Pålitelig isolering av sentrale nervesystemet Microårene over fem virveldyr grupper

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Målet med denne protokollen er å isolere microårene fra flere regioner i det sentrale nervesystemet i lissencephalic og gyrencephalic virveldyr.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M. L., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Isolering av microårene fra sentralnervesystemet (CNS) er vanligvis utføres ved å kombinere kortikale vev fra flere dyr, oftest gnagere. Denne tilnærmingen begrenser avhør av blod-hjerne barriere (BBB) egenskaper til cortex og tillater ikke for individuelle sammenligning. Dette prosjektet fokuserer på utvikling av en isolasjons metode som gjør det mulig for sammenligning av nevrovaskulære enheten (NVU) fra flere CNS-regioner: cortex, lillehjernen, optikk flik, hypothalamus, hypofysen, hjernestammen, og ryggmargen. Videre ble denne protokollen, opprinnelig utviklet for murine prøver, med hell tilpasset for bruk på CNS vev fra små og store virveldyr arter som vi er også i stand til å isolere microårene fra hjernen halvkule hvit materie. Denne metoden, når den er sammenkoblet med immunolabeling, tillater kvantifisering av protein uttrykk og statistisk sammenligning mellom individer, vevs type, eller behandling. Vi beviste dette anvendelsen ved å evaluere endringer i protein uttrykk under eksperimentell autoimmune encefalomyelitt (EAE), en murine modell av en neuroinflammatory sykdom, multippel sklerose. I tillegg kan microårene isolert med denne metoden brukes til nedstrøms programmer som qPCR, RNA-SEQ og Western Blot, blant andre. Selv om dette ikke er første forsøk på å isolere CNS microårene uten bruk av ultracentrifugation eller enzymatisk dissosiasjon, er det unikt i sin Adeptness for sammenligning av enkeltpersoner og flere CNS regioner. Derfor tillater det for etterforskning av en rekke forskjeller som kan ellers forbli obskure: CNS porsjoner (cortex, lillehjernen, optikk, hjernestammen, hypothalamus, hypofysen, og ryggmargen), CNS vev type (grå eller hvit materie), enkeltpersoner, eksperimentelle behandlingsgrupper og arter.

Introduction

Vår hjerne er det viktigste organet i kroppen vår. Av denne grunn, holde hjernen homeostase tross eksterne faktorer som kan utløse et avvik fra normalitet er en prioritet. Ifølge noen forskere, om lag 400 til 500 millioner år siden1, virveldyr dyr utviklet det vi nå kjenner som Blood-Brain Barrier (BBB)2,3. Denne beskyttende "gjerde" utøver den største innflytelsen over sentralnervesystemet (CNS) homeostase og funksjoner ved å tett regulere transport av ioner, molekyler, og celler mellom blod og CNS parenchyma. Når BBB er forstyrret, blir hjernen utsatt for giftig eksponering, infeksjon og betennelse. Derfor BBB dysfunksjon er forbundet med mange, om ikke alle, nevrologiske og neurodevelopmental lidelser4,5,6.

Den sofistikerte funksjon av BBB er tilskrevet den unike CNS microvasculature likedannet av nevrovaskulære enhet (NVU)2,3. Høyt spesialiserte endothelial celler, pericytes, og astrocytic ende-føtter er cellulære komponenter i NVU2,3. Den ekstracellulære matrise generert av disse cellene er også avgjørende for NVU og BBB fysiologi2,3. Selv om essensielle cellulære og molekylære komponenter av NVU er bevart blant virveldyr, er heterogenitet rapportert blant ordre og Art7,8. Men tekniske begrensninger hindre vår evne til å fullt ut vurdere disse forskjellene i nevrobiologi, biomedisinsk eller translational forskning.

På grunn av dette, utvidet vi en CNS region-spesifikk microvessel-isolasjon metode for å gjøre det gjelder for mange arter fra alle fem virveldyr grupper: fisk, amfibier, reptiler, fugler og pattedyr. Protokollen er beskrevet for bruk på små-lissencephalic og store-gyrencephalic virveldyr, inkludert arter med translational relevans9. I tillegg inkluderer vi andre regioner av CNS ikke undersøkt før i denne sammenheng, men relevant for nevrofysiologi og med enorme kliniske implikasjoner: hypothalamus, hypofysen, og hvit materie. Til slutt, testet vi kapasiteten til denne isolasjons metoden som et pålitelig verktøy for å identifisere endringer i protein uttrykk langs NVU og/eller BBB9,10,11. Som en proof-of-konseptet, viste vi hvordan du fastslår endringer i VCAM-1 og JAM-B uttrykk under EAE bruke isolasjons metoden etterfulgt av immunofluorescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer i denne studien er i samsvar med retningslinjene satt av University of California (UC), Davis institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC). Animal Care ved UC Davis er regulert av flere uavhengige ressurser og har blitt fullstendig akkreditert av foreningen for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care International (AAALAC) siden 1966. Svin CNS vev ble innhentet fra UCD Department of Animal Sciences, Meat Sciences Laboratory. CNS vev fra rhesus aper ble innhentet fra California National primater Research Center patologi Department (NIH P51OD011107). Ingen anestesi, døds aktiv, eller obduksjon ble utført av laboratoriet Staff på griser og aper. Derfor er det ingen spesielle anbefalinger om disse sakene.

Merk: denne metoden ble validert for flere arter, men den oppgitte protokollen tilsvarer mer direkte til mus og svin vev. Detaljer vedrørende optisk flik gjelder ikke ved bruk av pattedyr prøver. Alle biologisk farlige materialer må håndteres i en hensiktsmessig biosafety nivå (BSL) anlegget. Alle akutt giftige stoffer må håndteres under en avtrekksvifte. Alt biologisk farlige medisinsk avfall og akutt giftig avfall må avhendes på riktig måte.

1. forberedelse

  1. Klargjør løsninger (tabell 1) minst én dag foran.
    Merk: det er svært vanskelig å oppløse 70-dextran i kDa molekylvekt (MW). Det er mer effektivt å la løsningen røres over natten dekket med enten parafin film eller folie. Protokollen krever bruk av to forskjellige MV-2-løsninger avhengig av prøven under etterforskning. Den 18% dextran effektivt skiller myelin fra microvessel pellet når du utfører protokollen på små lissencephalic eksemplarer. Men, det utvikler en flekk av myelin innenfor grensesnittet av CNS vev fra store gyrencephalic eksemplarer, samt hypothalamus og hypofysen fra små eksemplarer. Dette smøre er forhindret ved å bruke 20% dextran.
  2. Forbered godt lysbilder ved å laste 50 μL per brønn av Poly-D-lysin og la tørke i 2 timer ved romtemperatur (RT), fortrinnsvis i et biologisk sikkerhetskabinett-klasse 2 (BSC-2). Ikke overdry. Skyll to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) og oppbevar den i kjøleskapet til den er klar til bruk.

2. CNS tissue disseksjon fra små Lissencephalic virveldyr prøve

Merk: artikkelen demonstrerer anvendelsen av protokollen på en C57BL6/J, 10 uke gamle, ~ 25 g, mannlig mus.

  1. Klargjør 2 15 mL koniske rør og et 1,7 mL mikrosentrifugen rør med henholdsvis 5 mL og 1 mL av MV-1-oppløsning per prøve. Hold rørene på isen.
  2. Bedøvelsen
    1. Bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av en Ketamin, xylazine, og acepromazine bedøvelse cocktail på 100/10/3 mg per kg kroppsvekt og spray med 70% etanol. Bekreft anestesi ved å vurdere fraværet av palpebral og pedal reflekser ved å berøre et øye og knipe en fot, henholdsvis.
    2. Bedøve duer ved innånding av 5% isoflurane ved hjelp av en induksjon anestesi boks.
    3. Bedøve fisk og frosker i 1% Tricaine i enten en fisk holde vanntank eller amfibier ringer ' s løsning (tabell av materialer), henholdsvis.
    4. Bedøve øgler ved avkjøling ved 4 ° c før døds aktiv.
  3. Halshugge dyret med kirurgisk saks, skrelle bort huden med tang for å eksponere skallen, og skjær med LaGrange saks gjennom foramen Magnum (figur 1A).
  4. Analysere hjernen med en slikkepott og overføre til en 15 mL konisk rør med MV-1-løsning. Hold slangen på isen.
  5. Hente hypofysen fra skallen ' s Sella turcica med pinsett og overføre til en 1,7 ml mikrosentrifugen rør med mv-1 løsning. Hold slangen på isen.
  6. Fjern hud og muskler for å avdekke den vertebrale kolonnen. Skjær ut lemmer, rib bur, og indre organer (figur 1B).
  7. Analysere ryggmargen ved en av de to metodene som er beskrevet nedenfor. Deretter kan du overføre til et 5 mL konisk rør med MV-1-løsning. Hold slangen på isen.
    1. Utfør laminectomy ved å skjære i en rostral for å caudal retning med LaGrange saks, starter gjennom cervical vertebrale foramen, til når korsryggen ledningen.
    2. Utfør Flushing i en caudal for å rostral retning gjennom korsryggen vertebrale foramen med en 18 G nål og 10 ml sprøyte lastet med mv-1 løsning (figur 1C, D).
      Merk: denne metoden fungerer bare med svært små eksemplarer, for det meste gnagere (< 100 g).
  8. Ved hjelp av en dissekere omfang, kutt dural SAC fra ryggmargen med våren saks og fjerne de resterende hjernehinnene med en dobbel-kanter hakke (figur 2).
  9. Overfør hjernen til en Petri parabol og ved hjelp av en dissekere omfang, fjerne hjernehinnene med en dobbel-kanter hakke (figur 2a-C).
  10. Avgiftsdirektoratet den olfactory pærer og thalamus med pinsett, Iris saks, og våren saks. Bruke doble kanter hakke, fjerne akkord plexus fra alle hjernen ventriklene. Sørg for å fjerne alle akkord plexus.
    Merk: akkord plexus og olfactory pærer er en massiv kilde til forurensning. I motsetning til BBB, disse blodkar er svært fenestrated og resultatene av den påfølgende eksperimenter vil bli kompromittert hvis de ikke er fjernet.
  11. Bruke tang, skille de distinkte CNS regioner: cortex, lillehjernen, hjernestammen, optikk flik (ikke på pattedyr eksemplarer), og hypothalamus.

3. CNS tissue disseksjon fra en stor Gyrencephalic virveldyr prøve

Merk: denne protokollen bruker svin CNS vev Hentet fra en for slakterier. Derfor er ingen anestesi, døds-eller obduksjon beskrevet eller vist her.

  1. Transport svin CNS vev i en 0,946 L (32 oz) histologi container lastet med MV-1 løsning inne i en is brystet/bøtte.
  2. Ved hjelp av en dissekere omfang, fjerne hjernehinnene med en dobbel-kanter hakke, tang, Iris saks, og fjær saks fra hver CNS vev. Sørg for å fjerne alle deler av akkord plexus fra hjernen ventriklene.

4. CNS vev homogenisering

Merk: det er mer effektivt når to etterforskere engasjere seg i homogenisering prosessen: en dissekere hjernehinnene under stereoscope og den andre homogenisere hakket vev. På denne måten blir vevet raskt tilbake til isen bøtte og holdt kaldt.

  1. Plasser hvert CNS-område på en Petri-rett med en oppløsning på ~ 1 mL MV-1. Ved hjelp av en enkelt-kant blad, hakke vevet å få 1-2 mm stykker.
    1. For en liten virveldyr prøve, bruk en 100 mm x 20 mm Petri parabolen.
    2. For en stor virveldyr prøve, bruk en 150 mm x 15 mm Petri parabolen.
  2. Homogenisering av en liten virveldyr (tabell 2 og tabell 3)
    1. Overfør cortex, lillehjernen, hjernestammen, optisk flik og ryggmargen til ~ 1 mL MV-1-løsning i en individuell 10 mL Potter-Elvehjem glass vev jeksel med en PTFE-morter ved hjelp av en overførings pipette. Tilsett 5 mL MV-1-løsning og homogenisere hvert vev (~ 10 slag). Overføring til individuelle 15 mL koniske rør. Hold rørene på isen.
      Merk: for en liten virveldyr, 5 eller 4, med eller uten optisk flik, henholdsvis 10 mL Potter-Elvehjem kverner og 15 mL koniske rør er nødvendig.
    2. Overfør hypothalamus og hypofysen med tang til ~ 100 μL av MV-1 løsning i en individuell 1,7 mL rør og nøye homogenisere med et glass micropestle. Skyll hver micropestle med en oppløsning på ~ 1 mL MV-1. Hold slangen på isen.
      Merk: for et lite virveldyr, er 2 glass micropestles og 1,7 mL rør nødvendig.
  3. Homogenisering av en stor virveldyr (Tabell 4 og tabell 5)
    1. Ved hjelp av en overføring pipette, overføre hakket vev til en 55 mL Potter-Elvehjem glass vev jeksel med en PTFE morter og fest til overhead stirrer. Legg halvparten av det anbefalte volumet av MV-1-løsning, i henhold til den spesifikke CNS-delen som homogenisert (tabell 5).
    2. Slå på overhead stirrer ved svært lav hastighet (~ 150 RPM) og forsiktig flytte glassrøret opp og ned i ca 30 s.
    3. Slå av overhead stirrer, tilsett mer MV-1-løsning, og gjenta trinn 4.3.2 til få en homogen slurry.
    4. Overføring til et 50 mL konisk rør. Hold slangen på isen.
    5. Vask jeksel med deionisert vann mellom hver CNS vev homogenisering.
      Merk: for et stort virveldyr 5 eller 4, med eller uten hvit materie, er 50 mL koniske rør nødvendig. Likeledes, to (2) 15 mL koniske rør er nødvendig for hypothalamus og hypofysen.

5. Microvessel rensing

  1. Sentrifuger vev homogenater som følge av trinn 4.2.1, 4.2.2 eller 4.3.4 ved 2 000 x g i 10 min ved 4 ° c. En stor hvit grenseflate av myelin ville blankett på topp av det rødlig microårene ' pellets. Kast supernatanter.
    1. Prøve med små virveldyr (tabell 2 og tabell 3)
      1. Resuspend cortex, lillehjernen, hjernestammen, optikk flik og rygg mARGs pellets i 5 mL iskald MV-2-løsning med en 5 mL serologisk pipette (~ 10 flush). Tilsett 5 mL iskald MV-2-løsning på hver fjæring og bland forsiktig ved å bla i rørene.
      2. Resuspend hypothalamus og hypofysen pellets med 1 mL MV-2 løsning.
    2. Store virveldyr (Tabell 4 og tabell 5)
      1. Tilsett 20 mL iskald MV-2 løsning på cortex, lillehjernen, hjernestammen, og ryggmargen microvessel pellets. Resuspend pellets ved å blande på et rør revolver shaker, stirring ved 40 RPM for ~ 5 min. balanser de koniske rør volumene i cortex-, lillehjernen-, hjernestammen-og rygg Lednings fjæringen ved å legge til mer MV-2-løsning.
      2. Resuspend hypothalamus og hypofysen microvessel pellets i 5 mL MV-2 løsning med en 5 mL serologisk pipette (~ 10 flush). Tilsett 5 mL iskald MV-2 løsning på suspensjoner og bland forsiktig ved å bla røret.
  2. Sentrifuger ved 4 400 x g for 15 min ved 4 ° c.
  3. Løsne forsiktig den tykke og tette myelin lag på flytende grensesnittet fra hver tube vegger ved langsomt å rotere rørene og la supernatanten passere langs veggene.
  4. Kast den myelin og flytende grensesnitt og blot innsiden veggen av hvert rør med en slikkepott innpakket med en lav-lo papir tørk. For små virveldyr prøver, fjerne myelin lag fra hver hypothalamus og hypofysen rør ved utsuging nøye med en overføring pipette.
  5. Tørk ut overflødig væske med en tvunnet tørkepapir. Resuspend hver pellet med 1 mL MV-3-løsning ved hjelp av lav bindings tips. Hold rørene på isen.

6. Microvessel eluering og filtrering

  1. Hell iskald MV-3-løsning i individuelle kanner for hver CNS-region. Oppbevares ved 4 ° c.
    1. For små prøver av virveldyr, bruk 10 mL MV-3-oppløsning per 50 mL beger. Totalt 6 – 7 kanner er nødvendig avhengig av om den optiske fliken er inkludert eller ikke.
    2. For store virveldyr-eksemplarer, bruk 30 mL MV-3-oppløsning per 100 mL beger. Totalt 6 – 7 kanner er nødvendig avhengig av om hvit materie er inkludert eller ikke.
  2. Plasser en celle sil på toppen av en 50 mL konisk slange. Bruk én per CNS-region. Bruk en 100 μm sil for cortex, hjernestammen, optikk flik, ryggmargen, og hypofysen. Bruk 70 μm celle sil for lillehjernen og hypothalamus.
  3. Fukt hver sil med 1 mL iskald MV-3-løsning.
  4. Legg til mer MV-3 løsning på suspensjoner forberedt i trinn 5,5 med en serologisk pipette mens miksing for å unngå aggregater. Forsiktig laste microårene på toppen av sil. Skyll med iskald MV-3-løsning.
    1. For små prøver av virveldyr (tabell 2 og tabell 3), tilsett 10 – 15 ml mv-3-oppløsning med en serologisk pipette og SKYLL med 5 ml mv-3-løsning.
    2. For store prøver av virveldyr, tilsett 20 mL MV-3-løsning med en serologisk pipette og skyll med 10 mL MV-3-løsning.
  5. Monter filtrerings enheten ved å plassere et nylon nettfilter på 20 μm på en modifisert filter holder (figur 2D), ett per CNS-område.
    1. For små prøver fra virveldyr (tabell 2 og tabell 3), bruk 25 mm modifiserte filter holdere for cortex, lillehjernen, hjernestammen, optikk og ryggmargen. Bruk 13 mm modifiserte filter holdere for hypothalamus og hypofysen.
    2. For store virveldyr (Tabell 4 og tabell 5), bruk 47 mm modifiserte filter holdere for cortex, lillehjernen, hjernestammen og ryggmargen. Bruk 25 mm for hypothalamus og hypofysen.
  6. Plasser filter på toppen av en 50 mL konisk rør og våt filter med 5 mL iskald MV-3-løsning som gjør at bufferen skjenker ned filterholderen til det koniske røret.
  7. Overfør den eluert microårene (fra trinn 6,4) på toppen av nylon nett filteret 20 μm og skyll microårene med 5 – 10 mL iskald oppløsning på MV-3.
  8. Gjenopprette filteret ved hjelp av ren tang og dyppe den i begeret som inneholder iskald MV-3 løsning fremstilt i trinn 6,1.
  9. Løsne microårene fra filteret ved å riste det forsiktig i ca. 30 s. For små prøver i virveldyr, hell begeret innhold i et 15 mL konisk rør. For store virveldyr-eksemplarer, hell begeret innhold i et 50 mL konisk rør.
  10. Sentrifuger på 2 000 x g i 5 min ved 4 ° c og resuspend pellet i 1 ml iskald mv-3-løsning ved hjelp av en lav-bindende pipette spissen.
    1. For små prøver fra virveldyr, Overfør suspensjonen (fra trinn 6,10) til et 1,7 mL mikrosentrifugen rør og sentrifuge ved 20 000 x g i 5 min ved 4 ° c.
      Merk: denne spin er utført på en stasjonære sentrifuge ved maksimal hastighet (~ 20 000 x g) for å sikre en robust yield.
    2. For store virveldyr-prøver overfører du fjæringen fra trinn 6,10 til et 5,0 mL mikrosentrifugen rør, tilsett 4 mL MV-3-løsning, og sentrifuger ved 2 000 x g i 5 min ved 4 ° c.

7. Immunostaining

Merk: Hematoksylin og eosin (H & E) farging ble utført på reptil, amfibier, og fisk eksemplarer som en proof-of-konseptet av protokollen gjennomførbarhet. Derfor er det ingen anbefaling for immunolabeling for disse prøvene.

  1. Fjern supernatanten fra de mikrosentrifugen rørene.
  2. Resuspend pellet i 1x steril PBS ved hjelp av en lav-bindende pipette spissen (tabell av materialer). Hold microårene fra forming aggregater ved pipettering flere ganger. For små prøver av virveldyr (tabell 3), bruk ~ 100 μL – 2000 μL i henhold til pellet størrelsen. For store prøver av virveldyr (tabell 5), bruk ~ 1 000 μL – 4000 μL i henhold til pellet størrelsen.
  3. Ved hjelp av en lav-bindende pipette spissen, overføre microårene til godt lysbilder, være forsiktig med å legge dem til sentrum av hver brønn, unngå sideveggene.
  4. Sett brønnen lysbilder, avdekket, inne i en BSC-2, og la tørke i 20 til 30 min ved RT.
    Merk: et relativt høyt volum på 1x PBS brukes for å unngå aggregatdannelse. På grunn av dette, er det nødvendig å la lysbildene tørke før fiksering for å sikre at microårene blir holdt av Poly-D-lysin belegg.
  5. Fjern gjenværende 1x PBS ved å pipettering ut med en overførings pipette, tilsett 200 μL av 4% paraformaldehyde (PFA) og ruge i 30 min ved RT.
  6. Pipetter ut den bindemiddel løsningen og vask 3x med 200 μL av 1x PBS i 5 minutter ved RT.
    Merk: H & E flekker på fisk, amfibier, og reptil CNS microårene ble utført på dette punktet.
  7. Tilsett 200 μL av blokkerings buffer i brønn raset og ruge i 60 min. 37 ° c.
  8. Fjern blokkerings bufferen med en overførings pipette, og Legg til 200 μL av den primære antistoff-cocktail i antistoff fortynningsmiddel (tabell med materialer). Ruge ved 4 ° c over natten.
  9. Pipetter ut den primære antistoff cocktail og vask 3x med 200 μL av 1x PBS i 5 min ved RT.
  10. Legg den sekundære antistoff cocktail (tabell av materialer) fortynnet i 1x PBS og ruge for 2 h ved RT, beskyttet mot lys.
  11. Pipetter ut den sekundære antistoff cocktail og vask 3x med 200 μL av 1x PBS i 5 min ved RT, beskyttet mot lys. Etter siste vask løsne godt Slide ramme og blot-tørr overflødig 1x PBS med en lav lo papir tørk.
  12. Legg til en dekkglass, flytende Antifade mountant medium, og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for kjernefysisk farging. La tørke over natten på RT beskyttet mot lys.
  13. Når den er tørr, Hold deg beskyttet mot lys på en skyve boks ved 4 ° c til den er klar for konfokalmikroskopi mikroskopi og datainnhenting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Microårene isolert fra murine CNS viste alle indre cellulære komponenter av nevrovaskulære Unit2,3. Ved hjelp av enten blodplater endothelial celle vedheft molekyl-1 (PECAM, også kjent som CD31) eller isolectin IB4 (en glykoprotein som binder endothelial celle glycocalyx) for endothelial celler, blodplater avledet vekstfaktor-β (PDGFRβ) eller Nevron-gliacellene antigen 2 (NG2) for pericytes og aquaporin-4 (AQP4) for astrocytic end-fot (Figur 3a, B) viser at disse iboende komponentene er til stede i isolerte microårene. CNS-regioner synlig inkluderer kortikale microårene (Figur 3B), lillehjernen (Figur 3C), hypofysen (Figur 3D), hypothalamus (Figur 3E), hjernestammen (Figur 3F), og ryggmargen (Figur 3G). Alle viste uttrykk for disse kanoniske markører.

Likeledes viste microårene uttrykk for adherens veikryss protein VE-cadherin (Figur 4A, C), tight Junction proteiner claudin-5 og zonula OCCLUDENS-1 (CLDN5 og zo-1, Figur 4A, D), tricellular Junction protein Angulin-1 (Figur 4a, E) og apicobasal markører C-X-C MOTIV chemokine ligand 12 og gamma-glutamyltransferase 1 (CXCL12 og GGT1, Figur 4A, F). Disse funnene er relevante fordi disse proteinene er indikatorer for sentrale BBB-spesifikke egenskaper9,12,13,14. En begrenset tilstedeværelse av astrocytter, oligodendrocytes, og neurons uttrykker gliacellene fibrillary surt protein (GFAP, Figur 4B, C, G), OLIGODENDROCYTE bestemt protein (osp , figur 4b, G), og neurofilament-medium (NFM, Figur 4B, H), henholdsvis viser at isolerte microårene hadde ubetydelig spor av uønsket ikke-nevrovaskulære enhet celler. Videre var flertallet av microårene blottet for uttrykket av α-glatte muskel utgangen (αSMA, figur 5B, C). Dette er relevant fordi αSMA er en markør for glatte muskelceller forbundet med arterioler og venules (figur 5a), som indikerer at denne isolasjons protokollen selektivt mål liten kaliber microårene15.

Microårene innhentet fra andre små lissencephalic virveldyr dele noen morfologiske funksjoner, som vist i fisk (frosk og øgle ikke vist) og avian microårene. Dette tyder på at denne metoden er nyttig for ytterligere karakterisering av forskjeller i NVU mellom arter (figur 6). Videre viste avian CNS-microårene (figur 6H – N) crossreactivity med mange av Antistoffene som er utviklet for mennesker og mus. Dette oppmuntrer videre undersøkelse av avian eksemplarer for biologiske og biomedisinsk BBB studier. Vi observerte lignende resultater når vi isolerte microårene fra griser og aper, to gyrencephalic arter (figur 7). Bare NVU kanoniske markører i svin microårene vises. I tillegg til de nevnte CNS-regionene, var vi i stand til å isolere microårene fra periventrikulær hvit materie (figur 7B). Dette er relevant fordi hvit materie er innblandet i neuroinflammatory forhold (for eksempel multippel sklerose16,17,18).

Vi ønsket å finne ut om denne metoden kan brukes som et pålitelig verktøy for å bestemme endringer i protein uttrykk. Å vite at VCAM-1 og jam-B har vært innblandet i neuroinflammatory prosessen i ryggmargen under eae, bestemte vi oss for å quantitate uttrykket av disse proteinene på topp og kroniske stadier av eae og humbug-kontroll mus (10 uke gamle C57BL/6J mus)9,10,11. For å gjøre dette, målte vi den vilkårlige enhet av intensitet (AUI) langs microårene diameter. Deretter, ved hjelp av en terskel på ≤ 20 AUI for DAPI, beregnet vi området under kurven (AUC) for VE-cadherin, VCAM-1 og JAM-B for 50 microårene per CNS-område (Figur 8a, B). Til slutt utførte vi toveis ANOVA etterfulgt av Sidak ' s post-hoc test for å bestemme den statistiske betydningen av endringer i protein uttrykk.

Som forventet, observerte vi en økning i VCAM-1 og JAM-B langs ryggmargen microårene under toppen av EAE (Figur 8D, E). Vi observerte imidlertid endringer i andre CNS-områder som ikke tidligere er rapportert for EAE. VCAM-1 betydelig økt i hypofysen microårene og redusert i hypothalamus og hjernestammen microårene. Det var endringer under kronisk EAE i alle CNS vev (Figur 8D). JAM-B betydelig økt i hypothalamus og hypofysen microårene under kronisk EAE (Figur 8E). Interessant, observerte vi endringer i ve-cadherin langs microårene isolert fra hypothalamus og hjernestammen under toppen av eae, den lillehjernen under kroniske eae (Figur 8C), og en nedgang i hypofysen microvessel bredde under peak og kroniske eae. Samlet sett tyder disse dataene på at denne metoden for microvessel isolasjon er et nyttig verktøy for å karakterisere endringer i regionale protein uttrykk mønstre under helse og sykdom.

Figure 1
Figur 1: effektiv rygg mARGs disseksjon uten laminectomy. Disseksjon av ryggmargen fra små virveldyr eksemplarer (opp til 100 g) utføres raskere og mer effektivt ved å skylle ledningen i en caudal for å rostral retning gjennom hele vertebrale foramen. Bruke dissekere saks hodet er fjernet av Atlas joint og ryggraden er skåret ut av hoften (A). Alle resterende organer er fjernet, slik at bare ryggraden (B). Ryggmargen i korsryggen vertebrale foramen vises som en liten hvit sirkel (< 1 mm diameter) i forhold til bredden av livmorhalsen (B, gule piler). Å holde en smal åpning ved korsryggen vertebrale foramen forenkler en trykkstigning fra korsryggen til cervical ryggraden når spyling med en 18 G nål og 10 CC sprøyte lastet med 1x PBS (C og D). En gang spyles, det rotere ledningen (D, gul pilen) er nært helt devoided av det dural SAC, og bare Pia nødvendig å bli fjernet under det dissekere omfang. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Plukk dissekere verktøy og modifisert filter holder med to kanter. Dette 11 cm lange dissekere verktøyet (A) har to svært skarpe, nesten horisontalt motsatte punkter, 2 mm tip-to-TIP (B). Ved å bruke milde nedadgående trykk og vri litt i en klokke mote (C), punktene legge seg horisontalt inn i hjernehinnene slik at de kan løftes oppover. Dette er spesielt nyttig når du fjerner hjernehinnene fra lillehjernen, fordi det gir tilgang til dybden av cerebelli Folia. Det er en likeledes meget nyttig når fjerner det hjernehinnene fra kortikale tissue, særlig gyrencephalic. I dette tilfellet er Pia svært integrert med høy kaliber blodkar som vil kompromittere renheten av microsevessel isolasjon. På samme måte letter det fjerning av akkord plexus, som er den mest sannsynlige kilden til forurensning. Filter holdere på 47 mm, 25 mm, og 13 mm diameter var laserskåret for å fjerne innløps kontakten (D) fra topp rommet (E), men behold sil-komponenten (G). Denne endringen er tillatt for montering av en Filterenhet (i,J) ved å plassere den 20 μm nylon filter nettet over sil og nederste del (G,H), sikring av nettet på plass når skruen den øverste delen (E). Det er kun 25 mm filterholderen som vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: microårene isolert fra flere CNS-områder uttrykt Kanonisk nevrovaskulære enhet markører. (A) ved hjelp immunolabeling og konfokalmikroskopi mikroskopi, innebygde cellulære komponenter av NVU brukes til å identifisere voksne (8-14 uke gamle C57BL/6J) murine CNS microårene. Som sett på Merge bildet for kortikale microårene (B), over den enkelte konfokalmikroskopi bilder for endothelial celle markør CD31 (hvit), Pericyte markør PDGFRβ (rød), og astrocytic end-fot markør AQP4 (grønn) alle disse cellulære komponenter er beholdt. Legg merke til at det intime forholdet mellom endothelial celler og pericytes gjør at de vises magenta på det sammenslåtte bildet, mens de astrocytic ende føttene ser ut til å ha en Halo som omgir dem (B). Det samme uttrykket mønsteret er observert for lillehjernen (C), hypofysen (D), hypothalamus (E), hjernestammen (F), og ryggmargen (G, DAPI, Nuclear flekken = blå; skala bar = 10 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: microårene uttrykte proteiner assosiert med BBB-spesifikke egenskaper. Endothelial celler i nevrovaskulære enhet (NVU) er også beskrevet av proteiner knyttet til deres egen verdi barriereegenskaper (A). Som sett i figuren, har endothelial celler kryss laget av VE-cadherin, CLDN5, ZO-1 (a, gul), og angulin-1 (a, lyseblå). De har også utstillingen apicobasal polaritet til flere proteiner inkludert GGT-1 og CXCL12 (A, grønn og rød). Nevroner, oligodendrocytes og astrocytt legemer kan inkluderes i de isolerte microårene, selv om de ikke er iboende i NVU (B). Disse er identifiserbare av uttrykk for NFM (rød), OSP (cyan), og GFAP (kalk grønn), henholdsvis (B). I samsvar med disse, våre isolerte microårene uttrykt adherens protein VE-cadherin (C, Red), stramt veikryss proteiner CLDN5 og zo-1 (D, rød og grønn, henholdsvis flette = gul), tricellular Junction protein LSR (E, grønn), og Apicobasal markører CXCL12 og GGT1 (F, rød og grønn, henholdsvis). De har også utstilt begrensede mengder GFAP (A, Green, G, White), osp (G, Green), og NFM (H, rød), antyder ubetydelig oppbevaring av ikke-nevrovaskulære enhet celler (DAPI, kjernefysisk beis = blå; skala bar = 10 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: de fleste isolerte microårene uttrykker ikke αSMA. Den nevrovaskulære enheten viser en sofistikert overgang fra arteriole-kapillær-venule (a). αSMA anular uttrykk tydelig identifiserer arteriole, og som det blir kapillær, αSMA (B, Red) uttrykk avtar, utsette veggmaleri markør NG2 (b, Green). Vi målte diameteren på αSMA + og αSMA-fartøy (hvite braketter, n = 20), for å skille dem som arterioler eller blodkar (DAPI, kjernefysisk beis = blå, skala bar = 10 μm). Sammenkoblet t-test analyse av diameter på αSMA + og αSMA-fartøy viste en høy statistisk betydning (C, αSMA + = rød, αSMA-rød/grønn, * * * * p < 0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: vellykket isolering av CNS microårene fra andre lissencephalic arter. Det CNS var innhøsting fra en vill-fanget Frog (8,2 cm), lizard (12,7 cm), tank-opphøyet regnbueørret (2 år gamle, 35,6 cm), og luftfarten-opphøyet duen (9 måneden-gamle, ~ 300 g). Microårene fra frosken, fisken og lizard ble farget av H & E (bare microårene fra ørret vises, skala bar = 20 μm). Pigeon microårene var immunolabeled. Vi var i stand til å identifisere microårene på alle regioner som er merket på fisk og Pigeon CNS skisserer: cortex (A og H), optikk flik (B og I), lillehjernen (C og J), hypofysen (D og L), hypothalamus (E og K), hjernestammen (F og M), og ryggmargen (G og N). I tillegg var vi i stand til å identifisere endothelial celler med isolectin IB4 (hvit), astrocytic ende-føtter med AQP4 (grønn), og tilstøtende neurons med NFM (rød) fra duen isolerte microårene (DAPI, kjernefysisk beis = blå, skala bar = 10 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: isolering av CNS microårene fra gyrencephalic arter. Hjernen og ryggmargen ble dissekert fra en gård-hevet gris (~ 6 mnd-gammel, ~ 120 kg) for microvessel isolasjon og immunolabeling. Vi var i stand til å identifisere microårene positivt merket for IB4 (hvit), PDGFRβ (rød), og AQP4 (grønn) på alle regioner av svin CNS: cortex (A), periventrikulær hvit materie (B), lillehjernen (C), hypofysen (D), hypothalamus (E), hjernestammen (F), og ryggmargen (G, DAPI, Nuclear flekken = blå, skala bar = 10 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: eksempel på annen anvendelse av CNS microvessel isolasjon. Uttrykk for JAB-B og VCAM-1 ble kvantifisert for murine EAE microårene. Vilkårlig enheter av intensitet (AUI) ble målt for cortex, lillehjernen, hypothalamus, hypofysen, hjernestammen, og ryggmargen av mus på topp og kroniske stadier av EAE, med humbug som kontroll (n = 4). For hvert CNS-område ble tolv microårene evaluert per mus for å bestemme AUI per fluorokromkonjugert og diameteren til microvessel (A). Hvite braketter viser eksempler på konfokalmikroskopi mikroskop programvare måleverktøy som brukes til å bestemme AUI for VCAM-1 (hvit), VE-cadherin (grønn), JAM-B (rød), og DAPI (blå, skala bar = 10 μm). Deretter ble de resulterende AUI plottet mot diameteren i mikron (B) for å beregne området under KURVEN (AUC) for hvert immunolabeled protein som et estimat av protein uttrykk. Gjennomsnittlig AUC per gruppe ble deretter analysert av toveis ANOVA, fulgt av Sidak ' post hoc-test, for totalt 48 microårene per CNS-region. Bortsett fra hypofysen microårene, observerte vi ingen store forskjeller mellom microvessel diameter forbundet med sykdom status (c, INSERT), men en betydelig reduksjon av ve-cadherin uttrykk fra hypothalamus og HJERNESTAMMEN i eae mus (c). Tilsvarende statistisk analyse viste en betydelig økning for VCAM-1 (D) og jam-B (E) i ryggmargen, i samsvar med neuroinflammatory status i toppen av eae. Interessant, vi har også observert endringer for VCAM-1 på hypothalamus, hypofysen, og hjernestammen. Disse resultatene er under etterforskning (svarte striper og prikker = humbug, røde stolper og prikker = peak EAE, laks barer og prikker = kronisk EAE, * p < 0,05, @p < 0.01, #p < 0.001, og & p < 0.0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

MV-1 10 mM HEPES
i 1x Hank ' s balansert saltløsning (HBSS) med kalsium og magnesium
MV-2 18% 70 kDa molekylvekt (MW) dextran
i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
MV-2 20% 70 kDa MW dextran
i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
MV-3 1% storfe serum albumin (BSA)
i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
Bindemiddel 4% paraformaldehyde (PFA)
i 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) pH 7,4
Vask buffer 1x PBS pH 7,4
Permeabilization & blokkerende buffer 10% BSA
0,25% ioniske overflateaktivt middel
i 1x PBS pH 7,4
Antistoff fortynningsmiddel 5% BSA
0,25% ioniske overflateaktivt middel
i 1x PBS pH 7,4

Tabell 1: løsninger som brukes i protokollen.

Trinn (er) Handling
4,1 og 4.1.1 Hakke i MV-1 løsning med en enkelt-kant blad
4,2 til 4.2.2 Homogenisere i MV-1-løsning ved hjelp av en Potter-ELVJ PTFE eller microtube morter
5,1 Spin på 2 000 x g, 4 ° c, 10 min
5.1.1 til 5.1.1.2 Resuspend pellet i MV-2 løsning
5,2 Spin på 4 400 x g, 4 ° c, 15 min
5,3 til 5,5 Resuspend pellet med 1 mL MV-3 løsning
6,2 kan ikke 6.4.1 Eluere over et 50 mL konisk rør gjennom en celle sil og skyll med MV-3-løsning
6,5, 6.5.1, 6,6 og 6,7 Filter med en 20 μm nylon nett på den modifiserte filterholderen
6,8 Legg nylon nett i 50 mL beger med 10 mL MV-3 oppløsning og rist for 30 s
6,9 til 6,10 Dekanter inn i en 15 mL konisk rør og Spin på 2 000 x g, 4 ° c, 5 min
6,10 Resuspend i 1 mL MV-3-løsning
6.10.1 Overføring til 1,7 mL microtube og snurr ved 20 000 x g, 4 ° c, 5 min
7,1 til 7,3 Resuspend i 1x PBS og lastes inn i godt lysbilder

Tabell 2: oppsett for små virveldyr microårene isolering. Dette diagrammet er en forkortet versjon av protokollen når du bruker en lissencephalic prøve.

Trinn (er) Løsning Handling CTX Cbl Velge Bst Sc Hyp Pit
4,1 MV-1 Hakke på parabolen 100 mm x 20 mm Petri rett, 1 mL N/a
4.2.1 og 4.2.2 MV-1 Homogenisere 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem med morter 1 mL, micropestle
5.1.1.1 og 5.1.1.2 MV-2 Resuspend 5 mL + 5 mL, 18% Dextran 1 mL, 20% dextran
5,5 og 6.4.1 MV-3 Resuspend 1 mL + 10-15 mL 1 mL av
6,2 og 6.4.1 MV-3 Sil størrelse 100 μm 70 μm 100 μm 70 μm 100 μm
Skyll 5 mL
6,5, 6.5.1 og 6,7 MV-3 Filter størrelse, skyll 25 mm filter, 10 mL 13 mm, 5 mL
6,8 MV-3 Rist på beger 10 mL
6,10 MV-3 Resuspend 1 mL av
7,2 1x PBS Resuspend 1,5 til 2,0 mL 0,5 til 1,0 mL 0,1 til 0,2 mL
7,3 1x PBS Belastning per brønn 200 μL 100 μL 25 til 50 μL
CTX = cortex, CBL = lillehjernen, BST = hjernestammen, OPT = optikk flik (ikke til stede i pattedyr), HYP = hypothalamus, PIT = hypofysen, SC = ryggmargen. Anbefalte volumer er for hele vev fra dyr som varierer i størrelse fra 20 g (unge mus) til 800 g (voksen rotte).

Tabell 3: anbefalt volum/størrelse. Denne disposisjonen har det anbefalte volumet av løsninger for å bruke en liten virveldyr prøve fra ~ 20-~ 800 g, eller mer spesifikt, ~ 25 g musen vises på videoen. Endelig justering av de nødvendige volumene må fastsettes av forskeren i henhold til den spesifikke mengden av vått vev innhentet etter disseksjon. Praksis og feilsøking anbefales på det sterkeste. CTX = cortex, CBL = lillehjernen, BST = hjernestammen, OPT = optikk flik (ikke til stede i pattedyr), HYP = hypothalamus, PIT = hypofysen, SC = ryggmargen.

Trinn (er) Handling
4,1 og 4.1.2 Hakke i MV-1 med en enkelt-kant blad
4,3 kan ikke 4.3.4 Homogenisere i MV-1-løsning ved hjelp av en Potter-Elvehjem jeksel med en PTFE-morter
5,1 Spin på 2 000 x g, 4 ° c, 10 min
5.1.2 til 5.1.2.2 Resuspend pellet i MV-2 løsning
5,2 Spin på 4 400 x g, 4 ° c, 15 min
5,3 til 5,5 Resuspend pellet med 1 mL MV-3 løsning
6,2 til 6,4 og 6.4.2 Eluere over et 50 mL konisk rør gjennom en celle sil og skyll med MV-3-løsning
6,5, 6.5.2, 6,6 og 6,7 Filter med en 20 μm nylon nett på den modifiserte filterholderen
6,8 Legg nylon-nettet i et 50 mL beger med 30 mL MV-3-oppløsning, og rist for 30 s
6,9 og 6,10 Dekanter inn i en 50 mL konisk slange og snurr ved 2 000 x g, 4 ° c, 5 min
6,10 Resuspend i 1 mL MV-3-løsning
6.10.2 Overføring til 5 mL microtube og Spin ved 2 000 x g, 4 ° c, 5 min
7,1 til 7,3 Resuspend i 1x PBS og lastes inn i godt lysbilder

Tabell 4: oppsett for store virveldyr microårene isolasjon. Dette diagrammet er en forkortet versjon av protokollen når du bruker en gyrencephalic prøve.

Trinn (er) Løsning Handling CTX Cbl Wm Bst Sc Hyp Pit
4,1 MV-1 Hakke på parabolen 3 − 5 mL 1 mL av
4,3 kan ikke 4.3.4 MV-1 Homogenisere 20 − 30 mL, 55 mL Potter-Elvehjem med morter & overliggende rører 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem med morter
5.1.2 til 5.1.2.2 MV-2 Resuspend > 20 mL, 20% dextran 5 mL + 5 mL, 20% dextran
5,5, 6,4 og 6.4.2 MV-3 Resuspend 1 mL + 20 mL 1 mL + 10 mL
6,2 og 6.4.2 MV-3 Sil størrelse 100 μm 70 μm 100 μm 70 μm 100 μm
Skyll 10 mL
6,5, 6.5.2 og 6,7 MV-3 Filter størrelse, skyll 47 mm filter, 10 mL 25 mm, 10 mL
6,8 MV-3 Rist på beger 30 mL
6,10 og 6.10.2 MV-3 Resuspend 1 mL + 4 mL
7,2 1x PBS Resuspend 2,0 til 4,0 mL 1,0 til 2,0 mL
7,3 1x PBS Belastning per brønn 200 μL 100 μL
CTX = cortex, CBL = lillehjernen, WM = hvit materie, BST = hjernestammen, HYP = hypothalamus, PIT = hypofysen, SC = ryggmarg. Anbefalte volumer er for prøver på ~ 45 cm3 for ctx, CBL, BST og SC hele Hyp og pit.

Tabell 5: anbefalt volum/størrelse. Denne oversikten har det anbefalte volumet av løsninger for bruk av en stor virveldyr. Mer spesifikt, det gjelder for CNS vev biopsier av ~ 45 cm3 for cortex, lillehjernen, hvit materie, hjernestammen, ryggmargen, og hele hypothalamus og hypofysen, som vist på videoen. Endelig justering av de nødvendige volumene må fastsettes av forskeren i henhold til den spesifikke mengden av vått vev innhentet etter disseksjon. Praksis og feilsøking anbefales på det sterkeste. CTX = cortex, CBL = lillehjernen, WM = hvit materie, BST = hjernestammen, HYP = hypothalamus, PIT = hypofysen, SC = ryggmarg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den BBB inkluderer de unike egenskapene til hjernen microvasculature endothelial celler kombinert med en sofistikert arkitektur av stramme-, adherens-, "Peg-socket"-knutepunkter, og vedheft plaketter avgjørende for CNS homeostase2,3,19. Endothelial celler egenskaper er indusert og vedlikeholdt av pericytes og de omkringliggende astroglia ende-fots prosesser2,3,19. BBB microvasculature viser polaritet (dvs. asymmetrisk uttrykk mønster av proteiner lokalisert på luminal eller abluminal endothelial celle overflater)20. Selv om dette kan kort definere BBB, i virkeligheten er det fortsatt en av de mest gåtefulle forestillinger i nevrovitenskap. For eksempel, regionale, kjønn, og alder forskjeller innenfor NVU kan forklare CNS regionale sikkerhetsproblemer til traumer, toksisitet, infeksjon, og betennelse, som kan ha store kliniske konsekvenser3,5,6. En annen hindring i forståelsen av BBB er forskjellene observert blant flere arter7,8. En av de store hekk av forståelse og gransker BBB er nettopp problemer knyttet til isolering av NVU som omfatter BBB, mens de fortsatt holder sine barriere-spesifikke egenskaper14.

I et forsøk på å akselerere vår forståelse av BBB, CNS-regionale forskjeller, så vel som arter forskjeller, tilpasset vi tidligere publiserte metoder. Vi lyktes tilpasset disse, spesielt Boulay et al.21, å få microårene fra enkelt kortikale, lillehjernen, hypothalamus, hypofysen, hjernestammen og spinal vev på en myriade av lissencephalic små virveldyr: fisk, amfibier, reptiler, fugler og pattedyr (Figur 3, Figur 4, figur 5, og figur 6). En fordel med denne metoden er at dens tilpasninger er basert på den totale størrelsen på CNS vev: forskeren velger mengden av løsningen, størrelsen på vev jeksel, koniske rør, filter holdere, etc. i henhold til vått vev, uavhengig av art, kjønn, og alder. I vår erfaring med immunolabeling, en ~ 20 g prøven gir nok microårene for en 8 godt lysbilde per cortex, lillehjernen, optikk flik, hjernestammen, og ryggmargen og en halv 8 godt lysbilde per hypothalamus og hypofysen. Imidlertid er utbytte av kortikale og optikk flik mye høyere i forhold til lillehjernen, hjernestammen, og ryggmargen.

Som vist, utførte vi de nødvendige tilpasninger for isolasjon og immunolabeling av CNS microårene av gris og macaque, større gyrencephalic pattedyr som er mer relevante for translational forskning (figur 7). Spesielt var vi i stand til å inkludere periventrikulær hvit materie på disse artene bare. Siden CNS i disse dyrene er større, samlet vi nok hvit materie å tillate oss å skille en microvessel pellet fra myelin laget under den andre sentrifugering (trinn 5,3, MV-2 med 20% dextran). Vi spekulerer i at en kritisk masse er nødvendig for å kunne oppnå denne separasjon og vi aktivt søker hvordan å få et lignende resultat med murine CNS vev.

Selv utelatt på grunn av enkelhet, gjorde vi utføre immunolabeling utover NVU kanoniske markører på avian, svin, og macaque microårene. Spesielt, alle arter delte cellulære og molekylære markører tidligere identifisert på murine prøver som er relevante for BBB funksjon (junctional proteiner VE-cadherin, CLDN5, ZO-1, og LSR og apicobasal markører CXCL12 og GGT1) eller i nærheten til NVU (NFM, OSP, og GFAP). Igjen, disse funnene oppfordrer bruken av denne metoden på andre arter å ytterligere identifisere NVU orthology og forskjeller blant arter. Det åpner også muligheten for videre etterforskning av NVU belastning, kjønn, og alder forskjeller innenfor samme art og muligheten for å bruke andre organismer for BBB biomedisinsk forskning. Vi viser også bevis for en vellykket bruk av denne microvessel-metoden for å quantitate endringer i protein uttrykks nivåer under nevroinflammasjon (Figur 8). Selv om vi utførte dette eksperimentet som en proof-of-konsept, tilnærmingen brukes her er i dag mye utnyttet i laboratoriet vårt. Vi favoriserer denne tilnærmingen over andre kvantitative metoder (f. eks Western Blot) fordi vi ønsker å fokusere ikke bare på uttrykks nivå, men relative protein overflod, flytting av CXCL12 og andre apicobasal proteiner, kobling av junctional proteiner, etc., innenfor det kompliserte utseendet på CNS microårene9,13,22. På samme måte er vi i dag feilsøking vår metode for andre programmer, for eksempel videre isolering av NVU cellulære komponenter (endothelial celler og pericytes), RNA-SEQ, og Proteomikk23,24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dr. Cruz-Orengo ble støttet av University of California, Davis, School of Veterinary Medicine oppstart Funds.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. 53208 (2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics