एचआईवी लक्ष्यों की एक एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर Phagocytosis परख में उपयोग के लिए मानव स्तन दूध से Leukocytes के अलगाव

Immunology and Infection

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Summary

मां का दूध मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस (एचआईवी) को संचारित करता है, हालांकि एचआईवी संक्रमित माताओं द्वारा स्तनपान कराने वाले शिशुओं में से केवल 15% संक्रमित संक्रमित हो जाते हैं। स्तनपान कराने वाले शिशुओं को प्रतिदिन 105]108 मातृ ल्यूकोसाइट्स का अध्ययन करना पड़ता है, हालांकि इन कोशिकाओं को कम किया जाता है। यहाँ हम स्तन दूध ल्यूकोसाइट्स के अलगाव और उनके phagocytic क्षमता का एक विश्लेषण का वर्णन.

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Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

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Abstract

यहां तक कि एंटीरेट्रोवायरल दवाओं की अनुपस्थिति में, एचआईवी संक्रमित माताओं द्वारा स्तनपान कराने वाले शिशुओं में से केवल 15% संक्रमित संक्रमित हो जाते हैं, जिससे स्तन के दूध (बीएम) के मजबूत सुरक्षात्मक प्रभाव का सुझाव मिलता है। जब तक स्वच्छ जल और उपयुक्त शिशु फार्मूला तक पहुंच विश्वसनीय नहीं होती, तब तक विश्व स्वास्थ्य संगठन एचआईवी संक्रमित माताओं के लिए स्तनपान बंद करने की सिफारिश नहीं करता है। कई कारकों की संभावना मिलकर काम करने के लिए बीएम संचरण को कम. स्तनपान कराने वाले शिशुओं को दैनिक रूप से105 ]108 मातृ ल्यूकोसाइट्स का सेवन करना, हालांकि जो काफी हद तक स्पष्ट नहीं है, वह बीएम के एंटीवायरल गुणों में इन कोशिकाओं का योगदान है। वर्तमान में हम मानव बीएम से कोशिकाओं को अलग करने के उद्देश्य से मापने के लिए एचआईवी लक्ष्यों के खिलाफ बीएम phagocytes द्वारा एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर phagocytosis (ADCP), सबसे आवश्यक और व्यापक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में से एक. कोशिकाओं को स्तनपान के विभिन्न चरणों में प्राप्त 5 मानव बीएम नमूनों से अलग किया गया था। अलगाव कोमल centrifugation के माध्यम से किया गया था दूध वसा और सेल गोली की बार-बार धोने के सावधान हटाने के बाद. एचआईवी लिफाफा (एनवीवी) के साथ लेपित फ्लोरोसेंट मोती एडीसीपी के विश्लेषण के लिए लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ल्यूकोसाइट्स की पहचान करने के लिए कोशिकाओं को CD45 सतह मार्कर के साथ दाग दिया गया था। यह पाया गया कि ADCP गतिविधि नियंत्रण प्रयोगों से ऊपर महत्वपूर्ण था और reproducibly मध्यम रूप से एक एचआईवी-विशिष्ट एंटीबॉडी 830A का उपयोग कर.

Introduction

मानव स्तन दूध (बीएम) मातृ कोशिकाओं है कि कर रहे हैं के शामिल है और 90% व्यवहार्य1. कोशिका संघटन स्तनपान की अवस्था, मां और शिशु की स्वास्थ्य स्थिति तथा व्यक्तिगत भिन्नता से दृढ़ता से प्रभावित होता है, जो1,2,3,4. यह देखते हुए कि बीएम में $103]105 ल्यूकोसाइट्स/एमएल शामिल हैं, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि स्तनपान कराने वाले शिशुओं को दैनिक 5 5]108 मातृ ल्यूकोसाइट्स दैनिक5. विभिन्न विवो अध्ययनों से पता चला है कि मातृ श्वेद् युकियों से शिशु को गंभीर रोग प्रतिरोधक क्षमता प्रदान होती है और वे प्रारंभिक घूस5,6,7,8 के इन स्थलों से परे अच्छी तरह से कार्य करते हैं ,9,10,11. शिशु द्वारा अंगीकृत सभी मातृ-व्युत्पन्न कोशिकाओं में प्रतिरक्षा कार्य करने या शिशु के स्वयं के ल्यूकोसाइट्स12के लिए क्षतिपूर्ति करने की क्षमता होती है।

मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस (एचआईवी) का मदर-टू-चाइल्ड ट्रांसमिशन (एमटीसीटी) संसाधन-सीमित देशों में संकट बना हुआ है। के रूप में दस्त और श्वसन रोगों संसाधन सीमित देशों में शिशुओं के बीच मृत्यु दर की पर्याप्त दर के लिए जिम्मेदार हैं, और इन बीमारियों को काफी अनन्य स्तनपान द्वारा कम कर रहे हैं, एचआईवी संक्रमित माताओं के लिए लाभ स्तनपान से13,14,15के जोखिम अधिक हो जाते हैं . जब तक स्वच्छ जल और उपयुक्त शिशु फार्मूला तक पहुंच विश्वसनीय नहीं होती, तब तक विश्व स्वास्थ्य संगठन एचआईवी संक्रमित माताओं के लिए स्तनपान बंद करने की सिफारिश नहीं करताहै। बीएम के माध्यम से लगभग 100,000 MTTs सालाना होते हैं; फिर भी, केवल 15% शिशुओं को उनके एचआईवी संक्रमित माताओं द्वारा स्तनपान संक्रमित हो जाते हैं, बीएम17,18,19,20,21के एक मजबूत सुरक्षात्मक प्रभाव का सुझाव . संचरण को रोकने के लिए कई कारकों की संभावना मिलकर काम करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि बीएम में एचआईवी-विशिष्ट एंटीबॉडी (एब्स) को कम एमटीसीटी और/या एचआईवी संक्रमण से कम शिशु मृत्यु के साथ सहसंबद्ध किया गया है22,23. क्या काफी हद तक स्पष्ट नहीं है अपने एंटीवायरल गुणों के लिए बीएम के सेलुलर अंश का योगदान है.

कई Abs विरोधी वायरल गतिविधियों की एक किस्म की सुविधा इम्यूनोग्लोबुलिन अणु के 'स्थिर' क्षेत्र द्वारा मध्यस्थता, क्रिस्टलीय टुकड़ा (एफसी), एफसी रिसेप्टर्स के साथ बातचीत के माध्यम से (FcRs) लगभग सभी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर पाया, जिनमें से लगभग सभी मानव बीएम24में पाए जाते हैं। एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर फैगोसाइटोसिस (एडीसीपी) वायरल संक्रमण की मंजूरी के लिए आवश्यक के रूप में प्रदर्शन किया गया है और एचआईवी25,26,27के MTCT की रोकथाम के मामले में understudied किया गया है, 28 , 29.एचआईवी के एमटीसीटी की रोकथाम के लिए बीएम फागोसाइट्स द्वारा एडीसीपी गतिविधि के संभावित योगदान के बारे में ज्ञान की कमी को देखते हुए, हमारा उद्देश्य कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता किए गए एडीसीपी का अध्ययन करने के लिए मानव बीएम से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक कठोर विधि विकसित करना था स्तनपान के विभिन्न चरणों में प्राप्त बी.एम.

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Protocol

इस अध्ययन में प्रत्येक भागीदार भर्ती और मानव विषयों के संरक्षण के लिए माउंट Sinai के कार्यक्रम के मार्गदर्शन और प्राधिकरण के साथ नैतिक और संस्थागत समीक्षा बोर्ड (IRB) अनुमोदन के साथ समझौते में साक्षात्कार किया गया था (PPHS) एक आईआरबी का उपयोग कर मंजूरी दे दी स्तन दूध के नमूने प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल.

1. लक्ष्य Microsphere तैयारी

  1. एक प्रासंगिक लक्ष्य प्रतिजन का चयन करें.
    नोट: इस उदाहरण में, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन V1V2-2F5K, जो देशी एचआईवी लिफाफा30के trimeric शीर्ष नकल करने के लिए डिजाइन किया गया था इस्तेमाल किया गया था.
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर biotinylation प्रदर्शन करते हैं।
    1. सूत्र का उपयोग करके 5 गुना मोलर अतिरिक्त के लिए प्रतिक्रिया में जोड़ने के लिए बायोटिन अभिकर्मक के mmol की गणना करें: mmol biotin - एमएल प्रोटीन x (mg प्रोटीन/एमएल प्रोटीन) x (mmol biotin/mg प्रोटीन) x (5 mmol biotin/mmol प्रोटीन)30,31. फिर सूत्र का उपयोग करके जोड़ने के लिए बायोटिन अभिकर्मक के $L की गणना करें: [L बायोटिन ] mmol बायोटिन x (1,000,000 $L/L) x (L/10 mmol).।
    2. खोलने से पहले कमरे के तापमान के लिए बायोटिन को बराबर करें। ऊपर की गई गणना के अनुसार 0.5 डिग्री 2.0 एमएल फॉस्फेट-बफर लवण (पीबीएस) में प्रोटीन को भंग करें।
    3. डाइमेथिलसल्फक्साइड (डीएमएसओ) में बायोटिन अभिकर्मक का 10 एमएम समाधान तैयार करें और प्रोटीन समाधान में 10 एमएम बायोटिन अभिकर्मक की उचित मात्रा जोड़ें, और बर्फ पर 2 एच के लिए या कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट प्रतिक्रिया करें।
  3. प्रोटीन concentrators का उपयोग कर अतिरिक्त बायोटिन निकालें (polyethersulfone [PES] झिल्ली, 3 केडीए आणविक वजन कट-ऑफ [MWCO], 0.5 एमएल; सामग्री की तालिका) निर्माता के निर्देशों के अनुसार.
    1. स्पिन कॉलम के ऊपरी कक्ष में जमा नमूना और पीबीएस को 400 डिग्री सेल्सियस कैप तक जोड़ें, फिर इस नमूना कक्ष को संग्रह ट्यूब में डालें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 12,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    2. प्रवाह-थ्रू छोड़ें और PBS को 400 $L. दोहराएँ सेंट्रीफ्यूगेशन में जोड़ें। प्रवाह-थ्रू छोड़ें और पीबीएस को 100 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा प्रोटीन सांद्रता को मापें।
      नोट: प्रोटीन का उपयोग किया जाता है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquote और जमे हुए किया जा सकता है।

2. एंटीबॉडी-डिपेंडेंट सेलुलर फागोसाइटोसिस (एडीसीपी) परख प्लेट तैयारी

  1. संयुक्त रूप से biotinylated प्रोटीन करने के लिए 1 $m microspheres ('beads'; सामग्री की तालिका) निर्माता के निर्देशों के अनुसार.
    1. संयुग्मी मोती की प्रति प्लेट, 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA)-PBS के 200 डिग्री एल में स्टॉक मोती के 12 डिग्री एल के साथ प्रोटीन के 6 डिग्री ग्राम, भंवर धीरे हर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर।
    2. 5 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज. सुपरनेट को त्यागें, भंवर धीरे और 0.1% बीएसए-पीबीएस के 1200 डिग्री एल में फिर से भरदें। दोहराएँ स्पिन और धो चरण 2x. 0.1% बीएसए-पीबीएस के 1200 $L में पुन: निलंबित।
  2. अलीकोट 10 डिग्री सेल्सियस मनका समाधान एक गोल नीचे 96-वेल प्लेट में अच्छी तरह से। एंटीबॉडी या ब्याज की प्रतिरक्षा सीरा के कमजोर पड़ने की तैयारी 2% HSA HBSS के 12 $L, आम तौर पर एंटीबॉडी या एक 1/100 सीरम कमजोर पड़ने के 50 डिग्री ग्राम /
    नोट: नमूना डेटा में, monoclonal एंटीबॉडी (mAb) 830A इस्तेमाल किया गया था.
  3. मनका प्लेट में अनुचित एंटीबॉडी/सेरा के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक अच्छी तरह से और अपकेंद्रित्र प्लेट में 200 $L के 200 $L जोड़ें 2,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए.
  4. ध्यान से एक तेजी से पलट और अदृश्य मनका गोली परेशान करने से बचने के लिए एक सिंक में प्लेट कुओं से तरल के decanting द्वारा supernatant हटा दें।

3. स्तन दूध सेल अलगाव

  1. स्वस्थ स्तनपान कराने वाली महिलाओं से मानव स्तन दूध प्राप्त, डबल इलेक्ट्रॉनिक या मैनुअल पंप का उपयोग कर व्यक्त की. अभिव्यक्ति के $ 4 एच के भीतर कोशिकाओं को अलग करना, कमरे के तापमान पर दूध रखते हुए।
  2. 50 एमएल ट्यूबों का उपयोग करते हुए, 15 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर 50 एमएल दूध का उपयोग करके सावधानी से स्किम दूध और वसा को सेल गोली को छोड़ते समय डाल दिया जाता है। ट्यूब दीवार से सभी वसा को हटाने के लिए एक लिंट-मुक्त पोंछे के साथ ट्यूब के अंदर साफ करें।
  3. हांक के संतुलित नमक समाधान में 2% मानव सीरम एल्बुरेन के 10 एमएल जोड़ें (2% HSA HBSS [बिना Ca2 + या Mg+]. सेल सक्रियण और apoptosis से बचने के लिए कोमल pipeting द्वारा गोली को फिर से निलंबित. 10 मिनट के लिए 450 x ग्राम पर एक 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरण।
  4. supernatant बंद डालो और कदम 1.3 दोहराएँ. फिर, धीरे से 2% HSA HBSS की 1 डिग्री 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित अपेक्षित सेल संख्या के आधार पर, और एक हेमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर द्वारा कोशिकाओं की गणना, भी सेल व्यवहार्यता टिप्पण.

4. एडीसीपी परख

नोट: यहाँ वर्णित तरीके Ackerman एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं32.

  1. प्रत्येक एडीसीपी परख प्लेट में 50,000 ताजा अलग बीएम कोशिकाओं को जोड़ें 2% एचएसए-एचबीएस एस के 200 $L में अच्छी तरह से। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट।
    1. नियंत्रण प्रयोगों के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-इनक्यूबेट कोशिकाओं के साथ 10 ग्राम/एमएल एक्टिन अवरोधक (साइटोचलसिन-डी), 50 ग्राम/एमएल एफसीआर ब्लॉकिंग एजेंट (FcBlock), या प्लेटों में उनके अतिरिक्त करने से पहले दोनों का संयोजन।
  2. 10 मिनट के लिए 930 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज प्लेट जोड़ें 200 $L 2% HSA HBSS और दोहराने centrifugation. ध्यान से चरण 2.7 और दोहराने धोने में के रूप में supernatant हटा दें.
  3. ध्यान से 0.5 ग्राम/एमएल (अंतिम सांद्रता) fixable व्यवहार्यता दाग 450 प्रति अच्छी तरह से 2% HSA HBSS के 50 डिग्री एल का उपयोग कर व्यवहार्यता के लिए supernatant और दाग कोशिकाओं को दूर. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 930 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज प्लेट और चरण 2.7 के रूप में supernatant निकालें। 2% एचएसए HBSS और सेंट्रीफ्यूज प्लेट के 200 $L जोड़ें फिर से चरण 2.7 में के रूप में supernatant को हटाने के बाद.
  4. व्यवहार्यता दाग के बाद, ब्याज की ल्यूकोसाइट मार्करों के लिए दाग कोशिकाओं, न्यूनतम एक CD45-विशिष्ट दाग जैसे पीई-माउस विरोधी मानव CD45 (क्लोन HI30) एक अनुकूलित एकाग्रता पर सहित (1 $g/$L में 50 में 1% बीएसए HBSS उदाहरण डेटा में).
    नोट: ब्याज की किसी भी वंश विशिष्ट मार्करों शामिल किया जा सकता है.
  5. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 930 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज प्लेट और चरण 2.7 के रूप में supernatant निकालें। 1% बीएसए HBSS के 200 $L जोड़ें और सेंट्रीफ्यूगेशन दोहराएँ। अतिनिशांत को हटा दें। कमरे के तापमान पर अंधेरे में 0.5% formaldehyde के 200 डिग्री एल में कोशिकाओं को 30 मिनट या रात में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठीक करें। विश्लेषण तक अंधेरे में फ्रिज में.

5. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण

  1. एक आगे तितर बितर (FSC) बनाम पक्ष तितर बितर (SSC) साजिश और मलबे (FSC से छोटी सामग्री ] 5000) पर doublets को खत्म करने के लिए प्रारंभिक gating प्रदर्शन (चित्र 1देखें). मृत कोशिकाओं को खत्म करने के लिए एसएससी बनाम व्यवहार्यता दाग (V450 इस मामले में) साजिश का उपयोग करें (उन है कि व्यवहार्यता दाग के लिए सकारात्मक हैं).
  2. एक एसएससी बनाम CD45 साजिश का प्रयोग करें प्रमुख ल्यूकोसाइट वर्गों (granuocytes, monocytes, लिम्फोसाइटों) के रूप में बड़े पैमाने पर वर्णित33,34अंतर करने के लिए .
    नोट: यह वर्गीकरण केवल विचारोत्तेजक है और सेल प्रकार की पुष्टि करने के लिए वंश-विशिष्ट मार्कर की आवश्यकता होती है।
  3. सभी CD45 + कोशिकाओं के लिए, या ब्याज के प्रत्येक ल्यूकोसाइट सबसेट के लिए, फ्लोरोरेसिन आइसोथियोसाइन (FITC) चैनल, जहां फ्लोरोसेंट मोती का पता चला रहे हैं के एक हिस्टोग्राम में मनका सकारात्मक कोशिकाओं पर एक मार्कर के साथ gating द्वारा ADCP गतिविधि को मापने।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण कुओं जिसमें मोती नहीं जोड़ा गया संकेत मिलता है जहां मनका सकारात्मक कोशिकाओं हिस्टोग्राम में स्पष्ट कर रहे हैं और इसलिए जहां gating मार्कर जगह के लिए.
  4. एडीसीपी स्कोर की गणना के रूप में (मध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता [MFI] मनका-सकारात्मक कोशिकाओं के) x (कुल CD45 + कोशिकाओं का% सकारात्मक जनसंख्या में). प्रत्येक Ab/serum सांद्रता पर स्कोर प्लॉट करने के लिए और एक क्षेत्र के तहत वक्र (AUC) विश्लेषण करने के लिए ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: ADCP (इस मामले में, 3865) एक गैर-विशिष्ट नकारात्मक नियंत्रण mAb के ADCP स्कोर AUC के 3x मानक विचलन से अधिक है, तो सकारात्मक माना जाता है।

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Representative Results

दूध कमरे के तापमान या कूलर पर रखा जा सकता है (हालांकि जमे हुए नहीं); हालांकि, यह देखते हुए कि हम कम व्यवहार्यता मनाया है जब दूध बहुत ठंडा रखा गया है (डेटा नहीं दिखाया गया है), और यह है कि इकट्ठा करने के लिए आसान है, संक्षेप में स्टोर, और परिवेश के तापमान पर परिवहन, यह सिफारिश की है कि नमूने को कम करने के क्रम में फ्रिज में नहीं हैं नमूना करने के लिए नमूना परिवर्तनशीलता. दूध में 7 डिग्री 183 दिन प्रसव के बाद, सेल एकाग्रता स्वचालित सेल काउंटर द्वारा निर्धारित 16,083 डिग्री 222,857 कोशिकाओं / चित्र 1 doubts gating रणनीति doubts doublets, मलबे को नष्ट करने, और मृत कोशिकाओं. Viability था $90 $99%. कुल जीवित कोशिकाओं का लगभग 1.6$12.3% सीडी 45+ ल्यूकोसाइट्स (तालिका 1) थे। अधिकांश कथित मोनोसाइट्स पहले वर्णित के रूप में अग्रदूतों / अपरिपक्व कोशिकाओं, सुझावात्मक एसएससी बनाम CD45 gating34के आधार पर दिखाई दिया। कथित monocytes एसएससीकम-मध्यस्थके रूप मेंपरिभाषित किया गया / रक्त मोनोसाइट्स से संबद्ध (चित्र 1), पिछले अध्ययनों के समान33,34. कथित कणिकाओं को एसएससी उच्च/ ध्यान दें कि यह वर्गीकरण केवल विचारोत्तेजक है और सेल प्रकार की पुष्टि करने के लिए वंश-विशिष्ट मार्कर की आवश्यकता होगी।

ताजा अलग बीएम कोशिकाओं के ADCP गतिविधि एचआईवी विशेष मानव mAb 830A, जो एचआईवी लिफाफा के V2 क्षेत्र के लिए विशिष्ट है और V1V2-2F5K प्रतिजन यहाँ परीक्षण करने के लिए बांध का उपयोग कर मापा गया था. एडीसीपी गतिविधि उदाहरण के लिए यहाँ उदाहरण के लिए मापा गया था 1 महीने के बाद प्रसव के बाद प्राप्त दूध का उपयोग कर (चित्र 2) . उदाहरण डेटा CD45+ कक्षों पर gating करते समय देखा अपेक्षित FITC (bead+) हिस्टोग्राम दिखाता है (1 g/mL mAb का उपयोग करके जनरेट किया गया डेटा दिखाया गया है). काले मार्कर ADCP स्कोर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया आबादी से संकेत मिलता है. नमूने में 830A डेटा (चित्र 2Aका पहला पैनल), CD45+ कोशिकाओं का प्रतिशत और उस जनसंख्या का माध्य फ्लोरोसेंट दिखाया गया है, जो चरण 3.4 में समीकरण का उपयोग करके ADCP स्कोर की गणना करने के लिए उपयोग किए गए थे. अब-बाउंड/एंटीजन-युग्मित मोती के साथ अपने इनक्यूबेशन से पहले actin अवरोधक cytochalasin-D (cytoD) और/या FcR-ब्लॉकिंग एब्स (FcBlock) के साथ पूर्व-इनक्यूबेट किए गए सेल नियंत्रण mAb 3865 के स्तर पर एडीसीपी गतिविधि का प्रदर्शन किया या नीचे, यह इंगित करता है कि एडीसीपी एफसीआर था। और actin-निर्भर (चित्र 2)। ADCP स्कोर कुल CD45+ कोशिकाओं के लिए निर्धारित किया गया था $ 25 -35 गुना पृष्ठभूमि नकारात्मक नियंत्रण विरोधी एंथ्रेक्स mAb 3865 का उपयोग कर परिभाषित स्तर से ऊपर. प्रत्येक प्रमुख सबसेट के रूप में अच्छी तरह से अलग से विश्लेषण किया गया था. कथित दानेदार लोगों ने एडीसीपी गतिविधि का प्रदर्शन किया [12]29 गुना पृष्ठभूमि से अधिक है। कथित मोनोसाइट एडीसीपी पृष्ठभूमि से ऊपर 2 डिग्री 3 गुना था (चित्र 2)। अपेक्षित के रूप में कथित लिम्फोसाइटों किसी भी औसत दर्जे का ADCP गतिविधि का प्रदर्शन नहीं किया (गैर विशिष्ट नकारात्मक नियंत्रण mAb 3865 के ADCP स्कोर AUC के 3x मानक विचलन से कम; डेटा नहीं दिखाया).

Figure 1
चित्रा 1: स्तन के दूध से अलग कोशिकाओं के नमूना प्रवाह साइटोमेट्री डेटा। कक्ष संसाधित किए गए थे और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में दाग. (ए)एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए भूखंड में डबलट को खत्म करने के लिए सिंगल सेल लगाए गए थे, जो दिखाया गया है, साथ ही एफएससी-ए में छोटे मलबे और 5,000 को भी बाहर निकाल दिया गया है। (ख) इस जनसंख्या का उपयोग एसएससी बनाम वी 450 (व्यवहार्यता दाग) भूखंड में लाइव कोशिकाओं (जो व्यवहार्यता डाई के साथ दाग नहीं है) पर गेट करने के लिए किया गया था। (ग)इन जीवित कोशिकाओं का उपयोग एफएससी बनाम एसएससी साजिश में किया गया था। गैर-ल्यूकोसाइट्स की अपेक्षित स्थिति, जो मुख्य रूप से स्तन उपकला कोशिकाओं होने की संभावना है, पर प्रकाश डाला गया है ("ई")। (घ)वही FSC बनाम एसएससी प्लॉट केवल CD45+ कक्षों के साथ दिखाया गया है। प्रमुख ल्यूकोसाइट सबसेट नोट केवल अच्छी तरह से स्थापित और अपेक्षित एसएससी पैरामीटर के आधार पर कथित पहचान कर रहे हैं (जी ] granulocytes; मी एकाकोशिका; लिम्फोसाइटों) (ई)व्यवहार्य कोशिकाओं का उपयोग एसएससी बनाम सीडी 45 प्लॉट के लिए किया गया था जिसमें प्रमुख ल्यूकोसाइट सबसेट ों का उल्लेख किया गया था। इस साजिश से बैक-गेटिंग ने पैनल D. नोट में दिखाए गए डेटा को प्राप्त किया कि यह वर्गीकरण केवल विचारोत्तेजक है और सेल प्रकार की पुष्टि करने के लिए वंश-विशिष्ट मार्कर की आवश्यकता होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र2: स्तन के दूध से अलग कोशिकाओं का उपयोग कर नमूना ADCP डेटा. एडीसीपी परख प्रदर्शन Ackerman एट अल30से अनुकूलित परख पर आधारित है. परख ऊपर प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में किया गया था. (क)नमूना FITC हिस्टोग्राम पर 1 g/mL mAb, मार्कर के साथ मनका / FITC + आबादी एडीसीपी स्कोर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया संकेत. स्कोर के रूप में गणना की गई (मनका सकारात्मक कोशिकाओं के MFI) x (कुल CD45का% + कोशिकाओं में मनका / अकेले mAb 830A का उपयोग कर पहला पैनल भी कुल CD45+ कोशिकाओं का प्रतिशत और मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता मान है कि उदाहरण में ADCP स्कोर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया इंगित करता है. (बी) प्रत्येक mAb तनुकरण पर एडीसीपी स्कोर पर बात ें ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर में क्षेत्र के तहत वक्र (एयूसी) मूल्यों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. नियंत्रण प्रयोगों के लिए, actin अवरोध करनेवाला cytochalasin-डी (cytoD), FcR अवरुद्ध एजेंट (FcBlock), या दोनों का एक संयोजन प्रतिरक्षा परिसरों के लिए उनके अलावा करने से पहले कोशिकाओं के साथ पूर्व इनक्यूबेट किया गया (देखें किंवदंतियों). ध्यान दें कि यह सेल वर्गीकरण केवल विचारोत्तेजक है और सेल प्रकार की पुष्टि करने के लिए वंश-विशिष्ट मार्कर की आवश्यकता होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना कक्ष/एमएल % CD45+ % ग्रैन्युलोसाइट्स*  % मोनोसाइट्स*
1 222,857 12.3 $ 1.9 13.6 ] 3.8 65.9 $ 5.6
2 27,361 1.6 ] 0.01 25.2 $ 4.0 9.1 $ 5.6
3 161,486 3.6 ] 1.1 47.8 ] 6.8 24.3 ] 4.3
4 16,083 2.7 ] 0.1 17.9 ] 3.5 34.4 $ 1.0
5 25,155 4.0 $ 0.7 29.7 $ 2.6 20.5 $ 1.4
* CD45के + कोशिकाओं

तालिका 1: ठेठ स्तन दूध सेल मायने रखता है और विशेषताओं के उदाहरण.

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Discussion

यहाँ वर्णित ADCP गतिविधि को मापने के लिए प्रवाह cytometry आधारित तकनीक पहले 201130 में वर्णित किया गया था और के बाद से मजबूत साबित किया गया है और 80 से अधिक अध्ययनों में उद्धृत. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पहली बार के लिए प्राथमिक बीएम कोशिकाओं के साथ उपयोग के लिए इस तकनीक adapts. बीएम कोशिकाओं द्वारा Fc-मध्यस्थ कार्यक्षमता के पिछले अध्ययन काफी हद तक ऑक्सीडेटिव फटने या ऊतक विज्ञान आधारित phagocytosis परख के माप के लिए सीमित किया गया है कोलोस्ट्रम से अलग कोशिकाओं का उपयोग (0 डिग्री 4 जन्म के बाद दिन). वस्तुतः कोई अध्ययन कोलोस्ट्रम चरण पिछले मानव बीएम में कोशिकाओं की जांच की है. कोलोस्ट्रल कोशिकाओं का उपयोग कर अध्ययन आम तौर पर निष्कर्ष निकाला है कि कोलोस्ट्रम में granulocytes रक्त से अलग उन लोगों की तुलना में कम सक्रिय हैं, एक 'exudate सेल' है कि अतिरिक्त संवहनी अंतरिक्ष में ले जाया गया है के रूप में व्यवहार35, हालांकि परस्पर विरोधी अध्ययन है इसी प्रकार की रोगाणुता और जीवाणुनाशक क्षमता36की सूचना दी .

दशकों के लिए, पारंपरिक माइक्रोस्कोपी बीएम ल्यूकोसाइट्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और दृश्य पहचान के इस प्रकार सेल गलत पहचान1के लिए नेतृत्व किया जा सकता है। कुछ अध्ययनों से स्तनपान के पहले महीने से परे बीएम ल्यूकोसाइट संरचना की तुलना की है, और सबसे कोलोस्ट्रम पर ध्यान केंद्रित किया है। कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कोशिकाओं की सही पहचान करने की संभावना है, हालांकि केवल बीएम अध्ययन की एक छोटी संख्या इस विधि का उपयोग कर किया गया है, अक्सर एक बहुत छोटे नमूना संख्या के साथ. वर्तमान अध्ययनों से पता चला है कि स्तनपान के सभी चरणों में बीएम के ल्यूकोसाइट सामग्री व्यापक रूप से भिन्न होती है, जो कि परिपक्व दूध में $ 104$7 x 105 ल्यूकोसाइट्स/एमएल से लेकर, परिपक्व दूध में 103डिग्री 5 x 104 ल्यूकोसाइट्स/एमएल तक कम हो जाती है, यद्यपि सभी अध्ययन इस बात की पुष्टि करते हैं कि कोशिका सांद्रता और संघटनस्तनपान1, 2 ,3,4,5की अवस्था से दृढ़ता से प्रभावित होते हैं . दूध अपनी परिपक्व संरचना के लिए संक्रमण के रूप में, न्यूट्रोफिल एकाग्रता में वृद्धि प्रतीत होता है, हालांकि इस तरह के अध्ययन आम तौर पर पहले महीने प्रसवोत्तर34से परे नहीं बढ़ाया है .

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल phagocytic लक्ष्य के रूप में फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग करता है, हालांकि यह संभावना प्रतिरक्षा परिसरों और संक्रमित कोशिकाओं के रूप में अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक लक्ष्यों की एक किस्म के बीएम ADCP अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, विभिन्न Ab isotypes द्वारा ट्रिगर और उपवर्ग. ल्यूकोसाइट्स में और अंतर करने के लिए एक बड़ा सेल धुंधला पैनल नियोजित किया जा सकता है। इन प्रासंगिक प्राथमिक कोशिकाओं द्वारा एडीसीपी की व्यापक समझ विकसित करने के लिए बड़े अध्ययन आवश्यक होंगे। इस प्रोटोकॉल एचआईवी के MTCT, साथ ही अन्य रोगजनकों की कमी के लिए एक संभावित तंत्र के रूप में बीएम ल्यूकोसाइट्स द्वारा एडीसीपी की स्थापना के लिए अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि समीक्षा के लिए माउंट सिनाई में Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन में चिकित्सा विभाग और सूक्ष्म जीव विज्ञान विभाग में डॉ सुसान ज़ोला-Pazner धन्यवाद. NIH/NICHD अनुदान संख्या R21 HD095772-01A1 के तहत इस परियोजना के लिए धन प्रदान की. इसके अलावा, आर पावेल चिकित्सा विभाग, संक्रामक रोगों के प्रभाग, माउंट Sinai में Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन से धन द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

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References

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