विशालकाय वायरस मिश्रण पृथक्करण के लिए फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में एकल सेल माइक्रो-आकांक्षा

Biology

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Summary

यहाँ, हम संक्रमित अमीबा के पृथक्करण के लिए एकल कोशिका सूक्ष्म-आकांक्षा विधि का वर्णन करते हैं। Faustoviruses और अज्ञात विशाल वायरस से संक्रमित Vermaiba वर्मीफॉर्मिस में वायरल subpopulations अलग करने के लिए, हम नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल विकसित की है और दो कम बहुतायत उपन्यास विशाल वायरस अलग करने की क्षमता का प्रदर्शन किया।

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Sahmi-Bounsiar, D., Boratto, P. V., Oliveira, G. P., Bou Khalil, J. Y., La Scola, B., Andreani, J. Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation. J. Vis. Exp. (152), e60148, doi:10.3791/60148 (2019).

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Abstract

अमीबा सह-संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, एक से अधिक वायरस एक ही कुएं में अलग-थलग हो सकते हैं। हम पहले अंत बिंदु कमजोर पड़ने और / या फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) वायरल आबादी के लिए लागू द्वारा इस मुद्दे को हल किया. हालांकि, जब मिश्रण में वायरस समान morphologic गुण है और वायरस में से एक धीरे धीरे गुणा, दो वायरस की उपस्थिति जीनोम विधानसभा के चरण में की खोज की है और वायरस आगे विशेषता के लिए अलग नहीं किया जा सकता है. इस समस्या को हल करने के लिए, हम एक एकल सेल सूक्ष्म आकांक्षा प्रक्रिया है कि जुदाई और अत्यधिक इसी तरह के वायरस की क्लोनिंग के लिए अनुमति देता है विकसित की है. वर्तमान काम में, हम वर्तमान कैसे इस वैकल्पिक रणनीति हमें Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 के छोटे वायरल subpopulations अलग करने की अनुमति दी, विशाल वायरस है कि धीरे धीरे बढ़ने और lytic और तेजी से बढ़ने की तुलना में अमीबल lysis के लिए नेतृत्व नहीं करते Faustovirus. पवित्रता नियंत्रण विशिष्ट जीन प्रवर्धन द्वारा मूल्यांकन किया गया था और वायरस आगे विशेषता के लिए उत्पादन किया गया.

Introduction

न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक बड़े डीएनए वायरस (NCLDV) अत्यंत विविध हैं, चार परिवारों द्वारा परिभाषित किया गया है जो यूकैरियोट1को संक्रमित करते हैं। पहले 300 केबीबीपी से ऊपर जीनोम वाले वायरस फिडकोडनविरीडीथे , जिनमें पैरामीशियम बर्सेरिया क्लोरेला वायरस 1 पीबीवीवी 12शामिल था . अलगाव और मिमीवायरस के पहले विवरण से पता चला है कि कण के आकार (450 एनएम) और जीनोम (1.2 एमबी)3दोनों के संदर्भ में वायरस का आकार दोगुना हो गया। तब से, कई विशाल वायरस वर्णित किया गया है, आमतौर पर एक अमीबा सह संस्कृति प्रक्रिया का उपयोग कर अलग. विभिन्न morphologies और आनुवंशिक सामग्री के साथ कई विशाल वायरस Acanthamoeba sp. कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है, मार्सिलेवायरस, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus सहित, और हाल ही में मेडुसा वायरस4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. समानांतर में, Vermaba वर्मीफॉर्मिस के अलगाव और विशाल वायरस Faustovirus, Kaumoebavirus, और Orpheovirus18,19,20के विवरण की अनुमति दी. अन्य विशाल वायरस उनके मेजबान protists के साथ अलग थे, जैसे कैफेटेरिया roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina एरिकिना23, और बोडो लवण 24. इन अलगावों के सभी अलगाव पर काम कर रहे टीमों की बढ़ती संख्या का परिणाम था और उच्च थ्रूपुट रणनीति अद्यतन25,26,27,28जैसे प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग के साथ सह-संस्कृति प्रणाली में सुधार।

2016 में, हमने विशाल वायरस27को अलग करने के लिए सह-संस्कृति और प्रवाह साइटोमेट्री को संबद्ध करने वाली रणनीति का उपयोग किया। इस रणनीति को टीका लगाया नमूनों की संख्या में वृद्धि करने के लिए विकसित किया गया था, सेल का समर्थन करता है के रूप में इस्तेमाल protists विविधता लाने के लिए, और जल्दी से सेल समर्थन के lysis का पता लगाने के लिए. प्रारंभिक आण्विक जीव विज्ञान की पहचान से बचने और एक अज्ञात वायरल जनसंख्या का त्वरित पता लगाने से बचने के लिए एक पूरक कदम जोड़कर इस प्रणाली को अद्यतन किया गया था जैसा कि Pacmanvirus29के मामले में . मिमिवायरस और सेड्राटवायरस A1130के मिश्रण को अलग करने के लिए कोशिका छँटाई के लिए युग्मन प्रवाह साइटोमेट्री की अनुमति है। हालांकि, हम बाद में जुदाई और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इन वायरल subpopulations का पता लगाने की सीमाओं का सामना करना पड़ा. अनुक्रमण के बाद, जब हम Faustovirus ST125 और Faustovirus LCD7 (अप्रकाशित डेटा) के जीनोम इकट्ठा, हम आश्चर्यजनक रूप से सार्वजनिक जीनोम डेटाबेस में पहचान नहीं दो उपन्यास वायरस के दो पूरक जीनोम प्रत्येक विधानसभा में पाया. हालांकि, न तो प्रवाह साइटोमेट्री और न ही संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (टीईएम) से पता चला कि अमीबा दो अलग-अलग वायरस, Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 से संक्रमित थे। हमने विशिष्ट PCR सिस्टम को उनके जीनोम के आधार पर क्रमशः Faustovirus, Usurpativirus, और Clandestinovirus मार्कर को बढ़ाना बनाया है; हमारा उद्देश्य पीसीआर आधारित सिस्टम है कि अलग किया जा रहा वायरस की शुद्धता के सत्यापन सक्षम करने के लिए किया गया था। हालांकि, अंत बिंदु कमजोर पड़ने और प्रवाह साइटोमेट्री उन्हें अलग करने में विफल रहा। इस एकल वायरल आबादी के अलगाव मुश्किल था क्योंकि न तो morphiology और न ही Clandestinovirus और Usurpativirus आबादी के प्रतिकृति तत्वों की विशेषता है. हम दो आबादी के ओवरलैपिंग के कारण प्रवाह cytometry द्वारा केवल एक वायरल आबादी का पता चला (प्रभावी जुदाई के बाद परीक्षण). हम उन्हें 96-वेल प्लेटों पर एक कण छँटाई का उपयोग कर अलग करने की कोशिश की, लेकिन हम किसी भी साइटोपैथिक प्रभाव का पालन नहीं किया, और हम पीसीआर प्रवर्धन द्वारा न तो Clandestinovirus और न ही Usurpativirus का पता चला. अंत में, यह केवल अंत बिंदु कमजोर पड़ने का संयोजन एकल अमीबा सूक्ष्म आकांक्षा है कि Faustoviruses से इन दो कम बहुतायत विशाल वायरस के जुदाई सक्षम द्वारा पीछा किया गया था. जुदाई की यह विधि इस आलेख का ऑब्जेक्ट है।

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Protocol

1. अमीबा संस्कृति

  1. एक सेल समर्थन के रूप में Vermaiba वर्मीफॉर्मिस (तनाव CDC19) का प्रयोग करें.
  2. प्रोटीज़-पेपटोन-खमीर निकालने-ग्लूकोज मध्यम (पीवाईजी) (तालिका 1) और 3 एमएल अमीबा के 3एमएल को 75 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क में 1 x 106 सेल/
  3. 28 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बनाए रखें।
  4. 48 एच के बाद, गिनती स्लाइड का उपयोग कर अमीबा की मात्रा निर्धारित करें।
  5. कुल्ला करने के लिए, 1 x 106 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर कोशिकाओं फसल और गोली amoebae द्वारा centrifugation पर 720 x ग्राम के लिए 10 मिनट. supernatant निकालें और भुखमरी माध्यम की उचित मात्रा में गोली resuspend 1 x 10 6 प्राप्त करने के लिए कक्ष/एमएल (तालिका 1)

2. Amoebae में स्टॉक वायरस का प्रचार

नोट: कमजोर पड़ने से पहले, यह पर्याप्त ताजा संस्कृति प्राप्त करने के लिए शेयर नमूना संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है, तो निस्पंदन के लिए आगे बढ़ना.

  1. भुखमरी माध्यम में अमीबा संस्कृति के 1 x 106 का उपयोग करें।
  2. 0.01 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता में सेल समर्थन पर सह-संस्कृति प्रक्रिया के बाद स्टॉक समाधान (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 या Faustovirus/Clandestinovirus ST1) से जारी वायरस के मिश्रण को टीका करें।
    नोट: MOI प्रमुख वायरल आबादी की बहुतायत और संक्रमित कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) तक 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्रेरित किया जाता है, जैसे अमीबल गोलाई या lysis, संक्रमण के बाद लगभग 10 से 14 एच।
  4. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए मीडिया और एक 5 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से छानली ले लीजिए।

3. अंत बिंदु कमजोर पड़ने

  1. भुखमरी माध्यम में वायरल नमूने का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने (10-1से 10 -11) निष्पादित करें (तालिका 1) .
  2. 1 x 106 वर्मामा वर्मीफॉर्मिस के 2 एमएल को टीका करें जो प्रत्येक पेट्री डिश में 100 डिग्री सेल्सियस मिश्रण इनोकुलम के साथ निहित है।
  3. पेट्री व्यंजन को 30 डिग्री सेल्सियस पर एक सील करने योग्य प्लास्टिक बैग में रखें।
  4. 6 एच postinfection पर उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ पेट्री व्यंजन देख शुरू करें और सेल आकारिकी की जांच हर 4 से 8 एच.
  5. कोशिकाओं को पूर्णांकित करने की विशेषता वाले साइटोपैथिक प्रभाव की उपस्थिति में, एकल सेल सूक्ष्म-आश्वासन प्रक्रिया शुरू करें।

4. एकल सेल माइक्रो आकांक्षा

  1. होस्ट तैयार करें.
    नोट:
    यह तैयारी एक ताजा सेल समर्थन करने के लिए संक्रमित एकल कोशिकाओं की रिहाई के लिए किया जाता है।
    1. एक एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के साथ संस्कृति में एमीबा का इलाज करें जिसमें वैन्कोमाइसिन का 10 ग्राम/एमएल, इमिपेनम का 10 ग्राम/एमएल, सिप्रोफ्लोक्सासिन का 20 ग्राम/एमएल, डक्सीसाइक्लिन का 20 ग्राम/एमएल, और वोरोकोजोकोनोल का 20 ग्राम/एमएल होता है। इस मिश्रण का उपयोग जीवाणु और फंगल संदूषण से बचने के लिए किया जाता है।
      नोट: प्रक्रिया सूक्ष्मजीवी सुरक्षा स्टेशन के बाहर एक बेंच पर होती है। 1x 106 कोशिकाओं/एमएल प्रत्येक में 15 पेट्री व्यंजनों में केंद्रित 2 एमएल एमीबा जोड़ें। अमीबा पालन के लिए, 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  2. निम्नलिखित मानदंडों के अनुसार सीमा कमजोर पड़ने से सूक्ष्म आकांक्षा के लिए इस्तेमाल पेट्री डिश का चयन करें: 1) कवक और जीवाणु एजेंटों द्वारा किसी भी दृश्य संदूषण की अनुपस्थिति, 2) वायरस के कारण अमीबा के साइटोपैथिक प्रभाव के सबूत, और 3) पूर्व अपान्याई और अमीबा के पूर्णांक चरण (वायरल कणों की आकांक्षा से बचने के लिए)।
  3. निम्नलिखित सामग्रियों के साथ कार्यस्थान सेट करें (चित्र 1A,B देखें):
    माइक्रोमैनिप्युलेटर, जो माइक्रोकैपिलरी पोजीशनिंग की अनुमति देता है;
    मैनुअल नियंत्रण दबाव डिवाइस, aspirate और microcapillary में कोशिकाओं को रिहा करने के लिए इस्तेमाल किया;
    उल्टे माइक्रोस्कोप;
    प्लग और मोटर मॉड्यूल खेलते हैं;
    कैमरा;
    कंप्यूटर मॉड्यूल हेरफेर कल्पना और तस्वीरें लेने के लिए।
  4. माइक्रोकैपिलरी चुनें (चित्र 1ब्देखें )।
    नोट: कोशिकाओं का आकार, सतहों के लिए उनकी झिल्ली के विरूपण और आसंजन, और सेलुलर गतिशीलता सूक्ष्म आकांक्षा की चिकनी प्रगति को प्रभावित कर सकती है। माइक्रोकैपिलरी व्यास को ठीक से चुना जा सकता है और उनके आकार और आकांक्षा के तरीकों के आधार पर विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 20 डिग्री मीटर आंतरिक व्यास का एक माइक्रोकैपिलरी एक पूर्णांक अमीबा (व्यास $10 $m) aspirate करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह एक आंतरिक स्थिति के रखरखाव और सेल के एक आसान रिलीज की अनुमति देता है.
  5. प्रणाली माउंट.
    1. 45 डिग्री पर motorized मॉड्यूल पर मनोरंजक प्रणाली के ऑपरेटिंग कोण को ठीक करें।
    2. एक डबल स्थापना प्रदर्शन, पहले मनोरंजक प्रणाली पर, और फिर microcapillary पर.
    3. माइक्रोकैपिलरी के माध्यम से तेल की कुछ बूँदें चलाने के बाद कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें।
      नोट: जैविक संगतता के साथ खनिज तेल डिवाइस द्वारा आपूर्ति की है.
    4. निर्माता की सिफारिशों के बाद बढ़ते पूरा करें।
  6. क्लोन कोशिकाओं (चित्र 2ए,बी) देखें।
    नोट:
    यह प्रक्रिया Fr$hlich और Knig31द्वारा वर्णित एक के समान है.
    1. पेट्री डिश रखें जिसमें संक्रमित अमीबा के 2 एमएल माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
    2. पहले कोशिकाओं पर ध्यान दें, और फिर संस्कृति में डूबे माइक्रोकैपिलरी पर।
    3. एक गोल एकल सेल उठाओ और microcapillary micromanipulator के करीब लाने के लिए.
    4. सेल पर मैनुअल दबाव नियंत्रण के साथ नरम आकांक्षा को लागू करें, इसे माइक्रोकैपिलरी के अंदर ले जाएं। पहले नमूने से एकल सेल निकालें और सेलुलर समर्थन में जारी करें, फिर इसे 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. कोशिकाओं की उपस्थिति का निरीक्षण करने और साइटोपैथिक प्रभाव के उद्भव की निगरानी करने के लिए एक उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ दैनिक प्रेक्षणों का संचालन करें।

5. पीसीआर स्क्रीनिंग

नोट: चरण 4 के बाद, पीसीआर द्वारा एक व्यवस्थित स्क्रीनिंग जुदाई की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। Usurpativirus/Faustovirus और Clandestinovirus/Faustovirus दोनों में, विशिष्ट प्राइमर और जांच प्रणालियों के डिजाइन और आवेदन प्राइमर-ब्लास्ट ऑनलाइन32 (तालिका 2) का उपयोग करके किए गए थे।

  1. सकारात्मक संस्कृति के नमूनों के एक हिस्से से डीएनए निकालें (यानी, जहां एक साइटोपैथिक प्रभाव मनाया जाता है), निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक स्वचालित निष्कर्षण प्रणाली का उपयोग कर।
  2. उचित रूप से डिज़ाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करें.
    नोट: यहाँ हम प्राइमर के लिए RpB2 (Faustovirus), LCD7 प्रमुख capsid प्रोटीन (Usurpatvirus) और मामूली capsid प्रोटीन (Clandestinovirus) के रूप में एनोटेट कोर जीन बढ़ाना डिजाइन
  3. thermocycler का उपयोग कर मानक पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
    1. प्रत्येक प्राइमर(तालिका 2),1x मास्टर मिक्स, और RNase मुक्त पानी के 50 डिग्री सेल्सियस के साथ 20 डिग्री एल पीसीआर प्रतिक्रियाओं बाहर ले।
    2. 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए Tak डीएनए पॉलिमरेज को सक्रिय करें, फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 विकृतीकरण के 45 चक्रों के साथ पालन करें, 58 डिग्री सेल्सियस पर 30 s के लिए प्राइमर का अनीलन, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 s के लिए विस्तार।
  4. एक 1.5% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों को चलाने, डीएनए जेल दाग के साथ दाग(सामग्री की तालिका),और यूवी के साथ कल्पना.

6. वायरस उत्पादन और शुद्धि

  1. पेट्री डिश संस्कृति के बाकी एक छोटे से फ्लास्क में वापस रखो.
  2. वायरस के उत्पादन के लिए 145 सेमी2के 15 फ्लास्क तैयार करें, जिसमें 40 एमएल वर्माोबा वर्मीफॉर्मिस को भुखमरी माध्यम में और 5 एमएल अलग-अलग वायरस जो पहले से ही पेट्री डिश से छोटे फ्लास्क में स्थानांतरित किए गए हैं।
  3. चरण 4.1 में उपयोग किए जाने वाले एक ही एंटीबायोटिक और एंटीफंगल मिश्रण के साथ इलाज करें।
  4. 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ हर दिन का निरीक्षण करें।
  5. पूर्ण संक्रमण के बाद, सभी फ्लास्क पूल करें। मलबे को खत्म करने के लिए 0.45 डिग्री मीटर फ़िल्टर का उपयोग करें।
  6. Ultracentrifuge 45 मिनट के लिए 50,000 x ग्राम पर सभी supernatants.
  7. अपकेंद्रण के बाद, आकांक्षा द्वारा प्रत्येक ट्यूब से supernatant निकालें और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 1 एमएल में गोली resuspend.
  8. 25% सुक्रोज (27.5 ग्राम की सुक्रोज 100 एमएल पीबीएस में, निस्पंदन द्वारा बाँझ) का उपयोग करके उत्पादित वायरस को शुद्ध करें।
  9. 30 मिनट के लिए 80,000 x ग्राम पर क्रोएराफ्यूज 8 एमएल सुक्रोज और वायरल सस्पेंशन के 2 एमएल को पीबीएस के 1 एमएल में वायरल पेलेट को फिर से निलंबित करें। इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. नकारात्मक दाग और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

नोट: Bou Khalil एट अल. पहले इस प्रोटोकॉलप्रकाशित 27.

  1. चमक-विसर्जन ग्रिड पर lysis supernatant के 5 $L जमा करें। कमरे के तापमान पर लगभग 20 मिनट के लिए छोड़ दें.
    नोट: चमक निर्वहन हमें प्लाज्मा आवेदन द्वारा एक हाइड्रोफिलिक ग्रिड प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है।
  2. ग्रिड को सावधानी से सुखाएं और उस पर 10 s के लिए 1% अमोनियम मोलिब्डेट की एक छोटी बूंद जमा करें। ग्रिड को 5 मिनट के लिए सूखने के लिए छोड़ दें।
  3. 200 केवी पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रेक्षणों पर आगे बढ़ें।

8. Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 की विशेषता

  1. Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 जीनोम अनुक्रमण, जीनोम विधानसभा, bioinformatics विश्लेषण का उपयोग कर की शुद्ध आबादी की विशेषता है, और उनके प्रतिकृति चक्र के अध्ययन के रूप में हम अन्य वायरस के लिए किया है10,20, 29.

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Representative Results

एकल कोशिका सूक्ष्म-आकांक्षा एक सूक्ष्म मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मीत है। इस तकनीक से गोल, संक्रमित अमीबा (चित्र 2) को पकड़ने में सक्षम बनाता है और इसकी रिलीज एक उपन्यास प्लेट में होती है जिसमें असंक्रमित अमीबा ( चित्र2 )है। यह एक कार्यात्मक प्रोटोटाइप है कि सह संस्कृति प्रणाली के लिए लागू होता है और सफलतापूर्वक अलग गैर-lytic विशाल वायरस है. इस दृष्टिकोण विशाल वायरस के क्षेत्र में पहली बार के लिए इस्तेमाल किया गया था और यह संभव दो नए कम बहुतायत विशाल वायरस को अलग करने के लिए बनाया है. हम नए वायरस Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 नाम है कि उच्च बहुतायत Faustoviruses की तुलना में कम बहुतायत में थे. सूक्ष्म आकांक्षा प्रक्रिया के बाद प्रत्येक प्लेट में वायरल उपस्थिति का विश्लेषण करने के लिए, हमने 15 सूक्ष्म-आकांक्षाओं पर पीसीआर लागू की। हमने शुद्ध उसुरपतिवायरस (उसुरपतिवायरस LCD7 की उपस्थिति [+] और Faustovirus की अनुपस्थिति [-]) केवल क्लोन 7 में देखा(चित्र 3)। क्लोन की शुद्धता की पुष्टि पीसीआर द्वारा विशिष्ट प्रोटोकॉल के साथ की गई थी जिसमें कुलेस्डेस्टिनोवायरस ST1 और Usurpativirus LCD7 (तालिका 2) को लक्षित किया गया था। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 (चित्र 4) की उपस्थिति का पता लगाया , जिसमें तंतुक के बिना एक विशिष्ट आइकोसाहेद्रल आकृति विज्ञान और लगभग 250 एनएम की एक icosahedral capsid है, क्रमशः. उत्पादन शुद्धता की पुष्टि के बाद, क्लोनल वायरस का उत्पादन किया गया था और पूरे जीनोम अनुक्रमण और आगे की विशेषता के लिए शुद्ध, विशेष रूप से संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (टीईएम) गुणन चक्र अध्ययन के लिए. हमने प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जनसंख्या (फस्टोवायरस/उपन्यास वायरस) के अतिव्यापन की पुष्टि की है (चित्र 5)।

Figure 1
चित्र 1: सूक्ष्म हेरफेर के लिए सामग्री. (ए) कार्यकेंद्र की वास्तविक स्थापना। (बी) कार्यकेंद्र के घटकों का योजनाबद्ध चित्रण। (ग)सूक्ष्माक्षकता का योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सूक्ष्म-आकांक्षा चरण। (एक) एकल सेल अलगाव प्रक्रिया (ज़ूम x40). (B)एकल कक्ष आकांक्षा के विभिन्न चरणों का योजनाबद्ध चित्रण: 1) कक्ष का स्थानीयकरण। 2) सेल की आकांक्षा. 3) रिलीज कदम. काले तीर microcapillary दिखाने के लिए और सफेद लोगों को एक सेल दिखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पीसीआर स्क्रीनिंग और पुष्टि। Usurpativirus LCD7 और Faustovirus के लिए किए गए सूक्ष्म आकांक्षाओं की पीसीआर की जांच। Usurpativirus LCD7 डीएनए की उपस्थिति (+) और Faustovirus डीएनए की अनुपस्थिति (-) सूक्ष्म-आकांक्षा प्रक्रिया के बाद क्लोन 7 के लिए मनाया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: नकारात्मक धुंधला माइक्रोग्राफ। वायरल निलंबन के नकारात्मक दाग, शुद्ध Clandestinovirus ST1 दिखा () और Usurpativirus LCD7 (बी) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: प्रतिनिधि गेट भूखंडों. (क)प्रत्येक एकल वायरल जनसंख्या का अधिरोपण जो पहले वायरस डीएनए लेबलिंग के लिए फ्लोरोसेंट आणविक जांचों से दागा गया था (पहले वर्णित प्रोटोकॉल26,30के बाद ) . तस्वीर के बाएँ भाग Faustovirus के पांच उपभेदों के अध्यारोपण से पता चलता है (गहरा हरा, हल्के हरे, नारंगी, लाल, और नीले). दाईं ओर, Faustovirus ST1 और Clandestinovirus ST1 (हल्के बैंगनी और गहरे बैंगनी) के अध्यारोपण दिखाई देता है. (ख) एक ही गेट में Faustovirus और Usurpativirus की दो वायरल आबादी की उपस्थिति के रूप में Faustovirus (बाएं)  शुद्ध Usurpativirus का एक डॉट साजिश Faustovirus (दाएं) के लिए पहले परिभाषित एक ही गेट से पता चलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पीवाईजी संरचना मात्रा
प्रोटीओस पेपटोन 20 ग्राम
खमीर निकालने 20 ग्राम
MgSO4$7H2हे 0.980 ग्राम
CaCl2 0.059 ग्राम
साइट्रेट सोडियम. डाइहाइड्रेट 1 ग्राम
फे (एनएच4) 2 (एसओ4) 2 x 6H2O 0.02 ग्राम
ग्लूकोज 18 ग्राम
आसवनित जल 1 एल
एचसीएल या KOH के साथ 6.8 पर पीएच समायोजित करें
ऑटोक्लेव 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट
भुखमरी माध्यम क्वान्टाइटीज़
खमीर निकालने 2 ग्राम
ग्लूकोज 18 ग्राम
फे (एनएच4) 2 (एसओ4) 2 x 6H2O 0.02 ग्राम
PAS (विस्तृत नीचे) 1 एल
PAS समाधान एक क्वान्टाइटीज़
KH2पीओ4 0.136 ग्राम
ना2एचपीओ4 0.142 ग्राम
PAS समाधान बी क्वान्टाइटीज़
MgSO4$7H2हे 4.0 मिलीग्राम
CaCl2$2H2हे 4.0 मिलीग्राम
Nacl 0.120 ग्राम
10 एमएल प्रत्येक विलयन ए और ठ को आसुत जल के 1 ल में मिलाया जाता है।

तालिका 1: संस्कृति मीडिया की संरचना.

वायरस लक्ष्य लक्ष्य जीन फोवर्ड प्राइमर (5-gt;3) रिवर्स प्राइमर (5-gt;3)
Faustovirus RpB2 आर.पी.बी.2 CWCAATCHGCYGATACHGTGA TGATTWGCYAATNGGYGC
Usurpatvirus LCD7 मेजर कैप्सिड जीन प्रमुख कैप्सिड जीन GGGCAAGAAGCTCAAGCTA GGGTGagGAGGAGTCAACG
Clandestinovirus ST1 माइनर कैप्सिड जीन माइनर कैप्सिड जीन AAAATGACGCGTTGGGC ACCGGGAATGTTCCTATGG

तालिका 2: Primmer अनुक्रम पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया.

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Discussion

एकल सेल माइक्रो-आकांक्षा हैंडलिंग और इसके अच्छे कार्य की अवधि ऑपरेटर-निर्भर है। प्रयोग के विभिन्न चरणों के लिए परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। कार्य केंद्र के micromanipulation घटकों का उपयोग सूक्ष्म आकांक्षा की प्रक्रिया और सेल की रिहाई को देखकर निरंतर नियंत्रण में होना चाहिए। सूक्ष्म अवलोकन द्वारा अनुवर्ती एक सेल के कब्जा और हस्तांतरण के लिए आवश्यक है. एक अनुभवी ऑपरेटर 10 कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1 से 2 एच ले सकता है और उन्हें अलग-थलग होने के लिए वायरस की बहुतायत के आधार पर एक-एक करके पुनः स्थानांतरित कर सकता है। जोड़तोड़ की संख्या भिन्न हो सकते हैं. हम 10 जोड़तोड़ के साथ शुरुआत की सलाह देते हैं। परिभाषा के अनुसार, हम अज्ञात वायरस की आंतरिक विशेषताओं को नहीं जानते हैं। इस प्रकार, उपयोग और अलगाव के लिए विभिन्न रणनीतियों के विकास के लिए इन वायरस को अलग करने की सफलता का अनुकूलन आवश्यक हैं.

सूक्ष्म-आश्वासन प्रक्रिया (माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा स्टेशन के बाहर एक बेंच पर) के तहत किया जाता है और इस प्रकार इसके उपयोग को प्रतिबंधित करता है और मानव रोगजनकों के अध्ययन के लिए इसके आवेदन को रोकता है। इसलिए, संदूषकों को सीमित करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीफंगल के मिश्रण का उपयोग अनिवार्य है। विधि की एक अन्य सीमा यह है कि यह केवल प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन योग्य सूक्ष्मजीवों पर किया जा सकता है जिस पर माइक्रोमैनोमैनेशन घटक लगाए गए थे, इस प्रकार, प्रकाश द्वारा प्रेक्षणीय सूक्ष्मजीवों पर किसी भी कार्य को नष्ट करने की संकल्पनात्मक रूप से माइक्रोस्कोपी. हालांकि, हम के बारे में 200 एनएम जो अलग और संक्रमित मेजबान क्लोनिंग से मिलकर एक अप्रत्यक्ष रणनीति का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अदृश्य रहने के विशाल वायरस को अलग करने में सक्षम थे.

अमीबल कैप्चर के लिए एकल सेल सूक्ष्म आकांक्षा का विकास जनसंख्या-सॉर्टिंग विधियों के विकास का एक हिस्सा है। एकल सेल माइक्रो-आकांक्षा हमें दो नए विशाल वायरस, Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 को अलग करने की अनुमति दी, Faustoviruses से विशिष्ट विशेषताओं के साथ. दोनों Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 के अत्यधिक समान रूपात्मक गुण Faustovirus LCD7 और प्रतिकृति के अपने अंतर से पता चलता है FACS की सीमा है, जो आम तौर पर विशाल वायरस छँटाई में प्रयोग किया जाता है. यह दो वायरल आबादी के अध्यारोपण द्वारा प्रतिनिधित्व किया है, Clandestinovirus ST1 और Faustovirus ST1 (चित्र 5एक) और भी Usupartivirus LCD7 और Faustovirus LCD7 के लिए पता लगाने के द्वारा. हालांकि, इस नई विधि के साथ, पूरे हेरफेर सेल की सावधान निगरानी और इसकी अखंडता के साथ दृश्य नियंत्रण में है यहां तक कि इसकी रिहाई के बाद। सीधे संक्रमित अमीबा को सॉर्ट करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग अप्रत्यक्ष रूप से उपन्यास वायरस को सॉर्ट करने के लिए एक वैकल्पिक समाधान हो सकता है। इस विधि आमतौर पर साइटोपैथिक प्रभाव या lysis का पता लगाने के क्रम में थाली की स्क्रीनिंग के द्वारा पीछा किया जाता है. मिश्रण में गैर-lytic वायरस की उपस्थिति अमीबल छँटाई करने के लिए एक सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकता है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल के निर्माण में और इन दो उपन्यास अलगाव के लिए पता नहीं लगाया गया था.

स्थिति और सामान्य में कोशिकाओं की पकड़ में micromanipulation के आवेदन के अलावा और intracytoplasmic शुक्राणु इंजेक्शन के लिए oocytes (ICSI)33, एकल सेल सूक्ष्म आकांक्षा एकल के अलगाव के लिए एक व्यावहारिक तरीका साबित हो गया है प्रकाशिक सूक्ष्मदर्शी31के अधीन प्रोकैरियोटिक कोशिकाएं प्रेक्षणीय होती हैं . अन्य अनुप्रयोगों सूक्ष्मजीवों के एक मिश्रित नमूने से अलग शुद्ध नमूने के लिए एक रूपात्मक आधार पर सेल छँटाई सहित परीक्षण किया जा सकता है। सूक्ष्मजीवों के प्रेक्षणीय पृथक्करण की कल्पना ऊपर वर्णित रणनीति का उपयोग करके की जा सकती है।

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Disclosures

सभी लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को उनकी सलाह और क्लेयर Andrani अंग्रेजी सुधार और संशोधनों में उसकी मदद के लिए दोनों जीन Pierre Baudoin और Olivier Mbarek धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम संदर्भ ANR-10-IAHU-03 (M]diterran-e संक्रमण के साथ "निवेश d'avenir (भविष्य के लिए निवेश)" कार्यक्रम के तहत राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी द्वारा प्रबंधित फ्रेंच राज्य से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और R$gion Provence Alpes द्वारा कोटे डी'अज़ूर और यूरोपीय वित्त पोषण FEDER PRIMI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Standard Euromedex Unkown Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix Applied Biosystems 4398876 Standard PCR
CellTram 4r Oil Eppendorf 5196000030 Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2 Sigma-aldrich CLS430825 Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2 Sigma-aldrich CLS430639 Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2 Sigma-aldrich CLS430641 Culture
DFC 425C camera LEICA Unkown Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope Nikon Unkown Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL Quiagen 9001874 DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids Kova International 87144E Cell count
Mastercycler nexus Eppendorf 6331000017 Standard PCR
Microcapillary 20 µm Eppendorf 5175 107.004 Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2 Eppendorf 631-0210 Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water ThermoFischer AM9920 Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge BECKMAN COULTER A94469 Virus purification
Petri dish 35 mm Ibidi 81158 Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm Sigma-aldrich SLSV025LS Filtration
SYBR green Type I Invitrogen unknown Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe Invitrogen S33102 Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20 FEI Unkown Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor BECKMAN COULTER 337922 Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 BECKMAN COULTER 344058 Virus purification

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References

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