Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokolün amacı lissencephalic ve gyrencephalic omurgalıların merkezi sinir sisteminin birden fazla bölgesinden mikrodamarları izole etmektir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M. L., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikrodamarların merkezi sinir sisteminden (CNS) izolasyonu genellikle çoğu kemirgenler olmak üzere birden fazla hayvanDan kortikal doku birleştirilerek gerçekleştirilir. Bu yaklaşım korteksiçin kan-beyin bariyeri (BBB) özelliklerinin sorgulanmasını sınırlar ve bireysel karşılaştırmaya izin vermez. Bu proje birden fazla CNS bölgelerinden nörovasküler birim (NVU) karşılaştırma sağlayan bir izolasyon yönteminin geliştirilmesi üzerinde duruluyor: korteks, serebellum, optik lob, hipotalamus, hipofiz, beyin sapı, ve omurilik. Ayrıca, başlangıçta mürin örnekleri için geliştirilen bu protokol, mikro damarları beyin yarımkürebeyaz maddesinden izole edebildiğimiz küçük ve büyük omurgalı türlerinCNS dokularında kullanılmak üzere başarıyla uyarlanmıştır. Bu yöntem, immünetiketleme ile eşleştirilmiş, protein ekspresyonu ve bireyler arasında istatistiksel karşılaştırma, doku tipi veya tedavi nicelik sağlar. Bu uygulanabilirliği, nöroinflamatuar bir hastalık olan multipl sklerozun bir minür modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) sırasında protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirerek kanıtladık. Ayrıca, bu yöntemle izole mikrodamarlar qPCR, RNA-seq ve Batı lekegibi downstream uygulamaları için kullanılabilir, diğerleri arasında. Bu ultracentrifugation veya enzimatik dissociation kullanmadan CNS mikrodamarları izole etmek için ilk girişimi olmasa da, tek bireyler ve birden fazla CNS bölgelerinkarşılaştırma için onun ustalık benzersizdir. Bu nedenle, aksi takdirde belirsiz kalabilir farklılıkların bir dizi soruşturma için izin verir: CNS bölümleri (korteks, serebellum, optik lob, beyin sapı, hipotalamus, hipofiz, ve omurilik), CNS doku tipi (gri veya beyaz madde), bireyler, deneysel tedavi grupları ve türleri.

Introduction

Beynimiz vücudumuzdaki en önemli organdır. Bu nedenle, normalden sapmayı tetikleyebilecek dış etkenlere rağmen beyin homeostazı tutmak bir önceliktir. Bazı bilim adamlarına göre, yaklaşık 400-500 milyon yıl önce1, omurgalı hayvanlar şimdi kan-beyin bariyeri (BBB)2,3olarak bildiğimiz geliştirdi . Bu koruyucu "çit" sıkı iyonların taşınması düzenleyerek merkezi sinir sistemi (CNS) homeostazı ve fonksiyonları üzerinde en büyük etkiyi uygular, moleküller, ve kan ve CNS parankim arasında hücrelerin taşınması. BBB bozulduğunda, beyin toksik maruzkalma duyarlı hale gelir, enfeksiyon, ve inflamasyon. Bu nedenle, BBB disfonksiyonu ile ilişkili birçok, hepsi değilse, nörolojik ve nörogelişimsel bozukluklar4,5,6.

BBB sofistike fonksiyonu benzersiz CNS mikrovaskülküle nörovasküler birim (NVU) 2,3tarafından uygun atfedilir. Son derece özel endotel hücreleri, perisitler ve astrositik uç ayaklar NVU2,3hücresel bileşenleridir. Bu hücreler tarafından oluşturulan ekstrasellüler matriks de NVU ve BBB fizyolojisi için gereklidir2,3. NVU'nun temel hücresel ve moleküler bileşenleri omurgalılar arasında korunmuş olsa da, heterojenlik siparişler ve türler arasında rapor edilir7,8. Ancak, teknik sınırlamalar nörobiyoloji, biyomedikal veya çevirisel araştırmalardaki bu farklılıkları tam olarak göz önünde bulundurma yeteneğimizi engellemez.

Bu nedenle, beş omurgalı grubundan balık, amfibiler, sürüngenler, kuşlar ve memeliler gibi çok sayıda türe de uygulanabilmek için CNS bölgesine özgü mikrodamar izolasyon yöntemini genişlettik. Protokol, çevirisel alaka düzeyi9olan türler de dahil olmak üzere küçük lissensefalik ve büyük jinekolojik omurgalılarda kullanılmak üzere tanımlanmıştır. Ayrıca, bu bağlamda daha önce araştırılmayan, ancak nörofizyoloji ile ilgili ve muazzam klinik etkileri olan CNS'nin diğer bölgelerini de dahil ediyoruz: hipotalamus, hipofiz ve beyaz madde. Son olarak, nvu ve / veya BBB9,10,11 boyunca protein ekspresyonu değişiklikleri tanımlamak için güvenilir bir araç olarak bu izolasyon yöntemininkapasitesinitest etti. Kavram kanıtı olarak, EAE sırasında VCAM-1 ve JAM-B ekspresyonundaki değişikliklerin immünoresans tarafından izlenen izolasyon yöntemini kullanarak nasıl belirlenebileceğimizi gösterdik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmanın tüm prosedürleri Kaliforniya Üniversitesi (UC), Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen kurallara uygundur. UC Davis hayvan bakımı çeşitli bağımsız kaynaklar tarafından düzenlenir ve tam Değerlendirme ve Laboratuvar Hayvan Bakımı Uluslararası Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından 1966 yılından bu yana akredite edilmiştir. Porcine CNS dokuları UCD Hayvan Bilimleri Bölümü Et Bilimleri Laboratuvarı'ndan alındı. Rhesus makaklarından CNS dokuları Kaliforniya Ulusal Primat Araştırma Merkezi Patoloji Bölümü'nden (NIH P51OD011107) alındı. Laboratuvar personeli tarafından domuz ve makaklara anestezi, ötenazi veya nekropsi yapılmadı. Bu nedenle, bu konularda özel bir öneri yoktur.

NOT: Bu yöntem birden fazla tür için doğrulanmıştır, ancak sağlanan protokol fare ve domuz dokularına daha doğrudan karşılık gelir. Memeli örnekleri kullanırken optik lobile ilgili ayrıntılar geçerli değildir. Tüm biyolojik tehlikeli maddeler uygun bir biyogüvenlik düzeyinde (BSL) tesiste kullanılmalıdır. Tüm akut toksik maddeler bir duman kaputunun altında ele alınmalıdır. Tüm biyolojik tıbbi atıklar ve akut toksik atıklar düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir.

1. Hazırlık

  1. En az bir gün öncesinde çözümler hazırlayın (Tablo 1).
    NOT: 70 kDa molekül ağırlığı (MW) dekstran eritmek çok zordur. Çözeltinin parafin film veya folyo ile kaplı bir gecede karıştırmak için daha verimlidir. Protokol, araştırma altındaki numuneye bağlı olarak iki farklı MV-2 çözeltisi kullanılmasını gerektirir. %18 dekstran, küçük lissensefalik numuneler üzerinde protokolü gerçekleştirirken miyelini mikrodamar peletinden verimli bir şekilde ayırır. Ancak, büyük jirensefalik örneklerden CNS dokuların arayüzü içinde miyelin bir yayma geliştirir, yanı sıra hipotalamus ve küçük örneklerden hipofiz. Bu yayma% 20 dekstran kullanılarak önlenir.
  2. Poli-D-lizin kuyusu başına 50 μL yükleyerek iyi kaydıraklar hazırlayın ve tercihen biyolojik güvenlik kabini sınıfı 2 (BSC-2) ile oda sıcaklığında (RT) 2 saat kurumasını bekleyin. Fazla kurmayın. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez durulayın ve kullanıma hazır olana kadar buzdolabında saklayın.

2. Küçük Lissencephalic Vertebrat Örneğinden CNS Doku Diseksiyonu

NOT: Makale bir C57BL6/J, 10 haftalık, ~ 25 g, erkek fare protokolün uygulama gösterir.

  1. Numune başına mv-1 çözeltisi olmak üzere sırasıyla 5 mL ve 1 mL'lik iki 15 mL konik tüp ve 1,7 mL mikrosentrifuge tüp hazırlayın. Tüpleri buzda tut.
  2. Anestezi
    1. Bir ketamin intraperitoneal enjeksiyon ile fareler anestezi, ksilazin, ve asetpromazine anestezik kokteyl 100/10/3 kg vücut ağırlığı başına mg ve sprey 70% etanol ile. Palpebral ve pedal reflekslerinin eksikliğini göz değdirerek ve sırasıyla bir ayağı çimdikleyerek değerlendirerek anesteziyi doğrulayın.
    2. Bir indüksiyon anestezi kutusu kullanarak% 5 isofluran inhalasyon güvercinler anestezi.
    3. Su tankı veya amfibi Ringer çözeltisi(Malzeme Tablosu)tutan bir balıkta %1 Tricaine'de balık ve kurbağaları anestezi edin.
    4. Ötanaziden önce 4 °C'de soğuyarak kertenkeleleri anestezi edin.
  3. Cerrahi makas ile hayvan Decapitate, kafatası ortaya çıkarmak için forseps ile deri soyma, ve foramen magnum ile LaGrange makas ile kesilmiş (Şekil 1A).
  4. Spatula ile beyni parçalayın ve MV-1 solüsyonu olan 15 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.
  5. Forseps ile kafatasısella turcica hipofiz almak ve MV-1 çözeltisi ile 1.7 mL mikrosantrifüj tüp transfer. Tüpü buzda tut.
  6. Vertebral sütun ortaya çıkarmak için deri ve kas çıkarın. Ekstremiteleri, göğüs kafesini ve iç organları kesin(Şekil 1B).
  7. Aşağıda açıklanan iki yöntemden biri ile omuriliği inceleyin. Daha sonra MV-1 çözeltisi ile 5 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.
    1. LaGrange makas ile kaudal yönde bir rostral keserek laminektomi gerçekleştirin, servikal vertebra foramenile başlayan , lomber kordon ulaşana kadar.
    2. 18 G iğne ve MV-1 çözeltisi yüklü 10 mL şırınga ile lomber vertebra foramen boyunca rostral yönde bir kaudal yıkama gerçekleştirin(Şekil 1C,D).
      NOT: Bu yöntem sadece çok küçük örnekler, çoğunlukla kemirgenler (<100 g) ile çalışır.
  8. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak, bahar makas ile omurilikten dural kese kesmek ve çift uçlu pick ile kalan menenjler kaldırmak(Şekil 2).
  9. Beyni Petri kabına aktarın ve bir diseksiyon dürbünü kullanarak, çift uçlu kazma ile menenjleri çıkarın(Şekil 2A–C).
  10. Koku ampulleri ve talamus forceps, iris makas ve bahar makas ile excise. Çift uçlu pick kullanarak, tüm beyin ventriküllerinden koroid pleksus kaldırın. Tüm koroid pleksus kaldırmak için emin olun.
    NOT: Koroid pleksus ve koku ampulleri büyük bir kontaminasyon kaynağıdır. BBB aksine, bu kılcal damarlar yüksek fenestrated ve onlar kaldırılmaz eğer sonraki deneylerin sonuçları tehlikeye olacaktır.
  11. Forseps kullanarak, farklı CNS bölgeleri ayırın: korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob (memeli örnekleri üzerinde değil) ve hipotalamus.

3. Büyük Jirensefalik Omurgalı Örneğinden CNS Doku Diseksiyonu

NOT: Bu protokol, mezbahadan elde edilen domuz CNS dokularını kullanır. Bu nedenle, hiçbir anestezi, ötenazi veya nekropsi burada açıklanan veya gösterilmiştir.

  1. Bir buz sandığı / kova içinde MV-1 çözeltisi yüklü bir 0.946 L (32 oz) histoloji konteyner içinde taşıma domuz CNS dokuları.
  2. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak, bir çift uçlu pick, forceps, iris makası ve bahar makası ile menenjler çıkarın her CNS doku. Beyin ventriküllerinden koroid pleksus parçalarını çıkardığınızdan emin olun.

4. CNS Doku Homojenizasyonu

NOT: İki araştırmacıhomojenizasyon sürecine girdiğinde daha verimlidir: biri steroskop altında menenjlerin kesilmesi, diğeri ise kıymalı dokuların homojenleştirilmesidir. Bu şekilde, dokular hızla buz kovası döndürülür ve soğuk tutulur.

  1. Her CNS bölgesini ~1 mL MV-1 çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Tek kenarlı bir bıçak kullanarak, 1-2 mm adet elde etmek için doku kıyma.
    1. Küçük bir omurgalı numunesi için 100 mm x 20 mm Petri kabı kullanın.
    2. Büyük bir omurgalı numunesi için 150 mm x 15 mm Petri kabı kullanın.
  2. Küçük bir omurgalı örneğinin homojenizasyonu (Tablo 2 ve Tablo 3)
    1. Transfer pipeti kullanarak ptfe zararlısı ile tek bir 10 mL Potter-Elvehjem cam doku öğütücüsünün korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omuriliği ~1 mL MV-1 çözeltisine aktarın. 5 mL MV-1 çözeltisi ekleyin ve her dokuyu homojenize edin (~10 vuruş). Bireysel 15 mL konik tüplere aktarın. Tüpleri buzda tut.
      NOT: Optik loblu veya optik lobsuz küçük bir omurgalı için sırasıyla 10 mL Potter-Elvehjem öğütücüler ve 15 mL konik tüp gereklidir.
    2. Tek bir 1,7 mL tüpte forsepsli hipotalamus ve hipofiz ~100 μL MV-1 çözeltisine aktarın ve cam mikroteksle dikkatlice homojenize olun. Her mikroengiyi ~1 mL MV-1 çözeltisi ile durulayın. Tüpü buzda tut.
      NOT: Küçük bir omurgalı için 2 cam mikrotekles ve 1.7 mL tüp gereklidir.
  3. Büyük bir omurgalı örneğinin homojenizasyonu (Tablo 4 ve Tablo 5)
    1. Bir transfer pipet kullanarak, bir PTFE havaneli ile 55 mL Potter-Elvehjem cam doku öğütücü için kıyma doku aktarın ve havai karıştırıcı eklemek. Homojenize edilen belirli CNS kısmına göre önerilen MV-1 çözeltisi hacminin yarısını ekleyin (Tablo 5).
    2. Çok düşük hızda (~ 150 rpm) havai karıştırıcı açın ve dikkatle yukarı ve aşağı yaklaşık 30 s için cam tüp hareket ettirin.
    3. Havai karıştırıcıyı kapatın, daha fazla MV-1 çözeltisi ekleyin ve homojen bir bulamaç elde edene kadar adım 4.3.2'yi tekrarlayın.
    4. 50 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.
    5. Her CNS doku homojenizasyonu arasında değirmeni deiyonize su ile yıkayın.
      NOT: Büyük bir omurgalı için 5 veya 4, beyaz maddeli veya beyaz maddesiz, sırasıyla 50 mL konik tüplere ihtiyaç vardır. Aynı şekilde hipotalamus ve hipofiz için iki (2) 15 mL konik tüp gereklidir.

5. Mikrodamar Arınma

  1. 4.2.1, 4.2.2 veya 4.3.4 adımdan kaynaklanan santrifüj dokusu, 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g.'de homojendir. Kırmızımsı mikrodamarların peletlerinin üstünde miyelinin büyük beyaz bir arabirimi oluşacaktır. Supernatants atın.
    1. Küçük omurgalı örneği (Tablo 2 ve Tablo 3)
      1. 5 mL serolojik pipet (~10 floş) ile 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisinde korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omurilik peletlerini yeniden askıya alın. Her süspansiyona 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin ve tüpleri çevirerek dikkatlice karıştırın.
      2. 1 mL MV-2 solüsyonu ile hipotalamus ve hipofiz peletlerini yeniden askıya alın.
    2. Büyük omurgalı örneği (Tablo 4 ve Tablo 5)
      1. Korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik mikrodamar peletlerine 20 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin. Bir tüp revolver shaker üzerinde karıştırarak pelet resuspend, ~ 5 dk için 40 rpm karıştırarak. Daha fazla MV-2 çözeltisi ekleyerek korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik süspansiyonları konik tüpler 'hacimleri dengesi.
      2. 5 mL serolojik pipet (~10 floş) ile 5 mL MV-2 çözeltisinde hipotalamus ve hipofiz mikrodamar peletlerini yeniden askıya alın. Süspansiyonlara 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin ve tüpü çevirerek dikkatlice karıştırın.
  2. 4 °C'de 15 dk için 4.400 x g santrifüj.
  3. Tüpleri yavaşça döndürerek ve süpernatantın duvarlar boyunca geçmesine izin vererek her tüpün duvarlarından sıvı arabirimindeki kalın ve yoğun miyelin tabakasını dikkatlice ayırın.
  4. Miyelin ve sıvı arabirimini atın ve her tüpün iç duvarını düşük tiftikli kağıt mendille sarılmış bir spatula ile lekelayın. Küçük omurgalı örnekleri için, transfer pipeti ile dikkatlice emerek her hipotalamus ve hipofiz tüpünden miyelin tabakasını çıkarın.
  5. Bükümlü düşük tiftik kağıt mendili yle fazla sıvıyı silin. Düşük bağlayıcı ipuçları kullanarak 1 mL MV-3 çözeltisi ile her peleti yeniden askıya alın. Tüpleri buzda tut.

6. Mikrodamar Elüsyonu ve Filtrasyonu

  1. Her CNS bölgesi için ayrı ayrı gagalara buz gibi MV-3 çözeltisi dökün. 4 °C'de tutun.
    1. Küçük omurgalı numuneler için, 50 mL kabı başına 10 mL MV-3 çözeltisi kullanın. Optik lobun dahil olup olmadığına bağlı olarak toplam 6-7 beare gereklidir.
    2. Büyük omurgalı numuneler için, 100 mL kabı başına 30 mL MV-3 çözeltisi kullanın. Beyaz maddenin dahil olup olmadığına bağlı olarak toplam 6-7 gaga gereklidir.
  2. 50 mL konik tüpün üzerine bir hücre süzgeci yerleştirin. CNS bölgesi başına bir tane kullanın. Korteks, beyin sapı, optik lob, omurilik ve hipofiz için 100 μm süzgeç kullanın. Beyincik ve hipotalamus için 70 μm hücreli süzgeç kullanın.
  3. Her süzgecinizi 1 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile ıslayın.
  4. Agregalardan kaçınmak için karıştırırken serolojik pipetle adım 5.5'te hazırlanan süspansiyonlara daha fazla MV-3 çözeltisi ekleyin. Mikro damarları süzgeç üzerine dikkatlice yükleyin. Buz gibi MV-3 çözeltisi ile durulayın.
    1. Küçük omurgalı numuneler için(Tablo 2 ve Tablo 3),serolojik pipet le 10-15 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 5 mL MV-3 çözeltisi ile durulayın.
    2. Büyük omurgalı numuneler için, serolojik pipet ile 20 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 10 mL MV-3 çözeltisi ile durulayın.
  5. Filtreleme ünitesini modifiye edilmiş bir filtre tutucuya(Şekil 2D)CNS bölgesi başına bir adet 20 m naylon net filtre yerleştirerek monte edin.
    1. Küçük omurgalı örnekleri için(Tablo 2 ve Tablo 3),korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omurilik için 25 mm modifiye filtre tutucular kullanın. Hipotalamus ve hipofiz için 13 mm modifiye filtre tutucu kullanın.
    2. Büyük omurgalı örnekleri için(Tablo 4 ve Tablo 5),korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik için 47 mm modifiye filtre tutucular kullanın. Hipotalamus ve hipofiz için 25 mm kullanın.
  6. Filtreyi 50 mL konik bir tüpün üzerine yerleştirin ve 5 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile ıslak filtre yiyerek tamponun filtre tutucudan konik tüpe dökülmesini önleyin.
  7. Eluted mikrodamarları (adım 6.4)'ı 20 μm naylon net filtrenin üzerine aktarın ve mikro damarları 5-10 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile durulayın.
  8. Filtreyi temiz forsepsler kullanarak kurtarın ve 6.1 adımda hazırlanan buz gibi MV-3 çözeltisini içeren kabın içine batırın.
  9. Mikro damarları filtreden yaklaşık 30 s boyunca hafifçe sallayarak ayırın. Küçük omurgalı örnekleri için, 15 mL konik bir tüp içinde beher içeriği dökün. Büyük omurgalı örnekleri için, 50 mL konik bir tüp içinde beher içeriği dökün.
  10. 4 °C'de 5 dk için 2.000 x g'lık santrifüj ve düşük bağlayıcı lı pipet ucu kullanarak 1 mL buz gibi MV-3 çözeltisi içinde peleti yeniden askıya alın.
    1. Küçük omurgalı numuneler için süspansiyonu (adım 6.10'dan) 1.7 mL mikrosantrifüj tüpe ve santrifüje 20.000 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya aktarın.
      NOT: Bu dönüş, sağlam bir verim sağlamak için maksimum hızda (~20.000 x g)tezgah üstü bir santrifüjde gerçekleştirilir.
    2. Büyük omurgalı numuneler için, 6.10 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne süspansiyonu aktarın, 4 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de 5 dk için 2.000 x g'de santrifüj ekleyin.

7. İmmünoboyama

NOT: Hematoksilin ve eozin (H&E) boyası protokol fizibilitesinin kanıtı olarak sürüngen, amfibi ve balık örneklerine yapıldı. Bu nedenle, bu örnekler için immünetiketleme için bir öneri yoktur.

  1. Mikrosantrifüj tüplerinden süpernatant çıkarın.
  2. Düşük bağlayıcı lı pipet ucu(Malzeme Tablosu)kullanarak 1x steril PBS pelet resuspend . Mikro damarların birden fazla kez boru landırarak agrega oluşturmasını engelleyin. Küçük omurgalı numuneler için(Tablo 3),pelet boyutuna göre ~100 μL-2.000 μL kullanın. Büyük omurgalı örnekleri için(Tablo 5),pelet boyutuna göre ~1.000 μL-4.000 μL kullanın.
  3. Düşük bağlayıcılı pipet ucu kullanarak, mikro damarları iyi kaydıraklara aktarın, yan duvarlardan kaçınarak her kuyunun ortasına eklemeye dikkat edin.
  4. Bir BSC-2 içinde ortaya iyi slaytlar ayarlayın ve RT 20 ila 30 dakika kurumaya bırakın.
    NOT: Agrega oluşumunu önlemek için nispeten yüksek hacimli 1x PBS kullanılır. Bu nedenle, mikrodamarların poli-D-lizin kaplama tarafından tutulduğundan emin olmak için fiksasyon dan önce slaytların kurutulması gerekmektedir.
  5. Bir transfer pipeti ile pipetleme yaparak artık 1x PBS'yi çıkarın, 200 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Pipet fiksatif çözeltiyi dışarı ve RT 5 dakika için 1x PBS 200 μL ile 3x yıkayın.
    NOT: Bu noktada balık, amfibi ve sürüngen CNS mikrodamarlarında H&E boyama işlemi yapıldı.
  7. Kuyu kaydıraä ına 200 μL engelleme tamponu ekleyin ve 37 °C' de 60 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Bir transfer pipet ile engelleme tampon u çıkarın ve antikor dilüent(Malzeme Tablosu)birincil antikor kokteyl 200 μL ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  9. Ana antikor kokteylini çıkarmak için pipet ve RT'de 5 dakika boyunca 200 μL 1x PBS ile 3x yıkayın.
  10. 1x PBS'de seyreltilmiş ikincil antikor kokteylini(Malzeme Tablosu)yükleyin ve RT'de 2 saat boyunca ışıktan korunan kuluçkaya yatırın.
  11. Pipet ikincil antikor kokteyli dışarı ve 3x 200 μL 1x PBS ile 5 dakika RT, ışıktan korunan. Son yıkamadan sonra iyi kaydıraktan sonra kaydıraktan sonra çerçeveyi ayırın ve 1x PBS'yi düşük tiftik kağıt silme ile kurulayın.
  12. Bir coverslip ekleyin, sıvı antifade montaj lı orta, ve 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) nükleer boyama için. RT'de bir gecede ışıktan korunarak kurusun.
  13. Kuruduktan sonra, konfokal mikroskopi ve veri toplama için hazır olana kadar 4 °C'de bir slayt kutusundaKi ışıktan korunun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Murine CNS'den izole edilen mikrodamarlar nörovasküler ünite2,3'üntüm içsel hücresel bileşenlerini gösterdi. Endotel hücreleri için trombosit endotel hücreli adezyon molekülü-1 (PECAM, CD31 olarak da bilinir) veya isolectin IB4 (endotel hücreli glycocalyx bağlayan bir glikoprotein) kullanarak, trombosit kaynaklı büyüme faktörü-β (PDGFRβ) veya perisitler için nöron-glial antijen 2 (NG2) ve astrositik uç ayaklar için aquaporin-4 (AQP4)(Şekil 3A,B)bu içsel bileşenlerin izole mikrokaplarda mevcut olduğunu göstermektedir. CNS bölgeleri kortikal mikrodamarlar (Şekil 3B), beyincik (Şekil 3C), hipofiz (Şekil 3D), hipotalamus ( Şekil3E), beyin sapı (Şekil 3F), ve omurilik (Şekil 3G). Hepsi bu kanonik işaretleri ifade gösterdi.

Aynı şekilde, mikrodamarlar yapışıklık protein VE-kadherin(Şekil 4A,C),sıkı kavşak proteinleri claudin-5 ve zonula oklüdens-1 (CLDN5 ve ZO-1, Şekil 4A,D), üç hücreli kavşak proteinangulin-1 (Şekil 4A,E) ve apikobazal belirteçler C-X-C motifkeokin ligand 12 ve gama-glutamyltransferaz 1 (CXCL12 ve GGT1, Şekil 4A,F). Bu proteinler önemli BBB özgü özellikleri9,12,13,14göstergeleri olduğu için bu bulgular ilgilidir. Glial fibrillary asidik proteini (GFAP, Şekil 4B,C,G),oligodendrosit spesifik protein (OSP, Şekil 4B,G)ve nörofilament-orta (NFM, Şekil 4B,H),sırasıyla izole mikrodamarların istenmeyen nörovasküler olmayan hücrelerin izlerinin olduğunu gösteren astrositler, oligodendrositler ve nöronların sınırlı varlığı. Ayrıca, mikrodamarların çoğunluğu α-düz kas aktinin ekspresyonundan yoksundu (αSMA, Şekil 5B,C). Bu durum, αSMA arteriyol ve venullarla ilişkili düz kas hücreleri için bir belirteç olduğu için önemlidir(Şekil 5A),bu izolasyon protokolünün seçici olarak küçük kalibreli mikro damarları hedef aldığını gösterir15.

Diğer küçük lissensefalik omurgalılardan elde edilen mikrokaplar, balıklarda (kurbağa ve kertenkele gösterilmez) ve kuş mikrodamarlarında görüldüğü gibi bazı morfolojik özellikleri paylaşırlar. Bu yöntem, türler arasındaki NVU farklılıklarının daha fazla karakterizasyonu için yararlı olduğunu göstermektedir(Şekil 6). Ayrıca, kuş CNS mikrodamarları(Şekil 6H–N)insan ve fare için geliştirilen antikorların çoğunda çapraz reaktivite gösterdi. Bu biyolojik ve biyomedikal BBB çalışmaları için kuş örneklerinin daha fazla araştırılmasını teşvik eder. İki jirensefalik tür olan domuz ve makaklardan mikrodamarları izole ettiğimizde de benzer sonuçlar elde ettik(Şekil 7). Sadece domuz mikrokaplarında NVU kanonik belirteçleri gösterilmiştir. Yukarıda bahsedilen CNS bölgelerine ek olarak, mikrodamarları periventriküler beyaz maddeden izole etmeyi başardık (Şekil 7B). Beyaz madde nöroinflamatuar koşullarda karıştığı için bu ilgilidir (örneğin, multipl skleroz16,17,18).

Bu yöntemin protein ekspresyonundaki değişiklikleri belirlemek için güvenilir bir araç olarak kullanılabileceğini öğrenmek istedik. VCAM-1 ve JAM-B EAE sırasında omurilik tefekaşit sürecinde karıştığı bilerek, biz EAE ve sham-control fareler (10 haftalık C57BL/6J fareler)9,10,11zirve ve kronik aşamalarında bu proteinlerin ekspresyonu quantitate karar verdi. Bunu yapmak için, mikrodamarların çapı boyunca rasgele yoğunluk birimini (AUI) ölçtük. Daha sonra, DAPI için ≤20 AUI eşiği kullanarak, VE-kadherin, VCAM-1 ve JAM-B için vecns bölgesi başına 50 mikrodamar için eğri (AUC) altındaki alanı hesapladık(Şekil 8A,B). Son olarak, protein ekspresyonundaki değişikliklerin istatistiksel önemini belirlemek için Sidak'ın post-hoc testini takip eden iki yönlü ANOVA uyguladık.

Beklendiği gibi, EAE zirvesi sırasında omurilik mikrodamarları boyunca VCAM-1 ve JAM-B'de bir artış gözlendik(Şekil 8D,E). Ancak, eae için daha önce bildirilmemiş diğer CNS bölgelerinde değişiklikler gözlemledik. VCAM-1 hipofiz mikrokaplarında anlamlı olarak artmış, hipotalamus ve beyin sapı mikrokaplarında azalmıştır. Tüm CNS dokularında kronik EAE sırasında değişiklikler oldu(Şekil 8D). JAM-B kronik EAE sırasında hipotalamus ve hipofiz mikrokaplarında anlamlı olarak artmıştır(Şekil 8E). İlginçtir ki, EAE'nin zirvesinde hipotalamus ve beyin sapından izole edilen mikrokaplar boyunca VE-kadherindeğişiklikleri, kronik AAE sırasında serebellum(Şekil 8C),pik ve kronik EAE sırasında hipofiz mikrodamar genişliğinde azalma gözlendi. Genel olarak, bu veriler mikrodamar izolasyonu bu yöntem sağlık ve hastalık sırasında bölgesel protein ekspresyon desenleri değişiklikleri karakterize etmek için yararlı bir araç olduğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Laminektomi olmadan etkili omurilik diseksiyonu. Küçük omurgalı örneklerinden (100 g'ye kadar) omuriliğin diseksiyonu, kordonu bir kaudal de rostral yönde niçin vertebraforamenboyunca kızartarak daha hızlı ve daha verimli bir şekilde gerçekleştirilir. Diseksiyon makası kullanılarak baş atlas eklemi tarafından çıkarılır ve omurga kalça(A)tarafından kesilir. Kalan tüm organlar çıkarılır, geriye sadece omurga(B)kalır. Lomber vertebraforamen içindeki omurilik servikal kord genişliğine göre çok küçük bir beyaz daire (<1 mm çap) olarak görünür(B, sarı oklar). Lomber vertebraforamen dar bir açıklık tutulması 18 G iğne ve 10 cc şırınga 1x PBS(C ve D)yüklü ile yıkama zaman lomber servikal omurga için bir basınç gradyanı kolaylaştırır. Bir kez kızartıldı, omurilik(D, sarı ok) neredeyse tamamen dural kese yoksun, ve sadece pia diseksiyon kapsamı altında kaldırılması gerekir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Çift uçlu kesme kesme aleti ve modifiye filtre tutucu. Bu 11 cm uzunluğundaki kesme aleti(A)iki çok keskin, neredeyse yatay olarak zıt noktalara sahiptir, 2 mm uç-uç(B). Hafif aşağı doğru basınç uygulayarak ve saat yönünde hafifçe bükülerek(C),noktalar yukarı kaldırılabilir, böylece menenjler içine yatay olarak kendilerini gömme. Bu özellikle beyincik menenjler çıkarırken yararlıdır, çünkü serebelli folia derinliğine erişim sağlar. Kortikal doku menenjler çıkarırken de çok yararlıdır, özellikle gyrencephalic. Bu durumda, pia son derece mikrosevessel izolasyon saflığını tehlikeye atacak yüksek kalibreli vaskülatür ile gömülüdür. Aynı şekilde, kontaminasyon en olası kaynağı olan koroid pleksus, kaldırılmasını kolaylaştırır. 47 mm, 25 mm ve 13 mm çapındaki filtre tutucular, giriş konektörünü(D)üst bölmeden (E)çıkarmak için lazerle kesilmiş, ancak elek bileşenini(G)saklar. Bu modifikasyon, 20 μm naylon filtre ağını elek ve alt kısmın üzerine yerleştirerek bir filtre ünitesinin montajına izin(I,J) izin verilir (G,H), üst kısmı vidalarken ağı yerinde sabitler (E). Sadece 25 mm filtre tutucu gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Birden fazla CNS bölgesinden izole edilen mikrodamarlar kanonik nörovasküler birim belirteçlerini ifade eder. (A) İmmünolabeling ve konfokal mikroskopi kullanılarak, NVU'nun içsel hücresel bileşenleri yetişkin (8-14 haftalık C57BL/6J) murine CNS mikrodamarları tanımlamak için kullanılır. Kortikal mikrodamarlar için birleştirme görüntüsünde görüldüğü gibi(B),endotel hücre belirteci CD31 (beyaz), perisit marker PDGFRβ (kırmızı) ve astrositik uç ayak belirteci AQP4 (yeşil) tüm bu hücresel bileşenler için bireysel konfokal görüntülerin üzerinde korunur. Endotel hücreleri ve perisitler arasındaki yakın ilişki onları birleştirilmiş resimde macenta görünmesini sağlamak dikkat, astrositik uç ayak onları çevreleyen bir hale var gibi görünürken(B). Aynı ekspresyon paterni beyincik (C), hipofiz (D), hipotalamus (E), beyin sapı (F),ve omurilik (G, DAPI, nükleer leke = mavi; ölçek çubuğu = 10 μm) için gözlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Mikrodamarlar BBB'ye özgü özellikleri ile ilişkili proteinleri ifade eder. Nörovasküler birim (NVU) içindeki endotel hücreleri de içsel bariyer özellikleri ile ilişkili proteinler tarafından tanımlanır (A). Şekilde görüldüğü gibi endotel hücrelerinde VE-kadherin, CLDN5, ZO-1(A, sarı) ve angulin-1(A, teal) kavşakları bulunur. Ayrıca GGT-1 ve CXCL12(A,yeşil ve kırmızı) dahil olmak üzere birden fazla proteine apikobazal polarite gösterirler. Nöronlar, oligodendrositler ve astrosit hücreli cisimler izole mikrodamarlara dahil edilebilirler, ancak NVU'ya özgü değildirler (B). Bunlar sırasıyla NFM (kırmızı), OSP (siyan) ve GFAP (kireç yeşili) ifadesi ile tanımlanabilir (B). Bunlarla tutarlı olarak, izole mikrodamarlarımız, bağlı proteinleri VE-kadherin(C,kırmızı), sıkı kavşak proteinleri CLDN5 ve ZO-1(D, kırmızı ve yeşil, sırasıyla, birleşerek = sarı), üç hücreli kavşak proteini LSR (E, yeşil) ve apikobazal belirteçler CXCL12 ve GGT1(Sırasıyla)ifade eder. Ayrıca sınırlı miktarda GFAP(A,yeşil, G,beyaz), OSP(G, yeşil) ve NFM(H, kırmızı) sergilenerek nörovasküler olmayan birim hücrelerin ihmal edilebilir şekilde tutulmasını öneren (DAPI, nükleer leke = mavi; ölçek çubuğu = 10 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: İzole edilmiş mikrodamarların çoğu αSMA ifade etmez. Nörovasküler birim arteriyol-kapiller-venül(A)sofistike bir geçiş sergiler. αSMA anuler ekspresyonu arteriyol'u açıkça tanımlar ve kapiller hale geldikçe αSMA(B, kırmızı) ekspresyonu azalır, duvar belirteci NG2(B, yeşil) ortaya çıkar. ΑSMA+ ve αSMA- damarların (beyaz braketler, n = 20) çapını ölçtük ve onları arteriyol veya kılcal damar olarak ayırdık (DAPI, nükleer leke = mavi, ölçek çubuğu = 10 μm). αSMA+ ve αSMA-damarların çapının eşleşmemiş t-test analizi yüksek istatistiksel anlamlılık gösterdi (C, αSMA+ = kırmızı, αSMA- kırmızı/yeşil, ****p < 0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: CNS mikrodamarlarının diğer lissensefalik türlerden başarılı bir şekilde izolasyonu. CNS yabani yakalanmış bir kurbağa (8,2 cm), kertenkele (12,7 cm), tank yetiştirilen gökkuşağı alabalığı (2 yaşında, 35,6 cm) ve kuş yetiştirilen güvercin (9 aylık, ~300 g) hasat edildi. Kurbağa, balık ve kertenkelenin mikro damarları H&E ile boyanmıştı (sadece alabalıktan gelen mikro damarlar gösterilmiştir, ölçek çubuğu = 20 μm). Güvercin mikrodamarları immünoetiketli idi. Biz balık ve güvercin CNS anahatları etiketli olarak tüm bölgelerde mikrodamarları tespit başardık: korteks(A ve H),optik lob(B ve Ben),beyincik (C ve J), hipofiz(D ve L),hipotalamus (E ve K), beyin sapı (F ve M), ve omurilik(G ve N). Ayrıca, isolectin IB4 (beyaz), AQP4 (yeşil) ile astrositik uç ayakları ve güvercinizole mikrokaplar (DAPI, nükleer leke = mavi, ölçek çubuğu = 10 μm) NFM (kırmızı) ile komşu nöronlar ile endotel hücreleri tespit başardık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: CNS mikrodamarlarının jirensefalik türlerden izolasyonu. Beyin ve omurilik bir çiftlik yetiştirilen domuz (~ 6 aylık, ~ 120 kg) mikrodamar izolasyon ve immünetiketleme için kesildi. Domuz CNS'nin tüm bölgelerinde IB4 (beyaz), PDGFRβ (kırmızı) ve AQP4 (yeşil) etiketli mikrodamarları tespit edebildik: korteks(A),periventriküler beyaz madde (B), serebellum (C), hipofiz (D), hipotalamus (E), beyin sapı (F), ve omurilik (G, DAPI, nükleer leke = mavi, ölçek çubuğu = 10m). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: CNS mikrodamar izolasyonunun diğer uygulamasına örnek. JAB-B ve VCAM-1 ekspresyonu murine EAE mikrodamarları için ölçüldü. EAE'nin en yüksek ve kronik evrelerinde farelerin korteks, beyincik, hipotalamus, hipofiz, beyin sapı ve omurilik için keyfi yoğunluk birimleri (AUI) ölçüldü ve kontrol olarak sham (n = 4). Her CNS bölgesi için, florokrom başına AUI ve mikrodamar çapını belirlemek için fare başına on iki mikrodamar değerlendirildi (A). Beyaz parantezler, VCAM-1 (beyaz), VE-kadherin (yeşil), JAM-B (kırmızı) ve DAPI (mavi, ölçek çubuğu = 10 μm) için AUI'yi belirlemek için kullanılan konfokal mikroskop yazılımı ölçüm aracının örneklerini gösterir. Daha sonra, ortaya çıkan AUI mikronçapı karşı çizilmiştir(B) protein ekspresyonunun bir tahmin olarak her immünetiketli protein için eğri (AUC) altında alanı hesaplamak için. Grup başına ortalama AUC daha sonra iki yönlü ANOVA tarafından analiz edildi ve ardından Sidak'ın hoc sonrası testi, CNS bölgesi başına toplam 48 mikrodamar için analiz edildi. Hipofiz mikrodamarları dışında, hastalık durumu ile ilişkili mikrodamar çapı(C, insert) arasında önemli bir fark gözlenmedi, ancak EAE farelerde hipotalamus ve beyin sapından VE-kadherin ekspresyonunda önemli bir azalma gözlendik (C). Benzer istatistiksel analizler, EAE'nin zirvesinde nöroinflamatuar durumla uyumlu olarak omurilikte VCAM-1 (D) ve JAM-B(E)için anlamlı bir artış gösterdi. İlginçtir, biz de hipotalamus VCAM-1 için değişiklikler gözlendi, hipofiz, ve beyin sapı. Bu sonuçlar araştırılıyor (siyah çubuklar ve nokta = düz çubuklar, kırmızı çubuklar ve noktalar = tepe EAE, somon barları ve nokta = kronik EAE, *p<0.05, @p<0.01, #p<0.001 ve &p<0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

MV-1 10 mM HEPES
1x Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) kalsiyum ve magnezyum
MV-2 %18 70 kDa molekül ağırlığı (MW) dextran
içinde 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
MV-2 %20 70 kDa MW dekstran
içinde 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
MV-3 %1 büyükbaş serum albumin (BSA)
içinde 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
Fiksatif %4 paraformaldehit (PFA)
1x fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7,4
Yıkama tamponu 1x PBS pH 7.4
Permeabilization & engelleme tampon %10 BSA
%0.25 niyonik yüzey aktif
içinde 1x PBS pH 7.4
Antikor dilüent %5 BSA
%0.25 niyonik yüzey aktif
içinde 1x PBS pH 7.4

Tablo 1: Protokolde kullanılan çözümler.

Adım(lar) Eylem
4.1 ve 4.1.1 Tek kenarlı bıçakile MV-1 çözeltisinde kıyma
4.2 ile 4.2.2 arası Potter-ELVJ PTFE veya mikrotüp havaneli kullanarak MV-1 çözeltisinde homojenleştirin
5.1 Spin 2,000 x g, 4 °C, 10 dk
5.1.1 ile 5.1.1.2 MV-2 çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın
5.2 4.400 x g,4 °C, 15 dk
5.3 ile 5,5 arası 1 mL MV-3 çözeltisi ile peleti yeniden askıya alın
6.2 ile 6.4.1 arası Bir hücre süzgeci ile 50 mL konik tüp üzerinde elute ve MV-3 çözeltisi ile durulayın
6.5, 6.5.1, 6.6 ve 6.7 Modifiye filtre tutucuda 20 μm naylon net içeren filtre
6.8 Naylon ağı 10 mL MV-3 çözeltisi ile 50 mL kabına yükleyin ve 30 s
6.9 ile 6.10 arasında 15 mL konik bir tüp içine Decant ve 2.000 x g,4 °C, 5 dk spin
6.10 MV-3 çözeltisinin 1 mL'sinde yeniden askıya alma
6.10.1 1,7 mL mikrotüp ve 20.000 x g,4 °C, 5 dk
7.1 ile 7.3 arası 1x PBS'de yeniden askıya alın ve kuyu slaytlarına yükleyin

Tablo 2: Küçük omurgalı mikrodamar izolasyonu için düzen. Bu grafik, lissensefalik bir örnek kullanırken protokolün kısaltılmış bir sürümüdür.

Adım(lar) Çözüm Eylem Ctx Cbl Tercih Bst Sc Hyp Çukur
4.1 MV-1 Çanak üzerine kıyma 100 mm x 20 mm Petri kabı, 1 mL Yok
4.2.1 ve 4.2.2 MV-1 Homojenize 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem 1 mL, mikroteksle
5.1.1.1 ve 5.1.1.2 MV-2 Yeniden askıya alma 5 mL + 5 mL, %18 Dekstran 1 mL, %20 dekstran
5.5 ve 6.4.1 MV-3 Yeniden askıya alma 1 mL + 10-15 mL 1 mL
6.2 ve 6.4.1 MV-3 Süzgeç boyutu 100 μm 70 μm 100 μm 70 μm 100 μm
Durulayın 5 mL
6.5, 6.5.1 ve 6.7 MV-3 Filtre boyutu, durulama 25 mm filtre, 10 mL 13 mm, 5 mL
6.8 MV-3 Beher üzerinde sallayın 10 mL
6.10 MV-3 Yeniden askıya alma 1 mL
7.2 1x PBS Yeniden askıya alma 1,5 ila 2,0 mL 0,5 ila 1,0 mL 0,1 ile 0,2 mL arasında
7.3 1x PBS Kuyu başına yük 200 μL 100 μL 25 ila 50 μL
CTX = korteks, CBL = serebellum, BST = beyin sapı, OPT = optik lob (memelilerde bulunmaz), HYP = hipotalamus, PIT = hipofiz, SC = omurilik. Önerilen hacimler 20 g (genç fare) ile 800 g (yetişkin sıçan) arasında değişen hayvanlardan tüm doku içindir.

Tablo 3: Önerilen hacim/boyut. Bu anahat ~ 20-~ 800 g, ya da daha spesifik olarak, ~ 25 g fare video gösterilen arasında değişen küçük bir omurgalı örnek kullanmak için çözümler önerilen hacmi vardır. Gerekli hacimlerin nihai ayarı, diseksiyondan sonra elde edilen ıslak doku miktarına göre araştırmacı tarafından belirlenmelidir. Uygulama ve sorun giderme önerilir. CTX = korteks, CBL = serebellum, BST = beyin sapı, OPT = optik lob (memelilerde bulunmaz), HYP = hipotalamus, PIT = hipofiz, SC = omurilik.

Adım(lar) Eylem
4.1 ve 4.1.2 Tek kenarlı bıçakla MV-1'de kıyma
4.3 ile 4.3.4 arası PTFE pestle ile Potter-Elvehjem öğütücü kullanarak MV-1 çözeltisinde homojenleştirmek
5.1 Spin 2,000 x g, 4 °C, 10 dk
5.1.2 ile 5.1.2.2 MV-2 çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın
5.2 4.400 x g,4 °C, 15 dk
5.3 ile 5,5 arası 1 mL MV-3 çözeltisi ile peleti yeniden askıya alın
6.2 ila 6.4 ve 6.4.2 Bir hücre süzgeci ile 50 mL konik tüp üzerinde elute ve MV-3 çözeltisi ile durulayın
6.5, 6.5.2, 6.6 ve 6.7 Modifiye filtre tutucuda 20 μm naylon net içeren filtre
6.8 Naylon ağı 30 mL MV-3 çözeltisi ile 50 mL'lik bir kabın içine yükleyin ve 30 s
6.9 ve 6.10 50 mL konik bir tüp içine Decant ve 2.000 x g,4 °C, 5 dk spin
6.10 MV-3 çözeltisinin 1 mL'sinde yeniden askıya alma
6.10.2 5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın ve 2.000 x g,4 °C, 5 dk
7.1 ile 7.3 arası 1x PBS'de yeniden askıya alın ve kuyu slaytlarına yükleyin

Tablo 4: Büyük omurgalı mikrodamar izolasyonu için düzen. Bu grafik, jirensefalik bir örnek kullanırken protokolün kısaltılmış bir sürümüdür.

Adım(lar) Soution Eylem Ctx Cbl Wm Bst Sc Hyp Çukur
4.1 MV-1 Çanak üzerine kıyma 3−5 mL 1 mL
4.3 ile 4.3.4 arası MV-1 Homojenize 20−30 mL, 55 mL Potter-Elvehjem haşere ve tepegöz ile 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem
5.1.2 ile 5.1.2.2 MV-2 Yeniden askıya alma >20 mL, %20 dekstran 5 mL + 5 mL, %20 dekstran
5.5, 6.4 ve 6.4.2 MV-3 Yeniden askıya alma 1 mL + 20 mL 1 mL + 10 mL
6.2 ve 6.4.2 MV-3 Süzgeç boyutu 100 μm 70 μm 100 μm 70 μm 100 μm
Durulayın 10 mL
6.5, 6.5.2 ve 6.7 MV-3 Filtre boyutu, durulama 47 mm filtre, 10 mL 25 mm, 10 mL
6.8 MV-3 Beher üzerinde sallayın 30 mL
6.10 ve 6.10.2 MV-3 Yeniden askıya alma 1 mL + 4 mL
7.2 1x PBS Yeniden askıya alma 2,0 ile 4,0 mL arası 1,0 ile 2,0 mL arasında
7.3 1x PBS Kuyu başına yük 200 μL 100 μL
CTX = korteks, CBL = beyincik, WM = beyaz madde, BST = beyin sapı, HYP = hipotalamus, PIT = hipofiz, SC = omurilik. Önerilen hacimler CTX, CBL, BST ve SC bütün HYP ve PIT için ~45 cm3 numuneleri içindir.

Tablo 5: Önerilen hacim/boyut. Bu anahat büyük bir omurgalı örneği kullanmak için önerilen çözüm hacmine sahiptir. Daha spesifik olarak, korteks, beyincik, beyaz madde, beyin sapı, omurilik ve tüm hipotalamus ve hipofiz için ~ 45 cm3 CNS doku biyopsileri için geçerlidir, video gösterildiği gibi. Gerekli hacimlerin nihai ayarı, diseksiyondan sonra elde edilen ıslak doku miktarına göre araştırmacı tarafından belirlenmelidir. Uygulama ve sorun giderme önerilir. CTX = korteks, CBL = beyincik, WM = beyaz madde, BST = beyin sapı, HYP = hipotalamus, PIT = hipofiz, SC = omurilik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BBB sıkı sofistike bir mimari ile birleştiğinde beyin mikrovaskületür endotel hücrelerinin benzersiz özelliklerini içerir,, "peg-soket"- kavşaklar, ve yapışma plakları CNS homeostaz için kritik2,3,19. Endotel hücreleri özellikleri indüklenen ve perisitler ve çevreleyen astroglia son ayak süreçleri2tarafından korunur,3,19. BBB mikrovaskületürü polarite (yani, luminal veya abluminal endotel hücre yüzeylerinde lokalize proteinlerin asimetrik ekspresyon deseni) gösterir20. Bu kısaca BBB tanımlayabilir iken, gerçekte nörolojik en esrarengiz kavramlarından biri olmaya devam etmektedir. Örneğin, NVU içinde bölgesel, cinsiyet ve yaş farklılıkları travma, toksisite, enfeksiyon ve inflamasyon, hangi önemli klinik sonuçları 3 olabilir CNS bölgesel güvenlik açıkları açıklayabilir3,5,6. BBB anlayışında bir diğer engel birden fazla takson7,8arasında gözlenen farklılıklardır. BBB'yi anlamanın ve araştırmanın önündeki en büyük engellerden biri, BBB'yi kapsayan NVU'nun izolasyonuyla ilgili zorlukolup, bariyere özgü özelliklerini hala korumanın14.

BBB, CNS-bölgesel farklılıklar ve tür farklılıkları nı anlamamızı hızlandırmak amacıyla, daha önce yayınlanmış yöntemleri uyarladık. Biz başarıyla bu adapte, özellikle Boulay ve ark.21, tek kortikal mikrodamarlar elde etmek için, serebellar, hipotalamik, hipofiz, beyin sapı, ve spinal dokular lissencephalic küçük omurgalılar sayısız: balık, amfibiler, sürüngenler, kuşlar, ve memeliler(Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, ve Şekil 6). Bu yöntemin bir avantajı, adaptasyonları CNS doku genel boyutuna dayalı olmasıdır: araştırmacı çözelti miktarı, doku öğütücü boyutu, konik tüp, filtre tutucular, vb ıslak doku göre seçer, ne olursa olsun türler, cinsiyet, ve yaş. İmmünoetiketleme deneyimimizde, ~20 g numune, korteks, beyincik, optik lob, beyin sapı ve omurilik başına 8 kuyu luk ve hipotalamus ve hipofiz başına yarım iyi slayt için yeterli mikrodamar verir. Ancak, kortikal ve optik lob verimi serebellum göre çok daha yüksektir, beyin sapı, ve omurilik.

Görüldüğü gibi, cns mikrodamarlarının izolasyonu ve immünetiketlemesi için gerekli uyarlamaları yaptık domuz ve makak, daha büyük jirensefalik memelilerin çeviriaraştırmaları için daha uygun olan(Şekil 7). Özellikle, biz sadece bu türler üzerinde periventriküler beyaz madde dahil başardık. Bu hayvanlardaki CNS daha büyük olduğundan, ikinci santrifüj sırasında miyelin tabakasından bir mikrodamar peletini ayırmamıza izin verecek kadar beyaz madde topladık (adım 5.3, MV-2 % 20 dekstran). Bu ayrımı achive edebilmek için kritik bir kitle gerekli olduğunu spekülasyon ve biz aktif nasıl murine CNS doku ile benzer bir sonuç elde etmek için arıyoruz.

Sadelik uğruna atlanmasına rağmen, kuş, domuz ve makak mikrodamarlarında NVU kanonik belirteçlerinin ötesinde immünetiketleme yaptık. Özellikle, tüm türler daha önce Murine örneklerinde BBB fonksiyonu (ve-kadherin, CLDN5, ZO-1 ve LSR ve apikobazal belirteçler CXCL12 ve GGT1) ile ilgili olarak tanımlanan hücresel ve moleküler belirteçleri paylaştılar veya NVU'ya (NFM, OSP ve GFAP) yakın. Yine, bu bulgular daha fazla NVU orthology ve türler arasında sapma tanımlamak için diğer türler üzerinde bu yöntemin kullanımını teşvik. Ayrıca, aynı türdeki NVU türü, cinsiyet ve yaş farklılıkları ve BBB biyomedikal araştırmalar için diğer organizmaları kullanmanın fizibilitesini daha fazla araştırma fırsatı nı da açarak. Ayrıca nöroinflamasyon sırasında protein ekspresyonu düzeylerindeki değişiklikleri quantitate için bu mikrodamar izolasyon yönteminin başarılı bir şekilde kullanıldığına dair kanıtlar gösteriyoruz(Şekil 8). Bu deneyi bir kavram kanıtı olarak gerçekleştirmiş olsak da, burada kullanılan yaklaşım şu anda laboratuarımızda yaygın olarak kullanılmaktadır. Biz sadece ifade düzeyi ama göreceli protein bolluğu, CXCL12 ve diğer apikobazal proteinlerin tehcir, junctional proteinlerin bağlantısı, vb, CNS mikrovessels9,13,22karmaşık görünümü içinde odaklanmak istiyorum çünkü diğer nicel yöntemler (örneğin, Batı leke) üzerinde bu yaklaşımı lehine . Aynı şekilde, şu anda nvu hücresel bileşenlerin daha fazla izolasyon gibi diğer uygulamalar için yöntem sorun giderme (endotel hücreleri ve perisitler), RNA-seq, ve proteomics23,24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Dr. Cruz-Orengo California Üniversitesi, Davis, Veterinerlik Okulu Start Up Fonları tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. 53208 (2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics