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Comparación de metastática célula sin fin renal Modelo establecido en el riñón del ratón y en la membrana chorioalantoica del pollo

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Cancer Research

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Summary

El carcinoma metastásico de células renales de células claras es una enfermedad sin un modelo animal completo para una investigación preclínica exhaustiva. Este protocolo ilustra dos nuevos modelos animales para la enfermedad: el modelo de ratón implantado ortopédicamente y el modelo de membrana corioalantoica de pollo, que demuestran metástasis pulmonar similar a los casos clínicos.

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Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X., Choi, Y., Wong, A., Cano-Ruiz, C., Zhao, R., Tan, P., Tso, J. L., Wu, L. Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (156), e60314, doi:10.3791/60314 (2020).

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Abstract

El carcinoma metastásico de células renales de células claras (CCRCC) es el subtipo más común de cáncer de riñón. El ccRCC localizado tiene un resultado quirúrgico favorable. Sin embargo, un tercio de los pacientes con CCCC desarrollarán metástasis en el pulmón, lo que está relacionado con un resultado muy pobre para los pacientes. Desafortunadamente, no hay terapia disponible para esta etapa mortal, porque el mecanismo molecular de la metástasis sigue siendo desconocido. Se sabe desde hace 25 años que la pérdida de la función del gen supresor tumoral von Hippel-Lindau (VHL) es patognomónica de ccRCC. Sin embargo, no se ha generado ningún modelo de ratón transgénico clínicamente relevante de ccRCC. El propósito de este protocolo es introducir y comparar dos modelos animales de nueva creación para ccRCC metastásico. La primera es la implantación renal en el modelo de ratón. En nuestro laboratorio, el sistema de edición de genes CRISPR se utilizó para eliminar el gen VHL en varias líneas celulares RCC. La implantación ortotópica de poblaciones heterogéneas de CCCC en la cápsula renal creó nuevos modelos de CCCc que desarrollan metástasis pulmonares robustas en ratones inmunocompetentes. El segundo modelo es el sistema de membrana corioalantoica de pollo (CAM). En comparación con el modelo de ratón, este modelo es más tiempo, mano de obra y rentable. Este modelo también soportaba la formación robusta de tumores y la intravasación. Debido al corto período de 10 días de crecimiento tumoral en CAM, no se observó metástasis abierta por inmunohistoquímica (IHC) en los tejidos embrionarios recogidos. Sin embargo, cuando el crecimiento del tumor se extendió por dos semanas en el pollo eclosionado, el IHC observó lesiones de CCRCC micrometastásicas en los pulmones. Estos dos nuevos modelos preclínicos serán útiles para seguir estudiando el mecanismo molecular detrás de la metástasis, así como para establecer nuevos xenoinjertos derivados del paciente (PDX) para el desarrollo de nuevos tratamientos para el CCRCC metastásico.

Introduction

El carcinoma de células renales es el7o cáncer más común en los Estados Unidos. Anualmente, se estima que 74.000 estadounidenses son diagnosticados recientemente, representando más de 14,000 muertes (subtipo histológico de células claras, o CCCC, es el subtipo más común, representando aproximadamente el 80% de los casos de CCR. Los pacientes con neoplasia maligna localizada son tratados con nefrectomía y tienen una tasa de supervivencia favorable de 5 años del 73%1. Sin embargo, el 25%-30% de los pacientes desarrollan metástasis distantes en órganos vitales como los pulmones, lo que resulta en una pobre supervivencia media de 13 meses y una tasa de supervivencia a 5 años de sólo 11%1,2,3. Se necesita una mayor comprensión del mecanismo metastásico para mejorar el resultado mortal de la CCRCC metastásica.

La pérdida del gen supresor de tumores VHL es una lesión genética distintiva observada en la mayoría de los casos de CCRCChumanos 4,5,6,7. Sin embargo, se desconoce el mecanismo oncogénico preciso de la pérdida de VHL en ccRCC. Además, el estado de la expresión VHL no es predictivo del resultado en ccRCC8. En particular, a pesar de los numerosos intentos de eliminación de VHL dirigido a la isla- epitelial, los científicos no han podido generar anormalidad renal más allá de las lesiones quísticas preneoplásicas observadas en ratones9,incluso cuando se combinan con la deleción de otros supresores tumorales como PTEN y p5310. Estos hallazgos apoyan la idea de que la pérdida de VHL por sí sola es insuficiente para la tumorigenesis o la metástasis espontánea subsiguiente.

Recientemente, nuestro laboratorio creó una nueva línea celular de nocaut VHL (VHL-KO) utilizando la deleción mediada por CRISPR/Cas9 del gen VHL en la línea celular murine VHL+ ccRCC (RENCA, o VHL-WT)11,12. Hemos demostrado que VHL-KO no sólo es mesenquimal, sino que también promueve la transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las células VHL-WT12. Se sabe que la EMT desempeña un papel importante en el proceso metastásico13. Nuestro trabajo demostró además que la metástasis pulmonar distante ocurre sólo con la coimplantación de células VHL-KO y VHL-WT en el riñón, apoyando un mecanismo cooperativo de metástasis. Es importante destacar que nuestro modelo VHL-KO y VHL-WT implantado ortopédicamente conduce a metástasis pulmonares robustas, recapitulando los casos clínicos de ccRCC. Este modelo de ccRCC metastásico espontáneo compensa la falta de un modelo de ratón metastásico transgénico, especialmente en el desarrollo de nuevos fármacos anti-metástasis. Este protocolo demuestra la implantación de cápsulas renales de las poblaciones de células heterogéneas de células RENCA de ingeniería genética.

Los modelos CAM de pollo tienen una larga historia en investigación para la angiogénesis y la biología tumoral debido a sus numerosas ventajas, como se resume en la Tabla 114 14,15,16,17,18. Brevemente, la ventana de tiempo para el crecimiento del tumor CAM es corta, permitiendo un máximo de 11 días hasta que el CAM se destruye al eclosionar el pollo16. A pesar del corto tiempo de crecimiento, el rico suministro de nutrición y el estado inmunodeficiente del embrión de pollo permiten un injerto tumoral muy eficiente16,19,20,21. Por último, el costo de cada óvulo fertilizado es de 1,1, en comparación con más de 100 dólares para un ratón SCID. Juntos, el modelo CAM puede servir como un valioso modelo animal alternativo en el establecimiento de nuevos PDX a un gran ahorro en tiempo y costo en comparación con el ratón. En este protocolo, evaluamos si el modelo fue capaz de recapitular la biología de ccRCC metastásico observado en el modelo ortotópico de ratón.

(SCID) Ratón Cam Nota
Costo >$100 cada uno $1 cada uno Viabilidad que van desde 50-75%
Necesidad de vivienda en barrera No Reduce aún más los costos y simplifica la monitorización en serie de los tumores
Tumor directamente visible No Figura 3A
Tiempo hasta el primer injerto (RENCA) 2 semanas 2-4 días ref 14, 15
Punto final de crecimiento (RENCA) 3-6 semanas 10 días ref 14, 15
Metastasis (RENCA) observada Sí en las chicas Figura 3D
Pasajes en serie referencia 16-18
Paso a ratones (RENCA) Hu, J., et al. under review (2019)
Mantener la heterogeneidad tumoral Hu, J., et al. under review (2019)

Tabla 1: Ventajas y limitaciones de los modelos de ratón y CAM. Esta tabla compara los dos modelos por sus ventajas y limitaciones en términos de tiempo requerido, costo, mano de obra, así como la biología. El modelo CAM tiene ventajas en eficiencia, pero también tiene sus propias limitaciones únicas debido a la diferente morfología entre aves y mamíferos. Por lo tanto, es importante confirmar que el modelo puede retener la biología de los xenoinjertos.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), designado como Comité de Investigación Animal del Canciller de UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 y ARC 2017-102-01A). El protocolo 2002-049-53 está optimizado para la implantación de células tumorales ccRCC en la cápsula renal de ratones desnudos o BALB/c. Los experimentos de implantación de tumores en huevos de pollo fertilizados antes de la eclosión no requieren la aprobación de la IACUC. Para ampliar el tiempo para el establecimiento de metástasis pulmonar, se permite que los embriones con tumor CAM eclosionen y crezcan en pollos. El protocolo 2017-102-01A cubre estos experimentos con animales.

1. Estudios de tumores ortotópicos en ratones

NOTA: La línea de tiempo de este experimento se muestra en la Figura 1A. Estos procedimientos fueron adaptados de las publicaciones anteriores11,12.

  1. Preparación de la suspensión de una sola célula para el injerto
    1. Separe las células RENCA VHL-WT y VHL-KO de los platos de cultivo utilizando tripina/EDTA.
    2. Cuente las células con un hemocitómetro y resuspenda en una mezcla preenfriada de 1:1 de PBS y solución de matriz extracelular a una concentración de 1 x 105 células/ L.
      NOTA: Utilice una relación 1:4 de células VHL-WT:VHL-KO para implantes heterogéneos y VHL-WT solo para implantes homogéneos.
    3. Transfiera las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y manténgalas en hielo hasta su implantación.
  2. Implantación a cápsula renal
    1. Anestesia: Precalienta una almohadilla caliente a 37oC y cúbrela con un trozo de gruesa cortina estéril. Anestetizar el ratón mediante inhalación de isoflurano a través de una cámara de inducción o inyección intraperitoneal (IP) de 1% de pentobarbital sódico a la dosis de 10 ml/kg.
    2. Afeitar el cabello desde el sitio quirúrgico. Este paso se puede omitir para ratones desnudos.
    3. Desinfección y drapeado quirúrgico: Desinfecte la parte posterior del ratón por completo con povidona-yodo 3x seguido de 70% etanol 1x y séquelo con hisopos de algodón estériles. A continuación, aplicar tres vendajes médicos estériles secuencialmente, cubriendo toda la espalda con el fin de crear un campo quirúrgico, así como para inmovilizar el ratón.
    4. Incisión y exteriorización renal: Antes de la operación, desinfecte los dedos del operador con povidona-yodo o utilice un par de guantes estériles. Coloque el ratón en la posición propensa y utilice los dedos para ubicar el riñón izquierdo justo debajo del flanco izquierdo. Utilice un par de fórceps y tijeras contundentes para cortar la piel abierta y la capa muscular bajo la ubicación especificada. Use hisopos de algodón estériles y fórceps para exteriorizar parcialmente el riñón izquierdo fuera del abdomen.
    5. Implantación de células tumorales: Cargue la suspensión celular preparada en el paso 1.1 en jeringas de insulina o jeringas Hamilton personalizadas (consulte la Tabla de materiales para obtener especificaciones). Inyectar 20 ml de células resuspendidas debajo de la cápsula renal.
      NOTA: La inyección exitosa se determina mediante la formación de una protuberancia translúcida en la superficie del riñón. La inyección accidental en el parénquima renal produce sangrado y una tasa de mortalidad postoperatoria de hasta el 90% debido a una hemorragia mortal en el lugar de la inyección.
    6. Tire lentamente de la aguja para permitir que la solución de matriz extracelular se solidifique y prevenga la hemorragia o fuga de células tumorales. Luego, con un hisopo de algodón estéril, empuja el riñón hacia el abdomen.
    7. Costura de herida: Utilice una sutura 5-0 recubierta de VICTRYL para coser la capa muscular. Desinfectar la piel con povidona-yodo una vez y cerrar la piel con autoclips de heridas.
    8. Recuperación: Coloque el ratón sobre la almohadilla caliente hasta que se despierte. Si el ratón fue anestesiado por inhalación, retire el isoflurano y mantenga el ratón en la almohadilla caliente hasta que esté despierto.
  3. Imagen de bioluminiscencia (BLI) y recolección de tejidos
    1. Seis semanas después de la implantación del tumor, tome imágenes BLI basadas en luciérnagas-luciferasa. A continuación, eutanasia ratones con inhalación de isoflurano seguida de luxación cervical.
    2. Recoger sangre para la detección de células tumorales circulantes (CTC) por citometría de flujo.
    3. Cosechar tumores y órganos de interés (riñón, pulmones, hígado, intestinos y bazo) utilizando una técnica de recolección de tejido estéril22. Arréglalos en un 4% paraformaldehído durante la noche para la incrustación de parafina y cera.

2. Modelo de xenoinjerto tumoral CAM

NOTA: Estos procedimientos fueron adaptados y modificados a partir de protocolos publicados anteriormente23,24. La línea de tiempo para este procedimiento se muestra en la Figura 1B. En este artículo solo se presenta el protocolo simplificado. Para protocolos detallados, por favor refiérase a otro artículo de JoVE publicado por nuestro grupo25.

  1. Preincubación: Incubar huevos de pollo recién puestos y fertilizados en una incubadora de huevos giratoria a 37oC y 55-65% de humedad durante 7 días.
  2. Suelte el CAM y abra la ventana (día de desarrollo 7):
    1. Localice y marque el saco de aire y las venas.
      NOTA: Por lo general, entre el 10 y el 15% de los óvulos se retiran porque no están fertilizados o mueren dentro de los 7 días posteriores a la fertilización.
    2. Crea un nuevo saco de aire en cima de una vena marcada.
    3. Delinee el nuevo saco de aire, aplique cinta adhesiva y vuelva a colocar los huevos en la incubadora.
      NOTA: El procedimiento se puede pausar aquí. Se recomienda reanudar los procedimientos dentro del mismo día porque el saco de aire puede moverse.
    4. Abrir una ventana: Con un par de tijeras microdiscontrantantes curvadas y un par de fórceps de punta de aguja, corte una ventana circular de 1,5 x 1,5 cm en el caparazón.
      NOTA: La interrupción de CAM está indicada por la sangre y un pedazo de CAM presente en la pieza de la cáscara cortada.
    5. Selle el orificio con apósito médico transparente y coloque los huevos en una incubadora estacionaria a 37 oC y 55%-65% de humedad.
      NOTA: Utilice la misma incubadora de huevos que en el paso 2.1. Apague el rotador para que quede inmóvil.
  3. Comprobación de la salud (día 9 del desarrollo): Retire los óvulos muertos y luego agrupe aleatoriamente el resto de los óvulos para la implantación de células tumorales.
    NOTA: Idealmente, la tasa de supervivencia en este punto es aproximadamente el 80% del día de desarrollo 0.
  4. Injertar las células tumorales en el CAM recién expuesto (día 10 del desarrollo)
    1. Diluir la solución de matriz extracelular en el doble del volumen de RPMI preenfriado 1640 (con L-glutamina). Separe las células RENCA y resuspenda en la solución anterior para alcanzar una concentración de 2 x 104 células/L.
      NOTA: Utilice una proporción 1:1 de células VHL-WT:VHL-KO para implantes heterogéneos y VHL-WT solo para una implantación homogénea.
    2. Para presolidificar la suspensión celular, llene 100 ml de cada mezcla de células en puntas de pipeta de 200 ml y colóquelas en una incubadora de células durante 15 minutos.
    3. Implante de 100 ml de suspensión celular para cada huevo en la superficie CAM a través de la ventana.
      NOTA: Algunos protocolos requieren rayar el CAM antes de la implantación23. Esto no es necesario para las células DeRENCA, porque crecen muy rápidamente.
  5. Cultivar células en el CAM durante 10 días y fotografiar cada 2 días.
  6. Eutanizar y cosechar el tumor, la sangre y los órganos.
    1. El día 20 del desarrollo (día 10 del tumor), recoja sangre a través de la vena corioalantoica con una jeringa heparinizada de 10 ml.
    2. Eutanasia los embriones poniéndolos en hielo durante 15 min.
    3. Cosecha y pesa tumores. Diseccionar pulmones e hígados utilizando una técnica de recolección de tejido estéril similar a la utilizada para ratones22.
      NOTA: Los hígados de pollo tienen dos lóbulos, que son los primeros órganos que se ven en la cavidad abdominal. No los confunda con los pulmones. Los pulmones de pollo se encuentran debajo del corazón y el tabique26. La recolección exitosa de los pulmones puede ser confirmada por costillas expuestas.
    4. Fijar los tumores y los órganos diseccionados en 4% paraformaldehído durante la noche para la incrustación de parafina-cera.
  7. Atrapa a los pollos.
    1. Para permitir un período prolongado de crecimiento tumoral, continúe la incubación hasta el día 21 y deje que los pollos eclosionen a 37 oC y al menos 60% de humedad.
      NOTA: Los pollos eclosionan naturalmente después del día 21 durante un período de tiempo de 24 horas, pero ocasionalmente tienen problemas para eclosionar por sí mismos. En este caso, romper las cáscaras de huevo algunas ayuda. Es importante que los pollos completen el proceso de eclosión dentro de las 24 h porque morirán por falta de nutrientes después de eso.
    2. Cultivar los pollos en una instalación animal (2017-102-01A) durante 2 semanas.
    3. El día 34 del desarrollo (día 24 del tumor), eutanasia los polluelos con inhalación de isoflurano seguida de luxación cervical.
    4. Diseccionar los pulmones utilizando una técnica de recolección de tejido estéril similar a las utilizadas para ratones22. Luego, arréglalos en un 4% de paraformaldehído durante la noche para la incrustación de parafina y cera.

3. Inmunohistoquímica

NOTA: Todas las secciones de tejido y la tinción de H&E fueron realizadas por el Laboratorio De Núcleo de Patología Traslacional (TPCL) de la Universidad de California, Los Angeles.

  1. Hornee los portaobjetos a 65 oC durante 20 min y desparafina 3 veces con xileno y rehidrata ralentí en serie de 100% de etanol a agua.
  2. Recuperar los antígenos en un tampón de citrato hervido en un vapor vegetal durante 25 minutos.
  3. Aplicar 1% BSA para el bloqueo. A continuación, aplique los anticuerpos primarios (anti-VHL, anti-HA, anti-bandera) preparados en una relación de dilución de 1:200 en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.
  4. Después de lavar 3 veces con TBST (7 min cada uno), incubar diapositivas con el anticuerpo secundario a 1:200 dilución. Lavar 3 veces con TBST (7 min cada uno) y aplicar reactivos DAB seguidos de contramancha de hematoxilina.

4. Citometría de flujo

  1. Procesar el ratón o la sangre de pollo con tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    NOTA: La lisis RBC suficiente es especialmente importante cuando se analiza la sangre CAM porque los glóbulos rojos de pollo están nucleados y no se pueden distinguir fácilmente en la citometría de flujo utilizando la dispersión hacia adelante y hacia el lado.
  2. Ejecute la citometría de flujo en el sistema sanguíneo y analice los datos de la expresión mStrawberry y EGFP.
  3. Establezca las puertas primarias en función de la dispersión hacia delante y lateral, excluyendo los desechos, las celdas muertas y los glóbulos rojos sin limosna.
  4. Establezca las puertas de fluorescencia en función de las muestras no manchadas y los controles teñidos individuales. Utilice el lisado sanguíneo preparado con Células VHL-WT, VHL-KO o RENCA sin etiquetar como controles manchados individuales y controles sin mancha, respectivamente.

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Representative Results

Cada experimento se realizó al menos 3 veces, a menos que se indique lo contrario. Los datos se presentan como media de desviación estándar (SD). La importancia fue determinada por una prueba T de estudiante en pareja cuando había dos grupos o por un ANOVA unidireccional cuando había tres o más grupos. Se utilizó un límite de valor p de 0,05 para establecer la importancia.

Células RENCA implantadas ortotópicamente crecieron con éxito en los riñones de los ratones, como confirman las manchas de BLI y H&E(Figura 2A-B). Aunque no hubo diferencia en el crecimiento primario, sólo el tumor heterogéneo y metastásico tenía metástasis robusta en el pulmón, como lo indica la señal BLI muy fuerte y los nódulos metastásicos en la tinción de H&E. Por otro lado, los tumores homogéneos no metastásicos no hicieron metástasis en órganos distantes. Los recuentos de CTC fueron más altos en los ratones que tenían tumores metastásicos que en los que tenían tumores no metastásicos(Figura 2C-D).

En concordancia con el modelo de ratón, el sistema CAM retuvo con éxito el crecimiento y el comportamiento metastásico de los tumores RENCA. Si bien no hubo diferencia de crecimiento entre tumores metastásicos y no metastásicos, el recuento de CTC fue significativamente mayor en los óvulos con tumores metastásicos que en aquellos con contrapartes no metastásicas(Figura 3A-C). Incubar los huevos con tumores CAM y permitir que los polluelos crezcan dos semanas adicionales amplió el período para que las células cancerosas metastásicas establezcan metástasis histológicamente detectables en el pulmón de los polluelos, como se muestra en las secciones de H&E y HA de tejido pulmonar de pollo(Figura 3D). La mayoría de los nódulos metastásicos consistían en células VHL-WT etiquetadas por HA, mientras que la bandera oeltó VHL-KO rara vez se veían, como hemos observado en ratones.

Figure 1
Figura 1: Visión general de los dos modelos animales para xenoinjertos metastásicos ccRCC. (A) Representación esquemática del modelo ortotópico del ratón. Los ratones de 3 o 4 semanas de edad se implantan ortotópicamente con tumores no metastásicos o metastásicos. Seis semanas después de la implantación, el crecimiento del tumor y la metástasis se visualizaron con BLI. Luego, se recogieron tumores, sangre y órganos para análisis posteriores. (B) Representación esquemática del modelo CAM que muestra los siguientes pasos: Preincubación, apertura de ventanas, implantación celular y eutanasia antes o después del sombreado. Los mismos análisis que el modelo de ratón se llevan a cabo para las muestras recogidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Crecimiento del tumor y metástasis en ratones implantados ortotóxicamente. (A) BLI de ratones y órganos extraídos (riñón, pulmón, hígado, intestino y bazo) 6 semanas después de la implantación ortotópica de las células RENCA. Izquierda: no metastásica (no satisfecha), derecha: metastásica. (B) Visión bruta y aumento del aumento de la tinción de H&E para el riñón y el pulmón (20x y 100x). Izquierda: no metastásica (no satisfecha), derecha: metastásica. (C) Análisis de flujo representativo para la detección de células mStraw+ y EGFP+ que circulan en la sangre. (D) Gráfico poblacional porcentual de células mStraw+ y EGFP+ circulantes. No satisfecha: no metastásica. Panel A fue adaptado de Hu et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Crecimiento tumoral y metástasis en el modelo CAM. (A) Tumores RENCA cultivados en CAM. Hubo 7 repeticiones para cada grupo. No satisfecha: no metastásica. (B) Análisis de flujo representativo para la detección de células mStraw+ y EGFP+ que circulan en la sangre. (C) Gráfico poblacional porcentual de células mStraw+ y EGFP+ circulantes. **p < 0.01. (D) Tinción del pulmón del IHC de un polluelo de 2 semanas que lleva un tumor metastásico durante su etapa embrionaria. De izquierda a derecha, las secciones muestran H&E, HA y la tinción de la bandera. N.o: arteria pulmonar de pollo; punta de flecha: nódulos metastásicos. Esta figura fue adaptada de Hu J et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Para muchos pacientes con neoplasias malignas epiteliales, la metástasis en órganos vitales es la causa principal de la mortalidad. Por lo tanto, es esencial encontrar el mecanismo subyacente y una nueva vía de terapia para la enfermedad metastásica. Desafortunadamente, hay una falta de modelos animales ccRCC metastásicos relevantes. El desafío en gran parte se debe a la incapacidad de recrear ccRCC en ratones a pesar de la generación de numerosos modelos transgénicos de ratón vHL knockout9,10. Aquí, demostramos los métodos para establecer un tumor de CCCc metastásico implantable en dos sistemas animales, el ratón y el pollo CAM. Estos hallazgos validaron el comportamiento metastásico de los tumores en dos ambientes dispares, y por lo tanto proporcionan oportunidades únicas para investigar más a fondo el mecanismo molecular de la metástasis. En el primer modelo, la población heterogénea de RENCA se implantó a ratones inmunocompetentes ortotópicamente en su cápsula renal. Después de 6 semanas, estos ratones mostraron metástasis pulmonar desenfrenada. En concordancia con el modelo de ratón, la implantación de células Heterogéneas de RENCA en el CAM creció con éxito y se intravasató en la sangre de los embriones de los polluelos. Al extender el período de crecimiento del tumor a 2 semanas después de la eclosión, se observaron metástasis pulmonares similares a las observadas en el ratón en los polluelos.

Para ambos modelos, la atención cuidadosa a los detalles técnicos de cada paso y la práctica para mejorar las habilidades técnicas son esenciales para aumentar la supervivencia animal y el injerto tumoral exitoso y metástasis. Para el modelo de ratón, la elección cuidadosa del equipo y la inyección precisa de las células tumorales a la cápsula renal maximizan la tasa de éxito al disminuir la mortalidad postoperatoria y aumentar la posibilidad de que el tumor obtenga un suministro de sangre adecuado para crecer y Metastatizar. El modelo CAM requiere más optimización en la configuración y la técnica. En nuestros estudios, la viabilidad del embrión estaba por debajo del 30% al principio. Es importante mantener la temperatura y la humedad al nivel deseado en todo momento al tener un buen equipo, monitoreo frecuente y una finalización más rápida de los procedimientos. Incluso después de la optimización, la supervivencia oscila entre el 50-75% dependiendo del experimentador y el lote individual de huevos. Se recomienda pedir siempre huevos adicionales para la copia de seguridad. En nuestra experiencia, dominar las técnicas CAM requiere más de 1 año. Dejar caer la membrana CAM y abrir la ventana es el paso crítico donde se produce con mayor frecuencia un daño accidental y mortal al embrión. La viabilidad del embrión del polluelo se puede mejorar evitando daños en el CAM.

Hay varias limitaciones al modelo de tumor CAM. En primer lugar, la aplicabilidad del modelo a todos los tipos de células tumorales. Hemos tenido una tasa de éxito del 100% injertando diferentes líneas de células tumorales establecidas en CAM, incluyendo líneas celulares tumorales de riñón, vejiga y próstata (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) y líneas celulares de cáncer de ovario (ID8 y SKOV3). Dos estudios adicionales de nuestro grupo proporcionan más información sobre estos tumores CAM25,27. Sin embargo, el crecimiento de algunas células de cáncer de ovario en CAM se ve potenciado por la suplementación de factor de crecimiento o células asociadas a tumores25. La optimización del número de celda o de los factores de crecimiento esenciales para cada línea o tipo de celda es importante. También incorporamos genes de reportero o marcador, como luciferasa, etiquetas proteicas (por ejemplo, HA o bandera), o etiquetas de fluorescencia (por ejemplo, mStrawberry o EGFP), para facilitar el seguimiento del crecimiento y la metástasis del tumor en los animales25,27. Sobre la base de nuestra experiencia, una gran mayoría de las líneas celulares de cáncer proliferantes se pueden establecer en CAM. Una limitación clave para el injerto podría ser la breve ventana de 10 días permitida para el crecimiento del tumor, lo que podría ser especialmente difícil para una línea celular de crecimiento lento para establecer suficiente masa en un período de tiempo tan corto.

Otra deficiencia del modelo CAM es la diferencia en fisiología entre el embrión aviar y los mamíferos. La metástasis del tumor CAM a órganos principales como el hígado o los pulmones del embrión se ha detectado predominantemente mediante técnicas sensibles de PCR28. El corto período de crecimiento de la CAM sería insuficiente para establecer grandes lesiones metastásicas que pueden ser verificadas por análisis histológicos. Además, la reducción de la perfusión vascular del pulmón embrionario no inflado no es favorable para establecer o apoyar el crecimiento de metástasis pulmonares. Para superar estas limitaciones, se obtuvo una aprobación de nuestro comité institucional de uso animal (IACUC) para incubar pollos del tumor CAM que llevan embriones y albergarlos 2 semanas más después de la eclosión. Extender el tiempo de crecimiento tumoral de esta manera nos permitió detectar metástasis pulmonares distantes por IHC. Aunque los estudios de pollos eclosionados requieren la aprobación adicional de la IACUC que los estudios de tumores CAM no hacen, este enfoque proporciona una valiosa oportunidad para estudiar la cascada metastásica en pollos como se hizo anteriormente en ratones. El sistema inmunitario del pollo se ha divulgado para desarrollar a partir del día 12 después de la fertilización20. Dada la alta eficiencia de injertando tumores de RENCA derivados de la muria reportada aquí y muchas otras líneas celulares de cáncer humano y PDXs en el CAM el día 10 después de la fertilización24,25,27, podríamos deducir que el sistema inmunológico en el embrión no está completamente desarrollado en este punto. La interacción del sistema inmunitario del pollo y el tumor CAM claramente justifica una investigación más profunda.

Nuestro trabajo proporciona una fuerte evidencia de apoyo de que el modelo de tumor CAM podría ser un modelo inicial simple in vivo para estudiar la biología del cáncer, incluyendo la metástasis. Debido a las limitaciones mencionadas anteriormente, el modelo CAM no debe reemplazar el modelo de ratón, sino complementarlo. Nuestra investigación en curso sugiere que la señal de interrelación entre las poblaciones de células heterogéneas en ccRCC es fundamental para gobernar la progresión metastásica11,12. El uso de los modelos CAM y ratón puede ser un medio valioso para validar la conversación cruzada metastásica en juego en ccRCC. Creemos que las numerosas ventajas del modelo CAM presentado aquí podrían acelerar el ritmo de descubrimiento de nuevos mecanismos metastásicos y tratamientos eficaces para remediar esta etapa mortal del cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la subvención de semillas ucLA JCCC, la subvención UCLA 3R, UCLA CTSI y UC TRDRP (LW). Agradecemos a la Instalación de Imágenes Preclínicas del Instituto Crump, el TPCL y el Departamento de Medicina Animal de Laboratorio (DLAM) de UCLA por su ayuda con métodos experimentales. La citometría de flujo se realizó en el Centro Integral del Cáncer de UCLA Johnson (JCCC) y en el Centro de Centro de Citometría de Investigación del SIDA, que cuenta con el apoyo de los premios P30 CA016042 y 5P30 AI028697, y por el JCCC, el Instituto de SIDA de UCLA, la Escuela de Medicina David Geffen de UCLA, la Cancillería de la UCLA y la Vicerrectora de Investigación de la UCLA. La consultoría estadística y los servicios de análisis de datos fueron proporcionados por el Programa de Bioestadística, Epidemiología y Diseño de Investigación (BERD) de UCLA CTSI que cuenta con el apoyo del NIH/Centro Nacional para el Avance de la Ciencia Traslacional UCLA CTSI Número de Subvención UL1TR001881.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning 25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18
anti-VHL antibody Abcam ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD Biosciences 14-826-79
BD Pharm Lyse BD Biosciences 555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826-5D
DAB Chromogen Kit Biocare Medical DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium Gibco LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) eBioscience 14-6681-82
Ethanol 200 Proof Cylinders Management 43196-11 Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Fisher Scientific 10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls Fisher Scientific 22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology MilliporeSigma 1.00496.5000
Hamilton customized syringe Hamilton 80408 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11) Santa Cruz Biotechnology sc805
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein Animal Health 1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" Medex Supply MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation MilliporeSigma 2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin Fisher Scientific MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium Sigma Aldrich 57-33-0 Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use Ricca Chemical 395516
pSicoR Addgene 11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC227420500
Renca ATCC CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Corning 10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile Fisher Scientific AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) Thomas Scientific 1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls Office Depot 220717
Suture Ethicon J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 1634
Thermo-Chicken Heated Pad K&H manufacturing 1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017
VHL-KO CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR Fisher Scientific 50-822-331
Wound autoclips kit Braintree scientific, inc. ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical Fisher Scientific X3S-4

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References

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