Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Temkin, M. I., Carlson, C. M., Stubbendieck, A. L., Currie, C. R., Stubbendieck, R. M. High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions. J. Vis. Exp. (152), e60275, doi:10.3791/60275 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroorganizmalar arasındaki etkileşimlerin incelenmesi, yeni antimikrobiyallerden mikrobiyal ekolojideki içgörülere kadar çok sayıda keşfe yol açmıştır. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesinde kullanılan birçok yaklaşım özel ekipman gerektirir ve pahalı ve zaman yoğundur. Bu makale, ucuz, büyük örnek sayılara ölçeklenebilir ve çok sayıda deneysel tasarımlara kolayca uyarlanabilen ortak kültür etkileşim idermeleri için bir protokol sunar. Mikroorganizmalar birlikte kültürlenir, her biri mikroorganizmaların bir çift taraflı kombinasyonunu temsil eder. Bir test organizması her kuyunun bir tarafında kültürlenir ve ilk olarak monokültürde kuluçkaya yatırılır. Daha sonra, hedef organizmalar aynı anda her kuyunun karşı tarafına 3D baskılı aşı damgası kullanılarak aşılanır. Ortak kültürden sonra, tamamlanan tahliller büyüme veya inhibisyon gibi görsel fenotipler için puanlandırılır. Bu tahliller fenotipleri onaylamak veya ilgi izole arasında desenleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu basit ve etkili yöntemi kullanarak, kullanıcılar mikroorganizmaların kombinasyonlarını hızlı ve verimli bir şekilde analiz edebilirler. Bu ortak kültür yaklaşımı antibiyotik keşfi nin yanı sıra kültür tabanlı mikrobiyom araştırmaları için de geçerlidir ve her iki uygulamaya da başarıyla uygulanmıştır.

Introduction

Doğada, mikroorganizmalar nadiren izole olarak bulunurlar; sonuç olarak, sürekli diğer organizmalar ile etkileşim vardır. Bu nedenle, mikroorganizmaların birbirleriyle nasıl etkileştiğini incelemek çok sayıda mikrobiyal davranışı anlamak için gereklidir1. Mikrobiyal etkileşimler karşılıklı, commensal veya antagonistik olabilir. Bu teractions sadece mikroorganizmaların kendilerini etkileyebilir ama aynı zamanda ortamlar ve barındıran mikroorganizmalar1,2kolonize .

Birçok bilim adamı yeni antimikrobiyal molekülleri tanımlamak için mikrobiyal etkileşimleri çalışma. Klinik olarak önemli ilk antimikrobiyal moleküllerden biri mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi ile bulunmuştur. Sir Alexander Fleming bir kontamine Penisilyum spp gözlenen bir Staphylococcus suşu büyümesini inhibe izole, hangi yaygın olarak kullanılan antibiyotik penisilin keşfine yol açtı3. Mikroorganizmaların rakiplerini kızdırmak için kullandıkları mekanizmaların karakterizasyonu antimikrobiyal moleküllerin keşfi için verimli bir kaynak olmaya devam etmektedir. Örneğin, son zamanlarda Streptomyces sp. suş Mg1 antibiyotik linearmycins üretir gösterilmiştir, Hangi Bacillus subtiliskarşı bir litik ve bozsal aktiviteye sahip4.

Ayrıca, non-ribozomally sentezlenmiş peptid lugdunin adlı son zamanlarda burun kommensal Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus aureusinhibe gözlem sonra keşfedildi5. Çalışmalar ayrıca mikroorganizmalar arasındaki karşılıklı etkileşimlerin antimikrobiyal moleküllerin keşfi için antagonistik etkileşimler kadar güçlü olduğunu göstermiştir. Örneğin, kabile Attini birçok mantar tarım karıncalar kendi mantar ürün zorunlu bir patojen inhibe etmek için antifungal molekülleri üreten dış iskelet üzerinde Pseudonocardia denilen simbiyotik bakteriler liman6. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi antimikrobiyal moleküllerin keşfi için yararlı olmuştur, yüksek iş elde ekranlarının kullanımı yeni antimikrobiyal moleküllerin keşfi ne neden olabilir.

Maliyet ve performans kolaylığı ile ilgili olarak, mikrobiyal etkileşimleri incelemek için kullanılan metodolojiler basitten komplekse kadar değişmektedir. Örneğin, bir agar fiş tsay birden fazla mikroorganizmalar arasında antagonizm araştırmak için kullanılabilecek ucuz ve basit bir yöntemdir7. Ancak, bir agar fiş teşp verimli bir prosedür değildir ve birçok çift yönlü kombinasyonları için emek yoğun olabilir. Mikrobiyal olarak üretilen ürünlerin yüksek iş akışı açısından hedef izolasyonlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için birçok laboratuvar 8diskdifüzyon tahlilleri kullanmalıdır. Bu tahliller kolay ve ucuzdur ve7. Ancak, bu tahnı mikrobiyal özlerin nesil gerektirir ve hedef organizmalar ve antibiyotiklerin belirli kombinasyonları için yanıltıcı sonuçlar üretebilir, Salmonella ve sefalosporinler gibi9.

Önceki yaklaşımlar, mikroorganizmaların birbirleriyle etkileşime girmesine izin vermek yerine, hedef organizmada bir tepki ortaya çıkarmak için izole bileşenlere dayanır. Mikroplar arasındaki etkileşimler monokültürde üretilmeyen "şifreli" antimikrobiyal moleküllerin üretimini ortaya çıkarmak olabilir, çünkü bu dikkat budur. Örneğin, son zamanlarda antimikrobiyal keyicin sadece bir Micromonospora sp tarafından üretilen gösterilmiştir. eş-aynı sünger mikrobiyom izole edilir bir Rhodococcus sp. ile kültürlü10. Daha karmaşık etkileşim metodolojileri bu potansiyel monokültür engelini aşar. Örneğin, iChip nadir ve zor çevresel örneklerden bakteri yetiştirmek için izole etmek için yararlıdır ve yerinde büyüme yoluyla mikrobiyal etkileşimlerin gözlem sağlar11. Etkileşimleri ayrıntılı olarak araştırmak için matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon zaman-of-flight görüntüleme kütle spektrometresi (MALDI-TOF-IMS) kullanılabilir. Bu yaklaşım, mikrobiyal kolonilerin yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip etkileşiminde bulunan küçük molekül ve peptidlerin bileşimi ve dağılımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. MALDI-TOF-IMS de rekabet mekanizmaları karakterize etmek için bakteriyel etkileşimleri birden fazla çalışmada kullanılmıştır12,13,14,15. Ancak, MALDI-TOF-IMS genellikle zahmetli numune hazırlama, ekipman çalıştırmak için özel uzmanlık ve pahalı ve özel kütle spektrometregerektirir. Bu nedenlerden dolayı, yüksek iş artışı çalışmaları için kullanımı zor bir tekniktir. Böylece, yukarıdaki yaklaşımların birçok sınırlamasını aşan mikrobiyal etkileşimler için basit, ölçeklenebilir ve yüksek iş ortağı ortak kültür tayini yararlı olacaktır.

Burada, yüksek iş artışı mikrobiyal co-kültür için bir protokol sunulmaktadır. Bu tetki basit ve kolayca mikrobiyal etkileşimler önceden varolan çalışmalara dahil edilmiştir. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan birçok yöntemin aksine, yöntemimiz basit, ucuz ve çok sayıda etkileşimin araştırılmasıiçin uygundur. Bu tahlilleri gerçekleştirmek sadece kolay değil, aynı zamanda malzemelerin çoğu laboratuvar tedarikçisi veya kamu kaynaklarından (örn. kütüphaneler ve makerspaces) yaygın olarak mevcuttur. Sonuç olarak, bu araştırma, mikroorganizmaların birçok çift yönlü kombinasyonları arasında ilginç desenleri belirlemek ve ayrıştırmak için ilk araştırma satırı olarak avantajlıdır, mikrobiyal ekolojinin araştırılması nda özellikle yararlı olabilecek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Donörün ailesinden bilgilendirilmiş onay alındı ve Wisconsin-Madison Üniversitesi İnsan Denekleri Komitesi çalışmayı onayladı (Kurumsal İnceleme Kurulu [IRB] onay numarası H-2013-1044).

1. Örnek Kültür

NOT: Bu prosedür burada insan burun boşluğundan izole bakteriler arasındaki etkileşimlerin incelenmesi için kullanılır. Prensip olarak, aşağıdaki yöntemler herhangi bir kültür koşulu için geçerlidir. Beyin-kalp infüzyon suyu (BHI) burun bakterilerinin genel yayılması için kullanılır. Tüm plakalar% 1.5 agar kullanılarak katılaşmış. Bu çalışma için, numuneler bir donörün burnuna (burun lavajı) sifonlanmış, mikrosantrifüj tüplerine aktarılan ve -80 °C'de dondurulan tuzlu çözeltiden alınır.

  1. Çözülmüş lavaj örneklerinin her birinin 100 μL'sini BHI plakalarına plakalamak için standart kültür tekniklerini kullanın.
  2. Plakaları aerobik olarak 37 °C'de 1 hafta kuluçkaya yatırın.
  3. Kuluçkadan sonra, plaka başına her bir farklı morfotipten ≥2 koloni seçin ve bir koloniyi ilk plakadan yeni bir BHI plakasına geçirerek ve 37 °C'de plakayı kuluçkaya yatırarak BHI plakaları üzerinde aerobik olarak izole edin. Bakteri kültürleri saf olana kadar tekrarlayın.
    NOT: Bakteriyel izole koloni morfolojisi, gram boyama, 16S rRNA gen dizilemesi veya başka bir yöntemle tanımlanabilir. Ancak, protokolü devam etmek için yalıtma kimliğini bilmek gerekli değildir.
  4. Kriyokorun tüm bakteriyel izole -80 °C'de 1 mL 50 gliserol ile 1 mL bakterili gece kültürü (bkz. bölüm 3) kriyotüplerde birleştirdikten sonra.

2. 3D Baskı Pulları

NOT: Polikarbonat, standart otoklav sıcaklığını (121 °C) aşan yüksek cam geçiş sıcaklığı (147 °C) nedeniyle damgalama malzemesi olarak seçilmiştir.

  1. 3D yazıcıyı polikarbonat filamentle yükleyin.
  2. Yapışmaya yardımcı olmak ve baskı sırasında aşı pulunun bükülmesini en aza indirmek için baskı yatağına beyaz okul tutkalı (polivinil asetat) uygulayın.
  3. Yükleyin. 3D yazıcı yazılımına aşı damgası(Şekil 1)için STL model dosyası (Tamamlayıcı Veri Dosyası).
  4. Aşılama damgasını 290 °C'lik meme sıcaklığında, 60 °C yatak sıcaklığına ve katman yüksekliği 0,38 mm'ye yazdırın.
  5. Damgayı alüminyum folyoya sarın ve 15 dk kurutma ile yerçekimi döngüsünde 1,5 saat otoklavlayarak sterilize edin.
    NOT: Polikarbonat higroskopik olmasına rağmen, pullar otoklavlama dan sonra sadece yaklaşık% 0.5 su ağırlığı korumak.

3. Gece Kültürlerin Hazırlanması

  1. Serolojik pipet kullanılarak, 14 mL kültür tüpüiçine steril BHI suyu 3 mL pipet.
  2. Steril 1 μL aşılama döngüsü kullanarak, bir bakteri kolonisini et suyuna aşıla. Kümenin et suyuna dağılmasını sağlamak için döngüyü döndürün. Kuluçkadan kısa bir süre önce kültür tüplerini girdap.
  3. Kültür tüplerini bir gecede 37 °C'de (~16 saat) 250 rpm'de bir çalkalayıcıya kuluçkaya yatırın.
  4. Bakteri kültürleri yeterli bulanıklığa ulaştığında hücre kümelerini parçalamak için girdap (OD600 ≥ 1).

4. Bioassay Plakalarının Hazırlanması

NOT: Bioassay plakaları steriliteyi korumak için laminar akış kaputunda hazırlanır.

  1. % 1.5 agar ile BHI medya hazırlayın ve üretici talimatlarına göre otoklavlama tarafından sterilize.
  2. Otoklavlamadan sonra BHI ortamı sıcaklık kontrollü bir su banyosunda 55 °C'ye kadar soğutun.
  3. Serolojik pipet kullanarak, 12 kuyu plakalı 12 kuyunun her birine 3 mL erimiş BHI media pipet. Kuyuların mümkün olduğunca kesin ve eşit olduğundan emin olun. Bir litre medya ~ 27 bioassay plakaları verecektir.
  4. Agar'ın bir gecede ayarlanın.

5. Biyoassay Plakalarını Test Organizması Ile Aşılama

NOT: Bir test organizması, inhibitör aktiviteüretiminin (örneğin, antibiyotik üretimi) ortak kültür etkileşimi testi kullanılarak belirlendiği organizmayı ifade eder. Bu deney için, test organizmaları nazal lavaj örneklerinden izole edilen Aktinobakterilerdir.

  1. Bir gecede kültür içine steril 10 μL aşılama döngü ekleyerek ve iyi bir plaka nın sol üçte üzerinde bir kültür damlacık çizgili bir biyoassay plaka üzerinde test organizma aşılayın.
    NOT: Kuyunun büyümesinin daha sonra hedef organizmaların aşılanması yasakolduğundan, kuyunun sadece üçte birinin seri olması önerilir.
  2. Plakadaki 12 kuyunun tümü test organizması ile aşılanana kadar tekrarlayın.
  3. 7 gün boyunca uygun sıcaklıkta ters plakalar inkübat. Daha yüksek sıcaklıklarda (≥37 °C) veya daha kuru iklimlerde, plakaların kurumasını önlemek için plakaları nemli bir kapta saklayın.

6. Hedef Organizmaların Hazırlanması

NOT: Hedef organizma, inhibisyon durumu ortak kültür etkileşimi analizi kullanılarak belirlenen organizmayı ifade eder. Bu deney için, hedef organizmalar Staphylococcus spp. burun lavajörneklerinden izole edilir.

  1. Bioassay plakalarını 6 gün kuluçkaya yatırdıktan sonra, yukarıda yapıldığı gibi, belirtilen hedef organizmaların gecekültürlerini hazırlayın (bkz. bölüm 3).

7. Hedef Organizma Aşısı

NOT: Bir gece kuluçkadan sonra kültürlerin bulanık olduğundan emin olun (OD600 ≥ 1). Bazı bakteri kültürleri kültür tüpünün alt kısmında flocculate olabilir. Girdap kümeleri dağıtmak ve kültür bulanıklık değerlendirmek için kültür tüpleri.

  1. 1.8 mL BHI ve 200 μL'lik boş 12 kuyu plakasının her kuyusunu doldurarak hedef plakayı hazırlayın.
  2. Savurun ve hedef plakaya steril aşı damgası yerleştirin. Kültürlerin komşu kuyuları kirletmemesini sağlamaya özen leyerek, kuyuların etrafındaki kültürleri yavaşça döndürün.
  3. Aşı lama damgasını kaldırın ve her pul ucunda seyreltilmiş hedef kültür damlacıkları olduğundan emin olun.
  4. Aşıpulu aşıpulu aşısız bir biyoassay plakasına yerleştirerek monokültür kontrol plakası hazırlayın ve bir kültürün her kuyuyu aşılayabilmesi için pulu hafifçe sallayın. Aşılama damgası kaldırıldıktan sonra, biyoassay plakasının kuyularında bir kültür damlası görülmelidir.
    1. Ortam eşit olmayan düzeylerde nisblü bir kuyu aşılanmamışsa, bir pipet kullanarak kuyuların sağ tarafına seyreltilmiş gece kültürünün 3 μL'sini noktalandırın.
  5. Yukarıda yapıldığı gibi bioassay plakaları aşılamak (adım 7.4.1 bakınız), ancak uçları 12 kuyu plakasağ tarafı ile hizalamak böylece damga hizalayın. Kuyulara aşı yaparken damganın mevcut bakteri kolonisi ile temas etmediğinden emin olun.
  6. Pulu dikkatlice çıkarın ve hedef plakaya geri yerleştirin.
  7. Tüm plakalar aşılanana kadar her biyoassay plakası için aşıyı tekrarlayın.
  8. 7 gün boyunca uygun sıcaklıkta baş aşağı bioassay plakaları inkübat.

8. Puanlama

  1. Test ve hedef organizmaların 1 hafta boyunca birlikte çalışmasından sonra, aşağıdaki görsel değerlendirmeye dayanarak etkileşimleri puanlar:
    1. Monokültür kontrolünden ayırt edilemeyen büyümeyi gösteren hedef organizma büyümesi ile kuyuları "0" (inhibisyon yok) olarak puan(Şekil 2A,B).
    2. Kontrole göre azalmış büyüme gösteren hedef organizmaile kuyuları "1" (zayıf inhibisyon)(Şekil 2C)olarak puanlandırın.
    3. Hedef organizmanın "2" (güçlü inhibisyon) olarak büyümediği kuyuları puanlayın (Şekil 2D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ortak kültür etkileşimi tahlilleri mikrobiyal etkileşimleri anlamak, ilgi kalıplarını belirlemek ve ilginç etkinliklerle mikrobiyal izolasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu tahlillerde, bir test organizması 12 kuyulu agar plakanın bir tarafında monokültürlü ve 7 gün boyunca kuluçkaya yatırılır. Daha sonra, bir hedef organizma test organizmasının yanında tespit edilir ve iki mikrop hedef organizmanın büyüme fenotip için puanlama önce 7 gün boyunca birlikte kültürlendi. Tahliller, hedef organizmanın büyümesi veya inhibisyonu görsel analizine dayalı olarak puanlandırılır.

Bu eş-kültür tahlilleri son zamanlarda Staphylococcus spp doğru Actinobacteria (test organizmalar) inhibitör aktivitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. (hedef organizmalar) insan burun boşluğundan izole (Şekil 2)16. Ortak kültür tahlilleri, Aktinobakteriler (n = 21) ve Staphylococcus izole leri (n = 39) arasındaki spesifik inhibisyon modellerini tanımlamak için kullanıldı ve Aktinobakterilerin koagülaz-negatif isterme yeteneklerinde farklılık gösterdiğini gösterdi. stafilokok (CoNS). Toplam 812 çift biliş test edildi. Özellikle Corynebacterium propinquum cons(Şekil 2D)ile karşılaştırıldığında, özellikle cons(Şekil 2C)inhibe edilen veya CoNS üzerinde hiçbir etkisi olmayan diğer Corynebacterium ile karşılaştırıldığında ( Şekil 2 C ) Şekil 2B), ve monokültür kontrolü ile karşılaştırıldığında ( Şekil2A)16.

Karşılaştırmalı genomik kullanılarak, siderofor üretimi için bir biyosentetik gen kümesi diğer Corynebacterium izole genomlarında yoktu C. propinquum genomlarında tespit edildi16. Sideroforlar,mikroorganizmalar tarafından üretilen şelatörlerdir. C. propinquum tarafından siderofor üretimi doğrulandı ve siderofor dehidroksinnokardiyomin16olarak tanımlandı. Bu sonuç, CoNS inhibisyonunun siderofor aracılı demir tükenmesine bağlı olduğu hipotezine yol açmıştır. Daha sonra, c. propinquum ve CoNS arasında hem standart hem de demir takviyesi BHI ortamda ortak kültür etkileşimi tahlilleri yaparak, inhibisyon fenotipinin demire bağımlı olduğu saptırıldı (Şekil 2E). Birlikte, bu sonuçlar siderofor aracılı demir tükenmesi C. propinquum16tarafından CoNS güçlü inhibisyonu sorumlu olduğunu ileri sürdü.

Figure 1
Şekil 1: Bioassay aşılama damgasının fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Co-kültür etkileşimi tahlilleri Corynebacterium propinquumtarafından CoNS siderophore aracılı inhibisyonu ortaya çıkarmak . (A) BHI biyoassay plakası üzerine aşılanmış CoNS monokültür (hedef organizma). (B,C,D) Corynebacterium spp. (test organizmalar, sol) ve CONS aynı suş (hedef organizma, sağ) BHI biyoassay plakaları aşılanmış farklı suşları arasında co-kültürler. Her panel (B) hiçbir inhibisyonu (skor = 0),(C) zayıf inhibisyonu (skor = 1) veya(D) güçlü inhibisyonu (skor = 2) ile etkileşimleri gösteren temsili bir görüntüdür. (E) Corynebacterium pseudodiphtheriticum (siderophore non-prodüktör) veya Corynebacterium propinquum (siderophore prodüktör) arasındaki etkileşimlerin BHI media (BHI) ve BHI medyasında aynı cons türü ile karşılaştırılması 200 μM FeCl3 (BHI + demir) ile tamamlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Veri Dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Antibiyotikler ve mikrobiyal etkileşimler aracılık diğer ikincil metabolitleri ilaç keşfi de dahil olmak üzere çok sayıda uygulama için yararlıdır. Burada, çok sayıda mikrobiyal etkileşimi değerlendirmek için ortak kültür tahlilleri için bir protokol sunulmuştur. Bu ortak kültür etkileşim iratları basit, uygun fiyatlı, ölçeklenebilir ve yüksek iş elde etme anlamına gelir, birlikte mikroorganizmaların birçok çift yönlü kombinasyonları araştırmak anlamına gelir. Hedef organizmalar, aşı damgası kullanılarak 12 kuyuluktaki bir kuyuda test organizmalarının yanında tespit edilir ve hedef organizmaların inhibisyonu hedef organizmanın fenotipinin görsel incelemesine göre puanlandırılır. Bu tahlillerde kullanılan malzemelerin çoğu laboratuvar tedarikçileri veya kamu kaynakları aracılığıyla kolayca kullanılabilir. Bu nedenle, tahliller kolayca birçok laboratuvar ortamlarına uyarlanabilir. Laboratuvarda, bu ortak kültür testleri çeşitli ortamlardan birçok konak ile ilişkili mikroorganizmaların etkileşimlerini araştırmada başarılı olmuştur.

Bu tekniğin birçok faydası olmakla birlikte, birkaç sınırlama da vardır. İlk kayda değer sınırlama, ortak kültür tahlillerinden desenlerin diğer meta veriler olmadan yorumlanmasının zor olmasıdır. Bu ortak kültür tahlilleri istihdam iki yeni kağıtlar16,18, ilgi inhibisyon desenleri sadece test organizmaların taksonomik kimlik gibi diğer meta veriler ile birlikte tespit edilmiştir. Bununla birlikte, meta verilere eşlik etmeden bile, bu makalede özetlenen yöntemler, belirli patojenlere veya hedef mikroplara yönelik inhibitör aktivite ile bakteriyel izolelerin tanımlanmasına olanak sağlamaktadır.

Ek bir sınırlama bu tahliller ticari olarak mevcut değildir, ve biyoassay plakaları el hazırlanmış olması gerekir, hangi tahlil verimliliğini sınırlayabilir. Plaka hazırlama deney için çok önemlidir ve plakalar hazırlanırken dikkatli olunmalıdır. Kuyular eşit değilse, aşı damgası tüm kuyuları aşılayamayabilir. Ancak, kaçırılan kuyular, hedef organizma kültürünü nisbeten her bir inoculated kuyunun sağ tarafına doğrudan boruile tiz olarak aşılanabilir. Gerçekten de, her plaka üzerinde birkaç kuyu damga tarafından cevapsız olsa bile, prosedür hala doğrudan her kuyuiçine hedef organizma borulama daha verimlidir. Alternatif olarak, kullanıcılar aşılama damgası ve pipet her kuyuiçine hedef organizma dan alabilirsiniz, ama bu süreç daha zaman alıcı, özellikle aynı anda 12 kuyu damgalama ile karşılaştırıldığında.

Son olarak, test organizması hedef organizma aşılanır önce monokültür sırasında kuyuda mevcut besin tüketebilir. Besin tükenmesi gözlenen inhibisyon desenleri etkileyebilir rağmen, şimdiye kadar test edilmiştir çift yönlü kombinasyonları arasında nadir gibi görünüyor. Özellikle, C. propinquum tarafından kuyularda demir tükenmesi insan burun mikrobiyota16üyeleri siderofor aracılı rekabetin keşfi için izin verdi.

Bu ortak kültür etkileşim itaret leri, medya kompozisyonu, zamanlama, hatta test organizması olarak birden fazla organizma veya mikrobiyal konsorsiyum da dahil olmak üzere değiştirerek özelleştirilebilir. Ayrıca etkileşim fenotipini tanımlamak için istenilen ayrıntı düzeyine bağlı olarak farklı puanlama sistemleri kullanılabilir. Puanlama ölçekleri, insan burun boşluğundan izole edilen bakteriler arasındaki rekabet etkileşimlerini tanımlamak için kullanılan 0-2'den(Şekil 2)ve Streptomyces'in antimikrobiyal potansiyelini değerlendirmek için kullanılan 0-3'ten örneklerdir. böcek mikrobiyomlarından izole18. Ancak, daha nüanslı ölçekler ile, puanlama giderek daha zor hale gelir. Böylece, inhibisyon en kolay ikili puanlama sistemi kullanılarak kabul edilir (örneğin, 0 hiçbir inhibisyon ve 1 inhibisyon olarak tanımlanır), hangi herhangi bir karışıklığı ortadan kaldırmak ve birden fazla kişi arasında puanlama standartlaştırmak. Ayrıca, inhibisyon fenotipleri için puanlama ek olarak, bu tahliller de pigment üretimi, sporülasyon, ya da görsel olarak değerlendirilebilir başka fenotip de dahil olmak üzere diğer fenotipler için puanlanabilir. Bu tahliller hedef organizmanın görsel denetimine dayalı analizlerle yüksek ölçeklenebilir olduğundan, fenotip puanlamasını kolaylaştırmak ve tahlil çıktısını artırmak için makine öğrenme algoritmaları için eğitim setleri oluşturulabilir.

Bu ortak kültür tahlillerinin önemli bir gücü, faaliyetleri veya inhibisyon modellerini ortaya çıkarmak için birçok çift yönlü etkileşim kombinasyonunu ucuzve hızlı bir şekilde taramayı kolaylaştırabilme yetenekleridir. Daha sonra, mikropların daha derin karakterizasyonu ve ilgi etkileşimleri için daha karmaşık ve yoğun yöntemler (yani genomik karakterizasyon, MALDI-TOF-IMS veya doğal ürün izolasyonu ve karakterizasyonu) kullanılabilir. ortak kültür tahlilleri. Yakın zamanda örnek olarak, bu ortak kültür inhibisyonu tahlilleri böcek kaynaklı Streptomyces'in Gram-negatif bakteri ve mantarları topraktan elde edilen benzerlerinden daha iyi inhibe edebildiğinizi göstermek için kullanılmıştır. İnhibisyon tahlilleri, 2.003 Streptomyces arasında inhibisyon paterninin hızlı ve etkin bir şekilde görüntülenmesi için izin verdi ve ilaca dirençli mantar patojenlerine karşı aktif olan sifomisin adı verilen yeni bir antifungal keşfin keşfine yol açtı. 18. Böylece, bu co-kültür etkileşim iypleri mikrobiyom araştırma, antimikrobiyal keşif için güçlü bir araç tır ve mikrobiyal etkileşimler desenleri içine daha derin anlayışlar kazanıyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Acknowledgments

Daniel May, Marc Chevrette ve Don Hoang'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Cameron R. Currie'nin çabaları da dahil olmak üzere bu çalışma, Wisconsin-Madison Üniversitesi, Araştırma ve Lisansüstü Eğitim Rektör Yardımcısı Ofisi tarafından Wisconsin Mezunlar Araştırma Vakfı'nın finansmanı ile desteklendi. Ulusal Sağlık Enstitüleri Çevirisel Araştırma Için Mükemmeliyet Merkezleri (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck Biyoloji ve Tıp Eğitim Programı (NLM 5T15LM007359) Hesaplama ve Enformatik eğitim hibe Tıp Milli Kütüphanesi tarafından desteklendi. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama da veya çalışmayı yayına sunma kararında hiçbir rolü yoktu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue VWR 12000-806
10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow VWR 12000-810
12-well cell culture plate, sterile with lid Greiner bio-one 665 180
14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile Falcon 352057
2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile USA scientific 1420-9710
25 mL serological pipet Cell Treat 229225B
Agar, bacteriological VWR J637
Brain Heart Infusion Broth Dot Scientific DSB11000-5000
Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter Keene Village Plastics 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
School Glue Elmer's EPIE304
Taz 6 3D printer Lulzbot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7, (August), 1234 (2016).
  2. Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21, (9), 501-507 (2006).
  3. Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10, (3), 226 (1929).
  4. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11, (12), e1005722 (2015).
  5. Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535, (7613), 511-516 (2016).
  6. Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398, (6729), 701-704 (1999).
  7. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6, (2), 71-79 (2016).
  8. Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38, (1), 61-65 (1944).
  9. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).
  10. Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12, (12), 3093-3102 (2017).
  11. Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76, (8), 2445-2450 (2010).
  12. Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157, (Pt 9), 2485-2492 (2011).
  13. Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (32), 13082-13087 (2012).
  14. Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. 349-396 (2014).
  15. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5, (12), 885-887 (2009).
  16. Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85, (10), 1-17 (2019).
  17. Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30, (4), 691-696 (2002).
  18. Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10, (1), 516 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics