Surveillance du pH extracellulaire dans les biofilms Cross-Kingdom à l'aide de la microscopie confocale

Immunology and Infection

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Summary

Le protocole décrit la culture de biofilms inter-royaume s'composés de Candida albicans et Streptococcus mutans et présente une méthode confocale basée sur la microscopie pour la surveillance du pH extracellulaire à l'intérieur de ces biofilms.

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Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

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Abstract

Les biofilms transversaux composés de cellules fongiques et bactériennes sont impliqués dans une variété de maladies buccales, telles que les infections endodontiques, la parodontite, les infections muqueuses et, plus particulièrement, les caries de la petite enfance. Dans toutes ces conditions, le pH de la matrice de biofilm influe sur les interactions microbe-hôte et donc la progression de la maladie. Le protocole actuel décrit une méthode à base de microscopie confocale pour surveiller la dynamique du pH à l'intérieur des biofilms transversaux comprenant Candida albicans et Streptococcus mutans. Le spectre à double émission dépendant du pH et les propriétés de coloration de la sonde ratiométrique C-SNARF-4 sont exploités pour déterminer les baisses de pH dans les zones extracellulaires des biofilms. L'utilisation de la ratiométrie de pH avec la sonde nécessite un choix méticuleux de paramètres d'imagerie, un étalonnage approfondi du colorant et un post-traitement minutieux basé sur le seuil des données d'image. Lorsqu'elle est utilisée correctement, la technique permet l'évaluation rapide du pH extracellulaire dans différentes zones d'un biofilm et donc la surveillance des gradients de pH horizontaux et verticaux au fil du temps. Alors que l'utilisation de la microscopie confocale limite le profilage Z à des biofilms minces de 75 m ou moins, l'utilisation de la ratiométrie du pH est idéalement adaptée à l'étude non invasive d'un facteur de virulence important dans les biofilms de l'ensemble du royaume.

Introduction

Les biofilms de cross-kingdom comprenant des espèces fongiques et bactériennes sont impliqués dans plusieurs conditions pathologiques dans la cavité buccale. Candida spp. ont souvent été isolés des infections endodontiques1 et des lésions parodontales2,3. Dans les infections muqueuses, les espèces streptococciques du groupe de mitis ont été montrées pour augmenter la formation de biofilm fongique, l'invasion de tissu, et la diffusion dans les modèles in vitro etmurines 4,5,6,7. Plus intéressant encore, le transport oral de Candida spp. a été prouvé pour être associé à la prévalence des caries chez les enfants8. Comme le montrent les modèles de rongeurs, une relation symbiotique entre Streptococcus mutans et Candidas albicans augmente la production de polysaccharides extracellulaires et conduit à la formation de biofilms plus épais et plus cariogéniques9,10.

Dans toutes les conditions susmentionnées, les caries de la petite enfance en particulier, le pH du biofilm est important pour la progression de la maladie, et le rôle éminent de la matrice biofilm pour le développement de microenvironnements acidogéniques11 exige des méthodologies qui permettent d'étudier les changements de pH à l'intérieur des biofilms inter-royaume. Des approches simples et précises basées sur la microscopie confocale pour surveiller le pH à l'intérieur des biofilmsbactériens 12 et fongiques13 ont été développées. Avec le colorant ratiométrique C-SNARF-4 et le post-traitement de l'image basé sur le seuil, le pH extracellulaire peut être déterminé en temps réel dans les trois dimensions d'un biofilm14. Comparé à d'autres techniques éditées pour la microscopie-basée pH-surveillance dans les biofilms, la ratiométrie de pH avec C-SNARF-4 est simple et bon marché, parce qu'elle ne nécessite pas la synthèse des particules ou des composés qui incluent un colorant de référence15 ou l'utilisation de l'excitation de deux-photon16. L'utilisation d'un seul colorant empêche les problèmes de compartimentation de sonde, de saignement fluorescent-à travers, et de blanchiment sélectif16,17,18 tout en permettant une différenciation fiable entre le pH intra- et extracellulaire. Enfin, l'incubation avec le colorant est effectuée après la croissance du biofilm, ce qui permet d'étudier à la fois les biofilms en laboratoire et in situ.

L'objectif du présent travail est d'étendre l'utilisation de la ratiométrie du pH et de fournir une méthode pour étudier les changements de pH dans les biofilms inter-royaume. Comme preuve de concept, la méthode est utilisée pour surveiller le pH dans les biofilms à deux espèces composés de S. mutans et De C. albicans exposés au glucose.

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Protocol

Le protocole pour la collecte de salive a été examiné et approuvé par le comité d'éthique du comté d'Aarhus (M-20100032).

1. Cultivation de biofilms de cross-kingdom

  1. Cultivez S. mutans DSM 20523 et C. albicans NCPF 3179 sur des plaques d'agar de sang à 37 oC dans des conditions aérobies.
  2. Transférer des colonies uniques de chaque organisme dans des tubes à essai remplis de 5 ml d'infusion cardiaque cérébrale (BHI). Cultivez pendant 18 h dans des conditions aérobies à 37 oC.
  3. Centrifuger les cultures de la nuit à 1 200 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant, suspendez les cellules en salin physiologique et ajustez l'OD550 nm à 0,5 pour C. albicans (107 cellules/mL) et S. mutans (108 cellules/mL). Diluer la suspension S. mutans 1:10 avec saline physiologique stérile (107 cellules/mL).
  4. Pipette 50 l de solution salivaire stérile, préparée selon la méthode de de Jong et coll.19, dans les puits d'une plaque optique de 96 puits pour la microscopie. Incuber pendant 30 min à 37 oC. Laver les puits 3x avec 100 l de salline physiologique stérile. Videz les puits.
  5. Ajouter 100 l de suspension C. albicans à chaque puits. Incuber à 37 oC pendant 90 min. Laver 3x avec saline physiologique stérile.
    REMARQUE : Ne videz pas complètement les puits pendant le lavage. Laissez un réservoir de 20 L pour éviter les forces excessives de cisaillement.
  6. Ajouter 100 ll de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (inactivé à 56 oC pendant 30 min) à chaque puits. Incuber à 37 oC pendant 2 h. Laver 3x avec saline physiologique stérile. Vider les puits, en laissant un réservoir de 20 l.
  7. Ajouter 100 l de suspension S. mutans (préparée à l'étape 1.3) à chaque puits. Ajouter 150 L de BHI contenant 5% de saccharose. Incuber à 37 oC pendant 24 h ou plus. Lorsque vous cultivez des biofilms plus anciens, changez le milieu quotidiennement en BHI frais. À la fin de la phase de croissance du biofilm inter-royaume, laver 5x avec saline physiologique stérile.

2. Imagerie par pH ratiométrique

REMARQUE : L'imagerie par pH ratiométrique doit être effectuée immédiatement après la fin de la croissance du biofilm.

  1. Pour l'imagerie par pH ratiométrique, utilisez un microscope à balayage laser confocal inversé avec une lentille d'immersion en huile ou en eau de 63x, une ligne laser de 543 nm et un système d'imagerie spectrale (c.-à-d. détecteur META) pour permettre l'imagerie des signaux fluorescents qui se chevauchent. À l'emploi d'un incubateur, chauffer le stade du microscope à 35 oC.
  2. Définir le détecteur pour assurer la détection de la fluorescence verte de 576 à 608 nm et la détection simultanée de la fluorescence rouge de 629 à 661 nm. Choisissez une puissance laser appropriée et gagnez pour éviter la surexposition et la sous-exposition.
    REMARQUE: L'exposition des images est mieux vu dans les images de palette avec de fausses couleurs.
  3. Définir la taille du sténopé à 1 unité Airy ou une tranche optique de 0,8 m. Définir la taille de l'image à 512 x 512 pixels et la vitesse d'analyse à 2. Choisissez une moyenne de ligne de 2, en utilisant l'option moyenne.
    REMARQUE : Au début d'une série d'expériences, vérifiez que les paramètres choisis au microscope offrent un contraste clair entre les cellules bactériennes, les parois des cellules fongiques, la matrice de biofilms et le cytoplasme fongique.
  4. Préparer 100 l de saline physiologique stérile contenant 0,4 % (w/v) de glucose, titré au pH 7. Préparer une solution de stock de C-SNARF-4 (1 mM en sulfoxide de diméthyle). Ajouter le colorant à une concentration finale de 30 m.
    CAUTION: Portez des gants nitriles lors de la manipulation du colorant ratiométrique.
  5. Videz l'un des puits avec un biofilm transversal, en laissant un réservoir de 20 L. Ajouter le salin stérile contenant du glucose et le colorant ratiométrique. Placez la plaque de 96 puits sur la scène du microscope et commencez à imagerier le biofilm.
  6. Acquérir des images uniques ou des piles Z à différents endroits du biofilm. Marquez la position X-Y dans le logiciel de microscope pour suivre les changements de pH dans des champs de vision particuliers au fil du temps. À intervalles réguliers, prenez des images avec le laser éteint pour corriger le décalage du détecteur.
  7. Répétez les étapes 2.4-2.6 pour l'analyse de chaque biofilm cultivé dans un puits différent.

3. Calibration du colorant ratiométrique

REMARQUE : L'étalonnage du colorant et l'installation d'une courbe d'étalonnage peuvent être effectués un jour différent de l'imagerie par pH ratiométrique.

  1. Préparer une série de tampons de 50 mM d'acide morpholinoethanesulfonic (MES) titrated à pH 4,0 à 7,8 en étapes de 0,2 pH à 35 oC. Pipette 150 l de chaque solution tampon dans les puits d'une plaque optique de 96 puits pour la microscopie.
  2. Ajouter le colorant aux puits remplis de tampons de la plaque de 96 puits à une concentration finale de 30 M. Laisser l'équilibre pendant 5 min.
  3. Réchauffer l'étape du microscope à 35 oC. Choisissez les mêmes réglages de microscope que pour l'imagerie par pH ratiométrique. Placez la plaque de 96 puits sur la scène du microscope. Concentrez-vous sur le fond des puits. Acquérir deux images (canal vert et rouge) pour toutes les solutions tampons, à 5 m au-dessus du fond du puits. À intervalles réguliers, prenez des images avec le laser éteint pour corriger le décalage du détecteur.
  4. Effectuer l'expérience d'étalonnage en triplicate.
  5. Exportez toutes les images sous forme de fichiers TIF. Importez-les dans un logiciel dédié d'analyse d'images (c.-à-d. ImageJ20). Soustrayez les images prises avec le laser désactivée des images respectives des solutions tampons en cliquant sur Processus . Calculatrice d'images Soustrayez).
    REMARQUE : Si nécessaire, recadrez les images pour éliminer les artefacts aux bordures de l'image en effectuant une sélection rectangulaire à l'aide d'Image. Crop.
  6. Divisez les images du canal vert à travers les images du canal rouge et calculez les intensités moyennes de fluorescence dans les images résultantes en cliquant sur Analyser Histogramme.
  7. À partir des expériences triplicate, tracez les rapports vert/rouge moyens par rapport au pH. Utilisez un logiciel dédié pour adapter une fonction aux données d'étalonnage (c.-à-d. MyCurveFit).

4. Analyse d'image numérique

REMARQUE : L'analyse numérique de l'image peut être effectuée à tout moment après l'étalonnage du colorant et de l'imagerie par pH ratiométrique.

  1. Conservez les images de biofilms de canal vert et rouge dans des dossiers séparés et renommez les deux séries de fichiers avec des numéros séquentiels (p. ex., GREEN_0001). Importer les images dans un logiciel dédié d'analyse d'images (c.-à-d. ImageJ). Cliquez sur Analyser Histogramme pour déterminer l'intensité moyenne de fluorescence dans les images prises avec le laser et soustraire la valeur des images de biofilm en cliquant sur Processus Mathématiques et mathématiques Soustrayez.
  2. Importer la série de 2 images dans un logiciel dédié d'analyse d'images (c.-à-d., daime21). Effectuer une segmentation fondée sur le seuil des images de canaux rouges(Segment Segmentation automatique Seuil personnalisé). Fixez le seuil « bas » au-dessus de l'intensité de fluorescence du cytoplasme fongique et le seuil « élevé » au-dessous de l'intensité des parois des cellules fongiques et des bactéries.
    REMARQUE : Lorsque des seuils appropriés ont été choisis, seules les zones extracellulaires sont reconnues comme des objets.
  3. Transférez la couche d'objet de la série d'images segmentées à la série d'images de canaux verts. Pour ce faire, cliquez sur Segment Transférer la couche d'objet.
    REMARQUE: Si le contraste entre les zones extracellulaires et le cytoplasme fongique est trop faible dans les canaux de couleur individuels, ajouter la série d'images de canal vert à la série de canaux rouges avant la segmentation en cliquant sur Edit Calculatrice d'images Ajout. Effectuez la segmentation telle que décrite sous 4.2 et transférez la couche d'objet de la série d'images segmentées à la fois à la série d'images vertes et rouges.
  4. Utilisez l'éditeur d'objets pour supprimer les pixels non-objet dans la série d'images de canaux rouges et verts (Visualiseur Éditeur d'objets Dans toutes les images Supprimer les pixels non-objet). Maintenant, les images de biofilms sont effacées des cellules bactériennes et fongiques. Exporter la série d'images traitées sous forme de fichiers TIF.
  5. Importer les deux séries d'images sur ImageJ. ImageJ attribue une intensité de 0 à tous les pixels non-objet. Supprimer ces pixels en divisant la série d'images rouges (R1) par lui-même (Processus Calculatrice d'images Image 1: R1; Opération : Diviser; Image 2: R1) et en multipliant la série d'images résultante (R2) avec la série d'images rouges d'origine (Processus Calculatrice d'images Image 1: R1; Opération: Multiplier; Image 2: R2). Une troisième série d'images (R3) est créée, identique à R1, sauf pour le fait que NaN est attribué à tous les pixels avec une intensité de 0 en R1. Procédez de la même manière avec la série d'images vertes.
  6. Utilisez le filtre 'Mean' (Processus Filtres et filtres Moyenne de l'année Rayon de rayon 1 pixel) sur la série d'images de canaux rouges et verts pour compenser le bruit du détecteur. Diviser la série d'images de canaux verts par la série d'images de canaux rouges(Processus Calculatrice d'images Image 1: G3; Opération : Diviser; Image 2: R3). La série d'images résultante (G3/R3) montre le rapport vert/rouge pour tous les pixels d'objet.
  7. Calculer le rapport moyen pour chaque image (Analysez Histogramme). Appliquer de fausses coloriage pour une meilleure représentation visuelle des ratios dans les images (Image Tables de recherche). Convertissez les ratios vert/rouge en valeurs de pH en utilisant la fonction montée en dessous de 3,6.

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Representative Results

Après 24 h et 48 h, de robustes biofilms croisés se sont développés dans les plaques de puits. C. albicans a montré des degrés variables de croissance filamentuse, et S. mutans a formé des amas denses de jusqu'à 35 m de hauteur. Les cellules et les chaînes simples de S. mutans regroupées autour d'hyphes fongiques, et de grands espaces intercellulaires indiquaient la présence d'une matrice volumineuse (Figure S1).

Calibration du colorant ratiométrique donne une courbe sigmoïdale asymétrique13,14. Le pH extracellulaire dans les biofilms a chuté rapidement dans les 5 premières minutes après l'exposition au glucose à des taux différents dans différents champs de vision microscopiques. Par la suite, l'acidification a ralenti, atteignant généralement des valeurs de 5,5 à 5,8 après 15 min (figure 1). Les biofilms répliqués ont montré un comportement similaire, avec seulement de légères variations dans le pH moyen (Figure S2).

L'exactitude des calculs de pH dépend fortement d'un choix prudent des paramètres d'image lors de l'acquisition. Pour les biofilms en question, une tranche optique de 0,8 m s'est avérée idéale pour obtenir le meilleur contraste possible entre les zones extracellulaires et le cytoplasme fongique (Figure S3). De plus, une taille de pixel de 0,28 m (Figure S4), un temps d'assistance pixel de 102,4 s (figure S5), et une moyenne de ligne de 2 (figure S6) ont fourni un bon contraste avec un temps d'acquisition d'image acceptable de 1 min. Pendant le post-traitement de l'image, toutes les cellules bactériennes et fongiques ont été retirées des images, tandis que la plupart des zones extracellulaires environnantes ont été incluses dans l'analyse subséquente du pH. Selon la luminosité des images, différents seuils supérieurs et inférieurs ont dû être choisis (Figure 2).

Les données de pH présentées dans la figure 1 et la figure S2 ont été enregistrées à 5 m à partir de l'interface biofilm-substratum. Avec l'augmentation de la distance par rapport au substrat, et selon la densité cellulaire dans les biofilms, l'intensité de fluorescence diminue, ce qui entraîne un contraste plus faible entre les cellules et la matrice. Cependant, dans les biofilms minces (35 m) cultivés dans la présente étude, le contraste au sommet du biofilm a permis une analyse d'image fiable (Figure S7A).

Figure 1
Figure 1 : Utilisation de la ratiométrie du pH dans les biofilms inter-royaumes exposés au glucose. (A) Un champ de vision d'un biofilm taché a été photographié avec une microscopie confocale et la zone couverte par les cellules bactériennes et fongiques a été enlevée avant l'analyse ratiométrique. (B) Le pH dans l'espace extracellulaire a été calculé et visualisé à l'aide d'une table de recherche (16 couleurs). Barres d'échelle de 20 m. (C) Le pH des biofilms de 24 heures a chuté rapidement lors de l'exposition au glucose à des taux légèrement différents dans différents domaines de vision. Barres d'erreur et déviation type (SD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Segmentation d'image basée sur le seuil des biofilms tachés. En raison des changements de pH locaux, l'intensité de fluorescence dans les biofilms change au fil du temps. (A) et (B) montrent le même champ de vision microscopique après 1 min et 15 min d'exposition au glucose, respectivement. Lors de la segmentation de l'image, les seuils élevés et bas doivent être choisis de manière adéquate pour éliminer toutes les zones couvertes par les cellules bactériennes et fongiques. (C) Les zones bleues ont été éliminées par le seuil bas (40), les zones rouges par le seuil élevé (115). (D) Seules les zones extracellulaires ont été reconnues comme des objets (entourés de lignes oranges). (E) Après l'élimination de la zone couverte par les cellules microbiennes, le calcul du pH pourrait être effectué dans la matrice de biofilm. Barres d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 1
Figure S1 : Biofilm typique de 24 h de cross-kingdom taché du colorant ratiométrique. Beaucoup de cellules de C. albicans ont montré la croissance filamentuse, alors que les cellules de S. mutans (jaune) ont formé des faisceaux denses ou localisées autour des hyphes fongiques comme cellules ou chaînes simples. De grands espaces intercellulaires ont indiqué la présence d'une matrice volumineuse de biofilm. Barres d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 2
Figure S2 : Le développement du pH dans les biofilms de 24 heures exposés au glucose. (A), (B), et (C) Le pH a été déterminé ratiométriquement dans trois biofilms de répétition pendant 15 min après exposition au glucose. Après une baisse rapide du pH dans les 5 premières minutes, l'acidification a ralenti, et des niveaux de 5,5 à 5,8 ont été atteints après 15 min. Des taux légèrement différents ont été observés dans différents champs de vision microscopiques (chacun représenté par une ligne). Le calibrage de la sonde ratiométrique n'a été effectué qu'une seule fois. Barres d'erreur - SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 3
Figure S3 : Impact de l'épaisseur de la tranche optique sur le contraste d'image. Des images de biofilms tachés ont été acquises avec (A) une taille de trou d'épingle de 2 unités aérées et une épaisseur de tranche optique de 1,6 m, et (B) 1 Airy Unit et une tranche optique de 0,8 m. À 1 Airy Unit, une puissance laser plus élevée / gain a été nécessaire pour l'acquisition d'image, mais le contraste entre le cytoplasme fongique et les zones extracellulaires améliorée. Barres d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 4
Figure S4 : Impact de la résolution sur le contraste d'image. Des images de biofilms tachés ont été acquises avec des tailles de pixels de (A) 1,12 m,( B) 0,56 m, (C) 0,28 m, (D) 0,14 m, et (E) 0,11 m. La réduction de la taille des pixels en dessous de 0,28 m n'a pas amélioré le contraste entre les zones extracellulaires et le cytoplasme fongique. Barres d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 5
Figure S5 : Impact de la vitesse d'analyse sur le contraste d'image. Des images de biofilms tachés ont été acquises avec des temps d'attente de pixels de (A) 12,8 euros,( B) 25,6 s, (C) 51,2 s, (D) 102 euros, et (E) 164 ' s. L'augmentation du temps de séjour de pixel au-delà de 102 's n'a pas amélioré le contraste entre les zones extracellulaires et intracellulaires. Barres d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 6
Figure S6 : Impact de la moyenne sur le contraste d'image. Les images de biofilms tachés ont été acquises avec des moyennes de ligne (moyenne) de (A) 1, (B) 2, et (C) 4. Une moyenne de ligne de 2 a fourni le meilleur compromis entre le contraste et le temps d'acquisition. Barres d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 7
Figure S7 : Contraste d'image dans les biofilms purement fongiques et les biofilms transversaux. (A) Le haut d'un biofilm croisé taché a été photographié à 30 m de l'interface. Le contraste entre les zones extracellulaires et intracellulaires était plus faible qu'à la base de biofilm mais toujours suffisant pour l'analyse de pH ratiométrique. (B) Un biofilm monospécifique De C. albicans a été photographié pour la ratiométrie de pH. La puissance/gain de laser pourrait être augmenté pour optimiser le contraste entre les parois de cellules fongiques et le cytoplasme. (C) Dans les biofilms de cross-kingdom, les bactéries brillamment fluorescentes ont empêché davantage d'augmentation de la puissance/gain de laser. Par conséquent, le contraste entre les parois cellulaires fongiques et le cytoplasme est moins prononcé que dans les biofilms purement fongiques. Barres d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Différents protocoles pour la culture de biofilms inter-royaume impliquant C. albicans et Streptococcus spp. ont été décrits précédemment9,22,23,24,25. Cependant, la configuration actuelle se concentre sur des conditions de croissance simples, un calendrier compatible avec les journées de travail régulières, une composition équilibrée des espèces, et le développement d'une matrice de biofilms volumineux. En outre, des plaques de 96 puits ont été enduites de solution salivaire pour imiter des conditions orales d'adhérence dans une certaine mesure.

L'utilisation de la ratiométrie pH avec C-SNARF-4 est une méthode peu coûteuse pour les mesures rapides du pH biofilm, dont les avantages et les inconvénients ont été discutés en détail ailleurs12,26. En bref, la technique permet l'évaluation du pH à différents endroits à l'intérieur des biofilms et donc la surveillance des gradients de pH horizontaux et des développements de pH au fil du temps27. Des profils de pH verticaux peuvent également être enregistrés, mais la profondeur de pénétration est limitée par l'utilisation de la microscopie confocale. Par conséquent, la ratiométrie de pH représente une alternative plus rapide, plus polyvalente et moins invasive aux microélectrodes de pH, qui sont actuellement la méthode de choix pour le profilage Z des biofilms épais28. Comparé à d'autres méthodes basées sur la microscopie pour les enregistrements de pH dans les biofilms, la ratiométrie de pH avec C-SNARF-4 a l'avantage d'utiliser seulement une tache. Par conséquent, plusieurs problèmes qui peuvent résulter du comportement fluorescent différentiel et de l'interaction entre les différents colorants sont contournés26.

Dans les biofilms inter-royaumes, la différenciation fondée sur des seuils entre la biomasse microbienne et les zones extracellulaires pose certains problèmes par rapport aux biofilms qui ne comprennent que des cellules bactériennes ou fongiques. Les cellules bactériennes intériorisent le colorant ratiométrique et affichent un signal fluorescent lumineux par rapport à la matrice de biofilm, mais aussi par rapport aux parois de cellules fongiques. Les parois cellulaires fongiques semblent un peu plus brillantes que la matrice de biofilm, qui à son tour montre une fluorescence plus élevée que le cytoplasme fongique. Dans les biofilms qui ne se composent que de cellules fongiques, les images peuvent être acquises avec une puissance laser élevée / gain, ce qui entraîne un contraste suffisant entre la matrice de biofilm et le cytoplasme fongique (Figure S7B). Lorsque des bactéries sont présentes, la puissance/gain laser doit être réduit pour éviter la surexposition des cellules bactériennes (Figure S7C). Par conséquent, le contraste entre le cytoplasme fongique et les zones extracellulaires n'est pas aussi prononcé, et les paramètres d'image tels que la taille du sténopé, la taille des pixels et le temps pixel-dwell doivent être choisis avec un grand soin pour l'analyse ratiométrique.

Comme pour toutes les techniques basées sur la microscopie, la qualité de l'image et le temps d'acquisition sont inversement corrélés. Dans les biofilms transversaux actuels, un temps d'imagerie de 30 s, idéalement 1 min, était nécessaire pour obtenir une qualité appropriée pour l'analyse ultérieure du pH. En comparaison, les biofilms qui abritent uniquement des bactéries peuvent être photographiés avec une qualité suffisante en 10 s ou moins29. Pour les analyses de microscopie de la croissance, de la structure ou de la composition des biofilms, les temps d'acquisition de 1 min ne posent pas de problème et, dans de nombreux cas, cela peut également s'appliquer aux enregistrements de pH. Cependant, les changements extrêmes de pH, tels que l'acidification rapide observée immédiatement après l'exposition au glucose (pH 'gt; 1 unité/min), sont difficiles à surveiller dans les biofilms de cross-kingdom.

Le présent travail démontre que les enregistrements de pH ratiométriques avec C-SNARF-4 sont réalisables dans les biofilms inter-royaume composés de S. mutans et C. albicans. Les études futures pourraient utiliser la méthode pour analyser les changements de pH dans les biofilms inter-royaumes présentant une plus grande diversité d'espèces, en particulier dans les biofilms cultivés in situ (c.-à-d. chez les enfants atteints de caries de la petite enfance)30. Dans cette étude, le pH dans les biofilms a été surveillé dans des conditions statiques et pour un temps d'observation limité de 15 min, juste après une impulsion de glucose. D'autres progrès peuvent inclure l'application d'un flux de fluide pour imiter les conditions in situ plus étroitement14,31,32. En outre, la ratiométrie de pH peut être employée pour étudier l'impact de diverses conditions nutritionnelles sur des changements à long terme de pH dans les biofilms de cross-kingdom et contribuer à élucider l'effet du pH de biofilm sur les tissus hôtes sous-jacents. Encore une fois, la déminéralisation de l'émail dentaire dans les caries de la petite enfance peut servir d'exemple proéminent.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Anette Aakjor Thomsen et Javier E. Garcia sont reconnus pour leur excellent soutien technique. Les auteurs remercient Rubens Spin-Neto pour les discussions fructueuses sur l'analyse d'images.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

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References

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