पांच कशेरुकी समूहों में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र माइक्रोवेसल्स का विश्वसनीय अलगाव

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Neuroscience

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Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य लिसेंसेफेलिक और जायरेंसेफलिक कशेरुकी के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई क्षेत्रों से माइक्रोवेसल्स को अलग करना है।

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Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M. L., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

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Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से सूक्ष्म जहाजों का अलगाव आमतौर पर कई जानवरों से कॉर्टिकल ऊतक के संयोजन से किया जाता है, अक्सर कृंतक। यह दृष्टिकोण कॉर्टेक्स के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) गुणों की पूछताछ को सीमित करता है और व्यक्तिगत तुलना के लिए अनुमति नहीं देता है। यह परियोजना एक अलगाव विधि के विकास पर केंद्रित है जो कई सीएनएस क्षेत्रों से न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (एनवीयू) की तुलना के लिए अनुमति देती है: कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ऑप्टिक पालि, हाइपोथैलेमस, पिट्यूटरी, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी। इसके अलावा, मूल रूप से मूत्र के नमूनों के लिए विकसित इस प्रोटोकॉल को छोटे और बड़े कशेरुकी प्रजातियों से सीएनएस ऊतकों पर उपयोग के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया था, जिसमें से हम मस्तिष्क गोलार्द्ध सफेद पदार्थ से सूक्ष्म जहाजों को अलग करने में भी सक्षम हैं। यह विधि, इम्यूनोलेबलिंग के साथ जोड़े जाने पर, प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा और व्यक्तियों, ऊतक प्रकार या उपचार के बीच सांख्यिकीय तुलना की अनुमति देती है। हमने प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई), न्यूरोफ्लेमेटरी रोग, मल्टीपल स्क्लेरोसिस के एक मूत्र मॉडल के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का मूल्यांकन करके इस प्रयोज्यता को साबित किया। इसके अतिरिक्त, इस विधि से अलग किए गए माइक्रोवेसल्स का उपयोग क्यूपीसीआर, आरएनए-सीक्यू और पश्चिमी दाग जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। हालांकि अल्ट्रासेंट्रियूज़ेशन या एंजामेटिक विच्छेदन के उपयोग के बिना सीएनएस माइक्रोवेसल्स को अलग करने का यह पहला प्रयास नहीं है, यह एकल व्यक्तियों और कई सीएनएस क्षेत्रों की तुलना के लिए अपनी माहिरता में अद्वितीय है। इसलिए, यह मतभेदों की एक श्रृंखला की जांच के लिए अनुमति देता है जो अन्यथा अस्पष्ट रह सकते हैं: सीएनएस भाग (कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ऑप्टिक पालि, ब्रेनस्टेम, हाइपोथैलेमस, पिट्यूटरी, और रीढ़ की हड्डी), सीएनएस ऊतक प्रकार (ग्रे या सफेद पदार्थ), व्यक्ति, प्रयोगात्मक उपचार समूहों, और प्रजातियों।

Introduction

हमारा मस्तिष्क हमारे शरीर में सबसे महत्वपूर्ण अंग है। इस कारण से, बाहरी कारकों के बावजूद मस्तिष्क होमोस्टोसिस रखना जो सामान्य स्थिति से विचलन को ट्रिगर कर सकता है, एक प्राथमिकता है। कुछ विद्वानों के अनुसार, लगभग 400-500 मिलियन साल पहले1,कशेरुकी जानवरों का विकास किया गया जो अब हम रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी)2,3के रूप में जानते हैं। यह सुरक्षात्मक "बाड़" रक्त और सीएनएस परन्चिमा के बीच आयनों, अणुओं और कोशिकाओं के परिवहन को कसकर विनियमित करके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) होमोस्टोसिस और कार्यों पर सबसे बड़ा प्रभाव डालती है। जब बीबीबी बाधित होता है, तो मस्तिष्क विषाक्त जोखिम, संक्रमण और सूजन के लिए अतिसंवेदनशील हो जाता है। इसलिए, बीबीबी रोग कई लोगों के साथ जुड़ा हुआ है, यदि सभी नहीं, न्यूरोलॉजिकल और न्यूरोडेवलपमेंटल विकार4,5,6।

बीबीबी के परिष्कृत कार्य को न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (एनवीयू)2,3द्वारा अनुरूप अद्वितीय सीएनएस माइक्रोवेस्कुल्चर के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। अत्यधिक विशेष एंडोथेलियल कोशिकाएं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइटिक एंड-फीट एनवीयू2,3के सेलुलर घटक हैं। इन कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न अतिरिक्त मैट्रिक्स एनवीयू और बीबीबी फिजियोलॉजी2,3के लिए भी आवश्यक है । यद्यपि एनवीयू के आवश्यक सेलुलर और आणविक घटकों को कशेरुकी के बीच संरक्षित किया जाता है, लेकिन7,8आदेशोंऔर प्रजातियों के बीच विषमता की सूचना दी जाती है। हालांकि, तकनीकी सीमाएं न्यूरोबायोलॉजी, बायोमेडिकल या ट्रांसलेशनल अनुसंधान में इन मतभेदों पर पूरी तरह से विचार करने की हमारी क्षमता में बाधा डालती हैं।

इस वजह से, हमने एक सीएनएस क्षेत्र-विशिष्ट माइक्रोवेसल-आइसोलेशन विधि का विस्तार किया ताकि इसे सभी पांच कशेरुकी समूहों से कई प्रजातियों पर लागू किया जा सके: मछली, उभयचर, सरीसृप, पक्षी और स्तनधारी। प्रोटोकॉल को छोटे-लिसेसेफेलिक और बड़े-जायरेंसेफेलिक कशेरुकी पर उपयोग के लिए वर्णित किया गया है, जिसमें अनुवादप्रासंगिक प्रासंगिकता9वाली प्रजातियां शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, हम सीएनएस के अन्य क्षेत्रों को इस संदर्भ में पहले जांच नहीं करते हैं, लेकिन न्यूरोफिजियोलॉजी के लिए प्रासंगिक और जबरदस्त नैदानिक प्रभावों के साथ: हाइपोथैलेमस, पीयूष और सफेद पदार्थ। अंत में, हमने एनवीयू और/या बीबीबी9,10,11के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में इस अलगाव विधि की क्षमता का परीक्षण किया । एक सबूत की अवधारणा के रूप में, हमने दिखाया कि प्रतिरक्षण के बाद अलगाव विधि का उपयोग करई के दौरान वीसीएएम-1 और जैम-बी अभिव्यक्ति में परिवर्तन कैसे निर्धारित किया जाए।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन की सभी प्रक्रियाएं कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (यूसी), डेविस इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा निर्धारित दिशा-निर्देशों के अनुसार हैं । यूसी डेविस में पशु देखभाल कई स्वतंत्र संसाधनों द्वारा विनियमित है और पूरी तरह से मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल इंटरनेशनल (AAALAC) के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा १९६६ के बाद से मांयता प्राप्त किया गया है । पोर्सिन सीएनएस ऊतक ों को यूसीडी डिपार्टमेंट ऑफ एनिमल साइंसेज, मीट साइंसेज लेबोरेटरी से प्राप्त किया गया था । रीसस मकाक से सीएनएस ऊतक कैलिफोर्निया नेशनल रहनुमा रिसर्च सेंटर पैथोलॉजी विभाग (एनआईएच पी51OD011107) से प्राप्त किए गए थे। सूअरों और मकाक पर प्रयोगशाला के कर्मचारियों द्वारा कोई संज्ञाहरण, इच्छामृत्यु या नेक्रॉप्सी नहीं की गई थी। इसलिए, इन मामलों के संबंध में कोई विशेष सिफारिशें नहीं की गई हैं।

नोट: इस विधि को कई प्रजातियों के लिए मान्य किया गया था, लेकिन प्रदान किया गया प्रोटोकॉल माउस और पोर्सिन ऊतकों से अधिक सीधे मेल खाता है। स्तनधारी नमूनों का उपयोग करते समय ऑप्टिक पालि से संबंधित विवरण लागू नहीं होते हैं। सभी जैव खतरनाक सामग्रियों को एक उपयुक्त जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) सुविधा में संभाला जाना चाहिए। सभी तीव्रता से विषाक्त सामग्री एक धुएं हुड के नीचे संभाला जाना चाहिए । सभी जैव खतरनाक चिकित्सा अपशिष्ट और तीव्रता से विषाक्त अपशिष्ट का उचित निपटान किया जाना चाहिए।

1. तैयारी

  1. समाधान तैयार करें(तालिका 1)कम से कम एक दिन आगे।
    नोट: 70 केडीए आणविक वजन (मेगावाट) dextran को भंग करना बहुत मुश्किल है। यह समाधान रात ोंरात या तो पैराफिन फिल्म या पन्नी के साथ कवर हलचल करने के लिए और अधिक कुशल है । प्रोटोकॉल जांच के तहत नमूने के आधार पर दो अलग एमवी-2 समाधान का उपयोग करने की आवश्यकता है। 18% dextran कुशलता से माइक्रोवेसल गोली से myelin अलग जब छोटे lissencephalic नमूनों पर प्रोटोकॉल प्रदर्शन । हालांकि, यह बड़े जायरेंसेफलिक नमूनों से सीएनएस ऊतकों के इंटरफ़ेस के भीतर मायलिन का एक धब्बा विकसित करता है, साथ ही हाइपोथैलेमस और छोटे नमूनों से पीयूष भी विकसित करता है। इस धब्बा को 20% dextran का उपयोग करके रोका जाता है।
  2. पॉली-डी-लाइसेन के प्रति अच्छी तरह से 50 माइक्रोन लोड करके अच्छी तरह से स्लाइड तैयार करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे के लिए सूखने दें, अधिमानतः जैविक सुरक्षा कैबिनेट-श्रेणी 2 (बीएससी-2) में। अधिक सूखी मत करो। फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ दो बार कुल्ला करें और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक फ्रिज में रखें।

2. सीएनएस ऊतक विच्छेदन छोटे Lissencephalic कशेरुकी नमूना से

नोट: लेख एक C57BL6/J, 10 सप्ताह पुराने, ~ 25 ग्राम, पुरुष माउस पर प्रोटोकॉल के आवेदन को दर्शाता है ।

  1. प्रति नमूना एमवी-1 समाधान के क्रमशः 5 एमएल और 1 मीटर के साथ दो 15 एमएआर शंकुट्यूब और 1.7 एमएल माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब तैयार करें। बर्फ पर ट्यूब रखें।
  2. एनेस्थेटाइजेशन
    1. एक केटामाइन, जाइलाज़ीन, और एसीप्रोमाज़ीन एनेस्थेटिक कॉकटेल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को 100/10/3 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम शरीर के वजन पर एनेस्थेटोनेल इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटिज़ करें और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। एक आंख को छूने और एक पैर चुटकी, क्रमशः द्वारा पालेब्राल और पेडल सजगता की अनुपस्थिति का आकलन करके संज्ञाहरण की पुष्टि करें ।
    2. एक प्रेरण संज्ञाहरण बॉक्स का उपयोग कर5% आइसोफ्लोरीन के साँस लेद्वारा कबूतरों को एनेस्थेटाइज़ करें।
    3. 1% ट्रिकेन में मछली और मेंढक को क्रमशः पानी की टंकी या उभयचर रिंगर के समाधान(सामग्री की तालिका)में एनेस्थेटाइज़ करें।
    4. इच्छामृत्यु से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करके छिपकली को एनेस्थेटाइज़ करें।
  3. सर्जिकल कैंची के साथ जानवर को काटना, खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए संदंश के साथ त्वचा को छील, और फोरमेन मैग्नम (चित्रा 1ए)के माध्यम से LaGrange कैंची के साथ काट दिया ।
  4. मस्तिष्क को स्पैटुला के साथ काटना और एमवी-1 समाधान के साथ 15 एमएल शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ पर ट्यूब रखें।
  5. खोपड़ी के सेला टर्सिका से संदंश के साथ पिट्यूटरी को पुनः प्राप्त करें और एमवी-1 समाधान के साथ 1.7 मिलीएम माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ पर ट्यूब रखें।
  6. कशेरुकी कॉलम को बेनकाब करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों को हटा दें। अंगों, रिब पिंजरे, और आंतरिक अंगों को काट लें(चित्रा 1बी)।
  7. नीचे वर्णित दो तरीकों में से एक द्वारा रीढ़ की हड्डी को विच्छेदन करें। फिर, एमवी-1 समाधान के साथ 5 एमएल शंकुट्यूब पर स्थानांतरित करें। बर्फ पर ट्यूब रखें।
    1. काठ की डोरी तक पहुंचने तक, ग्रीवा कशेरुकी फोरमेनके माध्यम से शुरू करते हुए, लागरेंज कैंची के साथ कौडल दिशा में रोस्ट्रल में काटकर लेमिनेक्टोमी करें।
    2. एक कौडल में रोस्ट्रल दिशा में एक 18 जी सुई और एमवी-1 समाधान के साथ भरी हुई 10 मिलीएल सिरिंज के साथ रोस्ट्रल दिशा में फ्लशिंग प्रदर्शन करें(चित्रा 1सी, डी)
      नोट: यह विधि केवल बहुत छोटे नमूनों के साथ काम करती है, ज्यादातर कृंतक (<100 ग्राम)।
  8. विच्छेदन के दायरे का उपयोग करके, वसंत कैंची के साथ रीढ़ की हड्डी से ड्यूरल थैली को काट दें और शेष मेनिंग्स को डबल-आयामी पिक(चित्रा 2)के साथ हटा दें।
  9. मस्तिष्क को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और विच्छेदन के दायरे का उपयोग करके, मेनिंग्स को डबल-आयामी पिक(चित्रा 2ए-सी)के साथ हटा दें।
  10. घ्राण बल्ब और संदंश, आईरिस कैंची, और वसंत कैंची के साथ थैलेसीमिया आबकारी। डबल-आयामी पिक का उपयोग करके, सभी मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से कोरॉयड प्लेक्सस को हटा दें। सभी कोरॉयड प्लेक्सस को हटाना सुनिश्चित करें।
    नोट: कोरॉयड प्लेक्सस और घ्राण बल्ब संदूषण का एक विशाल स्रोत हैं। बीबीबी के विपरीत, इन केशिकाओं को अत्यधिक फेनेटेड किया जाता है और यदि उन्हें हटाया नहीं जाता है तो बाद के प्रयोगों के परिणामों से समझौता किया जाएगा।
  11. संदंश का उपयोग करना, अलग सीएनएस क्षेत्रों को अलग करें: कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम, ऑप्टिक पालि (स्तनधारी नमूनों पर नहीं), और हाइपोथैलेमस।

3. सीएनएस ऊतक विच्छेदन से एक बड़े Gyrencephalic कशेरुकी नमूना

नोट: यह प्रोटोकॉल बूचड़खाने से प्राप्त पोर्सिन सीएनएस ऊतकों का उपयोग करता है। इसलिए, यहां कोई संज्ञाहरण, इच्छामृत्यु या नेक्रॉप्सी का वर्णन या दिखाया गया है।

  1. एक ०.९४६ एल (३२ आस्ट्रेलिया) हिटोलॉजी कंटेनर में परिवहन पोर्सिन सीएनएस ऊतकों एक बर्फ छाती के अंदर एमवी-1 समाधान के साथ भरी हुई/
  2. विच्छेदन के दायरे का उपयोग करके, प्रत्येक सीएनएस ऊतक से डबल-आयामी पिक, संदंश, आईरिस कैंची और वसंत कैंची के साथ मेनिंग्स को हटा दें। ब्रेन वेंट्रिकल्स से कोरॉयड प्लेक्सस के किसी भी टुकड़े को हटाना सुनिश्चित करें।

4. सीएनएस ऊतक समरूपता

नोट: यह अधिक कुशल है जब दो जांचकर्ता समरूपता प्रक्रिया में संलग्न हैं: एक स्टीरियोस्कोप के तहत मेनिंग्स को विच्छेदन और दूसरा कीमा बनाया हुआ ऊतकों को समरूप करता है। इस तरह, ऊतकों को जल्दी से बर्फ की बाल्टी में वापस कर दिया जाता है और ठंडा रखा जाता है।

  1. एमवी-1 समाधान के ~ 1 mL के साथ एक पेट्री डिश पर प्रत्येक सीएनएस क्षेत्र रखें। एक एकल किनारे ब्लेड का उपयोग करना, ऊतक कीमा 1-2 मिमी टुकड़े प्राप्त करने के लिए ।
    1. एक छोटे से कशेरुकी नमूने के लिए, 100 मिमी x 20 मिमी पेट्री डिश का उपयोग करें।
    2. एक बड़े कशेरुकी नमूने के लिए, 150 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश का उपयोग करें।
  2. एक छोटे कशेरुकी नमूने का समरूपीकरण(तालिका 2 और तालिका 3)
    1. कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम, ऑप्टिक पालि और रीढ़ की हड्डी को एक व्यक्तिगत 10 एमएल पॉटर-एल्वेहजेम ग्लास टिश्यू ग्राइंडर में एमवी-1 समाधान के ~ 1 एमएल में स्थानांतरित करें एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके पीटीएफई पेस्टल के साथ। एमवी-1 समाधान के 5 mL जोड़ें और प्रत्येक ऊतक (~ 10 स्ट्रोक) समरूप। व्यक्तिगत 15 mL शंकुट्यूब पर स्थानांतरित करें। बर्फ पर ट्यूब रखें।
      नोट: एक छोटे कशेरुकी, 5 या 4 के लिए, ऑप्टिक पालि के साथ या बिना, क्रमशः, 10 एमएल पॉटर-Elvehjem चक्की और 15 एमएल शंकु ट्यूबों की जरूरत है ।
    2. हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी को एक व्यक्ति गत 1.7 एमएल ट्यूब में एमवी-1 समाधान के ~ 100 माइक्रोन में संदंश के साथ स्थानांतरित करें और ग्लास माइक्रोपेस्टल के साथ सावधानीपूर्वक समरूप रहें। एमवी-1 समाधान के ~ 1 mL के साथ प्रत्येक माइक्रोपेस्टल कुल्ला। बर्फ पर ट्यूब रखें।
      नोट: एक छोटे कशेरुकी के लिए, 2 ग्लास माइक्रोपेस्टल और 1.7 मीटर ट्यूब की आवश्यकता होती है।
  3. एक बड़े कशेरुकी नमूने का समरूपीकरण(तालिका 4 और तालिका 5)
    1. एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करना, एक PTFE मूसल के साथ एक ५५ mL पॉटर-Elvehjem ग्लास ऊतक चक्की के लिए कीमा बनाया हुआ ऊतक हस्तांतरण और उपरि उभारने वाला को देते हैं । विशिष्ट सीएनएस भाग समरूप होने के अनुसार एमवी-1 समाधान की अनुशंसित मात्रा का आधा जोड़ें(तालिका 5)।
    2. बहुत कम गति (~ 150 आरपीएम) पर ओवरहेड रटर चालू करें और ध्यान से ग्लास ट्यूब को लगभग 30 एस के लिए ऊपर और नीचे ले जाएं।
    3. ओवरहेड रस्टर बंद करें, अधिक एमवी-1 समाधान जोड़ें, और समरूप घोल प्राप्त करने तक चरण 4.3.2 दोहराएं।
    4. 50 मीटर शंकुट्यूब पर स्थानांतरित करें। बर्फ पर ट्यूब रखें।
    5. प्रत्येक सीएनएस ऊतक समरूपता के बीच डिओनाइज्ड पानी के साथ ग्राइंडर धोएं।
      नोट: एक बड़े कशेरुकी 5 या 4 के लिए, क्रमशः सफेद पदार्थ के साथ या बिना, 50 mL शंकुट्यूब की आवश्यकता होती है। इसी तरह हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी के लिए दो (2) 15 एमएएल शंकुट्यूब की जरूरत होती है।

5. माइक्रोवेसल शुद्धि

  1. सेंट्रलाइज टिश्यू होमोजेनेट्स चरण 4.2.1, 4.2.2, या 4.3.4 पर 2,000 x ग्राम पर 10 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए। मायलिन का एक बड़ा सफेद इंटरफ़ेस लाल माइक्रोवेसल्स के छर्रों के शीर्ष पर होगा। अधिनेतों को त्यागें।
    1. छोटे कशेरुकी नमूना(तालिका 2 और तालिका 3)
      1. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट (~ 10 फ्लश) के साथ बर्फ-ठंडएमवी-2 समाधान के 5 एमएल में कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम, ऑप्टिक पालि और रीढ़ की हड्डी के छर्रों को फिर से निलंबित करें। प्रत्येक निलंबन के लिए बर्फ-ठंडा एमवी-2 समाधान के 5 मिलील जोड़ें और ट्यूबों को फ्लिप करके ध्यान से मिलाएं।
      2. एमवी-2 समाधान के 1 एमएल के साथ हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी छर्रों को फिर से निलंबित करें।
    2. बड़े कशेरुकी नमूना(तालिका 4 और तालिका 5)
      1. कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी के माइक्रोवेसल छर्रों के लिए बर्फ-ठंडा एमवी-2 समाधान के 20 मिलील जोड़ें। एक ट्यूब रिवॉल्वर शेखर पर मिश्रण करके छर्रों को फिर से निलंबित करें, ~ 5 मिन के लिए 40 आरपीएम पर सरगर्मी करें। अधिक एमवी-2 समाधान जोड़कर कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी के निलंबन की शंकुलिन ट्यूबों की मात्रा को संतुलित करें।
      2. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट (~ 10 फ्लश) के साथ एमवी-2 समाधान के 5 mL में हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी माइक्रोवेसल छर्रों को फिर से निलंबित करें। निलंबन के लिए बर्फ ठंडा एमवी-2 समाधान के 5 mL जोड़ें और ट्यूब फ्लिपिंग द्वारा ध्यान से मिश्रण।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 4,400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  3. ध्यान से ट्यूबों को घुमाकर और अलौकिक को दीवारों के साथ पारित करने की अनुमति देकर प्रत्येक ट्यूब की दीवारों से तरल इंटरफ़ेस पर मोटी और घने मायलिन परत को अलग करें।
  4. मायलिन और लिक्विड इंटरफेस को त्यागें और कम लिंट पेपर वाइप के साथ लिपटे स्पैटुला के साथ प्रत्येक ट्यूब की अंदर की दीवार को दागें। छोटे कशेरुकी नमूनों के लिए, एक हस्तांतरण पिपेट के साथ ध्यान से सक्शन द्वारा प्रत्येक हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी ट्यूब से मायलिन परत को हटा दें।
  5. एक मुड़ कम लिंट पेपर पोंछ के साथ अतिरिक्त तरल मिटा दें। कम बाध्यकारी सुझावों का उपयोग करके एमवी-3 समाधान के 1 mL के साथ प्रत्येक गोली को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर ट्यूब रखें।

6. माइक्रोवेसल एल्यूशन और फिल्ट्रेशन

  1. प्रत्येक सीएनएस क्षेत्र के लिए व्यक्तिगत बीकरमें बर्फ-ठंडा एमवी-3 समाधान डालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    1. छोटे कशेरुकी नमूनों के लिए, प्रति 50 मीटर बीकर प्रति एमवी-3 समाधान के 10 एमएल का उपयोग करें। ऑप्टिक पालि शामिल है या नहीं, इस के आधार पर कुल 6-7 चोंच आवश्यक है।
    2. बड़े कशेरुकी नमूनों के लिए, प्रति 100 मीटर बीकर प्रति एमवी-3 समाधान के 30 एमएल का उपयोग करें। सफेद पदार्थ शामिल है या नहीं, इस के आधार पर कुल 6-7 चोंच आवश्यक है।
  2. एक 50 mL शंकुट्यूब के शीर्ष पर एक सेल छलनी रखें। प्रति सीएनएस क्षेत्र में से एक का उपयोग करें। कॉर्टेक्स, ब्रेनस्टेम, ऑप्टिक पालि, रीढ़ की हड्डी और पीयूष के लिए 100 माइक्रोन छलनी का प्रयोग करें। सेरिबैलम और हाइपोथैलेमस के लिए 70 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करें।
  3. बर्फ-ठंडा एमवी-3 समाधान के 1 मिलील के साथ प्रत्येक छलनी गीला।
  4. कुल से बचने के लिए मिश्रण करते समय एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ चरण 5.5 में तैयार निलंबन के लिए अधिक एमवी-3 समाधान जोड़ें। सावधानी से छलनी के शीर्ष पर माइक्रोवेसल्स लोड करें। बर्फ-ठंडएमवी-3 समाधान के साथ कुल्ला।
    1. छोटे कशेरुकी नमूनों(टेबल 2 और टेबल 3)के लिए, एमवी-3 समाधान के 10-15 mL को एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ जोड़ें और एमवी-3 समाधान के 5 mL के साथ कुल्ला करें।
    2. बड़े कशेरुकी नमूनों के लिए, एमवी-3 समाधान के 20 mL को एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ जोड़ें और एमवी-3 समाधान के 10 एमएल के साथ कुल्ला करें।
  5. एक संशोधित फिल्टर धारक(चित्रा 2डी),एक प्रति सीएनएस क्षेत्र पर 20 माइक्रोन नायलॉन नेट फिल्टर रखकर फिल्ट्रेशन यूनिट को इकट्ठा करें।
    1. छोटे कशेरुकी नमूनों(टेबल 2 और टेबल 3)के लिए, कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम, ऑप्टिक पालि और रीढ़ की हड्डी के लिए 25 मिमी संशोधित फिल्टर धारकों का उपयोग करें। हाइपोथैलेमस और पिटीटीके लिए 13 मिमी संशोधित फिल्टर धारकों का उपयोग करें।
    2. बड़े कशेरुकी नमूनों(टेबल 4 और टेबल 5)के लिए, कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी के लिए 47 मिमी संशोधित फिल्टर धारकों का उपयोग करें। हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी के लिए 25 मिमी का उपयोग करें।
  6. एक 50 मिलीआर शंकुट्यूब और बर्फ के 5 मिलील के साथ गीले फिल्टर के शीर्ष पर फिल्टर रखें-ठंडा एमवी-3 समाधान सुनिश्चित करें कि बफर फिल्टर धारक को शंकुई ट्यूब पर डालता है।
  7. 20 माइक्रोन नायलॉन नेट फिल्टर के शीर्ष पर eluted माइक्रोवेसल्स (चरण 6.4 से) स्थानांतरित करें और बर्फ-ठंडा एमवी-3 समाधान के 5-10 मीटर के साथ माइक्रोवेसल्स को कुल्ला करें।
  8. साफ संदंश का उपयोग कर फिल्टर ठीक करें और इसे चरण 6.1 में तैयार बर्फ-ठंडा एमवी-3 समाधान युक्त बीकर में विसर्जित करें।
  9. फिल्टर से माइक्रोवेसल्स को धीरे से मिलाते हुए माइक्रोवेसल्स को लगभग 30 एस के लिए अलग करें। छोटे कशेरुकी नमूनों के लिए, बीकर सामग्री को 15 mL शंकुट्यूब में डालें। बड़े कशेरुकी नमूनों के लिए, एक 50 mL शंकुट्यूब में बीकर सामग्री डालना।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और कम बाध्यकारी पिपेट टिप का उपयोग करके बर्फ-ठंडा एमवी-3 समाधान के 1 मिलील में गोली को फिर से निलंबित करें।
    1. छोटे कशेरुकी नमूनों के लिए, निलंबन (चरण 6.10 से) को 1.7 मिलीग्राम माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 20,000 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें।
      नोट: यह स्पिन एक मजबूत उपज सुनिश्चित करने के लिए अधिकतम गति (~ 20,000 x ग्राम)पर बेंचटॉप अपकेंद्री पर किया जाता है।
    2. बड़े कशेरुकी नमूनों के लिए, निलंबन को चरण 6.10 से 5.0 मीटर माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, एमवी-3 समाधान के 4 मिलीएल जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें।

7. इम्यूनोदागिंग

नोट: हेमैटोक्सिलिन और इओसिन (एच एंड ई) प्रोटोकॉल व्यवहार्यता की एक सबूत की अवधारणा के रूप में सरीसृप, उभयचर और मछली के नमूनों पर धुंधला किया गया था। इसलिए इन नमूनों के लिए इम्यूनोलेबलिंग की कोई सिफारिश नहीं है।

  1. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से अधिनेता निकालें।
  2. एक कम बाध्यकारी पिपेट टिप(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर 1x बाँझ PBS में गोली को फिर से निलंबित करें । माइक्रोवेसल्स को कई बार पाइपिंग करके एग्रीगेट बनाने से रखें। छोटे कशेरुकी नमूनों(तालिका 3)के लिए, पैलेट आकार के अनुसार ~ 100 माइक्रोन-2,000 माइक्रोन का उपयोग करें। बड़े कशेरुकी नमूनों(तालिका 5)के लिए, पैलेट आकार के अनुसार ~ 1,000 माइक्रोन-4,000 माइक्रोन का उपयोग करें।
  3. कम बाध्यकारी पिपेट टिप का उपयोग करके, माइक्रोवेसल को अच्छी तरह से स्लाइड पर स्थानांतरित करें, उन्हें प्रत्येक कुएं के केंद्र में जोड़ने के लिए सावधान रहें, साइडवॉल से बचें।
  4. अच्छी तरह से स्लाइड सेट, खुला, एक बीएससी-2 के अंदर, और आरटी में 20 से 30 min के लिए सूखी चलो ।
    नोट: कुल गठन से बचने के लिए 1x पीबीएस की अपेक्षाकृत उच्च मात्रा का उपयोग किया जाता है। इस वजह से, यह सुनिश्चित करने के लिए कि माइक्रोवेसल्स पॉली-डी-लिसिन कोटिंग द्वारा आयोजित किए जा रहे हैं, फिक्सेशन से पहले स्लाइडको सूखने देना आवश्यक है।
  5. एक स्थानांतरण पिपेट के साथ बाहर पाइपिंग द्वारा अवशिष्ट 1x पीबीएस निकालें, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 200 माइक्रोन जोड़ें और आरटी में 30 सीन के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. फिक्सिव सॉल्यूशन को पिपेट करें और आरटी में 5 मिन के लिए 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ 3x धोएं।
    नोट: इस बिंदु पर मछली, उभयचर और सरीसृप सीएनएस माइक्रोवेस पर एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन किया गया था।
  7. अच्छी तरह से स्लाइड करने के लिए बफर अवरुद्ध और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मीटर के लिए इनक्यूबेट के 200 μL जोड़ें।
  8. एक स्थानांतरण पिपेट के साथ अवरुद्ध बफर निकालें और एंटीबॉडी डिल्यूंट(सामग्री की तालिका)में प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल के 200 μL जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  9. प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल बाहर पिपेट और आरटी में 5 मिन के लिए 1x PBS के २०० μL के साथ 3x धोने ।
  10. 1x पीबीएस में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल(सामग्री की तालिका)लोड करें और आरटी में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित।
  11. माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल बाहर पिपेट और आरटी में 5 मिन के लिए 1x PBS के २०० μL के साथ 3x धोने, प्रकाश से संरक्षित । पिछले धोने के बाद अच्छी तरह से स्लाइड के फ्रेम अलग और दाग-एक कम लिंट कागज पोंछ के साथ किसी भी अतिरिक्त 1x PBS सूखी ।
  12. परमाणु धुंधला के लिए एक कवरस्लिप, लिक्विड एंटीफीका माउंटेंट मीडियम और 4′,6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडॉल (DAPI) जोड़ें। प्रकाश से संरक्षित आरटी पर रात भर सूखने दें।
  13. एक बार सूखने के बाद, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और डेटा अधिग्रहण के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड बॉक्स पर प्रकाश से सुरक्षित रखें।

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Representative Results

माइक्रोवेसल्स को न्यूरोवेस्कुलर यूनिट2,3के सभी आंतरिक सेलुलर घटक दिखाई दिए . एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु-1 (पीईएएम, जिसे सीडी31 के रूप में भी जाना जाता है) या आइसोलेक्टिन IB4 (एक ग्लाइकोप्रोटीन जो एंडोथेलियल सेल ग्लीकोकालिक्स को बांधता है) का उपयोग करना, एस्ट्रोसाइटिक एंड-फीट(चित्रा 3ए, बी)के लिए पेरिसाइट्स और एक्वापोरिन-4 (एक्वापोरिन-4 (एक्वापोरिन-4(एक्यूपी4) के लिए प्लेटलेट व्युत्पन्न विकास कारक--ए-(पीडीजीएफआर) या न्यूरॉन-ग्लियल एंटीजेन 2 (एनजी2) यह दर्शाता है कि ये आंतरिक घटक अलग-थलग सूक्ष्मवेट्स में मौजूद हैं। सीएनएस क्षेत्रों में कॉर्टिकल माइक्रोवेसल्स(चित्रा 3बी),सेरिबैलम(चित्रा 3सी),पीयूष(चित्रा 3डी),हाइपोथैलेमस(चित्रा 3ई),ब्रेनस्टेम(चित्रा 3एफ),और रीढ़ की हड्डी(चित्रा 3जी)शामिल हैं। सभी ने इन विहित मार्कर की अभिव्यक्ति दिखाई।

इसी तरह, माइक्रोवेसल्स ने अनुयायियों जंक्शन प्रोटीन वीई-कैथेरिन(चित्रा 4ए, सी),टाइट जंक्शन प्रोटीन क्लॉडर्न-5 और ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स-1 (CLDN5 और ZO-1) की अभिव्यक्ति दिखाई, चित्रा 4ए, डी),त्रिकोशिय जंक्शन प्रोटीन एंगुलिन-1(चित्रा 4ए, ई)और एपिकोबासल मार्कर सी-एक्स-सी आकृति केमोकिन लिगांड 12 और गामा-ग्लूटामाइलट्रांसफरेज 1 (CXCL12 और GGT1, चित्रा 4ए, एफ)। ये निष्कर्ष प्रासंगिक हैं क्योंकि ये प्रोटीन निर्णायक बीबीबी -विशिष्ट गुणों9,12,13,14के संकेतक हैं . एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स की एक सीमित उपस्थिति ग्लियल फाइब्रिलेरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी, फिगर 4बी, सी, जी),ओलिगोडेनरोसाइट विशिष्ट प्रोटीन (ओएसपी, फिगर 4बी, जी),और न्यूरोफिलामेंट-मीडियम (एनएफएम, फिगर 4बी एच),क्रमशः दर्शाता है कि अलग-थलग सूक्ष्म जहाजों में अवांछित गैर-न्यूरोवेस्कुलर यूनिट के नगण्य निशान थे। इसके अलावा, अधिकांश सूक्ष्मवेसल α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (αSMA, चित्रा 5बी, सी)की अभिव्यक्ति से रहित थे। यह प्रासंगिक है क्योंकि αSMA आर्टेरियोल और वेनेल्स(चित्रा 5ए)से जुड़ी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है, यह दर्शाता है कि यह अलगाव प्रोटोकॉल चुनिंदा रूप से छोटे कैलिबर माइक्रोवेसल15को लक्षित करता है ।

अन्य छोटे लिसेसेफेलिक कशेरुकी से प्राप्त माइक्रोवेस कुछ रूपात्मक विशेषताओं को साझा करते हैं, जैसा कि मछली (मेंढक और छिपकली नहीं दिखाया गया है) और एवियन माइक्रोवेसल्स में देखा गया है। इससे पता चलता है कि यह विधि प्रजातियों(चित्र6)के बीच एनवीयू में मतभेदों के और लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, एवियन सीएनएस माइक्रोवेस(चित्रा 6एच-एन)ने मानव और माउस के लिए विकसित कई एंटीबॉडी के साथ क्रॉसरेएक्टिविटी दिखाई। यह जैविक और बायोमेडिकल बीबीबी अध्ययन ों के लिए एवियन नमूनों की आगे की जांच को प्रोत्साहित करता है। जब हमने सूअरों और मकाक, दो जाइनसेफेलिक प्रजातियों(चित्रा 7)से सूक्ष्मजहाजों को अलग किया तो हमने इसी तरह के परिणाम देखे। पोर्सिन माइक्रोवेसल्स में केवल एनवीयू विहित मार्कर दिखाए जाते हैं। उपरोक्त सीएनएस क्षेत्रों के अलावा, हम पेरिवेंट्रिकुलर सफेद पदार्थ(चित्रा 7बी)से माइक्रोवेसल्स को अलग करने में सक्षम थे। यह प्रासंगिक है क्योंकि सफेद पदार्थ को न्यूरोभड़काऊ स्थितियों (जैसे, मल्टीपल स्क्लेरोसिस16,17,18)में फंसाया जाता है।

हम यह पता लगाना चाहते थे कि क्या इस विधि का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में किया जा सकता है। यह जानते हुए कि वीसीएएम-1 और जैम-बी को ईएई के दौरान रीढ़ की हड्डी में न्यूरोभड़काऊ प्रक्रिया में फंसाया गया है, हमने ईएई और नकली नियंत्रण चूहों (10 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों)9,10,11के शिखर और पुराने चरणों में इन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने का फैसला किया । ऐसा करने के लिए, हमने माइक्रोवेसके व्यास के साथ तीव्रता (AUI) की मनमाने इकाई को मापा। फिर, डीएपीआई के लिए 20 AUI की सीमा का उपयोग करते हुए, हमने वीई-कैडरिन, वीसीएएम-1 और जेएम-बी के लिए 50 माइक्रोवेस प्रति सीएनएस क्षेत्र(चित्रा 8ए, बी)के लिए वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र की गणना की। अंत में, हमने प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए सिटक के बाद तदर्थ परीक्षण के बाद दो तरह के ANOVA का प्रदर्शन किया।

जैसा कि प्रत्याशित है, हमने ईएई(चित्रा 8डी, ई)के शिखर के दौरान रीढ़ की हड्डी के माइक्रोवेसल्स के साथ वीसीएएम-1 और जैम-बी में वृद्धि देखी। हालांकि, हमने ईएई के लिए पहले रिपोर्ट नहीं किए गए अन्य सीएनएस क्षेत्रों में परिवर्तन देखा। वीसीएएम-1 पीयूष माइक्रोवेस में काफी वृद्धि हुई है और हाइपोथैलेमस और ब्रेनस्टेम माइक्रोवेस में कमी आई है। सभी सीएनएस ऊतकों(चित्रा 8डी)में पुरानी ईएई के दौरान परिवर्तन हुए थे। जाम-बी क्रोनिक ईएई(चित्रा 8ई)के दौरान हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी माइक्रोवेसल्स में काफी वृद्धि हुई। दिलचस्प बात यह है कि हमने ईएई के शिखर के दौरान हाइपोथैलेमस और ब्रेनस्टेम से अलग माइक्रोवेसल के साथ वीई-कैथेरिन में परिवर्तन, क्रोनिक ईएई(चित्रा 8सी)के दौरान सेरिबैलम और चोटी और पुरानी ईएई के दौरान पीयूष माइक्रोवेसल चौड़ाई में कमी देखी। कुल मिलाकर, इस डेटा से पता चलता है कि माइक्रोवेसल अलगाव की यह विधि स्वास्थ्य और रोग के दौरान क्षेत्रीय प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन की विशेषता के लिए एक उपयोगी उपकरण है ।

Figure 1
चित्रा 1: लेमिनेक्टॉमी के बिना कुशल रीढ़ की हड्डी विच्छेदन। छोटे कशेरुकी नमूनों (100 ग्राम तक) से रीढ़ की हड्डी का विच्छेदन कशेरुकी फोरमेनमें रोस्ट्रल दिशा में एक कौडल में कॉर्ड को फ्लश करके तेजी से और अधिक कुशलता से किया जाता है। विच्छेदन कैंची का उपयोग करसिर एटलस संयुक्त द्वारा हटा दिया जाता है और रीढ़ कूल्हे(ए)से काट दिया जाता है। सभी शेष अंगों को हटा दिया जाता है, केवल रीढ़(बी)छोड़ कर। काठ कशेरुकी फोरमेन के भीतर रीढ़ की हड्डी गर्भाशय ग्रीवा की डोरी(बी,पीले तीर) की चौड़ाई की तुलना में एक बहुत छोटे सफेद सर्कल (<1 मिमी व्यास) के रूप में दिखाई देती है। काठ कशेरुकी फोरमेन में एक संकीर्ण खोलने रखते हुए काठ से गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के लिए एक दबाव ढाल की सुविधा जब एक 18 जी सुई और 1x PBS(सी और डी)के साथ भरी हुई 10 सीसी सिरिंज के साथ निस्तब्धता । एक बार फ्लश होने के बाद, रीढ़ की हड्डी(डी,पीला तीर) लगभग पूरी तरह से ड्यूरल थैली से रहित है, और केवल पिया को विच्छेदन के दायरे में हटाने की आवश्यकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डबल-आयामी पिक विच्छेदन उपकरण और संशोधित फ़िल्टर धारक। यह 11 सेमी लंबा विच्छेदन उपकरण(ए)में दो बहुत तेज, लगभग क्षैतिज रूप से विरोध किए गए बिंदु, 2 मिमी टिप-टू-टिप(बी)हैं। कोमल नीचे दबाव लागू करने और एक दक्षिणावर्त फैशन(सी)में थोड़ा घुमा कर, अंक खुद को क्षैतिज मेनिंग्स में एम्बेड इतना है कि वे ऊपर की ओर उठाया जा सकता है । यह विशेष रूप से उपयोगी है जब मेनिंग्स को सेरिबैलम से हटादिया जाता है, क्योंकि यह सेरिबैली फोलिया की गहराई में पहुंच की अनुमति देता है। कॉर्टिकल टिश्यू, खासकर जायरेंसेफलिक से मेनिंग्स को हटाते समय यह बहुत उपयोगी भी होता है। इस मामले में, पिया उच्च क्षमता वैस्कुलचर के साथ अत्यधिक एम्बेडेड है जो माइक्रोसेवेस अलगाव की शुद्धता से समझौता करेगा। इसी तरह, यह कोरॉयड प्लेक्सस को हटाने की सुविधा प्रदान करता है, जो संदूषण का सबसे अधिक स्रोत है। 47 मिमी, 25 मिमी और 13 मिमी व्यास के फिल्टर धारकों को शीर्ष डिब्बे(ई)से इनलेट-कनेक्टर(डी)को हटाने के लिए लेजर कट किया गया था, लेकिन छलनी घटक(जी)रखें। इस संशोधन ने एक फिल्टर यूनिट(आई,जे)की असेंबली के लिए छलनी और नीचे के हिस्से(जी,एच)पर 20 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर नेट रखकर अनुमति दी, शीर्ष भाग(ई)को पंगा लेते समय जाल को सुरक्षित करते हुए । केवल 25 एमएम फिल्टर होल्डर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कई सीएनएस क्षेत्रों से अलग माइक्रोवेसल्स ने विहित न्यूरोवैस्कुलर यूनिट मार्कर व्यक्त किए। (A)इम्यूनोलेबलिंग और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, एनवीयू के आंतरिक सेलुलर घटकों का उपयोग वयस्क (8-14 सप्ताह पुराने C57BL/6J) मुनीरिन सीएनएस माइक्रोवेस की पहचान करने के लिए किया जाता है । जैसा कि एंडोथेलियल सेल मार्कर सीडी31 (सफेद), पेरिसाइट मार्कर पीडीजीएफआरे (लाल), और एस्ट्रोसाइटिक एंड-फीट मार्कर AQP4 (हरे) इन सभी सेलुलर घटकों के लिए व्यक्तिगत कॉन्फोकल छवियों के ऊपर कॉर्टिकल माइक्रोवेसल्स(बी)के लिए विलय छवि पर देखा गया है। ध्यान दें कि एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स के बीच अंतरंग संबंध उन्हें विलय की तस्वीर पर मजेंटा दिखाई देते हैं, जबकि एस्ट्रोसाइटिक अंत पैर उनके आसपास एक प्रभामंडल(बी)दिखाई देते हैं। एक ही अभिव्यक्ति पैटर्न सेरिबैलम(सी),पीयूष(डी),हाइपोथैलेमस(ई),ब्रेनस्टेम(एफ),और रीढ़ की हड्डी(जी,DAPI, परमाणु दाग = नीला; स्केल बार = 10 माइक्रोन) के लिए मनाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: माइक्रोवेसल्स ने बीबीबी-विशिष्ट गुणों से जुड़े प्रोटीन व्यक्त किए। न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (एनवीयू) के भीतर एंडोथेलियल कोशिकाओं को उनके आंतरिक बाधा गुणों(ए)से जुड़े प्रोटीन द्वारा भी वर्णित किया जाता है। जैसा कि आंकड़े में देखा गया है, एंडोथेलियल कोशिकाओं में वीई-कैथेरिन, सीएलडीएन 5, जेडओ-1(ए,पीला) और एंगुलिन-1(ए,चैती) से बने जंक्शन होते हैं। वे जीजीटी-1 और CXCL12(ए,ग्रीन और रेड) सहित कई प्रोटीन के लिए एपिकोबसल ध्रुवीकरण का भी प्रदर्शन करते हैं । न्यूरॉन्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स, और एस्ट्रोसाइट-सेल निकायों को अलग-थलग माइक्रोवेसल्स में शामिल किया जा सकता है, हालांकि वे एनवीयू(बी)के आंतरिक नहीं हैं। ये क्रमशः एनएफएम (लाल), ओएसपी (सियान), और जीएफएपी (लाइमग्रीन)की अभिव्यक्ति से पहचाने जा सकते हैं। इनके अनुरूप, हमारे अलग-थलग माइक्रोवेसल्स ने क्रमशः प्रोटीन वीई-कैदरिन(सी,रेड), टाइट जंक्शन प्रोटीन सीएलडीएएन 5 और जेडओ-1(डी,लाल और हरे रंग, क्रमशः, विलय = पीला), ट्राइसेलुलर जंक्शन प्रोटीन एलएसआर(ई,ग्रीन), और एपिकोबिल मार्कर CXCL12 और GGT1(एफ,लाल और हरे रंग) का पालन किया। उन्होंने जीएफएपी(ए,ग्रीन, जी,व्हाइट), ओएसपी(जी,ग्रीन), और एनएफएम(एच,रेड) की सीमित मात्रा का भी प्रदर्शन किया, जिसमें गैर-न्यूरोवैस्कुलर यूनिट कोशिकाओं (DAPI, परमाणु दाग = नीला; स्केल बार = 10 माइक्रोन) की नगण्य अवधारण का सुझाव दिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अधिकांश अलग-थलग सूक्ष्मवेसल्स αSMA को व्यक्त नहीं करते हैं। न्यूरोवैस्कुलर यूनिट आर्टेरियोल-केशिका-वेल्यूल(ए)से एक परिष्कृत संक्रमण प्रदर्शित करती है। αSMA anular अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से धमनी की पहचान करती है, और जैसे ही यह केशिका बन जाता है, αSMA(बी,लाल) अभिव्यक्ति घटता है, भित्ति मार्कर NG2(बी,हरे रंग) को उजागर करता है। हमने αSMA + और αSMA-जहाजों (सफेद कोष्ठक, एन = 20) के व्यास को मापा, ताकि उन्हें आर्टेरियोल या केशिकाओं (DAPI, परमाणु दाग = नीला, स्केल बार = 10 माइक्रोन) के रूप में अलग किया जा सके। αSMA + और αSMA-जहाजों के व्यास के अपेयर टी-परीक्षण विश्लेषण ने उच्च सांख्यिकीय महत्व दिखाया(सी,αSMA + = लाल, αSMA-लाल/हरा, ****p <0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: अन्य लिसेंसेफेलिक प्रजातियों से सीएनएस माइक्रोवेसल्स का सफल अलगाव। सीएनएस को जंगली पकड़े गए मेंढक (8.2 सेमी), छिपकली (12.7 सेमी), टैंक-उठाया इंद्रधनुष ट्राउट (2 साल पुराना, 35.6 सेमी), और एवियरी-उठाया कबूतर (9 महीने पुराना, ~ 300 ग्राम) से काटा गया था। मेंढक, मछली और छिपकली से सूक्ष्मजहाजों एच एंड ई द्वारा दाग थे (ट्राउट से केवल सूक्ष्म जहाजों को दिखाया जाता है, स्केल बार = 20 माइक्रोन)। कबूतर माइक्रोवेसल्स इम्यूनोलेबल थे । हम मछली और कबूतर सीएनएस रूपरेखा पर लेबल के रूप में सभी क्षेत्रों पर माइक्रोवेस की पहचान करने में सक्षम थे: प्रांतस्था(ए और एच),ऑप्टिक पालि(बी और मैं),सेरिबैलम(सी और जे),पीयूष(डी और एल),हाइपोथैलेमस(ई और कश्मीर),ब्रेनस्टेम(एफ और एम),और रीढ़ की हड्डी(जी और एन)। इसके अतिरिक्त, हम आइसोलेक्टिन IB4 (सफेद), एस्ट्रोसाइटिक अंत-एक्यूपी 4 (हरे) के साथ पैर, और कबूतर के अलग माइक्रोवेस (DAPI, परमाणु दाग = नीले, पैमाने पर बार = 10 μm) से NFM (लाल) के साथ आसन्न न्यूरॉन्स के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान करने में सक्षम थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: जायरसेफेलिक प्रजातियों से सीएनएस माइक्रोवेसल्स का अलगाव। मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को माइक्रोवेसल आइसोलेशन और इम्यूनोलेबलिंग के लिए खेत में उठाए गए सुअर (~ 6 महीने पुराने, ~ 120 किलो) से विच्छेदित किया गया था। हम I4 (सफेद), PDGFRο (लाल), और एक्यूपी 4 (हरे) पोर्सिन सीएनएस के सभी क्षेत्रों के लिए सकारात्मक लेबल माइक्रोवेस की पहचान करने में सक्षम थे: प्रांतस्था(ए),पेरिवेंट्रिकुलर सफेद पदार्थ(बी),सेरिबैलम(सी),पीयूष(डी),हाइपोथैलेमस(ई),ब्रेनस्टेम(एफ),और रीढ़ की हड्डी(जी,डीपीआई, परमाणु दाग कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: सीएनएस माइक्रोवेसल अलगाव के अन्य अनुप्रयोग का उदाहरण। जेएबी-बी और वीसीएएम-1 की अभिव्यक्ति को मूत्र ईएई माइक्रोवेसल्स के लिए निर्धारित किया गया था। तीव्रता की मनमाने ढंग से इकाइयों (AUI) प्रांतस्था, सेरिबैलम, हाइपोथैलेमस, पीयूष, ब्रेनस्टेम, और चरम और ईएई के पुराने चरणों में चूहों की रीढ़ की हड्डी के लिए मापा गया था, नियंत्रण के रूप में दिखावा के साथ (n = 4) । प्रत्येक सीएनएस क्षेत्र के लिए, फ्लोरोक्रोम प्रति AUI और माइक्रोवेसल(ए)के व्यास को निर्धारित करने के लिए प्रति माउस बारह माइक्रोवेसल्स का मूल्यांकन किया गया था। सफेद कोष्ठक VCAM-1 (सफेद), VE-cadherin (हरे), जाम-बी (लाल), और DAPI (नीला, पैमाने पर बार = 10 μm) के लिए AUI निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया confocal माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर मापने उपकरण के उदाहरण दिखाते हैं । फिर, परिणामस्वरूप AUI प्रोटीन अभिव्यक्ति के अनुमान के रूप में प्रत्येक इम्यूनोलेबल प्रोटीन के लिए वक्र (AUC) के तहत क्षेत्र की गणना करने के लिए माइक्रोन(बी)में व्यास के खिलाफ साजिश रची गई थी । इसके बाद प्रति समूह मतलब एयूसी का विश्लेषण दो तरह के ANOVA द्वारा किया गया, इसके बाद सिटक के पोस्ट हॉक टेस्ट के लिए, प्रति सीएनएस क्षेत्र में कुल ४८ माइक्रोवेस के लिए । पीयूष माइक्रोवेसल को छोड़कर, हमने रोग की स्थिति(सी,सम्मिलित) से जुड़े माइक्रोवेसल व्यास के बीच कोई बड़ा अंतर नहीं देखा, लेकिन ईएई चूहों(सी)में हाइपोथैलेमस और ब्रेनस्टेम से वीई-कैथेरिन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी आई। इसी तरह के सांख्यिकीय विश्लेषण ने ईएई के शिखर के दौरान न्यूरोभड़काऊ स्थिति के अनुरूप रीढ़ की हड्डी पर वीसीएएम-1(डी)और जैम-बी(ई)के लिए महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई। दिलचस्प बात यह है कि हमने हाइपोथैलेमस, पिट्यूटरी और ब्रेनस्टेम में वीसीएएम-1 के लिए भी बदलाव देखे। इन परिणामों की जांच की जा रही है (काले सलाखों और डॉट्स = दिखावा, लाल सलाखों और डॉट्स = पीक EAE, सामन सलाखों और डॉट्स = क्रोनिक EAE, * पीएंडएलटी;0.05, @p<0.01, #p& 0.001, और & पी एंड एलटी;०.०००१) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एमवी-1 10 एमएम हेप्स
कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ 1x हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएसएस) में
एमवी-2 18% 70 केडीए आणविक वजन (मेगावाट) dextran
10 एमएम HEPES/HBSS में (एमवी-1)
एमवी-2 20% 70 केडीए मेगावाट dextran
10 एमएम HEPES/HBSS में (एमवी-1)
एमवी-3 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)
10 एमएम HEPES/HBSS में (एमवी-1)
लगानेवाला 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)
1x फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) पीएच 7.4 में
बफर धोएं 1x पीबीएस पीएच 7.4
परमीबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग बफर 10% बीएसए
0.25% एनप्याजिक सर्फेक्टेंट
1x पीबीएस पीएच 7.4 में
एंटीबॉडी डिल्यूंट 5% बीएसए
0.25% एनप्याजिक सर्फेक्टेंट
1x पीबीएस पीएच 7.4 में

तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान।

स्टेप (एस) कार्रवाई
4.1 और 4.1.1 एमवी-1 समाधान में एक एकल किनारे ब्लेड के साथ कीमा
4.2 से 4.2.2 पॉटर-ईएलवीजे पीटीएफई या माइक्रोट्यूब मूसल का उपयोग करके एमवी-1 समाधान में होमोजेनाइज करें
5.1 2,000 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिन पर स्पिन
5.1.1 से 5.1.1.2 एमवी-2 समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें
5.2 4,400 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 15 मिन पर स्पिन
5.3 से 5.5 एमवी-3 समाधान के 1 mL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें
6.2 से 6.4.1 एक सेल छलनी के माध्यम से एक 50 mL शंकु ट्यूब पर Elute और एमवी-3 समाधान के साथ कुल्ला
6.5, 6.5.1, 6.6, और 6.7 संशोधित फिल्टर धारक पर 20 माइक्रोन नायलॉन नेट के साथ फ़िल्टर करें
6.8 एमवी-3 समाधान के 10 mL के साथ 50 mL बीकर में नायलॉन नेट लोड और 30 एस के लिए हिला
6.9 से 6.10 एक 15 mL शंकुट्यूब में Decant और 2,000 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिन पर स्पिन
6.10 एमवी-3 समाधान के 1 mL में फिर से निलंबित
6.10.1 1.7 mL माइक्रोट्यूब पर स्थानांतरण और 20,000 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिन पर स्पिन
7.1 से 7.3 1x पीबीएस में फिर से सस्पेंड और अच्छी तरह से स्लाइड में लोड

तालिका 2: छोटे कशेरुकी माइक्रोवेसल्स अलगाव के लिए लेआउट। यह चार्ट एक लिसेसेफेलिक नमूने का उपयोग करते समय प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त संस्करण है।

स्टेप (एस) समाधान कार्रवाई सीटीएक्स Cbl चुनते Bst अनुसूचित जाति HYP गड्ढा
4.1 एमवी-1 पकवान पर कीमा 100 मिमी x 20 मिमी पेट्री डिश, 1 मिमी n/a
4.2.1 और 4.2.2 एमवी-1 समरूपता 5 लाख, मूसल के साथ 10 लाख पॉटर-Elvehjem 1 मीटर, माइक्रोपेस्टल
5.1.1.1 और 5.1.1.2 एमवी-2 रिसस्पेंड 5 mL + 5 mL, 18% Dextran 1 एल, 20% dextran
5.5 और 6.4.1 एमवी-3 रिसस्पेंड 1 mL + 10-15 mL 1 एमएल
6.2 और 6.4.1 एमवी-3 छलनी आकार 100 माइक्रोन 70 माइक्रोन 100 माइक्रोन 70 माइक्रोन 100 माइक्रोन
कुल्ला 5 लाख
6.5, 6.5.1 और 6.7 एमवी-3 फ़िल्टर आकार, कुल्ला 25 मिमी फिल्टर, 10 मिलीमीटर 13 मिमी, 5 मिलीमीटर
6.8 एमवी-3 बीकर पर हिला 10 करोड़
6.10 एमवी-3 रिसस्पेंड 1 एमएल
7.2 1x पीबीएस रिसस्पेंड 1.5 से 2.0 लाख 0.5 से 1.0 लाख 0.1 से 0.2 मीटर
7.3 1x पीबीएस प्रति कूद भार 200 माइक्रोन 100 माइक्रोन 25 से 50 माइक्रोन
CTX = कॉर्टेक्स, CBL = cerebellum, BST = brainstem, OPT = ऑप्टिक पालि (स्तनधारियों में मौजूद नहीं), HYP = हाइपोथैलेमस, PIT = पीयूष, अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी। अनुशंसित मात्रा 20 ग्राम (युवा माउस) से 800 ग्राम (वयस्क चूहा) तक आकार में शामिल जानवरों से पूरे ऊतक के लिए हैं।

तालिका 3: अनुशंसित मात्रा/आकार। इस रूपरेखा में ~ 20-~ 800 ग्राम, या अधिक विशेष रूप से, वीडियो पर दिखाए गए ~ 25 ग्राम माउस से लेकर एक छोटे कशेरुकी नमूने का उपयोग करने के लिए समाधानों की अनुशंसित मात्रा है। आवश्यक मात्रा का अंतिम समायोजन शोधकर्ता द्वारा विच्छेदन के बाद प्राप्त गीले ऊतक की विशिष्ट मात्रा के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए। अभ्यास और समस्या निवारण अत्यधिक अनुशंसित हैं। CTX = कॉर्टेक्स, CBL = cerebellum, BST = brainstem, OPT = ऑप्टिक पालि (स्तनधारियों में मौजूद नहीं), HYP = हाइपोथैलेमस, PIT = पीयूष, अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी।

स्टेप (एस) कार्रवाई
4.1 और 4.1.2 एमवी-1 में एक एकल बढ़त ब्लेड के साथ कीमा
4.3 से 4.3.4 पीटीएफई मूसल के साथ पॉटर-एल्वेहजेम ग्राइंडर का उपयोग करके एमवी-1 समाधान में होमोजेनाइज करें
5.1 2,000 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिन पर स्पिन
5.1.2 से 5.1.2.2 एमवी-2 समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें
5.2 4,400 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 15 मिन पर स्पिन
5.3 से 5.5 एमवी-3 समाधान के 1 mL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें
6.2 से 6.4 और 6.4.2 एक सेल छलनी के माध्यम से एक 50 mL शंकु ट्यूब पर Elute और एमवी-3 समाधान के साथ कुल्ला
6.5, 6.5.2, 6.6 और 6.7 संशोधित फिल्टर धारक पर 20 माइक्रोन नायलॉन नेट के साथ फ़िल्टर करें
6.8 एमवी-3 समाधान के 30 mL के साथ एक 50 mL बीकर में नायलॉन नेट लोड, और 30 एस के लिए हिला
6.9 और 6.10 एक 50 मीटर शंकुट्यूब में डेक्वेंट और 2,000 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिन पर स्पिन
6.10 एमवी-3 समाधान के 1 mL में फिर से निलंबित
6.10.2 5 एमएल माइक्रोट्यूब पर स्थानांतरित करें और 2,000 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिन पर स्पिन करें
7.1 से 7.3 1x पीबीएस में फिर से सस्पेंड और अच्छी तरह से स्लाइड में लोड

तालिका 4: बड़े कशेरुकी माइक्रोवेसल्स अलगाव के लिए लेआउट। यह चार्ट एक जायरेंसेफलिक नमूने का उपयोग करते समय प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त संस्करण है।

स्टेप (एस) Soution कार्रवाई सीटीएक्स Cbl Wm Bst अनुसूचित जाति HYP गड्ढा
4.1 एमवी-1 पकवान पर कीमा 3−5 लाख 1 एमएल
4.3 से 4.3.4 एमवी-1 समरूपता 20−30 मीटर, 55 mL पॉटर-Elvehjem मूसल और ओवरहेड रकर के साथ 5 लाख, मूसल के साथ 10 लाख पॉटर-Elvehjem
5.1.2 से 5.1.2.2 एमवी-2 रिसस्पेंड 20 मीटर, 20% डीडीएक्सटीएन 5 mL + 5 mL, 20% dextran
5.5, 6.4 और 6.4.2 एमवी-3 रिसस्पेंड 1 mL + 20 mL 1 mL + 10 mL
6.2 और 6.4.2 एमवी-3 छलनी आकार 100 माइक्रोन 70 माइक्रोन 100 माइक्रोन 70 माइक्रोन 100 माइक्रोन
कुल्ला 10 करोड़
6.5, 6.5.2 और 6.7 एमवी-3 फ़िल्टर आकार, कुल्ला 47 मिमी फिल्टर, 10 मिलीमीटर 25 मिमी, 10 मिलीमीटर
6.8 एमवी-3 बीकर पर हिला 30 करोड़
6.10 और 6.10.2 एमवी-3 रिसस्पेंड 1 mL + 4 mL
7.2 1x पीबीएस रिसस्पेंड 2.0 से 4.0 मीटर 1.0 से 2.0 मीटर
7.3 1x पीबीएस प्रति कूद भार 200 माइक्रोन 100 माइक्रोन
CTX = कॉर्टेक्स, CBL = सेरिबैलम, WM = सफेद पदार्थ, BST = ब्रेनस्टेम, HYP = हाइपोथैलेमस, पिट = पीयूष, अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी। अनुशंसित वॉल्यूम सीटीएक्स, सीबीएल, बीएसटी और एससी पूरे पीआईपी और पीआईटी के लिए ~ 45 सेमी3 के नमूनों के लिए हैं।

तालिका 5: अनुशंसित मात्रा/आकार। इस रूपरेखा में एक बड़े कशेरुकी नमूने का उपयोग करने के लिए समाधानों की अनुशंसित मात्रा है। अधिक विशेष रूप से, यह कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, सफेद पदार्थ, ब्रेनस्टेम, रीढ़ की हड्डी, और पूरे हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी के लिए ~ 45 सेमी3 के सीएनएस ऊतक बायोप्सी पर लागू होता है, जैसा कि वीडियो पर दिखाया गया है। आवश्यक मात्रा का अंतिम समायोजन शोधकर्ता द्वारा विच्छेदन के बाद प्राप्त गीले ऊतक की विशिष्ट मात्रा के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए। अभ्यास और समस्या निवारण अत्यधिक अनुशंसित हैं। CTX = कॉर्टेक्स, CBL = सेरिबैलम, WM = सफेद पदार्थ, BST = ब्रेनस्टेम, HYP = हाइपोथैलेमस, पिट = पीयूष, अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी।

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Discussion

बीबीबी में मस्तिष्क माइक्रोवेकुल्चर एंडोथेलियल कोशिकाओं के अद्वितीय गुण शामिल हैं, जो तंग-, अनुयायियों-, "खूंटी-सॉकेट"-जंक्शनों, और सीएनएस होमोस्टोसिस2,3,19के लिए महत्वपूर्ण आसंजन सजीले टुकड़े के साथ मिलकर हैं। एंडोथेलियल कोशिकाओं के गुणों को पेरिसाइट्स द्वारा प्रेरित और बनाए रखा जाता है और आसपास के एस्ट्रोग्लिया एंड फुट प्रक्रियाएं2,3,19होती हैं । बीबीबी माइक्रोवास्कुलचर ध्रुवीकरण (यानी, चमकदार या एबुमिनल एंडोथेलियल सेल सतहों पर स्थानीयकृत प्रोटीन के विषम अभिव्यक्ति पैटर्न)20प्रदर्शित करता है। हालांकि यह संक्षेप में BBB को परिभाषित कर सकते हैं, वास्तव में यह तंत्रिका विज्ञान में सबसे रहस्यपूर्ण धारणाओं में से एक बना हुआ है । उदाहरण के लिए, एनवीयू के भीतर क्षेत्रीय, लिंग और उम्र के अंतर आघात, विषाक्तता, संक्रमण और सूजन के लिए सीएनएस क्षेत्रीय कमजोरियों की व्याख्या कर सकते हैं, जिसके प्रमुख नैदानिक परिणाम3,5,6हो सकते हैं। बीबीबी की समझ में एक और बाधा मल्टीपल टैक्सा7,8के बीच देखे गए मतभेद हैं . बीबीबी को समझने और जांच करने की प्रमुख बाधाओं में से एक एनवीयू के अलगाव से संबंधित कठिनाई है जिसमें बीबीबी शामिल है, जबकि अभी भी इसकी बाधा-विशिष्टगुण14रखते हैं।

बीबीबी, सीएनएस-क्षेत्रीय मतभेदों के साथ-साथ प्रजातियों के मतभेदों के बारे में हमारी समझ में तेजी लाने के प्रयास में, हमने पहले प्रकाशित तरीकों को अनुकूलित किया। हमने इन विशेष रूप से बौले एट अल.21में, एकल कॉर्टिकल, सेरिबेलर, हाइपोथैलेमिक, पिट्यूटरी, ब्रेनस्टेम और रीढ़ के ऊतकों से सूक्ष्म वेसल्स प्राप्त करने के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया: मछली, उभयचर, सरीसृप, पक्षी, और स्तनधारियों(चित्रा 3, चित्र4, चित्रा 5,और चित्र 6)। इस विधि का एक लाभ यह है कि इसके अनुकूलन सीएनएस ऊतक के समग्र आकार पर आधारित हैं: शोधकर्ता प्रजातियों, सेक्स और उम्र की परवाह किए बिना गीले ऊतक ों के अनुसार समाधान, ऊतक ग्राइंडर के आकार, शंकुल ट्यूब, फिल्टर धारकों आदि की मात्रा चुनता है। इम्यूनोलेबलिंग के साथ हमारे अनुभव में, ~ 20 ग्राम नमूना प्रति कॉर्टेक्स, सेरिबेलम, ऑप्टिक पालि, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी और हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी प्रति 8 अच्छी तरह से स्लाइड के लिए पर्याप्त माइक्रोवेसल्स पैदावार करता है। हालांकि, कॉर्टिकल और ऑप्टिक पालि की उपज सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी की तुलना में बहुत अधिक है।

जैसा कि दिखाया गया है, हमने सुअर और मकाक के सीएनएस माइक्रोवेसल्स के अलगाव और इम्यूनोलेबलिंग के लिए आवश्यक अनुकूलन किए, बड़े जायरेंसेफलिक स्तनधारियों जो अनुवाद अनुसंधान के लिए अधिक प्रासंगिक हैं(चित्रा 7)। विशेष रूप से, हम केवल इन प्रजातियों पर पेरिवेंट्रिकुलर सफेद पदार्थ को शामिल करने में सक्षम थे। चूंकि इन जानवरों में सीएनएस बड़ा है, इसलिए हमने दूसरे सेंट्रलिफायरेशन (चरण 5.3, एमवी-2 के साथ 20% dextran) के दौरान माइलिन परत से माइक्रोवेसल पैलेट को अलग करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त सफेद पदार्थ एकत्र किए। हम अटकलें है कि एक महत्वपूर्ण जन के लिए इस जुदाई achive करने में सक्षम होने की जरूरत है और हम सक्रिय रूप से कैसे murine सीएनएस ऊतक के साथ एक समान परिणाम प्राप्त करने की मांग कर रहे हैं ।

हालांकि सादगी के लिए छोड़ दिया, हम एवियन, पोर्सिन, और मकाक माइक्रोवेसल्स पर एनवीयू विहित मार्कर से परे इम्यूनोलेबलिंग प्रदर्शन किया । विशेष रूप से, सभी प्रजातियों ने पहले बीबीबी फ़ंक्शन (जंक्शनल प्रोटीन वीई-कैथेरिन, सीएलडीएएन 5, जेडओ-1, और एलएसआर और एपिकोबासल मार्कर CXCL12 और GGT1) के लिए प्रासंगिक के रूप में मुयूरिन नमूनों पर पहचाने गए सेलुलर और आणविक मार्कर साझा किए या एनवीयू (एनएफएम, ओएसपी और जीएफएपी) के निकटता में। फिर, ये निष्कर्ष अन्य प्रजातियों पर इस विधि के उपयोग को प्रोत्साहित करने के लिए आगे NVU ऑर्थोलॉजी और प्रजातियों के बीच फर्क की पहचान । यह एक ही प्रजाति के भीतर एनवीयू तनाव, लिंग और आयु मतभेदों और बीबीबी जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए अन्य जीवों का उपयोग करने की व्यवहार्यता में आगे की जांच के अवसर को भी खोलता है। हम न्यूरोसूजन(चित्रा 8)के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस माइक्रोवेसल-आइसोलेशन विधि के सफल उपयोग के सबूत भी दिखाते हैं। हालांकि हमने इस प्रयोग को सबूत-अवधारणा के रूप में अंजाम दिया, लेकिन यहां इस्तेमाल किए गए दृष्टिकोण का वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में बड़े पैमाने पर दोहन किया जाता है । हम अन्य मात्रात्मक तरीकों (उदाहरण के लिए, पश्चिमी दाग) पर इस दृष्टिकोण का पक्ष लेते हैं क्योंकि हम न केवल अभिव्यक्ति के स्तर पर ध्यान केंद्रित करना चाहते हैं बल्कि सापेक्ष प्रोटीन बहुतायत, CXCL12 और अन्य एपिकोबसल प्रोटीन का स्थानांतरण, जंक्शनल प्रोटीन का लिंकेज, आदि, सीएनएस माइक्रोवेस9,13,22की जटिल उपस्थिति के भीतर। इसी तरह, हम वर्तमान में अन्य अनुप्रयोगों के लिए अपनी विधि का निवारण कर रहे हैं, जैसे एनवीयू सेलुलर घटकों (एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स), आरएनए-सीक्यू और प्रोटेओमिक्स23,24,25,26।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

डॉ क्रूज़-Orengo कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस, पशु चिकित्सा शुरू धन के स्कूल द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

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References

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