ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hancock, C. E., Bilz, F., Fiala, A. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (152), e60288, doi:10.3791/60288 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

עשרות שנים של מחקר אורגניזמים רבים במודל הובילו את המושג הנוכחי של הפלסטיות הסינפטית הבסיסית למידה והיווצרות זיכרון. שינויים המושרה למידה בשידורי סינפטית מופצים לעתים קרובות על פני הרבה נוירונים ורמות של עיבוד במוח. לכן, יש צורך להמחיש את הפלסטיות הסינפטית התלויות בלמידה ברחבי הנוירונים. זבוב הפירות מלאנוגסטר מייצג אורגניזם מודל נוח במיוחד לחקר המעגלים העצביים שבבסיס הלמידה. הפרוטוקול המוצג כאן מדגים דרך שבה התהליכים המשמשים את היווצרות זיכרונות הריח האסוציאטיבית, כלומר, פעילות סינפטית והשינויים שלהם, ניתן לפקח בvivo. באמצעות מגוון רחב של כלים גנטיים הזמינים ב Drosophila ילה, ניתן לבטא במפורש מחווני סידן מקודדים גנטית באוכלוסיות תאים ואפילו תאים בודדים. על ידי תיקון זבוב במקום, ופתיחת קפסולת הראש, ניתן להמחיש את דינמיקת הסידן בתאים אלה תוך מתן גירוי ריח. בנוסף, אנו מדגימים הערכה שבה הזבוב יכול להיות נתון, במקביל, לזעזועים חשמליים לגוף. זה מספק מערכת שבה זבובים יכולים לעבור מיזוג הריח הקלאסי-לפיו ריח נאיבי בעבר הוא למד להיות קשור לעונש הלם חשמלי-באותו זמן כמו ייצוג של ריח זה (וריחות לא מאומן אחרים) הוא שנצפתה במוח באמצעות שתי פוטון מיקרוסקופ. המעבדה שלנו דיווחה בעבר על הדור של חיישני סידן synaptically מקומי, אשר מאפשר לאחד להגביל את אותות הסידן פלורסנט לתאי טרום או פוסט סינפטית. מיקרוסקופ 2-פוטון מספק דרך. לפתור מבנים משובחים אנו מדגימה זאת על ידי התמקדות בנוירונים המשלבים מידע מהגוף הפטרייה, מרכז מסדר גבוה יותר של מוח החרק. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה לבחון את הקשרים סינפטית בין הנוירונים אשר הפעילות מאופנן כתוצאה של לימוד ריח.

Introduction

פענוח היכן וכיצד המידע נרכש במוח באמצעות למידה ומאוחסן לאחר מכן כזיכרון מהווה את אחת המשימות המאתגרים ביותר במדעי המוח1. מחקרים נוירומדעיים הובילו למושג שינוי בשידור הסינפטית כמצע עצבי הנמצא ביסוד הלמידה והיווצרות הזיכרון2,3. זה שיערו כי, במהלך הלמידה, קשרים סינפטית בין ההרכבים עצבי כי הם פעילים במהלך התפיסה של גירוי להיות שונה כך דפוס הפעילות המשולבת שלהם ניתן לאחזר במהלך הזיכרון להיזכר, ובכך להדריך פעולה התנהגותית עתידית4. אלה "התאים engram" ואת הסינפסות שלהם מופצים לעתים קרובות על פני אזורי המוח רמות של עיבוד, מה שמקשה על הקצאת שינויים נצפו בשידורי סינפטית ללמידה של משימה או גירוי. כדי להתאים ולהמחיש את השינויים הסינפטית האלה כי הם מקושרים למשימה למידה ספציפית אחד צריך מערכת המודל המתאים המאפשר בדיוק מגבילה את הסינפסות.

עבור מאמץ כזה, דרוזופילה מלאנוסטר מתאים במיוחד משום שהוא משלב פשטות מוחית יחסית, עושר התנהגותי ונגישות ניסויית. בין האורגניזמים המבוססים היטב, דרוסופילה ממוקם בין ה-נמטודות C. אלגיה ויונקים מבחינה גנטית כמו עכברים במונחים של מורכבות עצבית. מספר סטריוטיפית של נוירונים (~ 300) ורפרטואר התנהגותי מוגבל נצפה בג. יונקים, לעומת זאת, יש מיליוני נוירונים. ומורכבות התנהגותית אדירה המוח של זבוב הפירות הוא, עם שלה ~ 100,000, הנוירונים קטנים באופן משמעותי מהמוח של רוב בעלי החוליות, ורבים הנוירונים הם לזיהוי באופן אינדיבידואלי5. ובכל זאת, דרוזופילה מפגין ספקטרום רחב של התנהגויות מורכבות, כולל יכולת להציג למידה איתנה של ריח והיווצרות זיכרון, המתואר לראשונה לפני 40 שנים לפני6. במהלך הליך התניה קלאסי, קבוצות של זבובים חשופים לריח כגירוי ממוזג (CS+) בעוד הם מקבלים הלם חשמלי מעניש כמו גירוי ממוזג (ארה ב). הריח השני (CS-) מוצג לאחר מכן ללא כל עונש. כך, בעלי החיים לומדים להימנע מהריח הקשור לעונש, שניתן לבחון במצב הבחירה הבא בין שתי הריחות, CS+ ו-cs-. העבודה על ניתוח המצע העצבי שבבסיס התנהגות זו בדרוזופילה זיהתה את גופי הפטריות (MB) כאתר הראשי של "engram"7,8,9,10 ולכן, המעגלים של אזור המוח הזה היה והוא הנושא של מחקר אינטנסיבי כדי לחשוף את ההיגיון שבו אנגרמה זיכרון נרכש ומאוחסן (שנבדקו לאחרונה בשנת11,12).

The drosophila ילה MB מורכב ~ 2,000 נוירונים פנימיים (תאים קניון) לכל חצי הכדור, מאורגן התחזיות סיבי מקבילי13. Axons של הקרנת הריח הנוירונים מורחבים החזייה לרוחב לאורך ו calyces MB, אתר הקלט הדנדריטי הראשי של MB ולקבל קלט החוש מן האונות האנטנה. צרור האקטונים הארוכים והמקבילים של תאי קניון מהווים את מדווש ואת האונות. רוב התאים קניון bifurcate להרכיב אופקי β/β'-האונות על ידי הארכת עירבון אחד כלפי קו האמצע של המוח, ו-α האנכי/α'-האונות על ידי הארכת העירבון השני מקרין בכיוון הקדמי הקדמית. הקבוצה השנייה של תאים קניון צורות γ אופקי-האונות13 של המגה בייט שבו תהליך הלמידה והיווצרות הזיכרון לטווח הקצר הבאים יכול להיות מקומי10. האונות MB לקבל קלט כלי לימפה ולספק פלט efferent, שניהם מוגבלים בדרך כלל compartmental sub-אזורים נפרדים לאורך אקסונים תא קניון14,15,16. בפרט, הקלט של הנוירונים במגה-בתים של כלי לימפה בנפח MB הוכחו לתווך ערך מבוסס, למשל, ענישה, חיזוק השפעות הריח למידה אסוציאטיבית15,17. Stereotypic ובאופן אינדיבידואלי efferent MB פלט הנוירונים מתוך האונות בגוף פטריות לשלב מידע על פני מספר גדול של תאים קניון, יעד אזורי המוח מגוונות התנהגות דוב-מידע מספק מאוד או מאוד מספק15 . הארכיטקטורה העצבית הזאת הובילה. למושג של ארגון האנגרמה האסוציאטיבית ריחות מקודדים במדויק על ידי הרכבים המופעל בדלילות של תאים קניון. האירוע מגזר המקרה של אלה הרכבים תא הקניון ושחרורו של דופמין-עורר על ידי הענשת גירויים-העברת מודולים מתא קניון מראש לתוך הנוירונים הפלט מגה בייט כגון בעלי החיים לאחר מכן למנוע את הריח הזה מסוים10 ,12. אנו משתמשים זו אנגרמה מוגדר למדי בדיוק מקומי כמו במקרה פרדיגמטי כדי להמחיש כיצד אלה תלויי למידה שינויים בפעילות סינפטית ניתן לקבוע ופיקוח.

הערך של דרוזוהילה כמערכת מודל מסתמך בחוזקה על ארגז הכלים הגנטי ללא תחרות המאפשר לאחד לבטא טרנסגנים לזיהוי, ניטור ושליטה על נוירונים בודדים בתוך מעגלים מורכבים18. הופעתו של טכניקות לניטור הפעילות העצבית-כגון הדמיה סידן, דנו כאן-הרשו לקביעת דפוסי הפעילות העצבית בתגובה לגירוי מסוים. על-ידי שילוב ביטוי מGal4 ספציפי של מחווני סידן מקודדים גנטית (סמארה) עם גירוי ריח, אפשר לדמיין את הדינמיקה המועוררה של הסידן של נוירונים בריבית19. בפרוטוקול זה מראים כי על ידי צימוד טכניקה זו עם פרדיגמה מיזוג קלאסית, ניתן לבחון את תגובות הריח הזה בהקשר של למידה. פלסטיות המושרה למידה ניתן לגזור עוד באמצעות הסמזה כי הם לא רק מקומי לעצב מסוים אחד, אלא גם לתאי משנה ספציפיים של תא העצב. Pech ואח '20 הקים מבחר כלים המאפשרים בדיוק את זה. על-ידי התמקדות GCaMP321 אל מקדם או פוסטסינפסה באמצעות הצמדה בעלי החוליות Synaptophysin או dהומר, בהתאמה20-האפנון הדיפרנציאלי של אתרים אלה ניתן להבחין. לוקליזציה זו מהווה, בהקשר זה, יתרון על רוב הגנוטים היא כי הם במצב אוביקווילי לאורך הציטוסול-למשל, GCaMP22, GCaMP321, או GCaMP623 -כי זה אומר הארעיות טרום ופוסט סינפטית יכול להיות נבדל מזרם הסידן המשולב הכולל המתרחש כתוצאה של הפעלת תא העצב. הדבר יכול לספק רמזים לגבי המיקום והסוגים של הפלסטיות המתרחשים כתוצאה או הגורם ללמידה וליצירת זיכרון. כדוגמה, הפרוטוקול המסופק כאן מציג את הערך של כלי זה בפענוח האפנון של הנוירונים פלט MB במהלך הלמידה אסוציאטיבית הריח על ידי מיקוד הביטוי של חיישן הסידן רק postסינפסה. על-ידי ניטור, בתוך לטוס בודד, מעורר ריח פעילות לפני ואחרי המיזוג ריח השוואה ישירה ניתן להסיק בין תגובת ריח נאיבי ותגובת ריח למדה. בעוד קבוע באותו חדר הדמיה, זבובים חשופים מבחר של ריחות. לאחר מכן, הם מקבלים פרוטוקול התניה אסוציאטיבית, שבו אחת מריחות אלה מזווג עם הלם חשמלי (להיות CS+) ועוד ריח מוצג ללא חיזוק (להיות cs-). לבסוף, הזבובים נחשפים שוב לריחות כמו בשלב הראשון. השתמשו בסידן מיקרוסקופית. שתי פוטון

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זבובי פירות טרנסגניים, דרוזופילה מלאנוסטר

  1. צלב נקבה בתולה וזבובים גברים (הרים 25 ° צ' ב 60% לחות יחסית על מחזור 12 h אור/כהה) נשיאת Gal4 ובונה UAS הרצוי25, בהתאמה, כדי לייצר זבובים שבו נוירונים ספציפיים הריבית לבטא מקודד גנטית סידן אינדיקטור.
  2. גיל הצאצא הנשי של הצלב הנ ל עד שהם בטווח של 3-6 ימים פוסט eclosion. מעדיפים זבובים לנשים בגלל גודלם הגדול במקצת.

2. הכנת זבוב הפרי להדמיית סידן vivo

  1. בחר זבוב נקבה אחת והורדם על הקרח במשך לא יותר מ 5 דקות.
  2. באמצעות מלקחיים עדינים, מניחים את הזבוב בתא ההדמיה (הפגינו באיור 1ג). הקפידו לשמור על החזה והרגליים במגע עם חוטי החשמל בתחתית החדר ושהראש מניח. תקן את מיקום הזבוב באמצעות נייר דבק ברור.
    הערה: פרוטוקול זה מחייב חדר בנוי בהתאמה אישית, שבו הזבובים קבועים, כאשר כמוסת הראש נגישים לפתיחה, והזבובים יכולים לקבל שני משבי ריח לאנטנה ולזעזועים חשמליים לבית החזה ולרגליים (איור 1).
  3. באמצעות להב אזמל כירורגי קבוע ידית האזמל (ראה טבלת חומרים), לחתוך חלון בקלטת סביב הראש של הזבוב, עוזב את האנטנה מכוסה ורק את החלק הקדמי ביותר של בית החזה נחשף.
  4. הקף את הצדדים ואת החלק האחורי של הראש עם דבק באור כחול בהיר, מניפולציות בקפידה באמצעות סיכת חרק שנערך על ידי מלתעות קמור. הגדר את הדבק באמצעות מנורת LED כחולה מפליטת אור.
  5. בדוק כי הדבק מוגדר לחלוטין וברור כל דבק שיורית לא מוקשח מהמשטח של הראש לעוף.
  6. החל טיפה של הפתרון של הצלצול24 (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הקוטיקולה החשופה של הראש.
  7. , בעזרת סכין דקירה מאוד יפה. לחתוך דרך הקוטיקולה להסרה היעילה ביותר של הקוטיקולה, לחתוך הראשון על פני האחורי של הראש באמצעות ocelli כנקודת התחלה. ואז, לחתוך כל צד, המדיאלי לעיניים, כדי ליצור כנף של הקוטיקולה שניתן לקרוע בקלות באמצעות מלקחיים.
  8. להסיר את הקוטיקולה העודפת שעלולה לחסום את המוח באזור העניין.
  9. נקה בזהירות את פני השטח של כל קנה הנשימה באמצעות מלקחיים עדינים, הימנעות שיבוש רקמת המוח עצמו. להסיר ולרענן את הפתרון של הצלצול24 (ראה טבלת חומרים) כנדרש כדי לנקות את האזור של פסולת רקמות.
  10. מניחים את המחט משלוח תת-עורית בעמדה, כ 1 ס מ מראש הזבוב. ודא שאין דבר שיכול לשבש את מסירת הריח לאנטנות.
  11. במיקרוסקופ, לחבר את חדר ההדמיה למערכת ריח-משלוח דרך המחט מסירה תת-עורית.
  12. כדי לאפשר לזבוב להתאושש באופן מלא מהרדמה וניתוח, ולהסתגל לזרימת האוויר, מיישמים תקופת מנוחה של 10 דקות בשלב זה.

3. בvivo סידן הדמיה

  1. השתמש במיקרוסקופ מרובה פוטון המצויד בלייזר אינפרא אדום ומטרת טבילה במים (ראה טבלת חומרים), המותקנת על שולחן מבודד רטט. עבור ויזואליזציה של מחווני סידן מבוססי GFP, לכוונן את הלייזר כדי אורך הגל של 920 ננומטר ולהתקין GFP הלהקה לעבור מסנן.
  2. באמצעות כפתור הכוונון של Z גס, לסרוק דרך ציר Z של המוח ולאתר את אזור המוח של עניין. השתמש בפונקציית החיתוך כדי למקד את הסריקה רק באזור זה כדי למזער את זמן הסריקה, וכיצד לסובב את תצוגת הסריקה כך שהראש הקדמי של הראש פונה כלפי מטה.
  3. התאם את גודל המסגרת ל-512 x 512 px, מהירות הסריקה ל> 4 הרץ ולאזור הסריקה (בממד Y) כך שנוירונים מעניינים מכוסים.

4. ויזואליזציה של מעבר סידן מעורר ריח באמצעות מיזוג ריח

  1. השתמש במערכת שילוח ריחות19,26 שיכול לספק מספר גירויים ריח באופן זמני מדויק.
    1. השתמש במחשב נוסף כדי לשלוט בהתקן, וכדי לתקשר עם תוכנת מיקרוסקופ ההדמיה כדי לתאם את הגירוי בתמונה במהלך הניסויים.
    2. ליזום חבילת מאקרו מתוכנתים מראש מסוגל לקשר את תוכנת רכישת התמונה ותוכנית מסירת ריח (g., חבילת מאקרו של VBA המותקנת בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, ראה טבלת חומרים) כי הוא מגיב לקלט חיצוני הדק המסופק על-ידי החניכה של פרוטוקול מסירת ריח בתוכנית נפרדת).
  2. הפעל את המדידה על ידי ניטור "pre-הדרכה"/ריח נאיבי של סידן ארעיות ברזולוציה של 512 x 512 px וקצב מסגרת של 4 Hz. לספק הגירוי ריח של 2.5 מוקף על ידי רכישת תמונה נוספת עבור התפרצות ריח לפני 6.25 (כדי להקים F 0 ערך בסיסי) ו-12.5 s לאחר היסט ריח. , חזור על זה עם הדואואנט השני. ואחר כך עם אודואנט שלישי
  3. המשך 3 דקות לאחר מדידה זו עם מיזוג קלאסי ("אימון") זבוב.
    1. בחר את אחת הריחות המוצגים בשלב "טרום אימון" כדי להפוך את ה-CS+ ריח והשני כדי להפוך את הcs- ריח. הציגו את CS+ ריח באמצעות המחשב מבוקר ריח-מערכת הספק עבור 60 s לצד 12 90 V זעזועים חשמלי.
    2. לאחר הפסקה של 60 s, להציג את הריח CS לבד עבור 60 s. השימוש כאודונמלים 4-methylcyclohexanolו-3 -octanol. אין להציג את האודואנט השלישי (למשל, 1-octen-3-ol) במהלך אימון זה כפי שהוא משמש כשליטה רק לפני (שלב 4.2.) ואחרי (שלב 4.4) שלב האימון.
  4. למדוד את "לאחר האימון" מחזורי הסידן מעורר הריח שוב על ידי חזרה על "טרום הכשרה" פרוטוקול גירוי הריח (שלב 4.2.) 3 דקות לאחר סיום שלב ההכשרה (שלב 4.3).
    הערה: העיתוי של שלב זה אמור לשקף את זמן ההתעניינות לאחר היווצרות הזיכרון (למשל, לבצע שלב זה 3-4 דקות לאחר שלב המיזוג כדי לחקור זיכרון לטווח קצר). בדרך כלל, זבובים יכולים לשרוד כמה שעות בהכנה זו.
  5. שמור קבצי הדמיה בתבנית מתאימה (לדוגמה, Tiff) לניתוח תמונה מאוחר יותר.

5. ניתוח תמונה

  1. כדי לנתח תמונות, פתח קבצים מסוג Tiff (או דומה) בתוכנת ניתוח התמונה כגון פיג'י27.
  2. יישר את המחסניות באמצעות אלגוריתם תיקון תנועה כדי להבטיח תנועה מינימלית בכיוונים X ו-Y. התעלם מהקלטות שיראו תנועה חזקה בציר Z.
  3. בחר את הכלי של התוכנה המשמשת לסימון אזור מעניין (ROI) סביב האזור שיש לבחון. זה צריך להיות מדויק ככל האפשר כדי להגביל את ההשפעה של זריחה ברקע.
  4. השתמש בכלי המתאים של התוכנה כדי לחלץ נתונים בעוצמה הזמני של הקרינה כקבצי נתונים מתוך ההחזר הנבחר, כך ערך נוצר עבור כל מסגרת של ההקלטה.
  5. פתח את הנתונים באמצעות תוכנית לניתוח נתונים כדי לחשב את ערכי ΔF/F0 עבור כל מעקב אחר ריחות. F0 = זריחה ממוצעת של 2 לפני התפרצות הריח. ΔF = ההפרש בין הזריחה הגולמית במסגרת נתונה ו-F0. מערכים אלה, חשב ערך ΔF/F0 עבור כל מסגרת שניתן להתוות נגד הזמן כדי לשקף את הזריחה היחסית במשך תקופת גירוי הריח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באיור 2ניתן לראות דוגמה לתמונות שנרכשו באמצעות הפרוטוקול הנ ל. ד הומר-GCaMP3 מתבטא בעצב הפלט במגה בייט, אשר הדנדטים innervate תא 1 של האונה הγ-mb (תא העצב הוא כינה MVP228,29) והוא ממוקד גנטית באמצעות קו מפוצל-Gal4 MB112C16. כמו כן, הפגינו היא ההבדל בהתאמה התאית subsolic ו-post-synaptically אינדיקטור סידן מקומי. בעת השוואת דמויות 2a ואיור 2a, ניתן להבחין בבירור בביטוי הספציפי והמודנן של חיישן dhomer-GCaMP314 -ללא ביטוי בתאי האקונאליות של תא העצב, ואות מלווה לעין בתא הדנדריטי ברור-למרות התגובות משרעת התחתון-ריח ניתן לראות זבובים המבטא dהומר-GCaMP3 (איור 2, נמוך פאנלים), לעומת זבובים המבטא cytosolic GCaMP6f23 (איור 2, לוחות עליונים). זה מדגים כי הכלי הוא יעיל להדמיה של תגובות ריח ברמה של פוסטסינפסה, ולכן, מספק ספציפיות נוספות לבדיקת מעגלים עצביים בבסיס, במקרה זה, הקידוד ריח ו לימוד ריח.

דוגמא לאחרונה ניתן לראות באיור 3. בניסוי זה, dהומר-GCaMP3 מתבטא כמו באיור 2 -ב תא הפטרייה הגוף הפטריה MVP2. זהו תא עצב ידוע להיות מאופנן דרך לימוד ריח כזה, כי דיכאון טרום סינפטיות כתוצאה של מיזוג הריח מאוד משתקף בתגובה פוסט-סינפטיות מת לריח המיומן28,29 וכאן אישור של תוצאה זו מוצג באמצעות זה בפרוטוקול vivo הדמיה סידן. סימני הסידן המוצגים באיור 3 מייצגים נתונים למופת מזבוב אחד. שימו לב שרמת הרעש והשרעת יכולה להשתנות בין ההכנות הבודדות (למשל, להשוות בין איור 2e לבין איור 3c-e). לכן, השוואה בין בעלי חיים של טרום לעומת הכשרה מספקת דרך להסביר את השונות הבין-אישית. כמובן, הפרוטוקול מתאים להעברה להדמיה של נוירונים אחרים בעלי עניין.

Figure 1
איור 1: בניית חדר הרכבה והכנת זבוב להדמיה. (א) צעדים לבניית החדר הגובר על הזבוב. הבסיס הוא נוצר של שקופית מיקרוסקופ רגיל (1) מכוסה עם רשת פלסטיק קנס (2). שני חוטי חשמל הנושאים נגדי אישומים (3) מודבקים לשקופית משני צדדיו. החוטים מפוצלים ומכופפים כדי לחצות את השקופית (4) פועל מקביל אחד עם השני אבל לא במגע. שכבות של דבק סלוטייפ ברור (5) מתווספים עד שמגיעים לגובה של זבוב (כ 1 מ"מ). ערוץ נחתך דרך הקלטת אנכית (6), בערך 1 מ"מ רוחב כדי להתאים את רוחב של זבוב. פלטפורמה מוגבהת העשויה מנייר דבק ברור (7) בנויה ממש מעל חוטי החשמל כדי ליצור כרית לראש הזבוב בזמן שבית החזה נמצא מעל החוטים. (ב) תרשים סכמטי של הזבוב הממוקם תחת המיקרוסקופ שני-פוטון. גירוי הריח מושג באמצעות מחט תת-עורית הנמצאת מול ראש הזבוב (מוכנס דרך הערוץ בקלטת (6) ובראש הרציף (7) כדי לכוון את הריחות לאנטנה). (ג)-(ח) תיקון ופתיחה של ראש הזבוב. (ג) זבוב קבוע בתוך חדר ההדמיה, בתוך הערוץ (סרגל קנה מידה = 1 מ"מ) ומוחזק במקום על ידי פיסת נייר טרייה של דבק ברור על כל הזבוב. (ד) תצוגה מוגדלת של הזבוב בעמדה. סרגל בקנה מידה = 0.1 מ"מ. (e) חלון נחתך לתוך הקלטת סביב הראש של הזבוב. (ו) הראש קבוע יותר עם דבק בהיר כחול לריפוי. (ז) כמוסת הראש מכוסה בתמיסה של המצלצל ונפתחה. (ח) השלימה את הכנת המוח עם רקמה עודפת וקנה הנשימה (רקמה לבנה לעין (g) הוסרו). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: Postsynaptically-מקומי סידן דמיינו באמצעות dהומר-GCaMP3. (א) מיקרוסקופיה התמונותמראהאת הביטוי של מקומי ציטואלי GCaMP6f (i) ו postsynaptically dהומר מקומי-GCaMP3 (ii) ב תא העצב של פלט MB MVP2. החץ הירוק מציין את אזור המשנה γ1 של γ-האונה של MB. קנה מידה ברים = 15 μm. (ב)-(ד) תמונות שנתפסו באמצעות שני פוטון עירור מיקרוסקופ של גנוסוגים לעיל, מראה vivo פלואורסצנטית של חיישני סידן בהתאמה. (ב) F0 (בסיס פלואורסצנטית) תמונות, הפגינו כהטלה אינטנסיביות ממוצעת של 2 לפני התפרצות ריח. קנה מידה ברים = 10 μm. (ג) F תמונות (הקרינה הפלואורסצנטית במהלך גירוי ריח), הפגינו כתחזית אינטנסיביות ממוצעת על תקופת תגובה ריח (2.5 s). (ד) ΔF תמונות שנוצרו על-ידי הפחתת f0 תמונה מתמונת f, כדי להציג אות תגובה בפועל של ריח. (ה) ΔF/F0 עקבות מן הזבובים לעיל של גנוטיפים בהתאמה באמצעות גירוי ריח (בר אפור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הלמידה הנגרמת באמצעות הפלסטיות הסינפטית דמיינו דרך dהומר-GCaMP3. (א) סכמטית של פרוטוקולי מיזוג המשמשים בניסויים אלה. תגובות ריח נאיבי, לפני התניה ("pre") נמדדים ראשון. אז כל זבוב חווה אחד משלושה פרוטוקולי מיזוג אפשריים: "מזווג", כאשר ריח אחד (CS+) מזווג עם זעזועים חשמליים (ארה ב) ואחר (cs-) אינו מחוזק; "ריחות בלבד", שם רק ריחות מוצגים, שניהם ללא חיזוק, כדי לשלוט על אפקטי חשיפה ריח; ו "זעזועים בלבד", שם רק זעזועים חשמליים מוצגים ללא כל גירוי ריח, כדי לשלוט על השפעות חשיפה בהלם. לאחר שלב זה מיזוג, זבובים חשופים אז "טרום" ריחות שוב כדי לבדוק את הפעילות ריח מעורר משתנה ("Post"). (ב) דוגמה לאפנון לתגובת ריח כתוצאה מהצגת הריח/הלם הזווג. דיכוי חזק של תגובת CS+ ריח ניתן לראות באזור אכולי (קו מנוקד). (ג)-(ה) ריח התגובה העקבות של אותו זבוב כמו ב (ב), מראה כי אפקט הדיכוי הזה מוצג רק במקרה של הריח המיומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הניתוח של המעגלים העצביים שבבסיס הלמידה והזיכרון הוא מטרה בולטת בתחום מדעי המוח. הנגישות הגנטית של דרוזופילה והרוחב והקלות של בדיקות ההתנהגות הופכת את זה לכלי אידיאלי לחקור תופעות כאלה. כאן מוצגת שיטה שבה ניתן לדמיין, בתוך זבובים בודדים, האפנון המתרחשת ברמה תת-תאית כתוצאה ממיזוג הריח. על ידי ביצוע הן טרום אימון והדמיה לאחר האימון של הדינמיקה בסידן מעורר ריח, שהוקמה לראשונה על ידי הקבוצה שלנו17, אפשר לצייר ישירה, בתוך בעלי חיים השוואה בין התגובות ריח נאיבי ולמד, ולכן, בחון את הפלסטיות של הנוירונים בעניינים. זה מעניק יתרון לפרוטוקול זה על ידי הערכות המוניים (משמש מיזוג הריח הקלאסי) כי מדינות טרום והדרכה ניתן לכמת הערכה לאנשים, אשר מאפשר אחד לקבוע בין הפרט שונות. יתר על כן, הליך ההכשרה שבוצעה ישירות מתחת למיקרוסקופ הוא שווה במידה רבה הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח המשמש בדרך כלל ניסויים התנהגותיים ואינו כרוך בגירוי מלאכותי אלקטרואופטיקה של נוירונים. כמובן, טיפול בזבובים הקטנים ובזהירות לפתוח את קפסולת הראש מבלי לפגוע ברקמת המוח תוך שמירה על אברי החישה ללא פגע דורש רמת מומחיות שניתן להשיג על ידי הכשרה קפדנית וחוזרת, לא בניגוד למידה הנראית ב הערכות פיסיולוגיים כגון אלקטרופיזיולוגיה.

בנוסף, הפוטנציאל להשתמש באינדיקטורים הסידן לבדיקת פלסטיות ברמת תא העצב היחיד הוא הפגינו-הוספת דיוק גדול יותר לניתוח המעגל העצבי. זה לידי ביטוי על ידי הצגת דיכאון למידה הנגרמת של תגובה פוסט סינפטית בתוך תא עצב בחקירה היטב של פלט MB28,29. Drosophila ילה זנים המבטא מגוון של חיישני ניאון synaptically מקומי תחת שליטה uas זמינים, למשל, ביטוי presynaptically חיישן מקומי Synaptophysin-GCaMP3 או חיישן פלורסנט אדום של סינפטית שידור Synaptophysin-pHTomato20. כמובן, מגוון של חלבונים החיישן הפלואורסצנטית ניתן ליישם באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל.

טכניקות דימות אופטי הן באופן כללי מוגבל על ידי ברזולוציה הטמפורלית המרחבית של מערכת רכישת תמונה מיקרוסקופיים (למשל, מיקרוסקופ שני פוטון) ואת הרזולוציה הטמפורלית של החיישן עצמו (למשל, קינטיקה של חיישן הסידן). הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, למשל, באמצעות מהדק תיקון אלקטרופיזיולוגיה של הנוירונים במוח Drosophila ילה , עדיין מציעים ברזולוציה הטמפורלית ללא תחרות, אך מבלי לספק שום דיוק מרחבי. בשל הספציפיות של הביטוי הגן בנוירונים הריבית בשילוב עם לוקליזציה subcellular של החיישן, טכניקות דימות אופטי יכול להשלים טכניקות אלקטרופיזיולוגיות כדי לחשוף פלסטיות עצבית בבסיס למידה והיווצרות זיכרון. ההתקדמות המתמשכת בפיתוח של חיישנים פלואורסצנטית אולי יספק את האפשרות לנתיך חלבונים חיישן עם הקינטיקה מהירה יותר או האות לרעש גבוה יותר (g., GCaMP6 משתנים23) עם חלבונים synaptically המותאמות לשפות אחרות . כמו הומר די כמו כן, ההתקדמות האחרונה בהקמת טכניקות מיקרוסקופיים עם שיעורי רכישה מהירה יותר או רזולוציה מרחבית גבוהה יותר יוכיח ערך רב יותר בכוונון עדין של הגישה שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המועצה למחקר גרמני באמצעות מרכז מחקר שיתופי SFB 889 "מנגנונים של עיבוד חושי" ואת יחידת המחקר עבור 2705 "חיתוך של מעגל המוח: מבנה, פלסטיות ותפקוד התנהגותי של ה דרוזופילה . גוף פטרייה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octen-3-ol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA O5284 Chemical used as odorant
3-Octanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 218405 Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 153095 Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape Tesa SE, Norderstedt, Germany Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 10053-09 Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 11412-11 Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany 4665120 1.20x40mm
Insect Minutien pins Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 26002-10 Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK 953683 Blue light-curing glue
Microscope slide Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany 0656.1 Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M8410 Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany 421452-9900-000 Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution n.a. n.a. 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA 72-1551 5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK 0303 Product No. 11
Surgical scalpel handle Swann-Morton, Sheffield, UK 0907 Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger
from the odor-delivery device and the electric shock
application device (power supply) to interact with the
ZEN software from Zeiss that controls the microscope.
Custom-written and available upon request n.a. n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
  2. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  3. Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369, (1633), (2013).
  4. Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
  5. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21, (1), 1-11 (2011).
  6. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71, (3), 708-712 (1974).
  7. Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2, (1), 1-30 (1985).
  8. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263, (5147), 692-695 (1994).
  9. Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14, (6), 737-744 (2004).
  10. Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
  11. Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
  12. Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
  13. Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23, (1-2), 156-172 (2009).
  14. Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521, (17), 3992-4026 (2013).
  15. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
  16. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
  17. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15, (21), 1953-1960 (2005).
  18. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, (2), 202-230 (2011).
  19. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820, (8), 1169-1178 (2012).
  20. Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10, (12), 2083-2095 (2015).
  21. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, (2), 137-141 (2001).
  23. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, (7458), 295-300 (2013).
  24. Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16, (17), 5443-5456 (1996).
  25. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, (2), 401-415 (1993).
  26. Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  28. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88, (5), 985-998 (2015).
  29. Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86, (2), 417-427 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics