Co-Culture assays med høj gennemstrømning til undersøgelse af mikrobielle interaktioner

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den Co-kultur interaktion assays præsenteret i denne protokol er billig, høj gennemløb, og enkel. Disse analyser kan bruges til at observere mikrobielle interaktioner i co-kultur, identificere interaktionsmønstre og karakterisere det hæmmende potentiale af en mikrobiel stamme af interesse mod menneskelige og miljømæssige patogener.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Temkin, M. I., Carlson, C. M., Stubbendieck, A. L., Currie, C. R., Stubbendieck, R. M. High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions. J. Vis. Exp. (152), e60275, doi:10.3791/60275 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studiet af interaktioner mellem mikroorganismer har ført til talrige opdagelser, fra nye antimikrobielle stoffer til indsigt i mikrobiel økologi. Mange tilgange, der anvendes til studiet af mikrobielle interaktioner kræver specialiseret udstyr og er dyre og tidskrævende. Dette papir præsenterer en protokol for Co-Culture interaktion assays, der er billige, skalerbare til store prøve numre, og let tilpasses til talrige eksperimentelle designs. Mikroorganismer dyrkes sammen, med hver brønd repræsenterer en parvis kombination af mikroorganismer. En test organisme dyrkes på den ene side af hver brønd og først inkuberet i monokultur. Efterfølgende inokuleres målorganismer samtidigt på den modsatte side af hver brønd ved hjælp af et 3D-trykt inokulations stempel. Efter Co-kulturen, er de afsluttede assays scoret for visuelle fænotyper, såsom vækst eller hæmning. Disse assays kan bruges til at bekræfte fænotyper eller identificere mønstre blandt isolater af interesse. Ved hjælp af denne enkle og effektive metode, kan brugerne analysere kombinationer af mikroorganismer hurtigt og effektivt. Denne samkultur tilgang gælder for antibiotika opdagelse samt kultur baseret mikrobiom forskning og er allerede blevet anvendt med succes på begge applikationer.

Introduction

I naturen, mikroorganismer sjældent eksisterer i isolation; Derfor er de konstant interagerer med andre organismer. Derfor, at studere, hvordan mikroorganismer interagerer med hinanden er afgørende for at forstå en lang række mikrobielle adfærd1. Mikrobielle interaktioner kan være gensidige, commensal, eller antagonistisk. Disse i og kan påvirke ikke kun mikroorganismerne selv, men også de miljøer og værter, at mikroorganismerne kolonisere1,2.

Mange videnskabsfolk studerer mikrobielle interaktioner for at identificere nye antimikrobielle molekyler. En af de første klinisk vigtige antimikrobielle molekyler blev fundet gennem studiet af mikrobielle interaktioner. Sir Alexander Fleming observeret en kontaminerende Penicillium spp. isolat inhiberet væksten af en Staphylococcus stamme, hvilket førte til opdagelsen af den almindeligt anvendte antibiotika penicillin3. Karakterisering af de mekanismer, som mikroorganismer bruger til at antagonisere deres konkurrenter, er fortsat en frugtbar ressource til opdagelsen af antimikrobielle molekyler. For eksempel, det blev for nylig vist, at Streptomyces Sp. stamme Mg1 producerer antibiotika linearmycins, som har en lytisk og nedbryativ aktivitet mod Bacillus subtilis4.

Yderligere, en ikke-ribosomalt syntetiseret peptid ved navnet lugdunin blev for nylig opdaget efter observation, at nasal kommensal Staphylococcus Lugdunensis hæmmer Staphylococcus aureus5. Undersøgelser har også vist, at gensidige interaktioner mellem mikroorganismer er lige så kraftige som antagonistiske interaktioner for opdagelsen af antimikrobielle molekyler. For eksempel, mange svampe-landbrug myrer i stammen attini Harbor symbiotiske bakterier kaldet pseudonocardia på deres Exoskelet, der producerer svampedræbende molekyler til at hæmme en forpligte patogen af deres svampe afgrøde6. Da studiet af mikrobielle interaktioner har været gavnlig for at opdage antimikrobielle molekyler, kan brugen af højgennemløbs skærme resultere i opdagelsen af nye antimikrobielle molekyler.

Med hensyn til omkostninger og lethed af ydeevne, de metoder, der anvendes til at studere mikrobielle interaktioner spænder fra simple til komplekse. For eksempel er en agar stik analyse en billig og enkel metode, der kan bruges til at undersøge antagonisme mellem flere mikroorganismer7. En agar stik analyse er imidlertid ikke en effektiv procedure og kan være arbejdskraftintensiv for mange parvis kombinationer. For at vurdere virkningerne af mikrobielt producerede produkter på målisolater af interesse i et højt gennemløb, bruger mange laboratorier disk diffusion-assays8. Disse assays er nemme og billige og kan skaleres til et større antal prøver7. Denne analyse kræver imidlertid dannelse af mikrobielle ekstrakter og kan give vildledende resultater for visse kombinationer af målorganismer og antibiotika, såsom salmonella og cephalosporiner9.

De foregående tilgange er afhængige af isolerede komponenter for at fremkalde et respons i en målorganisme i stedet for at tillade mikroorganismer at interagere med hinanden. Dette er af note, fordi interaktioner mellem mikrober kan fremkalde produktionen af "kryptiske" antimikrobielle molekyler, der ikke produceres i monokultur. For eksempel, det blev for nylig vist, at den antimikrobielle keyicin er kun produceret af en Micromonospora Sp. Når Co-kultiveret med en Rhodococcus Sp., der er isoleret fra den samme svamp mikrobiome10. Mere komplekse interaktions metoder omgå denne potentielle monokultur hindring. For eksempel er iChip nyttigt til isolering af sjældne og vanskelige at dyrke bakterier fra miljøprøver og giver mulighed for observation af mikrobielle interaktioner gennem vækst in situ11. For at undersøge interaktioner i detaljer, matrix assisteret Laser Desorption/ionisering tid-of-Flight Imaging massespektrometri (MALDI-TOF-IMS) kan anvendes. Denne fremgangsmåde giver detaljerede oplysninger om sammensætningen og fordelingen af små molekyler og peptider produceret ved at interagere mikrobielle kolonier med høj rumlig opløsning. MALDI-TOF-IMS har også været anvendt i flere undersøgelser af bakterielle interaktioner til at karakterisere mekanismerne i konkurrencen12,13,14,15. Men, MALDI-TOF-IMS kræver ofte omstændelig prøveforberedelse, specialiseret ekspertise til at betjene udstyret, og dyre og specialiserede massespektrometre. Af disse grunde, det er en vanskelig teknik til at bruge til high gennemløb undersøgelser. Således, en enkel, skalerbar, og høj gennemstrømning Co-kultur assay for mikrobielle interaktioner, der overvinder mange begrænsninger af de ovennævnte tilgange ville være gavnlig.

Her præsenteres en protokol for mikrobiel Co-kultur med høj gennemløb. Denne analyse er enkel og let indarbejdet i allerede eksisterende undersøgelser af mikrobielle interaktioner. I modsætning til mange almindeligt anvendte metoder til studiet af mikrobielle interaktioner, vores metode er enkel, billig, og er modtagelig for at undersøge et stort antal interaktioner. Disse assays er ikke kun nemme at udføre, men materialerne er bredt tilgængelige fra de fleste laboratorie leverandører eller offentlige ressourcer (f. eks. biblioteker og make Spaces). Derfor er denne analyse er fordelagtig som en første linje i undersøgelsen for at identificere og analysere interessante mønstre blandt mange parvis kombinationer af mikroorganismer, som kan være særligt nyttig til undersøgelse af mikrobiel økologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informeret samtykke blev indhentet fra donorens forældre, og Udvalget for menneskelige ved University of Wisconsin-Madison godkendte undersøgelsen (institutionel undersøgelses tavle [IRB]-godkendelsesnummer H-2013-1044).

1. prøve kultur

Bemærk: Denne procedure anvendes her til undersøgelse af interaktioner mellem bakterier isolater fra den menneskelige næsehulen. I princippet gælder følgende metoder for enhver dyrknings tilstand. Hjerne-hjerte-infusion bouillon (BHI) anvendes til generel formering af nasale bakterier. Alle plader er solidificeret ved hjælp af 1,5% agar. Til denne undersøgelse udtages prøver fra saltopløsning, der skylles ind i en donors næse (næse skylning), overføres til mikrocentrifuge glas og fryses ved-80 °C.

  1. Brug standard dyrkningsteknikker til at plade 100 μl af hver af de optøede skylning prøver på BHI-plader.
  2. Pladerne inkubates aerobisk ved 37 °C i 1 uge.
  3. Efter inkubation vælges ≥ 2 kolonier af hver distinkt morfotype pr. plade og passage isolaterne aerobisk på BHI plader ved at striber en koloni fra den oprindelige plade på en ny BHI plade og inkuberet pladen ved 37 °c. Gentag, indtil de bakterielle kulturer er rene.
    Bemærk: Bakterielle isolater kan identificeres gennem koloni morfologi, Gram-farvning, 16S rRNA-gensekvensering eller en anden metode. Det er dog ikke nødvendigt at kende isolens identitet for at fortsætte protokollen.
  4. Cryopreserve alle bakterielle isolater ved-80 °C efter kombination af 1 mL 50% glycerol med 1 mL bakteriel natkultur (se punkt 3) i kryorør.

2.3D-tryk stempler

Bemærk: Polycarbonat blev valgt som stempel materiale på grund af dets høje glasovergangstemperatur (147 °C), der overstiger standard autoklave temperaturer (121 °C), hvilket minimerer potentialet for deformation efter gentagne anvendelser.

  1. Læg 3D-printeren i med polycarbonatfilament.
  2. Påfør hvid skole lim (polyvinylacetat) til print sengen for at støtte i vedhæftningen og minimere vridning af inokulations stemplet under udskrivningen.
  3. Indlæs. STL-modelfil (supplerende datafil) til inokulerings stemplet (figur 1) i 3D-printersoftwaren.
  4. Udskriv inokulations stemplet ved en 290 °C dysetemperatur, 60 °C senge temperatur og laghøjde på 0,38 mm.
  5. Wrap stemplet i aluminiumsfolie og sterilisere ved autoklave til 1,5 h på en tyngdekraft cyklus med 15 min tørring.
    Bemærk: Selvom polycarbonat er hygroskopisk, bevarer frimærkerne kun ca. 0,5% vand vægt efter autoclaving.

3. forberedelse af overnight kulturer

  1. Ved hjælp af en serologisk pipette afpipetteres 3 mL steril BHI bouillon i 14 mL kulturrør.
  2. Ved hjælp af en steril 1 μL inokulerende løkke, inokulere en bakteriel koloni i bouillon. Drej løkken for at sikre, at klump spredes ind i bouillon. Vortex kultur rørene kort før inkubation.
  3. Inkubér kultur rørene ved 37 °C natten over (~ 16 timer) på en shaker ved 250 rpm.
  4. Vortex til at nedbryde klumper af celler, når de bakterielle kulturer nå tilstrækkelig turbiditet (OD600 ≥ 1).

4. klargøring af bioassay plader

Bemærk: Bioassay plader er fremstillet i en laminar flow hætte til at opretholde sterilitet.

  1. Forbered BHI-medier med 1,5% agar og Steriliser ved autoklave i henhold til producentens anvisninger.
  2. Efter autoklaveringen afkøles BHI-mediet til 55 °C i et temperaturkontrolleret vandbad.
  3. Ved hjælp af en serologisk pipette afpipetteres 3 mL smeltede BHI-medier i hver af de 12 brønde på en 12-brønd plade. Sørg for, at brøndene er så nøjagtige og endda som muligt. En liter medier vil give ~ 27 bioassay plader.
  4. Lad agar sætte natten over.

5. inokulerende bioassay plader med test organismen

Bemærk: En testorganisme refererer til den organisme, for hvilken produktionen af inhiberende aktivitet (f. eks. antibiotika produktion) bestemmes ved hjælp af samkulturinteraktions analysen. Til dette eksperiment er testorganismerne Aktinobakterier isoleret fra prøver af nasale lavager.

  1. Testorganismen påsættes på en bioassay-plade ved at indsætte en steril 10 μl inokulerende løkke i overnight kulturen og striber en kultur dråbe over den venstre tredjedel af en plade brønd.
    Bemærk: Det anbefales at kun streak en tredjedel af brønden, som overvækst af brønden forbyder senere inokulering af målorganismer.
  2. Gentag, indtil alle 12 brønde på pladen er blevet inokuleret med testorganismen.
  3. Inkubatér pladerne på hovedet ved den passende temperatur i 7 dage. Ved højere temperaturer (≥ 37 °C) eller i tørre klimaer opbevares pladerne i en fugtig beholder for at forhindre, at pladerne tørrer ud.

6. forberedelse af målorganismer

Bemærk: En målorganisme refererer til den organisme, hvis hæmnings status bestemmes ved hjælp af co-Culture-interaktions analysen. Til dette eksperiment, målorganismerne er Staphylococcus spp. isoleret fra nasal lavages prøver.

  1. Efter inkuberingen af bioassay pladerne i 6 dage, Forbered natten kulturer af de specificerede målorganismer, som gjort ovenfor (se punkt 3).

7. målorganismen inokulation

Bemærk: Efter natten inkubation, sikre, at kulturerne er uklar (OD600 ≥ 1). Nogle bakterielle kulturer kan flokkulere i bunden af kulturen røret. Vortex kultur rørene til at sprede klumper og vurdere kulturen turbiditet.

  1. Forbered målpladen ved at fylde hver brønd med en tom 12-brønd plade med 1,8 mL BHI og 200 μL af målet overnight kultur.
  2. Pak og Placer et sterilt inokulationsstempel i målpladen. Forsigtigt hvirvle kulturerne rundt i brøndene, sørge for at sikre, at kulturerne ikke krydser kontaminerer tilstødende brønde.
  3. Løft inokulations stemplet, og sørg for, at der er en dråbe fortyndet målkultur på hvert stempel spids.
  4. Forbered en monokultur kontrol plade ved at placere inokulations stemplet på en ikke-inokuleret bioassay plade og forsigtigt klippe stemplet, således at en kultur dråbe inocyter hver brønd. Når inokulations stemplet er fjernet, bør en dråbe af kultur være synlig i brøndene af bioassay pladen.
    1. Hvis nogen brønde ikke er inokuleret med inokulations stempel på grund af ujævne niveauer af medier, spot 3 μL fortyndet overnight kultur på højre side af brøndene ved hjælp af en pipette.
  5. Bioassay pladerne inokuleres som ovenfor (Se trin 7.4.1), men Juster stemplet, så spidserne flugter med højre side af 12-brønd pladen. Sørg for, at stemplet ikke kommer i kontakt med den eksisterende bakterie koloni, når brøndene inokulerer.
  6. Fjern forsigtigt stemplet og Placer det tilbage i målpladen.
  7. Gentag inokulationen for hver bioassay plade, indtil alle pladerne er inokuleret.
  8. Inubat bioassay plader på hovedet ved den passende temperatur i 7 dage.

8. scoring

  1. Efter Co-culturing test og målorganismer i 1 uge, score interaktioner baseret på følgende visuelle vurdering:
    1. Score brøndene med målorganisme vækst, der udviser vækst, der er umulig at skelne fra monokultur kontrol som "0" (ingen hæmning) (figur 2A, B).
    2. Score brøndene med målorganisme, der udviser formindsket vækst sammenlignet med kontrol som "1" (svag hæmning) (figur 2C).
    3. Score brøndene, hvor målorganismen ikke voksede som "2" (stærk hæmning) (figur 2D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Co-Culture interaktions assays kan bruges til at forstå mikrobielle interaktioner, identificere interesse mønstre og afdække mikrobielle isolater med spændende aktiviteter. I disse assays, en test organisme er monokulturer på den ene side af en 12 brønd agar plade og inkuberet i 7 dage. Derefter ses en målorganisme ved siden af testorganismen, og de to mikrober blev co-dyrket i 7 dage, før de scorede for målorganismens vækst fænotype. Assays er scoret baseret på en visuel analyse af vækst eller hæmning af målorganismen.

Disse Co-Culture assays blev for nylig brugt til at vurdere den hæmmende aktivitet af Actinobakterier (test organismer) mod Staphylococcus SPP. (målorganismer) isoleret fra den menneskelige næsehulen (figur 2)16. Co-Culture-assays blev brugt til at identificere specifikke hæmnings mønstre mellem Actinobakterier (n = 21) og Staphylococcus isolater (n = 39) og viste, at Actinobakterier isolater viste variation i deres evne til at hæmme koagulase-negative stafylokokker (ulemper). I alt 812 parvise kombinationer blev testet. Især Corynebacterium propinquum stærkt hæmmet ulemper (figur 2D), især i forhold til andre Corynebacterium , der svagt hæmmede ulemper (figur 2C) eller havde ingen effekt på ulemper ( Figur 2B), og sammenlignet med monokultur kontrol (figur 2A)16.

Ved hjælp af Komparativ genomforskning blev der identificeret en biosyntetisk genklynge til siderophore produktion i C. propinquum genomer, som ikke fandtes i genomer af andre isolater af Corynebacterium 16. Siderophorer er chelatorer fremstillet af mikroorganismer til at skylle jern fra miljøet17. Siderophore produktion af C. propinquum blev bekræftet, og siderophore blev identificeret som dehydroxynocardamin16. Dette resultat førte til hypotesen om, at hæmning af ulemper skyldtes siderophore-medieret jern nedbrydning. Efterfølgende, ved at udføre Co-Culture interaktion assays mellem C. propinquum og ulemper på både standard og jern-suppleret BHI medium, det blev fastslået, at inhibering fænotype var jern-afhængige (figur 2E). Tilsammen viste disse resultater, at siderophore-medieret jern nedbrydning var ansvarlig for den kraftige hæmning af ulemper ved C. propinquum16.

Figure 1
Figur 1: fotografi af bioassay-inokulationsstemplet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Co-Culture interaktion assays afdække siderophore-medieret hæmning af ulemper ved Corynebacterium propinquum. A) monokulturer af ulemper (målorganisme), der er inokuleret på en BHI-bioassay-plade. (B, C, D) Co-kulturer mellem forskellige stammer af Corynebacterium spp. (test organismer, venstre) og den samme stamme af ulemper (målorganismen, højre) inokuleret på BHI bioassay plader. Hvert panel er et repræsentativt billede, der viser interaktioner med (B) ingen hæmning (score = 0), (C) svag hæmning (score = 1), eller (D) stærk hæmning (score = 2). E) sammenligning af interaktioner mellem Corynebacterium pseudodiphtheriticum (siderophore non-producer) eller Corynebacterium propinquum (siderophore producer) med samme stamme af ulemper på BHI Media (BHI) og BHI Media suppleret med 200 μM FeCl3 (BHI + jern). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende datafil. Venligst klik her for at downloade denne fil. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Antibiotika og andre sekundære metabolitter, at mægle mikrobielle interaktioner er nyttige for en lang række applikationer, herunder Drug Discovery. Heri præsenteres en protokol for Co-Culture assays til vurdering af et stort antal mikrobielle interaktioner. Disse Co-Culture interaktion assays er en enkel, overkommelig, skalerbar, og høj gennemløb midler til at undersøge mange parvis kombinationer af mikroorganismer i tandem. Målorganismer ses ved siden af testorganismer i en brønd på en 12-brønd plade ved hjælp af et inokulerings stempel, og hæmning af målorganismerne bedømmes på grundlag af visuel inspektion af målorganismens fænotype. Størstedelen af de materialer, der anvendes i disse analyser, er let tilgængelige gennem de fleste laboratorie leverandører eller gennem offentlige ressourcer. Derfor kan assays nemt skræddersys til mange laboratoriemiljøer. I laboratoriet, disse Co-kultur assays har været en succes i at undersøge samspillet mellem mikroorganismer forbundet med mange værter fra en række forskellige miljøer.

Mens der er mange fordele ved denne teknik, der er også et par begrænsninger. Den første bemærkelsesværdige begrænsning er, at mønstre fra Co-kultur assays er vanskelige at fortolke uden andre metadata. I to nylige papirer, der beskæftigede disse Co-kultur assays16,18, hæmnings mønstre af interesse blev kun identificeret i forbindelse med andre metadata, såsom den taksonomiske identitet af testorganismer. Ikke desto mindre, selv uden ledsagende metadata, de metoder, der er skitseret i dette papir er modtagelig for at identificere bakterielle isolater med hæmmende aktivitet mod specifikke patogener eller Target mikrober af interesse.

En yderligere begrænsning er, at disse assays ikke er kommercielt tilgængelige, og bioassay pladerne skal være håndlavede, hvilket kan begrænse analysens effektivitet. Plade præparat er afgørende for eksperimentet, og der skal udvises forsigtighed under klargøring af pladerne. Hvis brøndene er ujævne, kan inokulations stemplet muligvis ikke inokulere alle brønde. Men, savnede brønde kan simpelthen inokuleres ved direkte pipettering målorganismen kultur på højre side af hver uninoculeret godt. Faktisk, selv om et par brønde på hver plade er savnet af stemplet, proceduren er stadig mere effektiv end direkte pipettering målorganismen i hver enkelt brønd. Alternativt kan brugerne forgå inokulering stempel og pipettere målorganismen i hver brønd, men denne proces er mere tidskrævende, især i forhold til stempling 12 brønde samtidigt.

Endelig kan testorganismen indtage de tilgængelige næringsstoffer i brønden under monokultur, før målorganismen er vaccineret. Selv om næringsstof udtømning kan påvirke de observerede hæmning mønstre, det synes at være ualmindeligt blandt de parvis kombinationer, der er blevet testet hidtil. Især udtømning af jern i brøndene ved C. propinquum tilladt for opdagelsen af siderophore-medieret konkurrence fra medlemmer af den menneskelige nasal mikrobiota16.

Disse Co-Culture interaktion assays kan tilpasses ved at ændre mediernes sammensætning, timing, eller endda herunder flere organismer eller mikrobielle konsortier som test organismen. Desuden kan forskellige scorings systemer anvendes afhængigt af det ønskede detaljeringsniveau, der kræves for at beskrive interaktions Fænotypen. Eksempler scorings skalaer omfatter dem fra 0-2 bruges til at beskrive konkurrencemæssige interaktioner mellem bakterier isoleret fra den menneskelige næsehulen16 (figur 2) og fra 0-3 anvendes til at vurdere den antimikrobielle potentiale af Streptomyces isoleret fra insektmikrobiomer18. Men med mere nuancerede skalaer bliver det stadig vanskeligere at score. Således, hæmning er lettest genkendes ved hjælp af en binær scoring system (f. eks 0 er defineret som ingen hæmning og 1 som hæmning), som kan eliminere enhver forvirring og standardisere scoring på tværs af flere individer. Udover at score for hæmning af fænotyper, kan disse analyser desuden også bedømmes for andre fænotyper, herunder pigment produktion, sporulation eller enhver anden fænotype, der kan vurderes visuelt. Da disse assays er meget skalerbare med analyse baseret på visuel inspektion af målorganismen, kan der genereres Trænings sæt til maskinel lærings algoritmer for at lette fænotype scoring og yderligere øge analyse hastigheden.

En stor styrke af disse Co-kultur assays er deres evne til at lette screening mange kombinationer af parvise interaktioner billigt og hurtigt at afdække aktiviteter eller hæmning mønstre af interesse. Efterfølgende kan der anvendes mere komplekse og intensive metoder (dvs. genomkarakterisering, MALDI-TOF-IMS eller naturlig produkt isolation og-karakterisering) til dybere karakterisering af mikrober og interaktioner af interesse, som identificeres af Co-Culture assays. Som et nyligt eksempel, disse Co-kultur hæmning assays blev brugt til at vise, at insekt-afledte Streptomyces kan hæmme gram-negative bakterier og svampe bedre end deres jord-afledte modparter. Hæmning assays tilladt for hurtig og effektiv visualisering af inhibering mønstre blandt 2.003 Streptomyces isolater og førte til opdagelsen af en ny svampedræbende kaldet cyphomycin, som er aktiv mod lægemiddelresistente svampe patogener 18. disse Co-Culture interaktion assays er således et effektivt værktøj til mikrobiom forskning, antimikrobiel opdagelse, og få dybere indsigt i mønstre af mikrobielle interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Daniel May, Marc Chevrette, og Don Hoang for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde, herunder indsatsen fra Cameron R. Currie, blev støttet af University of Wisconsin-Madison, kontor for vice kansler for forskning og graduate uddannelse med finansiering fra Wisconsin Alumni Research Foundation, finansiering også ydet af Nationale institutter for sundhedscentre for Excellence for Translationel forskning (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck blev støttet af et nationalt bibliotek for medicin uddannelse tilskud til beregning og informatik i biologi og medicin Trænings program (NLM 5T15LM007359). De finansieringskilder havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling, og fortolkning, eller beslutningen om at indsende arbejdet til offentliggørelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue VWR 12000-806
10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow VWR 12000-810
12-well cell culture plate, sterile with lid Greiner bio-one 665 180
14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile Falcon 352057
2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile USA scientific 1420-9710
25 mL serological pipet Cell Treat 229225B
Agar, bacteriological VWR J637
Brain Heart Infusion Broth Dot Scientific DSB11000-5000
Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter Keene Village Plastics 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
School Glue Elmer's EPIE304
Taz 6 3D printer Lulzbot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7, (August), 1234 (2016).
  2. Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21, (9), 501-507 (2006).
  3. Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10, (3), 226 (1929).
  4. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11, (12), e1005722 (2015).
  5. Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535, (7613), 511-516 (2016).
  6. Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398, (6729), 701-704 (1999).
  7. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6, (2), 71-79 (2016).
  8. Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38, (1), 61-65 (1944).
  9. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).
  10. Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12, (12), 3093-3102 (2017).
  11. Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76, (8), 2445-2450 (2010).
  12. Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157, (Pt 9), 2485-2492 (2011).
  13. Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (32), 13082-13087 (2012).
  14. Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. 349-396 (2014).
  15. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5, (12), 885-887 (2009).
  16. Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85, (10), 1-17 (2019).
  17. Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30, (4), 691-696 (2002).
  18. Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10, (1), 516 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics