़ाएं। एक 20 सेकंड पकड़ अवधि के साथ 0 mmHg करने के लिए नीचे दबाव लाओ. 5 चक्र के लिए इस दोहराएँ.
  14. दबाव व्यास परीक्षण (+2% विवो लंबाई में): अंग को समायोजित करें ताकि यह vivo लंबाई में +2% हो, 0 mmHg करने के लिए दबाव सेट करें, और 1.5 mmHg/s करने के लिए ग्रेडिएंट. अधिकतम दबाव के लिए 0 mmHg से दबाव बढ़ाएं और फिर वापस करने के लिए 0 mmHg एक 20 दूसरी पकड़ अवधि के साथ। 5 चक्र के लिए इस दोहराएँ. सभी तीन लंबाई से दबाव डेटा अनुभाग 8 में इस्तेमाल किया जाएगा.
  15. बल-लंबाई परीक्षण (नामिक दबाव): अनलोड दबाव और अंग के लिए दबाव सेट करें -2% में विवो लंबाई. अंग को विवो लंबाई के +2% तक फैलाएं और -2% विवो लंबाई में 10 डिग्री मीटर/s की दर से वापस लौटें। कुल 3 चक्रों के लिए दोहराएँ.
  16. बल-लंबाई परीक्षण (1/3 अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश): अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश के 1/3 के लिए दबाव सेट करें और अंग को समायोजित करने के लिए -2% vivo लंबाई में। प्रारंभदबाने के बाद, अंग को विवो लंबाई में +2% तक फैलाएं और वापस -2% विवो लंबाई में 10 डिग्री/ 3 चक्रों की कुल के लिए दोहराने के बाद, बंद करो दबाएँ और डेटा सहेजें.
  17. बल-लंबाई परीक्षण (2/3 अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश): अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश के 2/3 के लिए दबाव सेट करें और अंग को समायोजित करने के लिए -2% vivo लंबाई में। प्रारंभ करें और अंग को फैलाने के लिए +2% vivo लंबाई में और वापस करने के लिए -2% vivo लंबाई में 10 डिग्री / 3 चक्रों की कुल के लिए दोहराने के बाद, बंद करो दबाएँ और डेटा सहेजें.
  18. बल लंबाई परीक्षण (अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश): अधिकतम दबाव + उत्तर प्रदेश के लिए दबाव सेट और संगठन को समायोजित करने के लिए -2% में विवो लंबाई. 10 डिग्री मीटर/s की दर से, अंग को विवो लंबाई में +2% तक फैलाएं और विवो लंबाई में -2% तक वापस रखें। कुल 3 चक्रों के लिए दोहराने के बाद, डेटा सहेजें. सभी बल डेटा अनुभाग 8 में उपयोग किया जाएगा।
  19. KRB परीक्षण मीडिया निकालें और कैल्शियम मुक्त KRB के साथ धो लें. 2 एमएम EGTA के साथ पूरक कैल्शियम मुक्त KRB समाधान के साथ मीडिया बदलें. 30 मिनट के लिए ऊतक इनक्यूबेट करें। समाधान निकालें और ताजा कैल्शियम मुक्त KRB के साथ मीडिया की जगह.

6. निष्क्रिय यांत्रिक परीक्षण

नोट: यदि पेसिव परीक्षण के साथ प्रारंभ चरण 1 पर प्रारंभ करें। यदि बेसल टोन परीक्षण चरण 6 पर निष्क्रिय प्रारंभ करने से पहले किया गया था. जमे हुए ऊतक के साथ शुरू करते हैं, अंग canulating से पहले कमरे के तापमान पर एक 30 मिनट के तुल्यता अवधि की अनुमति दें।

  1. अनलोड ज्यामिति ढूँढना: अंग खिंचाव तो अंग की दीवार तनाव में नहीं है. सीवन से सीवन के लिए cannulated अंग को मापने और अनलोड लंबाई के रूप में इस रिकॉर्ड.
  2. अनलोड दबाव ढूँढना: प्रारंभदबाने के बाद, 1 mmHg की वेतन वृद्धि में 0 से 10 mmHg करने के लिए दबाव बढ़ा। इस प्रक्रिया के माध्यम से जाते समय, उस दबाव का निर्धारण करें जिसमें अंग तनाव में नहीं है। कंप्यूटर प्रोग्राम मॉनिटर का उपयोग करना, यह बाहरी व्यास में सबसे बड़ी कूद से निर्धारित किया जा सकता है. बल शून्य करने के बाद, इस दाब के साथ-साथ बाहरी व्यास को रिकॉर्ड करें और इसे उस प्रथम बिंदु के रूप में नोट करें जिसमें अंग ढहा नहीं है।
  3. विवो खंड में अनुमानित: वीवो में मापे गए लंबाई को मापे गए पोस्ट-एक्सप्लांट द्वारा विवो में मापी गई लंबाई को विभाजित करके अनुमानित विवो खंड की गणना करें।
  4. दबाव व्यास पूर्व कंडीशनिंग: प्रारंभ दबाने के बाद, दबावसेट करने के लिए सेट 0 mmHg, लंबाई के रूप में vivo लंबाई में अनुमानित, और 1.5 mmHg/s करने के लिए ढाल. अधिकतम दबाव के लिए 0 mmHg से दबाव लेता है कि एक अनुक्रम चलाने शुरू और 0 करने के लिए वापस mmHg. एक 30 सेकंड होल्ड समय के साथ 5 चक्र के माध्यम से इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
  5. बल-लंबाई पूर्व कंडीशनिंग: अंग को इन विवो लंबाई में समायोजित करें और मैन्युअल रूप से दोनों दबावों के लिए कंप्यूटर प्रोग्राम में अनलोड दबाव दर्ज करें। प्रारंभ दबाने के बाद, ग्रेडिएंट को 2 mmHg पर सेट करें और अधिकतम 1/ अंग को +2% तक फैलाएं और 10 डिग्री सेल्सियस पर -2% खिंचाव तक वापस रखें। इस चक्र को कुल 5 बार दोहराएं और बंद करें
  6. विवो लंबाई में प्रयोगात्मक ढूँढना: vivo लंबाई में -2% पर ढूँढें और साजिश बल मूल्यों, विवो लंबाई में, और vivo लंबाई में के +2%. 0 mmHg से अधिकतम दबाव को लेकर समान स्थान पर दबाव पर बलों ले लो. विवो खंड में प्रयोगात्मक खिंचाव मूल्य है कि दबाव की एक सीमा पर एक अपेक्षाकृत फ्लैट लाइन दर्शाती हो जाएगा.
  7. Vivo लंबाई में नए पर दबाव व्यास और अक्षीय पूर्व कंडीशनिंग कदम दोहराएँ.
  8. समानता: विवो लंबाई में निर्धारित अंग के साथ, अनलोड दबाव के लिए इनलेट और आउटलेट दबाव सेट करें। अंग को 15 मिनट के लिए फिर से बराबर होने दें। 15 मिनट के बाद, धीरे धीरे प्रवेश और आउटलेट दबाव वापस लाने के लिए 0 mmHg.
  9. अनलोड कॉन्फ़िगरेशन का पुन: मूल्यांकन करें: अंग को अनलोड लंबाई पर लाएँ और अनलोड लंबाई का पुन: अनुमान लगाएं. अनलोड लंबाई और बाहरी व्यास रिकॉर्ड जबकि दबाव है 0 mmHg, अनलोड दबाव, और 1/ अनलोड दाब पर बल शून्य करें। अनलोड दबाव पर व्यास में विवो व्यास है.
    नोट: अनलोड लंबाई को फिर से निर्धारित करना आवश्यक है क्योंकि पूर्व कंडीशनिंग के बाद छोटे प्लास्टिक विकृतियों को पहले नरम जैविक ऊतकों में देखा गया था। इस अनलोड विन्यास अनुभाग 8 में उपयोग किया गया एक हो जाएगा।
  10. अल्ट्रासाउंड: अनलोड लंबाई और दबाव पर अल्ट्रासाउंड बी-मोड इमेजिंग प्रदर्शन करें।
  11. दबाव व्यास परीक्षण: प्रयोगात्मक vivo लंबाई में निर्धारित की -2% पर अंग और 0 mmHg पर दबाव के साथ, प्रेस शुरू| अधिकतम दबाव और वापस करने के लिए 0 mmHg से दबाव बढ़ाएँ 0 mmHg. 20 सेकंड के लिए 2-0 mmHg कदम पकड़ो. 5 बार की कुल के लिए दोहराने के बाद, इंटरफ़ेस में बंद करो बटन दबाएँ और फ़ाइल को बचाने के.
    नोट: विवो लंबाई में प्रयोगात्मक पर दोहराएँ, vivo लंबाई में प्रयोगात्मक के 22%.
  12. बल-लंबाई परीक्षण: नाममात्र के दबाव के लिए दबाव सेट करें और अंग को विवो लंबाई में -2% तक समायोजित करें। विवो लंबाई के +2% तक अंग को खिंचाव और वापस करने के लिए -2% में विवो लंबाई की दर से 10 डिग्री / कुल 3 बार दोहराने के बाद, डेटा सहेजें. इसे 1/3 अधिकतम दाब, 2/3 अधिकतम दाब तथा अधिकतम दाब के लिए दोहराएँ।
  13. अल्ट्रासाउंड छवियों बी-मोड छवि से अनलोड मोटाई की गणना। इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रवेश गहराई को निरूपित करने के लिए एक रेखा आरेखित करें। पैमाने को रेखा की लंबाई पर सेट करें (अर्थात् चित्र 6ठ और 6D)में दर्शाए अनुसार 2000 उउ ।
  14. दीवार मोटाई गणना: एक कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, ट्रेस और अंग के आंतरिक और बाहरी व्यास को मापने. फिर, आकर्षित और व्यास के बीच एक पंक्ति को मापने। कुल 25 ट्रांसमरल रेखाएँ आरेखित करें। सभी डेटा बिंदुओं का औसत करें और कुल 3 बार दोहराएँ.

7. साफ

  1. सुनिश्चित करें कि दबाव 0 mmHg है और बंद कर दिया. दोनों तीन तरह वाल्व के लिए मुख्य प्रवेश और आउटलेट बंद करें. कैनुलेशन डिवाइस के बेसिन से शेष तरल पदार्थ को प्रेरित करें।
  2. मंच से अंग निकालें और deionized पानी के साथ जलाशय की बोतल को भरने. एक सिरिंज का उपयोग करना, पानी के साथ cannula कुल्ला. कैनुला को बायपास करने के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
  3. दबाव और प्रवाह पर बारी, 200 mmHg करने के लिए इनलेट दबाव सेट, आउटलेट दबाव करने के लिए 0 mmHg, 10 mmHg/ जलाशय की बोतल खाली है, जबकि प्रणाली को चलाने के लिए अनुमति दें और हवा 5 मिनट के लिए या जब तक लाइनों सूखी हैं चलाने के लिए.

8. डेटा विश्लेषण

  1. दबाव व्यास परीक्षण के लिए, जहां दबाव अधिकतम जब तक न्यूनतम मूल्य से बढ़ाने के लिए शुरू होता है से डेटा एकत्र. बल-लंबाई परीक्षण के लिए, बल में अधिकतम शिखर के ठीक नीचे से तब तक डेटा एकत्र कीजिए जब तक कि बल कम होना बंद नहीं हो जाता।
  2. प्रत्येक दाब-व्यास परीक्षण के लिए डेटा फ़ाइल खोलें और माध्य दाब टैब का चयन करें. अंतिम वक्र के लोडिंग क्षेत्र में नेविगेट करें, 0 mmHg अधिकतम दबाव पर, और डेटा को स्प्रेडशीट में छोड़ दें. बाहरी व्यास, इनलेट दबाव, आउटलेट दबाव, बल, तापमान, पीएच, और प्रवाह टैब पर एक ही क्षेत्र का चयन करें एक ही दस्तावेज़ में प्रत्येक आइटम रखने.
  3. प्रत्येक बल-लंबाई परीक्षण के लिए डेटा खोलें। वक्र के लोडिंग क्षेत्र पर नेविगेट करें, -2% से +2%, और डेटा को किसी स्प्रैडशीट में खींचें और छोड़ें. अन्य मापा चर के लिए एक ही क्षेत्र का चयन करें और एक ही स्प्रैडशीट में प्रत्येक आइटम जगह है।
  4. दबाव व्यास और बल लंबाई परीक्षण के लिए सभी दबाव मूल्यों से उत्तर प्रदेश घटाना.
  5. प्रत्येक 1 mmHg (अर्थात, 0 +/- 0.5, 1 +/-0.5, 2 +/- 0.5) का औसत दबाव-व्यास डेटा।
  6. अंग (V) का अनलोड आयतन खोजें . समीकरण 1 Vको खोजने के लिए उपयोग किया जा सकता है, यह देखते हुए कि R02 माइक्रोस्कोप द्वारा मापा गया अनलोड बाहरी त्रिज्या है, L अनलोड लंबाई है, और H अल्ट्रासाउंड द्वारा पता लगाए जाने के रूप में अनलोड मोटाई है। असंपीड्यता की धारणा का लाभ उठाया जाता है, जिसका अर्थ है कि अंग मात्रा को संरक्षित करता है, जबकि विरूपण के अधीन होता है।
    नोट: अनलोड लंबाई सीवन से सीवन करने के लिए कैलिपर्स के साथ मापा जाता है। अनलोड व्यास को माइक्रोस्कोप, कैमरा और सॉफ्टवेयर के माध्यम से मापा जाता है जिसके बाद त्रिज्या की गणना की जाती है (चित्र 5) अनलोड मोटाई की गणना अल्ट्रासाउंड छवियों से की जाती है (चित्र 6)।
    Equation 3समीकरण 1
  7. असंपीड्यता की धारणा का प्रयोग करके विकृत आंतरिकEquation 4त्रिज्या Equation 6 काEquation 5निर्धारण करने के लिए अनलोड आयतन , विकृत बाहरी त्रिज्या ( ) और लंबाई ( ) का प्रयोग करें .
    Equation 7समीकरण 2
  8. क्रमशः प्रत्येक प्रतिबल की गणना करने के लिए समीकरण 3, 4, और 5 का उपयोग करें। समीकरण 3-5 में, च को अंतःदीप्तिदाबी दाब के रूप में परिभाषित किया जाता है तथा च ट्रांसड्यूसर द्वारा मापा जाने वाला बल है।
    Equation 8समीकरण 3
    Equation 9समीकरण 4
    Equation 10समीकरण 5
  9. दाब-व्यास संबंध, बल-दाब संबंध, परिधीय प्रतिबल-परिक्रमात्मक खिंचाव संबंध तथा अक्षीय प्रतिबल तथा परिधीय खिंचाव मान (चित्र7, चित्र8)। खिंचाव मूल्यों midwall त्रिज्या का उपयोग कर गणना की जा सकती है. परिधीय और अक्षीय तनावों की गणना समीकरण 6 तथा 7 में क्रमशः पाई जा सकती है।
    Equation 11समीकरण 6
    Equation 12समीकरण 7
  10. शारीरिक दबाव रेंज के पास और इन विवो खंड में अनुपालन की गणना करें। कम दबाव बाध्य (LPB) मतलब मापा दबाव के नीचे 1 मानक विचलन है. ऊपरी दाब परिबंध (यूपीबी) माध्य मापित दाब9से ऊपर 1 मानक विचलन है।
    Equation 13
  11. सामग्री कठोरता की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्पर्शज्या moduli की गणना करें। परिकलित परिधीय प्रतिबल की पहचान की जाती है जो निम्न दाब बद्ध तथा ऊपरी परिबंधदाब से मेल खाता है। विवो लंबाई में पहचान की गई प्रतिबल सीमा के भीतर परिधीय खिंचाव वक्र पर एक रेखीय रेखा को फ़िट करें। रेखा9 की प्रवणता की गणना कीजिए।

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Representative Results

महिला प्रजनन अंगों के यांत्रिक गुणों का सफल विश्लेषण उचित अंग विच्छेदन, कैनुलेशन, और परीक्षण पर आकस्मिक है। गर्भाशय के सींगों को बिना किसी दोष के योनि में निकालना अनिवार्य है (चित्र 1) अंग प्रकार के आधार पर कैनुला का आकार अलग-अलग होगा (चित्र 2). छाननी अवश्य की जा सके ताकि अंग प्रयोग के दौरान गति न कर सके बल्कि प्रक्रिया के दौरान अंग की दीवार को भी क्षति न पहुँचा ए त (चित्र 3) किसी भी चरण में विफलता के परिणामस्वरूप पोत पर दबाव बनाए रखने में असमर्थता होगी। परीक्षण प्रक्रिया मानकीकरण प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है ताकि लगातार और repeatable परिणाम उपज.

एक बार अंग विच्छेदन और ठीक से cannulated है, दबाव मायोग्राफ प्रणाली पर शक्ति. दाब मायोग्राफ प्रणालियों की स्थापना में नियंत्रक इकाई, प्रवाह मीटर तथा अवस्था (चित्र4) शामिल है। अंग के विभिन्न पहलुओं पर निगरानी रखने के लिए दाब मायोग्राफ प्रणाली का प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह यांत्रिक परीक्षण से गुजरता है (चित्र 5) । एक अल्ट्रासाउंड प्रणाली, या समकक्ष, के साथ और बेसल टोन के बिना अनलोड राज्य में अंगों की मोटाई को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्र 6)। यांत्रिक परीक्षण के बाद स्पर्शज्या मोडुली की गणना परिधीय एवं अक्षीय दिशाओं (सारणी2) के लिए की जा सकती है।

दोनों बेसल टोन परीक्षण और निष्क्रिय परीक्षण प्रजनन पथ के प्रमुख यांत्रिक गुणों उपज, के साथ और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के संकुचन योगदान के बिना (चित्र 7, चित्र 8)। अंगों के बीच स्केलिंग के लिए प्रोटोकॉल (तालिका 1) में कुछ समायोजन की आवश्यकता होती हैक्योंकि गर्भाशय ग्रीवा और योनि विवो46-48में विभिन्न भारों का अनुभव करते हैं . इस तरह की विविधताओं दबाव कैथराइजेशन के रूप में तकनीक के माध्यम से नजर रखी जा सकती है. प्रेशर कैथरिन एक विधि है जिसका उपयोग पहले योनि औरगर्भाशयके भीतर विवो स्थितियों पर नजर रखने के लिए किया जाता था . पिछले अध्ययनों में मॉडल चूहों से लेकर, खरगोश, और मनुष्य. एक ही सिद्धांत गर्भाशय ग्रीवा और योनि दबाव murine मॉडल के लिए विशिष्ट करने के लिए इसी तरह लागू होगा. यद्यपि, चाहे किसी अंग का परीक्षण किया जा रहा हो, प्रोटोकॉल के लिए समान सामग्रियों की आवश्यकता होती है (सारणी3)।

Figure 1
चित्र 1: Murine विच्छेदन आरेख. प्रजनन अंगों के लिए माउस विच्छेदन: दोनों गर्भाशय सींग, गर्भाशय ग्रीवा, और योनि. आंकड़ा में, मूत्राशय और मूत्रमार्ग योनि के पूर्वकाल से हटा दिए जाते हैं। आंतों और पेट की मांसपेशियों को बेहतर ढंग से परिलक्षित किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: दो कैनुला की आकार तुलना। प्रजनन अंगों के कैनुलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले दो कैनुला की आकार तुलना। बड़ा कैनुला (D ] 3.75 मिमी) योनि ऊतक के लिए प्रयोग किया जाता है () . छोटे कैनुला (D ] 0ण्75 मिमी ) काउपयोग ग्रीवा ऊतक (बी ) के लिए किया जाता है। ग्रीवा कैनुला चिकनी है, जबकि योनि कैनुला दो खांचे है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: योनि और गर्भाशय ग्रीवा के लिए कैनुलेशन विधि। प्रजनन अंगों की बदलती ज्यामिति और मोटाई के कारण, वे सबसे प्रभावी ढंग से अलग शिष्टाचार में cannulated हैं. योनि के लिए, एक "एक्स" फैशन में दो टांके जगह है. गर्भाशय ग्रीवा को छानते समय, गर्भाशय के सिरे पर 3 क्षैतिज टांके और बाहरी ओएस पर 4 टांके रखें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: दबाव मायोग्राफ डिवाइस के लिए सेटअप करें। दोनों बेसल और निष्क्रिय परीक्षण के लिए उपयोग DMT डिवाइस की स्थापना. DMT तीन मुख्य केन्द्रों से बना है: मंच (), नियंत्रक इकाई (बी), और प्रवाह मीटर (सी) . नियंत्रक इकाई के भीतर, वहाँ एक जलाशय की बोतल और एक बेकार की बोतल है. जलाशय की बोतल शुरू में तरल पदार्थ से भर जाती है जो प्रयोग के रूप में खाली हो जाती है। अपशिष्ट बोतल, जो शुरू में खाली है, प्रयोग के माध्यम से चलने वाले तरल पदार्थ एकत्र करता है। कंप्यूटर पर DMT सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रक इकाई इंटरफेस और दबाव, तापमान, और प्रवाह को नियंत्रित करता है। नियंत्रक इकाई एक वीजीए इंटरफेस केबल के माध्यम से मंच के भीतर बल और दबाव ट्रांसड्यूसर से outputs पढ़ता है. प्रणाली के चरण घटक में प्रणाली का एक इनलेट और आउटलेट प्रवाह होता है। इनलेट और आउटलेट प्रवाह इसी इनलेट और आउटलेट दबाव प्रणाली द्वारा मापा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: दबाव मायोग्राफ प्रोग्राम पर फ़ाइल सेटअप. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर सेट-अप का प्रदर्शन. एक बॉक्स ब्याज के क्षेत्र के चारों ओर तैयार की है और ऊतकके बाहरी व्यास ऑप्टिकली वास्तविक समय में नज़र रखी है ( ए). यांत्रिक परीक्षण के दौरान प्राप्त डेटा दर्ज की गई है और बाहरी व्यास, इनलेट दबाव, आउटलेट दबाव,मतलब दबाव, बल, तापमान, पीएच, और प्रवाह टैब ( बी) में वास्तविक समय प्रदर्शित किया जाता है। दबाव इंटरफ़ेस दबाव (mmHg) के भीतर, ढाल (mmHg/ इसके अतिरिक्त, इन-लाइन बल ट्रांसड्यूसर द्वारा मापे गए अक्षीय बल (एमएन) प्रदर्शित होता है। प्रवाह मीटर टैब (सी) में प्रवाह दर(जेडएल/मिनट) की सूचना दी जाती है। दाब अनुक्रमण को अनुक्रमक टैब () में दर्शाया और नियंत्रित किया जाता है। यांत्रिक परीक्षण के दौरान दर्ज किए गए डेटा दर्ज की गई है और बाहरी व्यास, इनलेट दबाव, आउटलेटदबाव, मतलब दबाव, बल, तापमान, पीएच, और प्रवाह टैब ( ई) में वास्तविक समय प्रदर्शित किया जाता है। योनि का एक प्रतिनिधि दाब व्यास परीक्षण बाहरी व्यास टैब पर समय के एक समारोह के रूप में बाहरी व्यास दिखाते हुए प्रदर्शित किया जाता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: अल्ट्रासाउंड इमेजिंग। मरिन प्रजनन अंगों की अल्ट्रासाउंड इमेजिंग। सभी छवियों को कम अक्ष-बी मोड पर अल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग कर लिया गया। अनलोड लंबाई और दाब पर योनि की एक प्रतिनिधि छवि () । योनि दीवार मोटाई ImageJ में गणना की गई थी. प्रति $उ पिक्सेल की संख्या को अंशांकित करने के लिए गहराई पैमाने (मिमी) के साथ एक ऊर्ध्वाधर रेखा खींची गई थी। बहुभुज उपकरण आंतरिक और बाहरी व्यास का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. तब मोटाई और औसत (बी) की गणना करने के लिए ट्रांसमरल रेखाएं खींचीगईथीं। यह 3 बार किया गया था. अनलोड लंबाई और दाब पर गर्भाशय ग्रीवा की एक प्रतिनिधि छवि (सी) । दीवार मोटाई तो छवि जम्मू और बहुभुज उपकरण का उपयोग कर एक समान तरीके से योनि (डी) के लिए गणना की गई थी. प्रजनन परिसर के भीतर, बाहरी व्यास दो अलगअलग स्थानों पर नज़र रखी है (ई). इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, ट्रांसड्यूसर एक 3-डीमुद्रित धारक (एफ) द्वारा स्थिर है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: योनि परीक्षण के लिए प्रतिनिधि परिणाम. प्रतिनिधि योनि बेसल और निष्क्रिय प्रोटोकॉल के यांत्रिक परीक्षण परिणाम. DMT प्रणाली द्वारा प्राप्त आंकड़ों के साथ, कई यांत्रिक संबंधों को प्राप्त किया जा सकता है. A) बेसल प्रेशर-व्यास , बी) निष्क्रिय दाब-व्यास , सी) बेसल बल-दबाव, डी) निष्क्रिय बल-दबाव , ) बेसल परिधीय तनाव-परिपरिक्य खिंचाव , एफ) निष्क्रिय परिधीय प्रतिबल-परिक्रमात्मक खिंचाव, जी) बेसल अक्षीय तनाव-परिपरिगमिक खिंचाव, एच) निष्क्रिय अक्षीय तनाव-परिस्थितित्मक खिंचाव। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: गर्भाशय ग्रीवा परीक्षण के लिए प्रतिनिधि परिणाम. गर्भाशय ग्रीवा बेसल और निष्क्रिय प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि यांत्रिक परीक्षण परिणाम. DMT प्रणाली द्वारा प्राप्त आंकड़ों के साथ, कई यांत्रिक संबंधों को प्राप्त किया जा सकता है. A) बेसल प्रेशर-व्यास , बी) निष्क्रिय दाब-व्यास , सी) बेसल बल-दबाव, डी) निष्क्रिय बल-दबाव , ) बेसल परिधीय तनाव-परिपरिक्य खिंचाव , एफ) निष्क्रिय परिधीय प्रतिबल-परिक्रमात्मक खिंचाव, जी) बेसल अक्षीय तनाव-परिपरिगमिक खिंचाव, एच) निष्क्रिय अक्षीय तनाव-परिस्थितित्मक खिंचाव। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विवो दबाव में अधिकतम दबाव 1/3 अधिकतम दबाव 2/3 अधिकतम दबाव अक्षीय खिंचाव कैनुला आकार अनुशंसित संख्या
सीवनों का
योनि 7 एमएमएचजी 15 एमएमएचजी 5 एमएमएचजी 10 एमएमएचजी -2%, विवो में, +2% 3.75 मिमी 2-- एक "एक्स" फैशन में
गर्भाशय ग्रीवा 10 एमएमएचजी 200 mmHg 66 mmHg 133 mmHg -2%, विवो में, +2% गर्भाशय के अंत के लिए 0.75 मिमी
योनि अंत के लिए 3.75 मिमी
3 क्षैतिज टांके पर
गर्भाशय ांत
4 टांके पर
योनि बाहरी ओएस

तालिका 1: प्रत्येक अंग के लिए यांत्रिक परीक्षण विधियों स्केलिंग के लिए जानकारी का सारांश. अनलोड दबाव मूल्यों संज्ञाहरण के तहत कैथरिजन तकनीक का उपयोग कर मापा गया (4% isoflurane में 100% ऑक्सीजन). एक गुब्बारा कैथेटर योनि माप और गर्भाशय ग्रीवा के लिए एक 2F कैथेटर के लिए उपयोग किया गया था.

योनि गर्भाशय ग्रीवा
बेसल
खतना (kPa)
127.94 188
बेसल
अक्षीय (kPa)
56.8 75.44
निष्क्रिय
खतना (kPa)
246.03 61.26
निष्क्रिय
अक्षीय (kPa)
112.74 19.26

तालिका 2: योनि और गर्भाशय ग्रीवा की स्पर्शरेखा moduli के लिए प्रतिनिधि परिणाम. स्पर्शज्या moduli दोनों आधारीय और निष्क्रिय स्थितियों के लिए और साथ ही दोनों परिमापनीय और अक्षीय दिशाओं के लिए गणना की गई. प्रदान की सभी माप kPa की इकाइयों में हैं.

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Discussion

इस लेख में प्रदान प्रोटोकॉल murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा के यांत्रिक गुणों का निर्धारण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण यांत्रिक गुणों दोनों अंगों के निष्क्रिय और बेसल टोन शर्तों में शामिल हैं. निष्क्रिय और बेसल टोन स्थितियों जैव रासायनिक वातावरण जिसमें अंग जलमग्न है बदलने से प्रेरित कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल के लिए, बेसल परीक्षण में शामिल मीडिया कैल्शियम होता है. बेसल टोन स्थिति का परीक्षण मादा प्रजनन अंगों के भीतर चिकनी मांसपेशी कोशिका यांत्रिक योगदान के अलगाव की अनुमति देता है54,55. निष्क्रिय यांत्रिक परीक्षण करते समय, मीडिया कैल्शियम शामिल नहीं है. कैल्शियम की कमी के अनुबंध से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को रोकता है. यह अन्य ईसीएम घटकों के स्पष्टीकरण की अनुमति देता है, जैसे कोलेजन और लोचदार फाइबर, जो काफी हद तक निष्क्रिय यांत्रिक गुणों को निर्देशित करते हैं। जब जैव रासायनिक और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के साथ संयुक्त, इन परिणामों ECM सूक्ष्मसंरचनात्मक संरचना और यांत्रिक समारोह के बीच संबंधों के स्पष्टीकरण की अनुमति. यह तो महिलाओं के प्रजनन स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक रोगों के संरचनात्मक और यांत्रिक तंत्र के चित्रण के लिए अनुमति देता है.

पहले योनि और ग्रीवा का परीक्षण किया जाता था ,27,28. योनि और गर्भाशय ग्रीवा, तथापि, एनिसोट्रोपिक गुणों का प्रदर्शन और विवो29,30 में multiaxial लोड हो रहा है अनुभव . इसलिए, यहां इस्तेमाल किए जाने वाले दबाव मायोग्राफ सिस्टम मल्टीएक्सियल लोडिंग पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं जो प्रजनन रोगों की etiologies को समझने में सहायता कर सकते हैं, साथ ही संभावित उपचार के बाद के डिजाइन। इसके अलावा, दबाव माइग्राफी बहुअक्षीय गुणों के मूल्यांकन की अनुमति देता है, जबकि विवो अंग ज्यामिति और देशी सेल-मैट्रिक्स बातचीत56 के संरक्षण. विवो में कोशिकाएं जैव यांत्रिक और जैव रासायनिक संकेतों57,58,59में परिवर्तन के जवाब में आस-पास के ईसीएम को सक्रिय रूप से फिर से तैयार करती हैं . यहां इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल फायदेमंद है क्योंकि यह शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों के तहत थोक अंग गुणों में बाद में परिवर्तन की निगरानी की अनुमति देता है। यह मल्टीएक्सियल सक्रिय और निष्क्रिय यांत्रिक गुणों के व्यवस्थित डेटासेट उत्पन्न करने के लिए एक मंच प्रदान करने में सहायता करता है। इसके अलावा, इन प्रयोगों में एकत्र किए गए आंकड़ों का लाभ उठाया जा सकता है ताकि स्वस्थ और में महिला प्रजनन अंगों की यांत्रिक प्रतिक्रिया का वर्णन और भविष्यवाणी करने के लिए सूक्ष्म संरचनात्मक रूप से प्रेरित गैर रेखीय संरचक मॉडल को तैयार और मान्य किया जा सके और रोग राज्यों16,60.

एक अतिरिक्त प्रणाली घटक है कि प्रोटोकॉल के लिए फायदेमंद था अंग दीवारों की मोटाई को मापने के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग किया गया था। मोटाई परीक्षण के दौरान अनुभवी तनाव की गणना के लिए महत्वपूर्ण जानकारी है.

किसी भी प्रयोगात्मक सेट अप के साथ, इस प्रक्रिया के लिए कुछ सीमाएं हैं. इस प्रोटोकॉल वर्तमान में केवल योनि और गर्भाशय ग्रीवा और नहीं चिपचिपा लोचदार प्रतिक्रिया के लोचदार प्रतिक्रिया पर विचार करता है. भविष्य में इस सीमा को कम करने के लिए एक संभावित विधि के लिए रेंगना और तनाव छूट assays61शामिल करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए है . एक दूसरी सीमा मान रहा है अंगों असंपीड्य हैं. इस अध्ययन के भीतर, मोटाई पूरी तरह से अनलोड विन्यास पर मापा गया था, के रूप में पूर्व अध्ययन है कि nonpregnant murine ऊतक प्रदर्शित करता है कि osmotic लोड िंग लोडिंग62के दौरान मात्रा में कम से कम परिवर्तन दर्शाती द्वारा प्रेरित . इसके अलावा , अतिरिक्त अध्ययन असह्यता44,60,63की इसी धारणा के तहत संचालित किया है . आदर्श रूप में, एक अल्ट्रासाउंड प्रयोग की संपूर्णता के लिए प्रदर्शन किया जाएगा ताकि inpressibility धारणा के लिए की जरूरत को दूर करने के लिए और बेहतर परिमित तत्व मॉडल को सूचित करने के लिए. एक अंतिम सीमा लोडिंग प्रोटोकॉल को सूचित करने के लिए विवो गर्भाशय ग्रीवा के दबाव में मात्रा निर्धारित की कमी है। साहित्य से पता चलता है कि मानव महिलाओं में गर्भाशय ग्रीवा का दबाव 37 mmHg53है . चूहे, तथापि, मनुष्य की है कि से अलग गर्भाशय ग्रीवा दबाव प्रदर्शित कर सकते हैं. योनि दाब में अंतर कृंतक मॉडलों और मानव नमूनों64,65के बीच प्रदर्शित किया गया . गैर-गर्भवती मरिन गर्भाशय ग्रीवा में दबाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। इस अंत की ओर, हाल ही में गर्भावस्था49के दौरान इंट्रा-यूटेरिन दबाव की सूचना दी गई थी।

इस प्रक्रिया में उपयोग की गई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दाब मायोग्राफ प्रणाली लोचदार, खोखले अंगों के बल गुणों को मापती है। इस प्रोटोकॉल आसानी से स्नान में रासायनिक additives को संशोधित करके अन्य विभिन्न अंगों और ऊतकों के लिए अनुकूल है, cannula आकार, और सीवन मोटाई.

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Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

इस कार्य को एनएसएफ केरियर पुरस्कार अनुदान #1751050 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

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