فحص خليه الضامة مراسل لفحص الأرقام مثل مستقبلات بوساطة NF-kB/AP-1 إشارات علي طبقات البروتين الممتف علي الأسطح البوليمريه

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يوفر هذا البروتوكول للباحثين طريقه سريعة وغير مباشره لقياس نشاط عامل النسخ NF-кB/AP-1 المعتمد علي TLR في خط خلايا الضامة في الاستجابة لمجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه وطبقات البروتين الممتصة التي تقوم بنمذجة البيئة المجهرية للزرع.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

استجابه المضيف التهابيه المستمرة للمواد البيولوجية المزروعة ، والمعروفة باسم رد فعل الجسم الأجنبي ، تمثل تحديا كبيرا في تطوير وتنفيذ الاجهزه الطبية الحيوية وتركيبات هندسه الانسجه. الضامة ، خليه مناعية فطريه ، هي اللاعبين الرئيسيين في رد فعل الجسم الأجنبي لأنها تبقي في موقع الزرع لعمر الجهاز ، وتدرس عاده للحصول علي فهم لهذه الاستجابة المضيف الضارة. وقد أظهرت العديد من الباحثين حيوي ان طبقات البروتين الممتد علي المواد المزروعة تؤثر علي سلوك الضامة ، وبعد ذلك تؤثر علي استجابه المضيف. تصف الطرق في هذه الورقة نموذجا في المختبر باستخدام طبقات البروتين الممتصة التي تحتوي علي جزيئات التلف الخلوي علي أسطح البوليمرات الحيوية لتقييم استجابات الضامة. تم استخدام NF-кB/AP-1 مراسل خط الخلايا الضامة والمقايسة الفوسفاتيز القلوية اللونية المرتبطة كطريقه سريعة لفحص غير مباشر NF-кB/AP-1 نشاط عامل النسخ استجابه لطبقات البروتين الممتدة المعقدة التي تحتوي علي بروتينات الدم والأنماط الجزيئية المرتبطة بالتلف ، كنموذج لطبقات البروتين الممتدة المعقدة التي تتشكل علي الأسطح الحيوية في الجسم الحيوي.

Introduction

رد فعل الجسم الخارجي (FBR) هو استجابه المضيف المزمنة التي يمكن ان تؤثر سلبا علي أداء المواد المزروعة أو الجهاز (علي سبيل المثال ، أجهزه تسليم المخدرات ، والمواد البيولوجية) ، من خلال الإفراج المستمر من الوسطاء التهابيه وعرقله التكامل بين المادة المزروعةوالانسجه ال ويبدا هذا الاستجابة المناعية الفطرية من خلال اجراء الغرس ويتميز بوجود طويل الأمد للخلايا المناعية الفطرية وتشكيل كبسوله ليفية حول زرع1. في سياق الاستجابات المضيفة المادية ، والتفاعلات الضامة المادية لها تاثير كبير علي تطور استجابه المضيف وتطوير FBR1. الضامة هي مجموعه متنوعة من الخلايا المناعية الفطرية, المجندين في موقع الزرع اما من السكان الضامة الانسجه المقيمين أو من الدم كالضامة المشتقة من الخلايا الاحاديه. يبدؤون في التراكم في موقع الزرع بعد فتره وجيزة من الغرس ، وفي غضون أيام تصبح الخلايا المهيمنة في البيئة المجهرية المزروعة. المواد-الضامة ملتصقة ، جنبا إلى جنب مع خلايا الجسم العملاقة الاجنبيه (fbgc) شكلت من خلال الانصهار الضامة ، يمكن ان تستمر علي سطح المادة لعمر الزرع2،3. التالي, تعتبر الضامة لتكون اللاعبين الرئيسيين في استجابه الجسم الأجنبي بسبب أدوارهم تدبير الخطوات المميزة لل FBR: استجابه التهابيه حاده, أعاده عرض الانسجه, وتشكيل الانسجه الليفية1.

مستقبلات مثل الأرقام (TLRs) هي عائله من مستقبلات التعرف علي النمط التي يتم التعبير عنها من قبل العديد من الخلايا المناعية, بما في ذلك الضامة, وقد ثبت ان تلعب دورا هاما في التهاب والتئام الجروح. بالاضافه إلى العوامل المسببة للمرض ، TLRs قادره علي ربط الجزيئات الذاتية ، والمعروفة باسم الاضرار المرتبطة الأنماط الجزيئية (DAMPs) ، والتي يتم تحريرها اثناء نخر الخلية وتنشيط مسارات الإشارات التهابيه مما ادي إلى إنتاج السايتوكينات التهابيه4. وقد اقترحنا نحن والآخرين ان الضرر المتكبدة خلال الانسجه الرخوة الحيوية إجراءات الزرع الإفراج damps ، التي كثفت بعد ذلك إلى الأسطح الحيوية بالاضافه إلى بروتينات الدم وتعدل التفاعلات اللاحقة الخلية المادية5،6. عندما تتفاعل الضامة مع طبقه البروتين الممتص علي الزرع ، قد تتعرف علي سطحها TLRs تكثيف DAMPs وتنشيط السلاسل التعاقبية الإشارات التهابيه ، مما يؤدي إلى NF-κB و AP-1 عامل النسخ التنشيط وإنتاج السايتوكينات التهابيه. لقد أظهرنا سابقا ان الضامة murine قد زادت بشكل ملحوظ NF-κB/AP-1 النشاط وعامل نخر الورم α (TNF-α ، إفراز التهابات الخلوية) في الاستجابة لطبقات البروتين الممتزات التي تحتوي علي الرطوبة علي مجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه مقارنه بالأسطح مع مصل الممتزات أو البلازما فقط (اي ، لا يوجد DAMPs الحالية) ، وان هذا الرد توسط إلى حد كبير من قبل TLR2 ، في حين TLR4 يلعب دورا اقل5.

و nf-κb/AP-1 مراسل الضام خط الخلية (جدول المواد) المستخدمة في هذا البروتوكول هو وسيله مريحه لقياس النسبية NF-κb و AP-1 النشاط في الضامة5،7،8. في تركيبه مع مثبطات مسار tlr ، هذا الخط خليه أداه مفيده للتحقيق التنشيط tlr ودوره في التهاب استجابه لمجموعه متنوعة من المحفزات5،7،8. الخلايا المراسلة هي الماوس تعديل الضامة مثل خط الخلية التي يمكن ان تنتج بشكل ثابت يفرز الفوسفاتيز القلوية الجنينية (SEAP) علي NF-κB و AP-1 عامل النسخ تفعيل9. ويمكن بعد ذلك استخدام المقايسة الفوسفاتيزه القلوية الانزيميه الملونة (جدول المواد) لقياس الكميات النسبية للتعبير seap كمقياس غير مباشر للنشاط NF-κb/AP-1. كما NF-κB و AP-1 هي المصب من العديد من مسارات إشارات الخلية ، وتحييد الأجسام المضادة والمثبطات التي تستهدف TLRs محدده (علي سبيل المثال ، TLR2) أو الجزيئات محول TLRS (علي سبيل المثال ، MyD88) يمكن استخدامها للتحقق من دور مسار معين. توفر المنهجية الموصوفة في هذه المقالة نهجا بسيطا وسريعا لتقييم مساهمه الإشارات TLR في استجابات الضامة murine إلى مجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه مع طبقات البروتين الممتص التي تحتوي علي كل من بروتينات الدم و DAMPs كنموذج في المختبر من الحيوي المزروعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. وسائل الاعلام واعداد الكاشف

  1. اعداد وسائل الاعلام الليفية. الجمع بين 450 مل من المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) ، 50 mL من مصل الأبقار الجنينية (الدم) ، و 5 مل من البنسلين/ستربتومايسين. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
  2. اعداد مراسل وسائل الاعلام النمو الضامة في الارصفه 50 mL. الجمع بين 45 مل من DMEM ، 5 مل من فار ، 5 ميكروغرام/مل القضاء علي الميكوبلازما الكاشف (جدول المواد) ، و 200 ميكروغرام/مل phleomycin D1 (جدول المواد). يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
  3. اعداد مراسل الضامة المقايسة وسائل الاعلام في 50 مل aliquots. الجمع بين 45 مل من DMEM ، 5 مل من الحرارة المعطلة (مرحبا--فار) ، 5 ميكروغرام/مل القضاء علي الميكوبلازما الكاشف ، و 200 ميكروغرام/مل phleomycin D1. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.

2. طلاء خليه السطوح الثقافة مع بولي (ميثيل ميثاكريليت)

  1. تذوب بولي (ميثيل ميثاكريليت) (PMMA) في كلوروفورم في 20 ملغ/مل (علي سبيل المثال ، 100 ملغ من PMMA في 5 مل من كلوروفورم) في قارورة الزجاج التلالؤ 20 مل. ضعي شريط التحريك المغناطيسي في القارورة واتركيه لتحريكه لمده 2 ساعة علي الأقل ، حتى يذوب كل المواد الصلبة.
    تحذير: كلوروفورم ضار إذا استنشق. ضمان استخدام المذيبات في غطاء الدخان اثناء ارتداء قفازات بولي.
  2. ماصه 400 μL من محلول PMMA علي مركز الشريحة المجهر الزجاج بوروسيليكات في المغطي تدور ، وتدور في 3000 دوره في الدقيقة لمده 2 دقيقه. اعداد عدد الشرائح المطلوبة لفحص ، فضلا عن 3 − 5 اضافيه لقياس زاوية الاتصال بالماء. تخزين الشرائح في صندوق نظيف (رش ومسحت مع 70 ٪ الايثانول) للاستخدام في المستقبل.
    ملاحظه: وغالبا ما تستخدم الطلاء تدور لإيداع رقيقه ، والطلاء موحده علي سطح مستو. تدور المغطي بالدوار الركيزة بسرعات عاليه ، وذلك باستخدام قوه الطرد المركزي لنشر محلول الطلاء علي السطح.
    1. قياس زاوية الاتصال المياه في موقعين عشوائي علي سطح الشرائح المغلفة اضافيه (اي ، وليس الشرائح التي تستخدم لثقافة الخلية) مع مقياس الرطوبة لضمان سطح الزجاج كانت مغطاه تماما مع البوليمر.
      ملاحظه: وينبغي استخدام المياه فقط من اعلي درجه نقاء (علي سبيل المثال ، الزجاج المقطر الثلاثي) لقياسات زاوية الاتصال المياه.
  3. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) نعلق 8-غرفه الآبار لزجه إلى PMMA المغلفة الشرائح باستخدام ملقط معقمه والتقنية العقيمة التالية. اضغط بقوة علي الأعلى من الآبار لزجه للتاكد من انها تعلق بقوة. احتضان الشرائح مع الآبار اللاصقة المرفقة في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها لتامين الختم.
    1. اختبار ختم الآبار لزجه عن طريق أضافه 200 μL من الصف ثقافة الخلية (اندوتوكسين خاليه) المياه لكل بئر. احتضان في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 60 دقيقه وضمان عدم وجود تسرب قبل المضي قدما. يستنشق الماء ، ويجري الحرص علي عدم إزعاج طلاء PMMA.
  4. قم بغسل الماء الخالي من السموم باضافه 300 μL من الماء الخالي من السموم إلى كل بئر واحتضان لمده 1 ساعة (ثلاث مرات) ، 12 ساعة ، و 24 ساعة قبل الاستخدام لأزاله اي مذيب متبقي.
  5. اختبار تركيز اندوتوكسين الشرائح التي سيتم استخدامها لثقافة الخلية. احتضان 200 μL من المياه الكاشفة الخالية من اندوتوكسين (جدول المواد) في بئر واحده من كل شريحة ل 1 ح. قياس تركيز اندوتوكسين في استخراج باستخدام نقطه نهاية اللونية اندوتوكسين فحص (جدول المواد).
    ملاحظه: البروتوكول التالي خاص بمجموعه الفحص الخاصة بالسموم التي ترد في جدول المواد.
  6. استخدم فقط الماء والمواد الاستهلاكية (مثل الماصة ، وأنابيب الطرد المركزي الصغيرة وصفائح البئر) المعتمدة بدون مولد حر (اي المضادة للذيفان الذاتي) لهذا العمل. أيضا ، اي الأواني الزجاجية المستخدمة في اعداد الأسطح المغلفة البوليمر يجب depyrogenated باستخدام التعقيم بالحرارة الجافة (250 درجه مئوية لمده 30 دقيقه) قبل استخدام10. قياس اندوتوكسين في الحل استخراج ، كما هو موضح هنا ، يمكن ان يؤدي إلى التهوين من اندوتوكسين علي سطح المادة11،12. التالي ، فمن المستحسن انه عند وضع بروتوكول طلاء البوليمر ، وأداء رد فعل الفحص اندوتوكسين (اي الخطوات 2.5.4 − 2.5.6 لعينات الاختبار [كاشف المياه] أو الضوابط سبايك) مباشره داخل الآبار التي تحتوي علي عينه المغلفة لضمان عدم وجود مصادر للذيفان المعوي غير قصد إدخالها في النظام اثناء عمليه الطلاء.
    1. جلب جميع عينات الاختبار (علي سبيل المثال ، مقتطفات) والكواشف الفحص اندوتوكسين إلى RT. أعاده تشكيل الكاشف اللوني في العازلة المقايسة ومعيار اندوتوكسين في المياه الكاشفة ، والسماح لأذابه لمده 5 دقائق ودوامه بلطف قبل استخدام. تغطيه جميع الزجاجات مع فيلم البارافين عندما لا تكون في الاستخدام.
    2. إنشاء منحني التخفيف القياسية 5 − 8 نقطه من اندوتوكسين القياسية التي تتراوح بين الحد الأدنى للحد الأعلى من الفحص عن طريق اجراء التخفيف التسلسلي للمعيار اندوتوكسين في المياه كاشف.
    3. للسيطرة علي تعزيز أو تثبيط الفحص اندوتوكسين في عينات الاختبار ، واعداد السيطرة الايجابيه (وتسمي أيضا السيطرة علي ارتفاع أو عينه ارتفعت) عن طريق تمييع كميه معروفه من اندوتوكسين في محلول عينه اختبار غير المستخدمة.
      ملاحظه: تركيز السيطرة الايجابيه يجب ان يكون نفس التركيز كمعيار في منتصف المنحني القياسي. إذا كان المبلغ المسترد من ارتفاع اندوتوكسين (اي تركيز السيطرة الايجابيه ناقص تركيز عينه الاختبار غير المسننة) هو داخل 50 − 200 ٪ من التركيز الاسمي للحاد اندوتوكسين ، يمكن اعتبار حل استخراج لا تتداخل بشكل كبير مع الفحص.
    4. أضافه 50 μL من المعايير ، والعينات ، أو الضوابط سبايك لكل بئر من لوحه 96 بشكل جيد في مكرره أو ثلاث نسخ. استخدام المياه كاشف كعنصر تحكم سلبي.
    5. أضافه 50 μL من كاشف الكروم إلى كل بئر. أضافه كاشف بسرعة إلى جميع الآبار. استخدم جهاز توقيت لتسجيل مقدار الوقت المستغرق لأضافه كاشف إلى جميع الآبار. غطي الصفيحة بختم لاصق وحضن عند 37 درجه مئوية (وقت الحضانة يعتمد كثيرا علي شهادة التحليل المضمنة في طقم الكاشف الكروروني). بدلا من ذلك ، تحقق علي لوحه كل 15 دقيقه اثناء الحضانة حتى يتم ملاحظه تغيير اللون في جميع الآبار القياسية.
    6. بعد الحضانة ، أضافه 25 μL من 50 ٪ حمض الخليك لكل بئر (التركيز النهائي من 10 ٪ حمض الخليك في البئر) لوقف رد الفعل. أضافه حمض الخليك في نفس الترتيب كما تم أضافه كاشف الكروم. قراءه امتصاص لوحه باستخدام قارئ لوحه في 405 nm. يستنشق السائل واللوحة المرتجعة.
      ملاحظه: وينبغي أضافه حمض الخليك تاخذ نفس الطول من الوقت لأضافه إلى كل بئر كما استغرق الكاشف اللوني (± 30 ق).
  7. الاشعه فوق البنفسجية (UV) تعقيم الشرائح لمده 30 دقيقه قبل التجارب ثقافة الخلية.

3. طلاء خليه ثقافة الأسطح مع بوليديميثيلسيلاوكسين

  1. مزيج بوليميثيلسيلاوكسان (PDMS) الاستومر في نسبه الوزن 10:1 (قاعده: عامل العلاج). في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، ماصه حوالي 10 مل من قاعده بوليديميثيلسيلاوكسين في أنبوب معقم. تزن الأنبوب وببطء أضافه عامل العلاج حتى 10% وقد أضيف.
    تحذير: استخدام الكواشف PDMS في منطقه جيده التهوية وتجنب الاتصال العين عن طريق ارتداء نظارات السلامة.
  2. اخلطي المطاط المرن بشكل جيد من خلال التحريك مع طرف ماصه مصلي معقم وعن طريق التنضيد للأعلى والأسفل. أضافه تقريبا 200 μL من الحل لكل بئر من لوحه 48-حسنا. أماله لوحه جيدا ببطء لضمان تغطيه كامله من الآبار مع محلول الاستومر.
  3. وضع لوحه جيدا مع الاستومر في فرن فراغ تعيين في 50 cmHg ، 40 درجه مئوية. قم بازاله الغطاء والغطاء بمسحه واحده لمنع الحطام الآخر من السقوط في الآبار. السماح لاحتضان لمده لا تقل عن 48 h.
    1. تاكد من ان الآبار مغطاه بالبالكامل عن طريق الفحص البصري. تاكد من المعالجة الكاملة للالاستومر عن طريق الحث برفق بطرف ماصه معقم قبل الازاله.
  4. أضافه 300 μL من 70 ٪ الايثانول (مصنوعة من الايثانول المطلق والمياه الخالية من اندوتوكسين) واحتضان في RT ل 1 ح. أزاله الايثانول والقيام بغسل المياه الخالية من السموم عن طريق أضافه 300 μL من المياه الخالية من اندوتوكسين إلى كل بئر واحتضان لمده 1 ساعة (ثلاث مرات) ، 12 ساعة ، و 24 ساعة قبل استخدامها لأزاله اي المذيبات المتبقية.
    1. احتضان 200 μL من المياه الخالية من التسمم الداخلي في ثلاثه ابار من كل لوحه ل 1 ح. قياس التركيز الداخلي لمستخلصات المياه باستخدام فحص السموم اللونية لنقطه النهاية (الخطوات 2.5.1 − 2.5.6).

4. طلاء خليه السطوح الثقافة مع بولي المفلوره (الاثلين)

  1. جعل 1 ملغ/مل محلول من بولي المفلوره (الاثلين) (fPTFE) (علي سبيل المثال ، أضافه 10 ملغ من fPTFE إلى 10 مل من المذيبات المفلوره [جدول المواد]) في 20 مل قارورة الزجاج تلالؤ. ضعي شريط التحريك المغناطيسي في القارورة واتركيه لتحريكه لمده 24 ساعة علي الأقل ، حتى يذوب كل المواد الصلبة.
  2. أضافه ما يقرب من 150 μL من محلول البوليمر لكل بئر من البوليسترين 48-بئر لوحه (اي ، لا ثقافة الانسجه تعامل). أماله لوحه جيدا ببطء لضمان التغطية الكاملة لجميع الآبار مع محلول البوليمر. استبدل الغطاء.
    1. لضمان فعاله fPTFE-طلاء الآبار ، وينبغي ان تكون مغلفه الزجاج الشفتين في fPTFE وتستخدم لقياس زاوية الاتصال المياه (خطوه 4-3). وضع الشفتين داخل الآبار من لوحه 24 بئر. أضافه ما يقرب من 400 μL من محلول البوليمر لكل بئر تحتوي علي coverslip. دفع الشفتين أسفل باستخدام ملقط معقمه ، وضمان انها مغطاه تماما في محلول البوليمر ، وتغطيه لوحه جيدا مع غطاء.
  3. وضع لوحه جيدا مع محلول البوليمر و/أو coverslips في فرن فراغ تعيين في 50 cmHg ، 40 درجه مئوية. قم بازاله الغطاء والغطاء بمسحه واحده لمنع الحطام الآخر من السقوط في الآبار. السماح لاحتضان لمده لا تقل عن 48 h.
    1. قياس زاوية الاتصال المياه من الشفتين المغلفة fPTFE مع الجندول لضمان طلاء فعال.
      ملاحظه: وينبغي استخدام المياه فقط من اعلي درجه نقاء (علي سبيل المثال ، الزجاج المقطر الثلاثي) لقياسات زاوية الاتصال المياه.
  4. أضافه 300 μL من 70 ٪ الايثانول (مصنوعة من الايثانول المطلق والمياه الخالية من اندوتوكسين) واحتضان في RT ل 1 ح. أزاله الايثانول والقيام بغسل المياه الخالية من السموم عن طريق أضافه 300 μL من المياه الخالية من اندوتوكسين إلى كل بئر واحتضان لمده 1 ساعة (ثلاث مرات) ، 12 ساعة ، و 24 ساعة قبل استخدامها لأزاله اي المذيبات المتبقية.
    1. احتضان 200 μL من المياه اندوتوكسين خاليه في ثلاثه ابار من كل لوحه ل 1 ح. قياس تركيز اندوتوكسين المياه باستخدام نقطه النهاية اللونية لفحص السموم (الخطوات 2.5.1 − 2.5.6).
  5. الاشعه فوق البنفسجية تعقيم لوحات جيدا لمده 30 دقيقه قبل التجارب ثقافة الخلية.

5. جعل Lysate من خلايا 3T3

  1. تنمو الخلايا 3T3 في قوارير T150 متعددة إلى 70 ٪ التقاء. لفصل الخلايا ، والشفط وسائل الاعلام ، وغسل السطح مع 5 مل من تلفزيوني ، والطامحين تلفزيوني. أضافه 5 مل من الحيوانية خاليه من الأصل ، انزيم التفكك الخلية المؤتلف (جدول المواد) واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 3 − 5 دقيقه.
  2. افصل الخلايا بآماله القارورة برفق ذهابا وإيابا. أضافه 5 مل من تلفزيوني لتحييد الانزيم المؤتلف المستخدمة لتفكك الخلية. نقل الخلايا المنفصلة من قوارير إلى أنبوب الطرد المركزي وتخلط عن طريق التنضيد. اجراء عدد الخلايا الحية باستخدام مقياس اللزوجة وصبغ الخلية القدرة علي البقاء.
    ملاحظه: تم اختيار انزيم التفكك الخلية التي يمكن تحييدها من خلال التخفيف في النظام التلفزيوني لتجنب إدخال البروتينات القائمة علي المصل في اعداد محلله. إذا تم استخدام التريبسين لفك الخلايا ، فانه ينبغي تحييدها بمحلول يحتوي علي مصل ، ويجب اجراء غسيل تلفزيوني إضافي لتقليل كميه بروتينات المصل التي تم ترحيلها إلى اعداد الليفات.
  3. الطرد المركزي الخلايا في 200 x g لمده 5 دقيقه. يستنشق ماده طافي وأعاده التعليق الخلايا في الحجم الأصلي (اي ، 10 مل x عدد من قوارير) من تلفزيوني ليغسل اي وسائل الاعلام المتبقية. كرر.
  4. الطرد المركزي الخلايا مره أخرى في 200 x ز لمده 5 دقائق ويستنشق supernatant. أضافه حجم الوحدة التلفزيونية المطلوبة لتحقيق تركيز الخلية النهائية من 1 × 106 خلايا/مل. ضع محلول الخلية في الفريزر-80 درجه مئوية حتى تجمد العينة بالبالكامل (علي الأقل 2 ساعة).
  5. ذوبان محلول الخلية في 37 درجه مئوية حمام المياه. مره واحده أذابه تماما ، ووضع الحل مره أخرى في-80 درجه مئوية الفريزر حتى تجمد تماما. كرر ما مجموعه 3 دورات تجميد الذوبان.
  6. اجراء فحص حمض ثنائي القطب الصغير (bca) علي الخلية محلله في مجموعه متنوعة من المخففات (علي سبيل المثال ، 1/100 ، 1/200 ، 1/500 ، 1/1000) لتحديد تركيز البروتين. تمييع الخلية محلله إلى تركيز البروتين من 468.75 ميكروغرام/مل ، aliquot ، وتخزين في-80 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل.
    ملاحظه: تركيز البروتين النهائي في لوحه 48-بئر هو 125 ميكروغرام/سم2 (استنادا إلى المساحة السطحية لبئر واحده ، 0.75 سم2).
  7. اجراء لطخه الغربية لتقييم وجود damps في محلله (علي سبيل المثال ، الحرارة صدمه البروتين 60 [HSP60] ، عاليه الحركة مربع مجموعه 1 [HMGB1]) عن طريق تحميل 40 − 60 ميكروغرام من البروتين محلله في المخزن المؤقت التحميل علي 1.5 ملم سميكه 10 ٪ هلام بولياكرياميد ومتابعه القياسية وصمه عار الغربية الاجراءات.

6. تقييم تاثير طبقات البروتين الممتبيد والمستقبلات مثل الحصيلة علي NF-κB النشاط من الضامة

ملاحظه: وللاطلاع علي تخطيطي لسير العمل التجريبي وتخطيط اللوحة ، يرجى الرجوع إلى الشكل 1الف والشكل التكميلي 1، علي التوالي.

  1. تنمو الضامة مراسل في قارورة الحجم المناسب للتقاء 70 ٪. الشفط وسائل الاعلام ، وغسل السطح مع تلفزيوني ، والطامحين تلفزيوني. أضافه انزيم التفكك الخلية المؤتلف واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 8 دقائق.
  2. فصل الخلايا عن طريق التنصت بحزم علي جانبي القارورة. اينتنشيط انزيم التفكك الخلية المؤتلف عن طريق أضافه حجم متساو من وسائل الاعلام النمو (التي تحتوي علي 10 ٪ من الهواء). اجراء عدد الخلايا الحية باستخدام مقياس اللزوجة وصبغ الخلية القدرة علي البقاء.
    ملاحظه: الجدوى المتوقعة لمراسل الضامة بعد 8 دقيقه حضانة في انزيم التفكك الخلية هو 90 ٪.
  3. خلايا الطرد المركزي في 200 x g لمده 5 دقائق يستنشق ماده طافي وأعاده التعليق في الحجم الأصلي من تلفزيوني لغسل الخلايا. الطرد المركزي مره أخرى وأعاده تعليق الخلايا في 7.3 x 105 خلايا/مل في وسائل الاعلام المقايسة (التي تحتوي علي الحرارة غير مفعله).
  4. فصل خليه منفصلة في 3 أنابيب مختلفه: مثبط TLR4 ، المضادة لTLR2 ، وغير المعالجة. احتضان الخلايا مع 1 ميكروغرام/مل TLR4 المثبط لمده 60 دقيقه في RT أو مع 50 ميكروغرام/مل المضادة لTLR2 لمده 30 دقيقه في RT.
  5. أضافه 200 μL من lysate, 10% المعرضة للخطر, 10% البلازما التجارية الماوس (جدول المواد), أو خليط من حلول البروتين إلى لوحه 48-بئر (أو ما يعادلها) والسماح للبروتين لامتصاص في 37 درجه مئوية للمبلغ المطلوب من الوقت (اي, 30 دقيقه, 60 دقيقه, أو 24 ساعة). يستنشق حلول البروتين من الآبار ، وذلك باستخدام ماصه باستور الطازجة لكل محلول البروتين ، وغسل الأسطح مع 250 μL من تلفزيوني لمده 5 دقائق. الطامحين. كرر لما مجموعه 3 يغسل.
    ملاحظه: قد تحتاج هذه الخطوة للبدء في وقت سابق في البروتوكول اعتمادا علي الوقت الامتزاز المطلوب. اضبط البروتوكول وفقا لذلك.
  6. بعد فتره الحضانة مع مثبط TLR4 أو المضادة لTLR2 ، خلايا ماصه لأعاده التعليق. أضافه 200 μL من حل الخلية لكل بئر.
  7. ل TLR2 حاله السيطرة الايجابيه ، أضافه Pam3CSK4 إلى تركيز النهائي من 150 ng/mL. ل TLR4 حاله السيطرة الايجابيه ، أضافه lipopolysساكاريد (LPS) إلى تركيز نهائي من 1.5 ميكروغرام/مل. احتضان الخلايا عند 37 درجه مئوية لمده 20 ساعة.
  8. عينه 20 μl من ماده طافي من كل بئر ولوحه في نسخه مكرره في لوحه 96-بئر. وتشمل ثلاثه ابار من 20 ميكرولتر وسائل الاعلام الفحص كعنصر تحكم في الخلفية. أضافه 200 μL من SEAP مخبر فحص كاشف لكل بئر. تغطيه لوحه مع ختم لاصق واحتضان ل 2.5 h في 37 درجه مئوية.
    ملاحظه: قد يختلف وقت الحضانة تبعا للظروف التجريبية ، وينبغي ان يكون الأمثل لاختلاف قوي في الامتصاص بين الآبار السيطرة الايجابيه والسلبية.
    1. نقل ما تبقي من ماده طافي إلى أنبوب 1.5 mL (لكل بئر). الطرد المركزي في 1,000 x g لمده 10 دقيقه لبيليه اي الحطام. نقل ماده طافي إلى أنبوب 1.5 mL جديده وتخزين في-80 درجه مئوية. تحليل سوبرناتانت لوجود السايتوكينات التهابيه (علي سبيل المثال ، tnf-α ، انترلوكين 6) عن طريق المقايسة المناعية المرتبطة بالانزيم (ELISA).
  9. أزاله ختم لوحه لاصقه. قراءه امتصاص لوحه باستخدام قارئ لوحه في 635 nm. يستنشق السائل واللوحة المرتجعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم اختبار طرق التنظيف للأسطح المغلفة بالبوليمر لضمان عدم وجود اي خلل في الطلاء ، والذي سينظر اليه علي انه تغيير في زاوية الاتصال بالماء إلى مشبك زجاجي غير مطلي (الشكل 2). نقع الشرائح المجهر PMMA المغلفة في 70 ٪ الايثانول ل 1 ح تم العثور علي أزاله الطلاء PMMA (الشكل 2، لوحه اليسار) ، من المرجح بسبب ذوبان pmma في 80 wt ٪ الايثانول13، التالي تم تنظيف الأسطح pmma المغلفة باستخدام 30 دقيقه من التعقيم للاشعه فوق البنفسجية وحدها. تم تحسين تركيز PMMA للطلاء سابقا5. وكان 1 ح 70 ٪ الايثانول نقع لتنظيف PDMS ، وأهملت التعقيم للاشعه فوق البنفسجية منذ ضوء الاشعه فوق البنفسجية يمكن ان يسبب سلسله الانشقاق والتاثير علي خصائص ترطيب السطح من PDMS14. كلا 70 ٪ الايثانول نقع والتعقيم للاشعه فوق البنفسجية لم تؤثر علي زاوية الاتصال المياه من الشفتين المغلفة fPTFE (الشكل 2، لوحه الحق) ، التالي فان طريقتين ، في الخلافة ، واستخدمت لتنظيف الطلاء fptfe. تم وصف طريقه طلاء fPTFE سابقا من قبل مجموعه غرينجر15.

تم اجراء لطخه الغربية علي محلله 3t3 لضمان ان الأنواع الرطبة كانت موجودة في الخليط الجزيئي المعقدة. وأظهرت النتائج ان كلا من الHMGB1 والHSP60 ، وهما damps16،17الموثقة جيدا ، كانت موجودة في محلله (الشكل 1ب). وأكد الامتزاز من يغاندس tlr من محلله علي السطوح البوليمر من قبل الضامة مراسل ذبح (غير المعالجة ، TLR2 تحييد ، أو TLR4 تثبيط) لمده 20 ساعة علي السطوح البوليمر البروتين كثفت (اي الانسجه المعالجة الثقافة البوليسترين [tcps] ، pmma ، pdms ، fptfe) ، ثم تقييم غير مباشر NF-кb/AP-1 النشاط علي أساس الإنتاج seap باستخدام المقايسة الانزيميه (الشكل 1C والشكل 3). وعلاوة علي ذلك ، فان الضامة مراسل زادت بشكل ملحوظ NF-кB/AP-1 النشاط علي المضادات الممتصة بالمقارنة مع المكثفات التي قام بها الاتحاد أو البلازما وليس البروتين الممتص مسبقا (وسائل الاعلام) (الشكل 4). Tlr يغاندس الاصطناعية lipopepated الثلاثي (Pam3CSK4 ، TLR2 ligand) و lipopolys (lps ، TLR4 ligand) تم تضمينها كعناصر تحكم ايجابيه لتاكيد الأجسام المضادة أو المثبط والفحص كانوا يعملون بشكل صحيح. وكان تحييد TLR2 انخفاض ملحوظ اقوي في NF-кb/AP-1 استجابه من الضامة مراسل لامتصاص محلله مقارنه مع تثبيط TLR4. كذلك ، كميات صغيره من محلله المخفف في المصل (علي أساس البروتين الكلي) الناجمة زيادة كبيره NF-кb/AP-1 استجابه مقارنه مع المصل وحده ، مع انخفاض فعال اقل تعتمد علي سطح البوليمر (الشكل 5). تظهر هذه النتائج فاعليه الجزيئات المشتقة من مضادات التشبع علي حمل النشاط التابع ل TLR NF-кB/AP-1 في الضامة المراسلة علي مجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه.

Figure 1
الشكل 1: الأساليب والنتائج لفحص الفوسفاتيز القلوية من NF-кB/AP-1 مراسل الضامة علي TCPS ، PMMA ، PDMS ، و fPTFE. (ا) رسم تخطيطي لسير العمل لمراسل الضامة الفوسفاتيز القلوية المقايسة. (ب) لطخه الغربية من محلله تاكيد وجود الأنواع الرطبة HMGB1 و HSP60 ، مع β-actin كعنصر تحكم التحميل. (ج) نشاط NF-кb/AP-1 (يمثله الامتصاص) من الضامة مراسل مثقف علي وسائل الاعلام (السيطرة السلبية) ، 10 ٪ سلاح ، lysate ، و PAM3CSK4 (TLR2 ligand السيطرة الايجابيه) ل 20 ح. وتظهر البيانات نتائج تجربه واحده وتمثل نتائج ما لا يقل عن تجربتين منفصلتين ، موضحه بأنها تعني ± الانحراف المعياري (SD). كل تجربه تستخدم n = 3 الآبار منفصلة لكل حاله ، وكان كل بئر مطلي في نسخه مكرره لفحص الانزيميه. تحليلها باستخدام واحد في اتجاه ANOVA و Tukey اختبار ما بعد الخاصة. p < 0.001. وقد تم تكييف هذا الرقم مع اذن من McKiel وفيفيباتريك5. حقوق التاليف والنشر 2018 جمعيه الكيميائية الامريكيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الاستفادة المثلي من أساليب التنظيف للأسطح PMMA-و fPTFE المغلفة ، التي تم تقييمها باستخدام زاوية الاتصال بالماء (WCA). وقد اتخذت القياسات علي 2 بقع منفصلة علي الأقل 3 الشفتين المشاركين. يتم عرض البيانات علي انها تعني ± SD. تحليل باستخدام ANOVA في اتجاه واحد و Tukey اختبار ما بعد الخاصة. * p < 0.05. وقد تم تكييف هذا الرقم مع اذن من McKiel وفيفيباتريك5. حقوق التاليف والنشر 2018 جمعيه الكيميائية الامريكيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: النشاط الذي تم بوساطة الحركة NF-кb/AP-1 (يمثله الامتصاص) من الضامة مراسل مثقف علي 10 ٪ سلاح (السيطرة) ، lysate ، والسيطرة الايجابيه لمده 20 ساعة. (ا) تاثير تحييد TLR2 علي استجابات المراسل الضام إلى الامتصاص السيطرة الايجابيه هي بأم (Pam3CSK4 ، TLR2 ligand). (ب) تاثير تثبيط TLR4 علي رد الضامة مراسل إلى الممتصة لل. السيطرة الايجابيه هي LPS (TLR4 ligand). تظهر البيانات نتائج تجربه واحده وهي تمثل النتائج من تجربتين منفصلتين علي الأقل ، موضحه بأنها تعني ± SD. كل تجربه تستخدم n = 3 الآبار منفصلة لكل حاله ، وكان كل بئر مطلي في نسخه مكرره لفحص الانزيميه. تحليلها باستخدام واحد في اتجاه ANOVA و Tukey اختبار ما بعد الخاصة. * * p < 0.01 ، * * * p < 0.001. وقد تم تكييف هذا الرقم مع اذن من McKiel وفيفيباتريك5. حقوق التاليف والنشر 2018 جمعيه الكيميائية الامريكيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: NF-кB/AP-1 النشاط (التي تمثلها الامتصاص) من الضامة مراسل مثقف علي وسائل الاعلام (السيطرة السلبية) ، 30 دقيقه و 24 ساعة طبقات البروتين كثف ، و Pam3CSK4 (السيطرة الايجابيه) علي TCPS ل 20 ح. يتم الجمع بين البيانات من 3 تجارب منفصلة ويظهر كمتوسط ± SD. كل تجربه تستخدم ن = 3 الآبار منفصلة لكل حاله ، وكان كل بئر مطلي في نسخه مكرره لفحص الانزيميه (اي ، n = 9 غير مستقله الآبار ثقافة الخلية و n = 18 غير مستقله الآبار المقايسة الانزيميه). تحليلها باستخدام واحد في اتجاه ANOVA و Tukey اختبار ما بعد الخاصة. p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مراسل الضامة NF-кb/AP-1 النشاط (يمثله الامتصاص) بعد 20 ساعة ردا علي تخفيفات من محلله في (البروتين الكلي = 280 ميكروغرام/بئر) كثف إلى السطوح البوليمر لمده 30 دقيقه. (ا) TCPS. (ب) PMMA. (ج) PDMS. (د) fptfe. تظهر البيانات نتائج تجربه واحده وهي تمثل النتائج من تجربتين منفصلتين علي الأقل ، موضحه بأنها تعني ± SD. كل تجربه تستخدم n = 3 الآبار منفصلة لكل حاله ، وكان كل بئر مطلي في نسخه مكرره لفحص الانزيميه. تحليلها باستخدام واحد في اتجاه ANOVA و Tukey اختبار ما بعد الخاصة. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. وقد تم تكييف هذا الرقم مع اذن من McKiel وفيفيباتريك5. حقوق التاليف والنشر 2018 جمعيه الكيميائية الامريكيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 1
الشكل التكميلي 1: تخطيطات المثال المستخدمة ل NF-кB/AP-1 مراسل الضامة ثقافة الخلية المقايسة في 8-الغرفة و 48-بئر تنسيقات لوحه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التركيز الأساسي لمعملنا هو استجابه المضيف لعمليات زراعه الانسجه الرخوة الصلبة ، وعلي وجه الخصوص كيف تؤثر الاضرار الخلوية المتكبدة اثناء اجراء الغرس علي استجابه المضيف. يصف العمل المعروض هنا التجارب الاوليه باستخدام خط خليه الضامة مراسل وفي المختبر الذي يحتوي علي الرطوبة الخلوية التي تحتوي علي الليمات ، للتحقيق في تاثير الجزيئات التي تم إطلاقها اثناء الضرر الخلوي (اي من جراحه الزرع) علي الاستجابات الضامة لحيوي. وقد استخدمت الخلايا الليفية الخلية محلله لنمذجة الضرر الخلوي وإطلاق damps بسبب التنسيب البيولوجية. تم اختيار الخلايا الليفية لإنشاء الليمات بسبب انتشار الخلايا الليفية في الانسجه الرخوة ، فضلا عن قدرتها علي إفراز مجموعه متنوعة من البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، بما في ذلك الفيبرونكتين18. تم اختيار تجميد ذوبان الدراجات كطريقه لتحلل لإنتاج كل من DAMPs المستمدة من داخل الخلايا والمحتوي ، علي غرار ما يمكن ان يكون موجودا في بيئة الزرع. لم تستخدم مثبطات البروتياز لجعل هذا lysate. في حين تحلل الخلية غير المنضبط مثل تجميد ذوبان الدراجات يمكن ان يؤدي إلى الإفراج عن بروتياسيس التي قد تتحلل DAMPs, هذه الانزيمات من المرجح أيضا ان تكون موجودة في بيئة زرع الحيوية عندما تتلف الخلايا اثناء عمليه الغرس. وأكد وجود damps في الخليط الجزيئي المعقدة من محلله بواسطة لطخه الغربية (الشكل 1ب; HMGB1 و HSP60) وفحص مراسل SEAP (الشكل 1ج؛ NF-кB/AP-1 النشاط استجابه ل lysate الممتص). وقد أجرينا أيضا اختبارات حيث تم تخفيف محلله في الخلية علي أساس تركيز البروتين الكلي وكثف علي أسطح ثقافة الخلايا (الشكل 5) لتعكس بشكل أفضل تعقيد بيئة الزرع ، لأنها سوف تحتوي علي وفره من بروتينات الدم وكذلك damps6. مراسل الضامة NF-кb/AP-1 النشاط ظلت زيادة كبيره علي طبقات كثف من محلله المخفف في الجهاز العام ، واقل تخفيف لتحقيق التنشيط الكبيرة كانت تعتمد علي السطح ، تتراوح بين 0.1 ٪ (tcps) إلى 10 ٪ (pdms و fptfe).

تم اختيار البوليمرات pmma ، pdms ، و PTFE لهذا العمل لأنها غير قابله للتحلل ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في الأدب لتقييم امتصاص البروتين والضام استجابه ل حيوي19،20،21،22،23،24،25. كما استخدمت tcps للمقارنة نظرا لأنه هو الركيزة المشتركة المستخدمة في الأنابيب الضامة و tlr يشير العمل21,26,27,28. المواد المستخدمة في عملنا هي أمثله تمثيليه لحيوي الصلبة غير القابلة للتحلل. ومع ذلك ، يمكن استخدام العديد من المواد الأخرى مع هذا النموذج ، شريطه ان المواد يمكن ان تكون مغلفه علي لوحات ثقافة الخلية أو الشرائح المجهر وتطهيرها بشكل صحيح. تم اختيار الخط الخلوي NF-κB/AP-1 لهذا النموذج في المختبر لأنه يتيح القياس السريع وغير المباشر للنشاط NF-κB/AP-1 من خلال التعبير المحرض NF-κB/AP-1 من SEAP. NF-κB/AP-1 مراسل الضامة تتطلب استخدام phleomycin D1 في وسائل الاعلام الثقافية كمضاد حيوي انتقائي لضمان ان الخلايا فقط مع NF-кB/AP-1 الجينات SEAP غير موجودة29. لفحص الفوسفاتيز القلوية ، فمن الاهميه بمكان لاستخدام مرحبا--العرض في وسائل الاعلام الثقافة الخلية لتجنب النتائج الايجابيه كاذبه المحتملة المتولدة عن الفوسفاتاسيس القلوية الموجودة في المصل. وتشير أبحاثنا حتى الآن إلى ان الأسطح غير القابلة للكشف لا تولد نتيجة ايجابيه زائفه يمكن كشفها ، ويرجح ان تكون جزيئات المصل ممتصه بقوة لسطح الثقافة ولا يتم إطلاقها في البحر الخارق. الثقافة [تيم بوينت] للمراسلة [بلبلسس] (20 [ه]), فحصت حضانة [تيبوينت] (2.5 [ه]), و [مستينس] قراءه طول موجي (635 [نم]) ل ال [الفوسفاتيز مقايسة] قلوية كان امثلت مع هذا نظامه ان يضمن قويه وقابل للتكرار قياسات لكل شروط.

وقد تم اختيار الاوليه البروتين الامتزاز مرجعيه من 30 دقيقه لهذا العمل نظرا لاستخدامها الشائع في الأدب الامتزاز البروتين (الشكل 1ج)30,31,32,33,34. ومع ذلك ، فقد استكشفنا أيضا فترات امتصاص أطول (اي 60 دقيقه و 24 ساعة ، الشكل 4) لتمثيل طبقه البروتين الممتصة التي تتفاعل معها الضامة بشكل أفضل ، والتي من المحتمل ان تحدث 4 − 24 ساعة بعد الغرس1. وقد افترض ان معظم الامتزاز البروتين وتبادل يحدث في الدقيقة 60 الاولي من التعرض لسطح26,35,36, ولذلك قد يكون الوقت الامتزاز 60 min نقطه زمنيه أكثر صله. وقد انتقلنا أيضا من استخدام السلاح كعنصر تحكم سلبي لوجود DAMPs في طبقه البروتين ألممتم لبلازما الماوس التجارية. الأساس المنطقي لاستخدام البلازما بدلا من المصل هو ان بروتينات البلازما معروفه للعب ادوار كبيره في الامتزاز البروتين واستجابه الضام1، وان البلازما يوفر تمثيلا أفضل للبروتينات في بيئة الجرح. يتم اعداد البلازما المستخدمة في تجارب الامتزاز البروتين عاده باعتبارها 1 − 10 ٪ تخفيف26،36،37، والتي حفزت استخدامنا من البلازما 10 ٪. ويشيع استخدام البلازما البشرية26,36, كما انه من الأسهل للحصول علي كميات كبيره وأكثر اهميه سريريا, بالمقارنة مع البلازما الماوس. ومع ذلك ، اخترنا لاستخدام البلازما الماوس التجارية في هذا النموذج للحفاظ علي الأنواع من حلول البروتين متسقة مع تلك الخلايا مراسل.

الاستعمال من المراسلة [بلبلسن] خليه خط قدم بعض قصور ضمن الدراسة. أولا ، باستخدام خط الخلايا الضامة الكريات البيضاء murine القيود المتاصله ، كما النمط الظاهري والسلوك قد تختلف من الثقافات الضامة الابتدائية. وفي حين سيتم تناول هذا القيد في العمل في المستقبل باستخدام الضامة الاوليه, وأظهرت خط خليه الضامة الابويه لتقليد بشكل وثيق الضامة نخاع العظم المشتقة من حيث مستقبلات سطح الخلية والاستجابة للجنيدس الميكروبية ل TLRs 2, 3 و 438. وعلاوة علي ذلك, نف-κB/AP-1 مراسل الضامة أسفرت عن نتائج مماثله ردا علي HMGB1 والتحفيز LPS بالمقارنة مع الضامة murine الاوليه الصفاقي39. وتجدر الاشاره إلى ان NF-κB/AP-1 مراسل الضامة ، وسلالهم الابويه ، لا تعبر عن TLR540. وقد أظهرت الباحثين ان HMGB1 كان قادرا علي تنشيط النسخ NF-κB العوامل عبر مسارات الإشارات TLR5 في الخلايا يشيك-293 بشكل ثابت مع الإنسان TLR541. ولذلك ، تم إهمال مساهمه HMGB1-TLR5 الاشاره إلى النشاط NF-κB الكلي علي الأسطح المغلفة lysate في هذا النموذج. بالاضافه إلى ذلك ، الضامة مراسل وسلالهم الابويه لا تعبر عن بروتين محول ASC ، التالي لا تشكل معظم أنواع الانتفاخات ولا يمكن معالجه غير نشط IL-1β أو غير نشط IL-18 إلى اشكالهم ناضجه42. ولذلك ، فان النموذج الذي استخدمناه لا يمثل مساهمه النشاط نافخه التابعة ASC واللاحقة التلقائي IL-1β والإشارات آيل-18 في الاستجابات الضامة إلى الأسطح الممتصة لlysate. التالي ، ويهدف هذا الفحص كدراسة تمهيديه لتنشيط NF-κB المعتمدة علي TLR ، والبحوث اللاحقة باستخدام الضامة الاوليه ينصح لتوفير فهم أكثر اكتمالا وتمثيلا للتنشيط الضام والنمط الظاهري علي الأسطح المادية للفائدة.

يقيس ال [الفوسفاتيز] قلوية بشكل غير مباشر ال [نف-кB/ا-1] نشاط من المراسلة [بلبلسن]. ومع ذلك ، هناك العديد من مسارات الإشارات غير TLRs التي تنطوي علي NF-кB/AP-1 (علي سبيل المثال ، interleukin-1 مستقبلات [IL-1R]43 ومستقبل عامل نخر الورم [tnfr]44). ولذلك ، كان من الضروري تقييم مساهمه TLR2 و TLR4 الإشارات في زيادة NF-кB/AP-1 استجابه للأسطح الممتصة باستخدام اختبارات تثبيط (الشكل 3). وكان الأساس المنطقي لاختيار هذين السطحين TLRs هو ان ما لا يقل عن 23 DAMPs التي تم إظهارها للاشاره من خلال TLR2 و TLR445، بما في ذلك HMGB1 تتميز جيدا ، ويتم التعبير عن كل من المستقبلات علي سطح الخلية ويمكن ان تتفاعل مباشره مع السطح الإحيائي6. وأظهرت اختبارات تثبيط TLR2 و TLR4 انه عندما تم حظر TLR2 أو TLR4 الإشارات ، تم تخفيض الاستجابة NF-кb/AP-1 من الضامة مراسل لامتصاص محلله ، مشيرا إلى ان كلا المسارين متورطان. ومع ذلك ، كان هناك انخفاض ملحوظ في النشاط NF-кB/AP-1 عندما تم تحييد TLR2 الإشارات ، مما يوحي بان TLR2 قد تلعب دورا أساسيا في استجابه الضامة مراسل لامتصاص lysate. ونحن ندرك انه قد يكون هناك بعض تثبيط خارج الهدف مع المسار الإشارات TLR تحييد الأجسام المضادة ومثبطات. واستخدمت أضداد التحييد لكبح مسار TLR2 لأنه لم تكن هناك المتاحة تجاريا TLR2 جزيئات المثبط في وقت هذا العمل.

الطرق المعروضة هنا استخدام lysate, كمصدر معقد من DAMPs, و NF-κB/AP-1 مراسل الضامة كنموذج في المختبر للاستجابات الضامة لل DAMPs وغيرها من البروتينات كثف إلى حيوي البوليمريه (الشكل 1). نتوقع بروتوكول لدينا يمكن استخدامها لتحليل بسرعة NF-κB/AP-1 الردود والمنبع TLR إشارات من الضامة مراسل لمجموعه متنوعة من المواد (بما في ذلك المواد القابلة للتحلل ، السقالات المساميه أو هيدروجيل) وطبقات البروتين كثف (الشكل 3). ومع ذلك ، فان استخدام المواد المساميه والهيدروجيل سيدخل التعقيد داخل النظام ، لأنه قد يكون من الصعب التمييز بين الجزيئات الممتصة والجزيئات الرخوة. ونحن نتوقع أيضا ان هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهوله للتحقيق في مساهمه المسار الإشارات الأخرى المنبع NF-кb/AP-1 (علي سبيل المثال ، C-نوع مستقبلات يكتين46 و النيوكليوتيد ملزم النطاق الاقليه (إيماءه)-مثل مستقبلات47) مع مثبطات المناسبة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن مقارنه الاستجابة NF-κB/AP-1 من الضامة مراسل بين المواد المختلفة ، قدمت استجابات يتم تطبيع لنشاط خليه خط الأساس (اي الخلايا في وسائل الاعلام علي كل سطح مع عدم وجود بروتين الممتصة مسبقا) وجميع المواد لديها مستويات اندوتوكسين غير قابل للكشف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للتمويل التشغيلي من مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PTJ 162251) ، ولجنه البحوث الاستشارية التابعة لمجلس الشيوخ بجامعه الملكة ، ودعم البنية التحتية من صندوق جون ايفان للقيادة التابع للمؤسسة الكندية للابتكار (34137 المشروع 34137). وقد دعمت L.A.M. من قبل جامعه الملكة r. صموئيل ماكلولين الزمالة ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث الكندية جائزه الماجستير في المنح الدراسية الدراسات العليا والدراسات العليا في اونتاريو. ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور ميرون سيتشووك علي هديته السخية من الخط الخلوي "NF-κB/AP-1" و "Drs". مايكل بلينهاسيت وساندرا لورنزو لاستخدامها نظام التصوير هلام وقارئ لوحه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20, (2), 86-100 (2008).
  2. Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5, (1), 5-10 (1984).
  3. Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60, (3), 487-496 (2002).
  4. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81, (1), 1-5 (2007).
  5. McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, (11), 3792-3801 (2018).
  6. Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20, (2), 101-108 (2008).
  7. Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88, (4), 687-697 (2010).
  8. Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49, (83), 9618-9620 (2013).
  9. Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286, (42), 36532-36549 (2011).
  10. Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26, (34), 6811-6817 (2005).
  11. Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24, (5), 959-966 (2006).
  12. Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23, (4), 1055-1062 (2012).
  13. Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63, (8), 1173-1178 (2010).
  14. Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254, (2), 306-315 (2002).
  15. Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17, (10), 1141-1158 (2006).
  16. Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279, (9), 7370-7377 (2004).
  17. Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164, (2), 558-561 (2000).
  18. Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156, (6), 1149-1155 (2007).
  19. van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21, (6), 701-718 (1987).
  20. Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22, (8), 713-731 (1988).
  21. Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23, (6), 535-548 (1989).
  22. González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30, (4), 463-473 (1996).
  23. Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7, (2), 159-169 (1995).
  24. Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5, (1), 66-78 (2010).
  25. Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31, (13), 3479-3491 (2010).
  26. Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57, (3), 336-345 (2001).
  27. Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101, (9), 2740-2752 (2013).
  28. McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, (4), 1380-1390 (2015).
  29. Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280, (1), 101-107 (2012).
  30. Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5, (1), 45-54 (1995).
  31. Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25, (8), 1109-1115 (1999).
  32. Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29, (22), 6624-6633 (2013).
  33. Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
  34. Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, (34), 10673-10678 (2015).
  35. Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44, (2), 221-241 (1973).
  36. Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25, (11), 1397-1407 (1991).
  37. Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15, (10), 786-795 (1994).
  38. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33, (5), 443-454 (2010).
  39. Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98, (1), 132-143 (2015).
  40. Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170, (12), 6217-6223 (2003).
  41. Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17, (4), 1128-1140 (2016).
  42. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180, (11), 7147-7157 (2008).
  43. Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107, (1), 7-11 (2001).
  44. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281, (5381), 1305-1308 (1998).
  45. Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87, (6), 989-999 (2010).
  46. Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
  47. Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10, (4), 775-782 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics