在Vivo光学钙成像学习诱导突触可塑性在果蝇黑色素增生

Neuroscience

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Summary

在这里,我们提出了一个协议,其中前和/或午睡钙可以在果蝇学习和记忆的上下文中可视化。体内钙成像使用显着局部钙传感器与经典的嗅觉调节范式相结合,因此可以确定这种类型的关联学习背后的突触可塑性。

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Hancock, C. E., Bilz, F., Fiala, A. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (152), e60288, doi:10.3791/60288 (2019).

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Abstract

几十年来对许多模型生物体的研究导致了目前作为学习和记忆形成基础的突触可塑性的概念。突触传播中由学习引起的变化通常分布在大脑的许多神经元和处理水平上。因此,需要一些方法来可视化神经元间学习依赖性突触可塑性。果蝇果蝇黑色素体是研究学习基础神经元回路的一个特别有利的模型有机体。这里提出的协议演示了一种方式,其中可以监测形成关联嗅觉记忆的过程,即突触活动及其变化。利用果蝇中现有的广泛遗传工具,可以具体表达确定细胞群甚至单个细胞中的遗传编码钙指标。通过将苍蝇固定到位,并打开头部胶囊,可以在提供嗅觉刺激的同时,可视化这些细胞中的钙动力学。此外,我们演示了一种设置,即苍蝇可以同时受到对身体的电击。这提供了一个系统,苍蝇可以经历经典的嗅觉调节 - 其中以前天真的气味被学习与电击惩罚 - 同时,这种气味(和其他未经训练的气味)的表示是通过双光子显微镜在大脑中观察到。我们的实验室以前曾报告过合成局部钙传感器的产生,这使得人们可以将荧光钙信号限制在午睡前或午合室。双光子显微镜提供了一种在空间上解决精细结构的方法。我们通过关注神经元来整合来自蘑菇体内的信息,这是昆虫大脑的高阶中心,从而说明了这一点。总体而言,该协议提供了一个检查神经元之间的突触连接的方法,这些神经元的活动由于嗅觉学习而被调节。

Introduction

通过学习在大脑中获取信息的位置和方式,然后存储为记忆,是神经科学最具挑战性的任务之一。神经科学研究已经导致突触传播的概念改变,作为神经元基质的基础,学习和记忆形成2,3。据推测,在学习期间,在刺激感知期间活跃的神经元集合之间的突触连接会被修改,从而在记忆记忆记忆期间可以检索其组合活动模式,从而指导未来的行为行动4。这些"基因细胞"及其突触通常分布在大脑区域和处理水平,这使得很难将突触传播的观察到的变化分配给学习任务或刺激。要本地化和可视化那些与特定学习任务有因果关系的突触变化,需要一个适当的模型系统,以便精确限制这些突触。

对于这样的努力,果蝇黑色素是特别适合的,因为它结合了相对的大脑简单性,行为丰富,和实验可访问性。在成熟的模型生物中,果蝇位于线虫基因可处理的哺乳动物(如小鼠)之间的神经元复杂性。在C.elegans中观察到神经元的立体数量(+300)和有限的行为表谱。另一方面,哺乳动物拥有数百万个神经元和惊人的行为复杂性。果蝇的大脑有10万欧元,神经元比大多数脊椎动物的大脑小得多,许多神经元是单独可识别的5。然而,果蝇表现出广泛的复杂行为,包括表现出强大的关联嗅觉学习和记忆形成的能力,第一次描述超过40年前6。在这个经典的调理过程中,成群的苍蝇受到一种气味作为条件刺激(CS+),而他们接受惩罚电击作为无条件的刺激(美国)。然后,第二种气味 ( CS-) 被呈现,没有任何惩罚.因此,动物学会避免与惩罚相关的气味,这可以在两种气味,CS+和CS-之间的后续选择情况进行测试。在果蝇中解剖这种行为背后的神经元基质的工作已经确定蘑菇体(MB)是"engram"7、8、9、10的主要部位。因此,这个大脑区域的电路是,也是密集研究的主题,以揭示记忆密码被获取和存储的逻辑(最近回顾在11,12)。

果蝇MB由每半球2,000个内在神经元(Kenyon细胞)组成,以平行的斧子投影13组织。嗅觉投影神经元的斧子扩展到侧原体和MB calyces,MB的主要树突输入位点,并从天线叶接收嗅觉输入。长,平行的斧子束的肯扬细胞构成脚轮和叶。大多数Kenyon细胞通过将一个抵押品伸向大脑的中线,形成水平β/β-叶,并通过向背向前方向延伸第二个抵押品,形成水平β/β-叶。另一组肯扬细胞形成MB的水平β-叶13,其中学习过程和随后的短期记忆形成可以本地化10。MB 叶接收一个正位输入并提供有效输出,这两个输出通常都限制在肯扬细胞斧14、15、16上不同的隔间子区域。特别是,一个多巴胺能MB输入神经元已被证明调解基于价值,例如,惩罚性,增强作用在关联嗅觉学习15,17。来自蘑菇体叶的立体和单独可识别的可识别的 MB 输出神经元集成了大量 Kenyon 细胞中的信息,针对不同的大脑区域,并承担行为指导性或厌恶性信息15.这种神经元结构导致了关联形图的组织概念。气味由稀疏激活的Kenyon细胞集合相对精确编码。这些Kenyon细胞组合的重合活性和多巴胺的释放 - 通过惩罚刺激引起的 - 调节从Kenyon细胞前突子到MB输出神经元的传输,使动物随后避免这种特殊的气味10 , 12.我们使用这个相当精确定义和本地化的语法作为范例案例来说明如何确定和监测突触活动中的这些与学习相关的变化。

果蝇作为模型系统的价值强烈依赖于无与伦比的基因工具箱,它允许人们表达转基因,以识别,监测和控制复杂电路18中的单个神经元。神经元活动监测技术的出现(如钙成像,这里讨论)使得能够确定神经元活动模式以响应特定的刺激。通过将基因编码的钙指标(GECIs)的特定Gal4驱动表达与嗅觉刺激相结合,可以可视化感兴趣的神经元的异味引起的钙动力学19。在此协议中,通过进一步将此技术与经典调理范式耦合,可以在学习环境中检查这些嗅觉响应。学习诱导的可塑性可以使用 GECIs 进一步解剖,这些 GECIs 不仅被本地化为单个特定神经元,而且还可分解到神经元的特定子隔间。Pech等人20建立了一系列工具,正是允许这一点。通过将GCaMP321定位到前或后发孔-通过与脊椎动物突触素或d荷马,分别20个链接- 这些位点的差分调制可以区分。在此上下文中,这种本地化比大多数在细胞醇中普遍存在的 GECA 具有优势,例如,GCaMP 22、GCaMP321或 GCaMP623 ,因为这意味着前和后瞬变可以区别于神经元激活后发生的整体综合钙流入。这可以提供有关由于或导致学习和记忆形成而发生的可塑性的位置和类型的线索。例如,此处提供的协议显示了此工具在嗅觉关联学习期间破译 MB 输出神经元调制的价值,将钙传感器的表达定向到仅对贴子的表达。通过监测,在单个苍蝇内,嗅觉调理前后的异味活动可以直接比较天真的气味反应和所学的气味反应。虽然固定在同一成像室,苍蝇暴露于多种气味。然后,他们收到一个厌恶的关联调理协议,其中一种气味与电击(成为CS+)配对,而另一种气味在没有强化的情况下呈现(成为CS-)。最后,苍蝇再次暴露在与第一步相同的气味中。使用双光子显微镜观察钙动力学。

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Protocol

1. 转基因果蝇,果蝇黑色素

  1. 交叉雌性处女和雄蝇(在12小时光/暗周期中,在60%的相对湿度下提高25°C)分别携带所需的Gal4和UAS构造25,以产生苍蝇,其中感兴趣的特定神经元表示基因编码钙指示器。
  2. 年龄的雌性后代的上述十字架,直到他们在3-6天后,环状。雌性苍蝇更可取,因为它们的体型稍大。

2. 果蝇在体内培养钙成像的制剂

  1. 选择一只雌性苍蝇,在冰上麻醉不超过5分钟。
  2. 使用精细钳子,将苍蝇放入成像室(如图 1 c所示)。确保胸部和腿部与造型室底部的电线接触,并确保头部平放。使用透明胶带固定苍蝇的位置。
    注:此协议需要一个定制的腔室,其中苍蝇是固定的,头部胶囊可以打开,苍蝇能够同时受到天线的气味刺激和对胸部和腿部的电击(图1)。
  3. 使用固定在手术刀手柄上的手术手术刀刀片(见材料表),在苍蝇头部的胶带上切开一个窗口,使天线被覆盖,只有胸腔的前半部分暴露。
  4. 用蓝光固化胶包围头部的两侧和背面,使用凹凸钳口持有的昆虫销进行精心操作。使用蓝色发光 LED 灯设置胶水。
  5. 检查胶水是否完全设置,并清除飞头背表面残留的未硬化胶水。
  6. 应用环铃溶液24(材料表)覆盖头部裸露的角质。
  7. 使用非常细刀片的刺刀,穿过角质层。为了最有效地去除角质层,首先使用 ocelli 作为起点穿过头部的后部。然后,切开每一侧,中联眼睛,形成角质的皮瓣,可以很容易地撕掉使用钳子。
  8. 去除任何可能阻塞大脑感兴趣区域的多余的角质层。
  9. 小心清除任何气管的背表面使用精细的钳子,避免脑组织本身中断。根据需要清除环鸣器溶液24(参见材料表),以清除组织碎片区域。
  10. 将皮下气味输送针放在位置,距离苍蝇头部约 1 厘米。确保没有任何东西会阻碍气味传递到天线。
  11. 在显微镜下,通过皮下气味输送针将成像室连接到气味输送系统。
  12. 为了让苍蝇完全从麻醉和手术中恢复,并适应气流,在此阶段实施10分钟的休息期。

3. 体内钙成像

  1. 使用装有红外激光和水浸物的多光子显微镜(见材料表),安装在振动隔离的桌子上。为了可视化基于GFP的钙指标,将激光调谐到920nm的激发波长,并安装GFP带通滤波器。
  2. 使用粗 Z 调节旋钮,扫描大脑 Z 轴并定位感兴趣的大脑区域。使用裁剪函数仅将扫描焦点集中在此区域,以最小化扫描时间,并旋转扫描视图,使头部前朝下。
  3. 将帧大小调整为 512 x 512 px,扫描速度调整为 > 4 Hz,以及扫描区域(在 Y 维度中),以便覆盖感兴趣的神经元。

4. 通过嗅觉调节,气味引起的钙瞬变的可视化

  1. 使用气味传递系统19,26,可以提供几个气味刺激在时间上精确的方式。
    1. 使用额外的计算机来控制设备,并与成像显微镜软件通信,在实验期间将气味刺激与图像捕获进行协调。
    2. 启动一个预编程的宏包,能够连接图像采集软件和气味传递程序(例如,安装在显微镜控制软件中的 VBA 宏包,参见材料表),该软件包可响应外部输入在单独的程序中启动气味传递协议提供的触发器)。
  2. 通过监测"预训练"/以512 x 512 px和4 Hz的帧速率监测"预训练"/鼻气味引起的钙瞬变开始测量。 提供2.5 s气味刺激,并额外采集6.25s之前的气味(建立F0基线值)和 12.5 s 后气味偏移。用第二个气味剂重复,然后用第三个气味剂重复。
  3. 继续 3 分钟后,这个测量与经典条件 ("训练") 苍蝇.
    1. 选择在"预训练"阶段呈现的气味之一,成为 CS+气味,而另一种成为 CS气味。使用计算机控制的气味传递系统呈现 CS+气味,用于 60 s 和 12 个 90 V 电击。
    2. 休息60小时后,单独呈现CS气味60s。用作异味剂4-甲基环己烷醇和3-辛醇。在本次培训期间,请勿出示第三种异味剂(例如 1-octen-3-ol),因为它仅在培训阶段(步骤 4.2.)之前和之后(步骤 4.4)用作控制。
  4. 在完成训练阶段(步骤 4.3)后 3 分钟,通过重复"训练前"气味刺激方案(步骤 4.2.),再次测量"训练后"异味引起的钙瞬变。
    注:此步骤的时间应反映记忆形成后的兴趣时间(例如,在调理步骤后 3-4 分钟执行此步骤以调查短期记忆)。通常,苍蝇可以生存几个小时,在这种准备。
  5. 以适当的格式(例如 Tiff)保存映像文件,以便以后进行图像分析。

5. 图像分析

  1. 要分析图像,请打开图像分析软件中的 Tiff(或类似)文件,如斐济27
  2. 使用移动校正算法对齐堆栈,以确保 X 和 Y 方向的最小移动。丢弃在 Z 轴中显示强运动的任何录像。
  3. 选择用于标记要检查的区域周围的感兴趣区域 (ROI) 的软件工具。这应尽可能精确,以限制背景荧光的影响。
  4. 使用软件的相应工具从所选 ROI 中提取时光荧光强度数据作为数据文件,以便为录制的每一帧生成值。
  5. 使用数据分析程序打开数据,以计算每个气味痕迹的 μF/F0值。F0 = 气味出现前 2 s 中的平均荧光。[F ] 给定帧中的原始荧光与 F0之间的差值。从这些值中,计算每个帧的 μF/F0值,该值可随时间绘制,以反映整个气味刺激周期的相对荧光。

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Representative Results

图2中可以看到使用上述协议获取的图像示例。d荷马-GCaMP3在MB输出神经元中表示,其树突内压在MB+-lobe的隔间1(神经元称为MVP228,29),并使用分裂Gal4线MB112C16进行基因定位。此外,演示的还有细胞细胞的亚细胞定位和合成后局部钙指标的差异。在比较图 2a图 2f时,可以清楚地观察到 dHomer-GCaMP3 传感器14的特定、分段表达式 - 神经元的正交室中没有表达式,并且可以看到一个穿插信号在树突状的隔间里。清晰 - 虽然较低的振幅 - 气味反应可以看到在苍蝇表达dHomer-GCaMP3 (图 2,下面板), 相比苍蝇表达细胞性 GCaMP6f23图 2,上面板).这表明该工具在柱塞水平上对嗅觉反应的可视化是有效的,因此,为检查基础的神经回路(在本例中为气味编码和气味编码)提供了额外的特异性。嗅觉学习。

后者的示例如图3所示。在本实验中,dHomer-GCaMP3如图2所示 - 在蘑菇体输出神经元MVP2中。这是一个已知通过嗅觉学习调节的神经元,因此,由于异味性嗅觉调理而导致的前突触性抑郁症反映在对训练气味28、29和此处的已故后嗅觉反应中,这一结果的确认显示使用这种体内钙成像方案。图 3所示的钙痕量代表来自单个苍蝇的模范数据。请注意,噪声级别和振幅可能因各个准备情况而异(例如,比较图 2e图 3c-e)。因此,训练前与训练后动物内的比较提供了一种解释个体间变异性的方法。当然,该协议是适合转移到成像的其他感兴趣的神经元。

Figure 1
图1:建造安装室和准备一只飞来成像。a) 建造飞装室的步骤.底座由标准显微镜幻灯片 (1) 组成,上面覆盖着精细的塑料网 (2)。两根带有相反电荷 (3) 的电线粘附在两侧的滑轨上。导线被剥离和弯曲,以穿过彼此平行的滑轨 (4),但不接触。加入透明胶带(5)层,直到达到苍蝇的高度(约1毫米)。通道垂直穿过胶带 (6),宽约 1 mm,以适合苍蝇的宽度。由透明胶带(7)制成的高架平台建在电线的正上方,在胸腔位于电线顶部时,形成苍蝇头部的枕头。(b) 位于双光子显微镜下的苍蝇的示意图。气味刺激是通过位于苍蝇头部前面的皮下针实现的(通过胶带 (6) 中的通道插入和平台 (7) 顶部,将气味引导到天线上)。(c) - (h) 固定和打开苍蝇头.(c) 固定在成像室内、通道内(Scale bar = 1 mm)内的苍蝇,并在整个飞行中用一块新的透明胶带固定到位。(d) 放大位置的苍蝇视图。比例尺 = 0.1 mm. (e) 一个窗口被切入苍蝇头部周围的胶带中.(f) 头部用蓝光固化胶进一步固定。(g) 头胶囊被林格溶液覆盖并打开.(h) 完成大脑制备,并清除多余的组织和气管(在 (g) 中可见的白色组织)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:使用d荷马-GCaMP3可视化的后同步局部钙。a) 共聚焦显微镜图像,显示在 MB 输出神经元 MVP2 中,细胞局部化的 GCaMP6f (i) 和后同步本地化dHomer-GCaMP3 (ii) 的表达。绿色箭头表示 MB + 叶的 #1 子位。刻度条 = 15 μm.(b)-(d) 使用上述基因型的双光子激发显微镜捕获的图像,显示相应钙传感器的体内荧光。(b) F0(基线荧光)图像,在气味出现前以2s的平均强度投影显示。刻度条 = 10 μm. (c) F气味图像(气味刺激期间的荧光),表现为气味响应周期 (2.5 s) 的平均强度投影。(d ) α F 图像通过从 F气味图像中减去 F0图像生成,以显示实际气味响应信号。(e) [F/F0通过气味刺激(灰色条) 从上述苍蝇中追踪到各自基因型的苍蝇。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:通过dHomer-GCaMP3可视化学习诱导的贴贴可塑性。a) 这些实验中使用的调节协议原理图.在先测量调理("预")之前,先有异味反应。然后,每只苍蝇都会经历三种可能的调节协议之一:"配对",其中一种气味(CS+)与电击(美国)配对,另一种(CS-)不强化;"仅气味",其中只呈现气味,两者均无加固,以控制气味暴露效果;和"仅冲击",其中只提出电击没有任何气味刺激,以控制冲击暴露效果。在此调节阶段后,苍蝇将再次暴露在"预"气味中,以测试改变的气味诱发活动("后")。(b) 由成对气味/休克呈现产生的气味反应调制示例。在 #1 分区域(虚线)中可以看到对 CS+气味的反应的强烈抑制。(c) - (e) 气味响应痕迹来自同一苍蝇 (b), 表明这种抑制作用仅在训练过的气味的情况下才观察到。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

神经回路的解剖是神经科学领域的一个突出目标。果蝇的遗传可及性以及行为测试的广度和易用性使其成为研究此类现象的理想工具。在这里,提出了一种方法,可以在单个苍蝇中可视化由于嗅觉调节而在亚细胞水平上发生的调制。通过进行预训练和训练后对气味引起的钙动力学的可视化(由我们第17组首先建立),可以在天真和学到的气味反应之间画出直接的、动物内部的比较,因此,检查感兴趣的神经元的可塑性。这赋予了该协议比大规模评估(用于经典嗅觉)的优势,因为培训前和训练后状态可以定量评估个人,这允许一个人确定个人之间变异性。此外,直接在显微镜下进行的训练过程基本上等同于行为实验中通常使用的经典嗅觉调节范式,不涉及神经元的人工光遗传学刺激。当然,处理小苍蝇,小心地打开头部胶囊,同时不损害脑组织,同时保持感觉器官完好无损,需要一定程度的专业知识,可以通过细致和反复的训练,与在生理评估,如电生理学。

此外,还证明了使用局部钙指标检查单神经元水平的可塑性的潜力 - 为神经元回路解剖增加更高的精度。这通过在经过充分调查的MB输出神经元28,29中显示一个学习引起的午睡反应的抑郁就证明了这一点。在UAS控制下,提供表达各种协同局部荧光传感器的果蝇菌株,例如,表示预同步局部传感器Synaptophysin-GCaMP3或突触的红色荧光传感器传输突触素-pHTomato20.当然,可以使用上述协议实现荧光传感器蛋白的各种。

光学成像技术一般受到微观图像采集系统(例如双光子显微镜)的时间和空间分辨率以及传感器本身的时间分辨率(例如钙传感器的动力学)的限制。电生理记录,例如,使用贴片夹电生理学从果蝇大脑中的神经元的somata,仍然提供无与伦比的时间分辨率,但不提供任何空间精度。由于感兴趣的神经元中基因表达的特异性与传感器的亚细胞定位相结合,光学成像技术可以补充电生理技术,以揭示神经元的可塑性学习和记忆的形成。荧光传感器的不断发展可能为具有更快的动力学或更高的信噪比(例如,GCaMP6 变体23)的传感器蛋白提供与协同局部蛋白质融合的可能性像d荷马。此外,在建立具有更快采集率或更高空间分辨率的微观技术方面的最新进展将证明对于进一步优化我们的方法是无价的。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了德国研究委员会的支持,通过合作研究中心SFB 889"感官处理机制"和2705年"脑回路解剖:结构,可塑性和行为功能" 果蝇蘑菇体"。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octen-3-ol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA O5284 Chemical used as odorant
3-Octanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 218405 Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 153095 Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape Tesa SE, Norderstedt, Germany Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 10053-09 Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 11412-11 Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany 4665120 1.20x40mm
Insect Minutien pins Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 26002-10 Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK 953683 Blue light-curing glue
Microscope slide Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany 0656.1 Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M8410 Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany 421452-9900-000 Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution n.a. n.a. 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA 72-1551 5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK 0303 Product No. 11
Surgical scalpel handle Swann-Morton, Sheffield, UK 0907 Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger
from the odor-delivery device and the electric shock
application device (power supply) to interact with the
ZEN software from Zeiss that controls the microscope.
Custom-written and available upon request n.a. n.a.

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