Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

Immunology and Infection

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Summary

Le lait maternel transmet le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), bien que seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH soient infectés. Les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour, bien que ces cellules soient sous-étudiées. Ici nous décrivons l'isolement des leucocytes de lait maternel et une analyse de leur capacité phagocytic.

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Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

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Abstract

Même en l'absence de médicaments antirétroviraux, seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur du lait maternel (BM). À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour réduire la transmission de La BM. Les nourrissons allaités ingèrent par jour 105à 108 leucocytes maternels, bien que ce qui reste largement incertain, c'est la contribution de ces cellules aux qualités antivirales de la BM. Actuellement, nous avons cherché à isoler les cellules de la BM humaine afin de mesurer phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l'une des réponses immunitaires innées les plus essentielles et les plus répandues, par les phagocytes BM contre les cibles du VIH. Des cellules ont été isolées de 5 échantillons humains de BM obtenus à divers stades de lactation. L'isolement a été effectué par centrifugation douce suivie d'une élimination soigneuse de la graisse de lait et le lavage répété de la pastille cellulaire. Les perles fluorescentes recouvertes d'épitope de l'enveloppe du VIH (Env) ont été utilisées comme cibles pour l'analyse du PCAA. Des cellules ont été souillées avec le marqueur de surface CD45 pour identifier des leucocytes. On a constaté que l'activité de l'ADCP était significative au-dessus des expériences de contrôle et reproductiblement mesurable à l'aide d'un anticorps spécifique au VIH 830A.

Introduction

Le lait maternel humain (BM) est composé de cellules maternelles qui sont viablesà 90% 1 . La composition cellulaire est fortement affectée par le stade de lactation, l'état de santé de la mère et du nourrisson, et la variation individuelle, qui reste mal comprise1,2,3,4. Étant donné que la BM contient 103à 105 leucocytes/mL, on peut estimer que les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour5. Diverses études in vivo ont démontré que les leucocytes maternels fournissent une immunité critique au nourrisson et sont fonctionnels bien au-delà de ces sites d'ingestion initiale5,6,7,7 ,9,10,11. Toutes les cellules d'origine maternelle ingérées par le nourrisson ont le potentiel d'effectuer des fonctions immunitaires à côté ou de compenser les leucocytes12.

La transmission mère-enfant (TMT) du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste une crise dans les pays à ressources limitées. Étant donné que les maladies diarrhéiques et respiratoires sont responsables de taux de mortalité importants chez les nourrissons dans les pays à ressources limitées, et que ces maladies sont considérablement réduites par l'allaitement exclusif, les avantages pour les mères infectées par le VIH l'allaitement maternel l'emporte de loin sur les risques13,14,15. À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH16. Environ 100 000 MTT par l'intermédiaire de BM se produisent annuellement ; pourtant, seulement 15 % des nourrissons allaités par leur mère infectée par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur de la BM17,18,19,20,21. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour prévenir la transmission. Fait important, les anticorps spécifiques au VIH (Abs) dans le BM ont été corrélés avec une réduction du MTCT et/ou une réduction de la mortalité infantile par infection par le VIH22,23. Ce qui reste largement flou est la contribution de la fraction cellulaire de BM à ses qualités antivirales.

Beaucoup d'Abs facilitent une variété d'activités antivirales médiées par la région « constante » de la molécule d'immunoglobuline, le fragment cristallin (Fc), par l'intermédiaire de l'interaction avec des récepteurs de Fc (FcRs) trouvés sur pratiquement toutes les cellules immunitaires innées, pratiquement toutes qui se trouvent dans l'humain BM24. La phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) a été démontrée comme nécessaire pour le dégagement des infections virales et a été sous-étudiée dans le cas de la prévention du MTCT du VIH25,26,27, 28 Annonces , 29. Étant donné le manque de connaissances sur la contribution potentielle de l'activité ADCP par les phagocytes BM à la prévention du TMT du VIH, nous avons cherché à mettre au point une méthode rigoureuse pour isoler les cellules de la BM humaine afin d'entreprendre une étude de l'ADCP BM obtenu à divers stades de lactation.

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Protocol

Chaque participant à cette étude a été recruté et interviewé en accord avec l'approbation de la Commission d'examen éthique et institutionnel (CISR) avec les directives et l'autorisation du Programme de protection des sujets humains (PPHS) approuvé par le Mont Sinaï à l'aide d'un protocole pour l'obtention d'échantillons de lait maternel.

1. Cibler la préparation de la microsphère

  1. Sélectionnez un antigène cible pertinent.
    REMARQUE : Dans cet exemple, la protéine recombinante V1V2-2F5K a été utilisée, qui a été conçue pour imiter l'apex trimérique de l'enveloppe indigène de VIH30.
  2. Effectuer la biotinylation à l'aide d'un kit commercial (Table of Materials) selon le protocole du fabricant.
    1. Calculer la mmol du réactif de biotine pour ajouter à la réaction pour un excès de molaire 5 fois à l'aide de la formule: mmol biotine - mL protéine x (protéine mg/mL protéine) x (protéine de biotine de mmol/mg) x (5 mmol biotine/protéine mmol)30,31. Calculez ensuite le réagent de biotine à ajouter à l'aide de la formule : biotine L et biotine de mmol x (1 000 000 l/L) x (L/10 mmol).
    2. Équilibrez la biotine à température ambiante avant l'ouverture. Dissoudre la protéine dans 0.5-2.0 mL de saline phosphate-tamponné (PBS) selon le calcul fait ci-dessus.
    3. Préparer une solution de 10 mM de réactif de biotine dans le diméthylsulfoxide (DMSO) et ajouter le volume approprié de 10 mM de réactif de biotine à la solution protéique, et incuber la réaction sur la glace pendant 2 h ou à température ambiante pendant 30 min.
  3. Enlever l'excès de biotine à l'aide de concentrateurs de protéines (membranes polyéthersulfone [PES], 3 kDa de poids moléculaire coupé [MWCO], 0,5 mL; Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
    1. Déposez l'échantillon dans la chambre supérieure de la colonne de spin et ajoutez du PBS jusqu'à 400 l. Cap, puis insérez cette chambre d'échantillon dans un tube de collecte. Centrifugeuse à 12 000 x g à température ambiante pendant 30 min.
    2. Jeter le flux à travers et ajouter PBS à 400 l. Répéter la centrifugation. Jetez le flux à travers et ajoutez pbS à 100 l. Mesurer la concentration de protéines par un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Les protéines peuvent être aliquoted et congelées à -80 oC jusqu'à ce qu'elles soient utilisées.

2. Phagocytose cellulaire anticorps-dépendante (ADCP) Préparation de plaque d'essai

  1. Conjuguer les protéines biotinylated à 1 m microsphères (« perles »; Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
    1. Par assiette de perles conjuguées, incuber 6 g de protéines avec 12 l de perles de bouillon dans 200 L de 0,1 % d'albumine de sérum bovin (BSA)-PBS à température ambiante pendant 1 h, vortexant doucement toutes les 20 min.
    2. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant, le vortex doucement et le resuspendre en 1200 'L de 0,1% BSA-PBS. Répétez le spin et lavez l'étape 2x. Resuspendre en 1200 l de 0,1% BSA-PBS.
  2. Aliquot 10 l de solution de perle par puits dans une plaque ronde de 96 puits. Préparer des dilutions d'anticorps ou de sérum immunitaire sédentaire dans 12 'L de 2% HSA HBSS, généralement à partir de 50 'g/mL d'anticorps ou une dilution de sérum 1/100.
    REMARQUE : Dans les données de l'échantillon, l'anticorps monoclonal (mAb) 830A a été utilisé.
  3. Ajouter 10 ldddd d'anticorps/sérum titrés à la plaque de perles et couver pendant 2 h à 37 oC. Ajouter 200 oL de 2 % de HSA HBSS à chaque puits et plaque de centrifugeuse à 2 000 x g pendant 10 min.
  4. Retirez soigneusement le supernatant par un renversement rapide et une décantation du liquide des puits de plaque dans un évier pour éviter de déranger la boulette de perle invisible.

3. Isolement des cellules du lait maternel

  1. Obtenir du lait maternel humain auprès de femmes allaitantes en bonne santé, exprimé à l'aide de pompes électroniques ou manuelles doubles. Isoler les cellules à moins de 4 h de l'expression, en gardant le lait à température ambiante.
  2. À l'aide de tubes de 50 ml, centrifuger 50 ml de lait à 800 x g pendant 15 min. Verser soigneusement le lait écrémé et la graisse tout en laissant le granule cellulaire intact. Essuyez l'intérieur du tube avec une lingette sans papier pour enlever toute la graisse de la paroi du tube.
  3. Ajoutez 10 ml d'albumen de sérum humain de 2 % dans la solution de sel équilibrée de Hank (2 % HSA HBSS [sans Ca2 ou Mg)). Resuspendre le granule par pipetage doux pour éviter l'activation cellulaire et l'apoptose. Transférer dans un tube de 15 ml et une centrifugeuse à 450 x g pendant 10 min.
  4. Verser le supernatant et répéter l'étape 1.3. Ensuite, resuspend doucement les cellules dans 1/2 ml de 2% HSA HBSS en fonction du nombre de cellules prévu, et compter les cellules par un hémocytomètre ou un compteur cellulaire automatisé, notant également la viabilité cellulaire.

4. ADCP d'astoique

REMARQUE : Les méthodes décrites ici sont adaptées d'Ackerman et coll.32.

  1. Ajoutez 50 000 cellules BM fraîchement isolées à chaque plaque d'adpode aDCP dans 200 L de 2 % De HSA-HBSS. Incuber pendant 2 h à 37 oC.
    1. Pour les expériences de contrôle, les cellules pré-incubées à 37 oC avec un inhibiteur de l'actine de 10 g/mL (cytochalasin-D), un agent de blocage De50 g/mL FcR (FcBlock) ou une combinaison des deux avant leur ajout aux plaques.
  2. Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min. Ajouter 200 l de 2 % HSA HBSS et répéter la centrifugation. Retirez soigneusement le supernatant comme à l'étape 2.7 et répétez le lavage.
  3. Enlever soigneusement les supernatants et les cellules tachées pour la viabilité en utilisant 0,5 g/mL (concentration finale) tache de viabilité fixable 450 par puits dans 50 'L de 2% HSA HBSS. Incuber 20 min à température ambiante dans l'obscurité. Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min et retirer le supernatant comme à l'étape 2.7. Ajouter 200 L de 2% HSA HBSS et plaque de centrifugeuse à nouveau suivie par l'enlèvement du supernatant comme à l'étape 2.7.
  4. Après coloration de viabilité, les cellules de tache pour les marqueurs de leucocyte d'intérêt, y compris un minimum d'une tache CD45-spécifique telle que PE-souris anti-humain CD45 (clone HI30) à une concentration optimisée (1 'g/L dans 50 'L de 1% BSA HBSS dans les données d'exemple).
    REMARQUE : Tous les marqueurs d'intérêt spécifiques à la lignée peuvent être inclus.
  5. Incuber 20 min à température ambiante dans l'obscurité. Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min et retirer le supernatant comme à l'étape 2.7. Ajouter 200 l de 1 % de BSA HBSS et répéter la centrifugation. Enlever le supernatant. Fixer les cellules dans 200 oL de 0,5 % de formaldéhyde dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min ou pendant la nuit à 4 oC. Réfrigérer dans l'obscurité jusqu'à l'analyse.

5. Analyse par cytométrie de flux

  1. Effectuer le gating initial pour éliminer les doublets sur une dispersion vers l'avant (FSC) par rapport à la dispersion latérale (SSC) parcelle et les débris (matériel plus petit que FSC 5000) (voir Figure 1). Utilisez une tache SSC vs viabilité (V450 dans ce cas) parcelle pour éliminer les cellules mortes (ceux qui sont positifs pour la tache de viabilité).
  2. Utilisez une parcelle SSC vs CD45 pour différencier les principales classes de leucocytes (granulocytes, monocytes, lymphocytes) comme décrit sazèle 33,34.
    REMARQUE : Cette classification n'est que suggestive et des marqueurs spécifiques à la lignée sont nécessaires pour confirmer le type de cellule.
  3. Pour toutes les cellules CD45MD, ou pour chaque sous-ensemble d'intérêt des leucocytes, mesurez l'activité aDCP en gatingant avec un marqueur sur les cellules perlées-positives dans un histogramme du canal isothiocyanate de fluorescéine (FITC), où les perles fluorescentes sont détectées.
    REMARQUE : Les puits de contrôle négatifs dans lesquels les perles n'ont pas été ajoutées indiqueront où les cellules perlées-positives sont apparentes dans l'histogramme et donc où placer le marqueur de gating.
  4. Calculer les scores ADCP comme (intensité médiane de fluorescence [IMF] des cellules perlées-positives) x (% du Total CD45 - cellules dans la population positive). Utilisez un logiciel graphique pour tracer les scores à chaque concentration Ab/sérum et effectuer une analyse de zone sous la courbe (AUC).
    REMARQUE : L'ADCP est considéré comme positif si l'AUC est supérieur à 3 x 3 fois l'écart-type de l'AUC de score ADCP d'un mAb négatif non spécifique de contrôle (dans ce cas, 3865).

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Representative Results

Le lait peut être conservé à température ambiante ou plus frais (mais non congelé); cependant, étant donné que nous avons observé une viabilité réduite lorsque le lait a été gardé très froid (données non montrées), et qu'il est plus simple de recueillir, de stocker brièvement et de transporter à des températures ambiantes, il est recommandé que les échantillons ne soient pas réfrigérés afin de réduire variabilité d'échantillon à échantillon. Dans le lait obtenu 7 à 183 jours après le partum, la concentration cellulaire déterminée par un compteur cellulaire automatisé variait de 16 083 à 222 857 cellules/mL. La figure 1 illustre la stratégie de gating éliminant les doublets, les débris et les cellules mortes. La viabilité était de 90 à 99 %. Environ 1,6 à 12,3 % du total des cellules vivantes étaient des CD45et des leucocytes(tableau 1). La plupart des monocytes présumés semblaient être des précurseurs/cellules immatures comme décrit précédemment, basé sur le SSC suggestif contre CD45 gating34. Les monocytes prétendus ont été définis comme SSCfaible-intermédiaire/CD45faible, bien que peu ont montré les niveaux plus élevés de coloration CD45 distinctde la population de lymphocytes prétendu (SSCfaible/CD45faible) plus généralement associés aux monocytes sanguins (Figure 1), semblables aux études précédentes33,34. Les prétendus granulocytes ont été définis comme SSCélevé/CD45intermédiaire33,34 ( tableau1). Notez que cette classification n'est que suggestive et que des marqueurs spécifiques à la lignée seraient nécessaires pour confirmer le type de cellule.

L'activité ADCP des cellules BM fraîchement isolées a été mesurée à l'aide du mAb 830A humain spécifique au VIH, qui est spécifique pour la région V2 de l'enveloppe du VIH et se lie à l'antigène V1V2-2F5K testé ici. L'activité de l'ADCP a été mesurée pour l'exemple ici à l'aide de lait obtenu à 1 mois après le partie(figure 2A). Les données d'exemple montrent les histogrammes FITC (perles) attendus observés lors du gating sur lescellules CD45 (les données générées à l'aide d'un mAb de 1 g/mL sont affichées). Les marqueurs noirs indiquent les populations utilisées pour calculer les scores ADCP. Dans l'échantillon 830A, on montre le pourcentage decellules CD45 et la fluorescence moyenne de cette population, qui ont été utilisés pour calculer le score ADCP à l'aide de l'équation à l'étape 3.4. Les cellules pré-incubées avec l'inhibiteur de l'actine cytochaasin-D (cytod) et/ou FcR-bloquant Abs (FcBlock) avant leur incubation avec les perles Ab-bound/antigène-couplées ont montré l'activité ADCP au niveau du mAb de commande 3865 ou ci-dessous, indiquant ADCP était FcR et l'actine dépendante (Figure 2). Le score ADCP déterminé pour le total des cellules CD45et était de 25 à 35 fois supérieur aux niveaux de fond définis à l'aide du contrôle négatif anti-anthrax mAb 3865. Chaque sous-ensemble majeur a également été analysé séparément. Les prétendus granulocytes présentaient une activité ADCP de 12 à 29 fois plus élevée que l'arrière-plan. Le prétendu ADCP monocyte était de 2 à 3 fois au-dessus de l'arrière-plan (figure 2). Les lymphocytes prétendus comme prévu n'ont montré aucune activité aDCP mesurable (moins de 3x déviation standard de l'AUC de score ADCP du mAb négatif non spécifique 3865 ; données non montrées).

Figure 1
Figure 1 : Données de cytométrie du flux d'échantillons de cellules isolées du lait maternel. Les cellules ont été traitées et tachées comme décrit dans le protocole. (A) Les cellules simples ont été fermées pour éliminer les doublets dans une parcelle FSC-H vs FSC-A comme indiqué, atténuant également les petits débris 'lt;5,000 dans FSC-A. (B) Cette population a été utilisée pour s'immiscer dans les cellules vivantes (qui ne tachent pas avec le colorant de viabilité) dans une parcelle SSC vs V450 (tache de viabilité). (C) Ces cellules vivantes ont été utilisées dans une parcelle FSC vs SSC. La position attendue des non-leucocytes, susceptibles d'être principalement des cellules épithéliales mammaires, est mise en évidence (« E »). (D) La même parcelle FSC vs SSC n'est montrée qu'avec descellules CD45. Les principaux sous-ensembles de leucocytes mentionnés ne sont que des identités prétendues fondées sur des paramètres SSC bien établis et attendus (G et granulocytes; M et monocytes; Lymphocytes L). (E) Des cellules viables ont été utilisées pour une parcelle SSC vs CD45 avec les principaux sous-ensembles de leucocytes notés. Le back-gating de cette parcelle a donné les données montrées dans le panneau D. Notez que cette classification n'est que suggestive et que des marqueurs spécifiques à la lignée sont nécessaires pour confirmer le type de cellule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Échantillonnez les données ADCP à l'aide de cellules isolées du lait maternel. L'adsay ADCP effectué est basé sur l'extrait adapté d'Ackerman et coll.30. L'assay a été effectué comme indiqué dans le protocole ci-dessus. (A) Échantillons d'histogrammes FITC à 1 mAb g/mL, avec des marqueurs indiquant les populations de perles/FITCMD utilisées pour déterminer le score ADCP. Les scores ont été calculés comme (IMF des cellules perlées-positives) x (% de CD45 total- cellules dans la population positive de perle/FITCMD). Le premier panneau utilisant mAb 830A seul indique également le pourcentage de cellules CD45totales et la valeur moyenne d'intensité de fluorescence utilisée pour calculer le score ADCP dans cet exemple. (B) Les scores ADCP à chaque test de dilution de mAb ont été utilisés pour calculer les valeurs de zone sous la courbe (AUC) dans les logiciels graphiques. Pour les expériences de contrôle, l'inhibiteur de l'actine cytochaasin-D (cytod), l'agent de blocage FcR (FcBlock), ou une combinaison des deux ont été pré-incubés avec des cellules avant leur ajout aux complexes immunitaires (voir légendes). Notez que cette classification cellulaire n'est que suggestive et que des marqueurs spécifiques à la lignée sont nécessaires pour confirmer le type de cellule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

échantillon Cellules/mL % CD45 % Granulocytes  % Monocytes
1 222,857 12,3 à 1,9 13,6 à 3,8 65,9 à 5,6
2 27,361 1,6 à 0,01 25,2 à 4,0 9,1 à 5,6
3 161,486 3,6 à 1,1 47,8 à 6,8 24,3 à 4,3
4 16,083 2,7 à 0,1 17,9 à 3,5 34,4 à 1,0
5 25,155 4,0 à 0,7 29,7 à 2,6 20,5 à 1,4
Descellules CD45

Tableau 1 : Exemples de dénombrements et de caractéristiques typiques des cellules du lait maternel.

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Discussion

La technique basée sur la cytométrie du débit pour mesurer l'activité ADCP décrite ci-dessus a été décrite pour la première fois en 201130 et a depuis fait ses preuves et a été citée dans plus de 80 études. Le protocole décrit ici adapte cette technique pour une utilisation avec des cellules BM primaires pour la première fois. Les études antérieures de la fonctionnalité fc-négociée par les cellules De MB ont été en grande partie limitées à la mesure des éclats oxydatifs ou des essais de phagocytose histologiques utilisant des cellules isolées du colostrum (0 à 4 jours après la naissance). Pratiquement aucune étude n'a examiné des cellules dans bM humain au-delà de la phase de colostrum. Les études utilisant des cellules colostral ont généralement conclu que les granulocytes dans le colostrum sont moins actifs que ceux isolés du sang, se comportant comme une « cellule d'exsudat » qui s'est déplacée dans l'espace extravasculaire35,bien que des études contradictoires aient ont signalé des capacités phagocytiques et bactéricides similaires36.

Pendant des décennies, la microscopie traditionnelle a été utilisée pour identifier les leucocytes BM, et ce type d'identification visuelle peut avoir conduit à une erreur d'identification cellulaire1. Peu d'études ont comparé la composition des leucocytes BM au-delà du premier mois de lactation, et la plupart se sont concentrées sur le colostrum. L'utilisation de la cytométrie du débit pour identifier les cellules est susceptible d'identifier avec précision les cellules, bien que seulement un petit nombre d'études De MB ont été faites en utilisant cette méthode, souvent avec un nombre d'échantillons très faible. Les études actuelles ont indiqué que la teneur en leucocytes de BM à tous les stades de lactation varie considérablement, allant de 104x 7 x 105 leucocytes/mL dans le colostrum précoce, diminuant à 103x 5 x 104 leucocytes/mL dans le lait mûr, bien que toutes les études confirment que la concentration et la composition des cellules sont fortement impactées par le stade de lactation1,2,3,4,5. À mesure que le lait passe à sa composition mature, la concentration de neutrophiles semble augmenter, bien que de telles études ne se soient généralement pas étendues au-delà du premier mois post-partum34.

Le protocole décrit ci-dessus utilise des perles fluorescentes comme cible phagocytique, bien qu'il puisse probablement être appliqué pour étudier BM ADCP d'une variété de cibles plus biologiquement pertinentes telles que les complexes immunitaires et les cellules infectées, déclenchées par divers isotypes Ab et Sous-classes. Un plus grand panneau de coloration de cellules peut être employé pour différencier davantage les leucocytes. De grandes études seront essentielles pour développer une compréhension complète de l'ADCP par ces cellules primaires pertinentes. Ce protocole permet l'établissement d'ADCP par les leucocytes BM comme mécanisme potentiel de réduction du MTCT du VIH, ainsi que d'autres agents pathogènes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions la Dre Susan Zolla-Pazner, du Département de médecine et de microbiologie de l'École de médecine Icahn du Mont Sinaï, pour son examen des manuscrits. Le NIH/NICHD a fourni du financement pour ce projet sous le numéro de subvention R21 HD095772-01A1. En outre, R. Powell a été soutenu par des fonds du Département de médecine, Division des maladies infectieuses, Icahn School of Medicine à Mount Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

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References

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