Ein Makrophagen-Reporter-Zell-Assay zur Untersuchung der toll-like Receptor-vermittelten NF-kB/AP-1-Signalisierung auf adsorbierten Proteinschichten auf polymeren Oberflächen

Bioengineering

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Summary

Dieses Protokoll bietet Forschern eine schnelle, indirekte Methode zur Messung der TLR-abhängigen NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität in einer murinen Makrophagenzelllinie als Reaktion auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen und adsorbten Proteinschichten, die die Mikroumgebung des Biomaterials Implantate modellieren.

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McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).

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Abstract

Die anhaltende Entzündungswirtsreaktion auf ein implantiertes Biomaterial, die sogenannte Fremdkörperreaktion, stellt eine große Herausforderung bei der Entwicklung und Umsetzung biomedizinischer Geräte und Gewebetechnikkonstrukte dar. Makrophagen, eine angeborene Immunzelle, sind Schlüsselakteure in der Fremdkörperreaktion, weil sie während der Lebensdauer des Geräts an der Implantatstelle bleiben und häufig untersucht werden, um ein Verständnis dieser schädlichen Wirtsreaktion zu erlangen. Viele Biomaterialforscher haben gezeigt, dass adsorbierte Proteinschichten auf implantierten Materialien das Makrophagenverhalten beeinflussen und anschließend die Wirtsreaktion beeinflussen. Die Methoden in diesem Papier beschreiben ein In-vitro-Modell mit adsorbierten Proteinschichten, die zelluläre Schadensmoleküle auf Polymerbiomaterialoberflächen enthalten, um Makrophagenreaktionen zu bewerten. Als schnelles Verfahren zur indirekten Untersuchung der NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität als Reaktion auf komplexe adsorbierte Proteinschichten, die Blutproteine und schadensassoziierte molekulare Muster enthalten, wurden eine NF-B/AP-1-Makrophagen-Zelllinie und der zugehörige farbmetrische alkalische Phosphatase-Assay als schnelle Methode verwendet, um indirekt die Aktivität des NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktors als Reaktion auf komplexe adsorbierte Proteinschichten mit Blutproteinen und schadensassoziierten molekularen Mustern als Modell der komplexen adsorbierten Proteinschichten zu untersuchen, die auf biomaterialen Oberflächen in vivo gebildet wurden.

Introduction

Die Fremdkörperreaktion (FBR) ist eine chronische Wirtsreaktion, die sich negativ auf die Leistung eines implantierten Materials oder Geräts (z. B. Arzneimittelabgabegeräte, Biosensoren) auswirken kann, durch die anhaltende Freisetzung von Entzündungsmediatoren und durch Behinderung der Integration zwischen dem implantierten Material und dem umgebenden Gewebe1. Diese angeborene Immunantwort wird durch das Implantationsverfahren eingeleitet und zeichnet sich durch die langfristige Präsenz angeborener Immunzellen und faseriger Kapselbildung um das Implantat1aus. Im Kontext von materialbasierten Host-Antworten haben Makrophagen-Material-Wechselwirkungen einen signifikanten Einfluss auf den Verlauf der Host-Antwort und die Entwicklung eines FBR1. Makrophagen sind eine vielfältige angeborene Immunzellpopulation, die entweder aus geweberesidenten Makrophagenpopulationen oder aus dem Blut als monozytenabgeleitete Makrophagen an die Implantatstelle rekrutiert wird. Sie beginnen sich kurz nach der Implantation an der Implantatstelle anzusammeln und werden innerhalb weniger Tage zur vorherrschenden Zellpopulation in der Mikroumgebung des Implantats. Materialhafte Makrophagen, zusammen mit Fremdkörper-Riesenzellen (FBGC), die durch Makrophagenfusion gebildet werden, können an der Materialoberfläche über die Lebensdauer des Implantats2,3bestehen bleiben. Makrophagen gelten daher aufgrund ihrer Rolle bei der Orchestrierung der charakteristischen Schritte des FBR als Schlüsselakteure in der Fremdkörperreaktion: akute Entzündungsreaktion, Gewebeumbau und Bildung von fibrotischem Gewebe1.

Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind eine Familie von Mustererkennungsrezeptoren, die von vielen Immunzellen ausgedrückt werden, einschließlich Makrophagen, und haben gezeigt, dass eine bedeutende Rolle bei Entzündungen und Wundheilung spielen. Zusätzlich zu pathogenen Liganden sind TLRs in der Lage, endogene Moleküle, sogenannte damage-associated molecular patterns (DAMPs), zu binden, die während der Zellnekrose freigesetzt werden, und entzündliche Signalwege zu aktivieren, die zur Produktion von proinflammatorischen Zytokinen führen4. Wir und andere haben vorgeschlagen, dass Schäden, die während der Implantation von Weichgewebebiomaterial entstehen, DAMPs freisetzen, die dann zusätzlich zu Blutproteinen auf biomateriale Oberflächen adsorbieren und nachfolgende Zell-Material-Wechselwirkungen modulieren5,6. Wenn Makrophagen mit der adsorbierten Proteinschicht auf einem Implantat interagieren, können ihre Oberflächen-TLRs adsorbierte DAMPs erkennen und proinflammatorische Signalkaskade aktivieren, was zur Aktivierung des NF-B- und AP-1-Transkriptionsfaktors und zur Produktion von proinflammatorischen Zytokinen führt. Wir haben bereits gezeigt, dass murine Makrophagen die NF-B/AP-1-Aktivität und den Tumornekrosefaktor proinflammatorischezytokin) Sekretion als Reaktion auf DAMP-haltige adsorbierte Proteinschichten auf einer Vielzahl von polymeren Oberflächen im Vergleich zu Oberflächen mit nur adsorbiertem Serum oder Plasma (d. h. keine DAMPs vorhanden), und dass diese Reaktion weitgehend durch TLR2 vermittelt wird, während TLR4 eine geringere Rolle spielt5.

Die in diesem Protokoll verwendete Makrophagen-Zelllinie nF--B/AP-1-Reporter (Tabelle der Materialien) ist eine praktische Methode, um die relative NF-B- und AP-1-Aktivität in den Makrophagen5,7,8zu messen. In Kombination mit TLR-Signalweg-Inhibitoren ist diese Zelllinie ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der TLR-Aktivierung und ihrer Rolle bei Entzündungen als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen5,7,8. Die Reporterzellen sind eine modifizierte Mausmakrophagen-ähnliche Zelllinie, die bei NF-B und AP-1 Transkriptionsfaktoraktivierung9stabil abgesonderte embryonale alkalische Phosphatase (SEAP) erzeugen kann. Der kolorimetrische enzymatische alkalische Phosphatase-Assay (Materialtabelle) kann dann verwendet werden, um relative Mengen der SEAP-Expression als indirektes Maß für die NF-B/AP-1-Aktivität zu quantifizieren. Da NF-B und AP-1 nach geschaltet von vielen Zellsignalsignalpfaden sind, können neutralisierende Antikörper und Inhibitoren, die auf bestimmte TLRs (z. B. TLR2) oder TLR-Adaptermoleküle (z. B. MyD88) abzielen, verwendet werden, um die Rolle eines bestimmten Signalwegs zu überprüfen. Die in diesem Artikel beschriebene Methodik bietet einen einfachen und schnellen Ansatz zur Bewertung des Beitrags der TLR-Signalisierung in murinen Makrophagenreaktionen zu einer Vielzahl von polymeren Oberflächen mit adsorbierten Proteinschichten, die sowohl Blutproteine als auch DAMPs als In-vitro-Modell implantierter Biomaterialien enthalten.

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Protocol

1. Medien- und Reagenzienzubereitung

  1. Bereiten Sie Fibroblastenmedien vor. Kombinieren Sie 450 ml dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM), 50 ml fetales Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin/Streptomycin. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  2. Bereiten Sie Reporter Makrophagen Wachstumsmedien in 50 ml Aliquots. Kombinieren Sie 45 ml DMEM, 5 ml FBS, 5 g/ml Mykoplasma-Eliminationsreagenz (Materialtabelle) und 200 g/ml Phleomycin D1(Materialtabelle). Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  3. Bereiten Sie Reporter Makrophagen Assay Medien in 50 ml Aliquots. Kombinieren Sie 45 ml DMEM, 5 ml inaktivierte FBS (HI-FBS), 5 g/ml Mykoplasmen-Eliminationsreagenz und 200 g/ml Phleomycin D1. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.

2. Beschichtung von Zellkulturoberflächen mit Poly(Methylmethacrylat)

  1. Poly(Methylmethacrylat) (PMMA) in Chloroform bei 20 mg/ml (z. B. 100 mg PMMA in 5 ml Chloroform) in einer 20 ml Glasszintillationsdurchstechflasche auflösen. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in die Durchstechflasche und lassen Sie sie mindestens 2 h rühren, bis sich alle Feststoffe aufgelöst haben.
    ACHTUNG: Chloroform ist schädlich, wenn es eingeatmet wird. Achten Sie darauf, Lösungsmittel in einer Dunstabzugshaube zu verwenden, während Sie PVA-Handschuhe tragen.
  2. Pipette 400 l PMMA-Lösung in der Mitte eines Borosilikatglasmikroskop-Dias in einem Spincoater und Drehung bei 3000 U/min für 2 min. Bereiten Sie die Anzahl der für den Test erforderlichen Dias sowie 3-5 extra für die Wasserkontaktwinkelmessung vor. Lagern Sie Dias in einer sauberen Box (gesprüht und mit 70% Ethanol gewischt) für die zukünftige Verwendung.
    HINWEIS: Spin-Beschichtung wird oft verwendet, um eine dünne, gleichmäßige Beschichtung auf einer flachen Oberfläche abzulagern. Ein Spincoater dreht ein Substrat mit hohen Geschwindigkeiten und verteilt die Beschichtungslösung mit Zentrifugalkraft über die Oberfläche.
    1. Messen Sie den Wasserkontaktwinkel an zwei zufälligen Positionen auf der Oberfläche von extra beschichteten Dias (d. h. nicht die für die Zellkultur verwendeten Dias) mit einem Goniometer, um sicherzustellen, dass die Glasoberfläche vollständig mit dem Polymer beschichtet wurde.
      HINWEIS: Für Wasserkontaktwinkelmessungen sollte nur Wasser mit höchster Reinheit (z.B. Glas dreifach destilliert) verwendet werden.
  3. In einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) befestigen 8-Kammer-Haftbrunnen mit steriler Zange und aseptischer Technik an PMMA-beschichteten Dias. Drücken Sie fest auf die Oberseite der klebrigen Brunnen, um sicherzustellen, dass sie fest befestigt sind. Inkubieren Sie die Dias mit befestigten Klebebrunnen bei 37 °C über Nacht, um die Dichtung zu sichern.
    1. Testen Sie die Abdichtung der klebrigen Brunnen, indem Sie jedem Brunnen 200 L Zellkultur-Grade (endotoxinfreies) Wasser hinzufügen. Bei Raumtemperatur (RT) 60 min inkubieren und vor dem Fortfahren keine Leckage sicherstellen. Saugen Sie das Wasser, achten Sie darauf, die PMMA-Beschichtung nicht zu stören.
  4. Führen Sie endotoxinfreie Wasserwaschungen durch Zugabe von 300 l Endotoxin-freies Wasser zu jedem Brunnen und Inkubation für 1 h (dreimal), 12 h und 24 h vor der Verwendung, um alle verbleibenden Lösungsmittel zu entfernen.
  5. Testen Sie die Endotoxinkonzentration der Dias, die für die Zellkultur verwendet werden sollen. Inkubieren Sie 200 l Endotoxin-freies Reagenzwasser (Materialtabelle) in einem Brunnen jedes Dias für 1 h. Messen Sie die Endotoxinkonzentration im Extrakt mit einem Endpunkt chromogenen Endotoxin-Assay (Materialtabelle).
    HINWEIS: Das folgende Protokoll ist spezifisch für das Endotoxin-Assay-Kit, das in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist.
  6. Verwenden Sie für diese Arbeiten nur Wasser und Verbrauchsmaterialien (z.B. Pipettenspitzen, Mikrozentrifugenrohre und Brunnenplatten), die pyrogenfrei (d.h. endotoxinfrei) sind. Außerdem sollten alle Glaswaren, die bei der Herstellung der polymerbeschichteten Oberflächen verwendet werden, vor der Verwendung10mit trockener Wärmesterilisation (250 °C für 30 min) depyrogeniert werden. Die Messung von Endotoxin in der Extraktlösung, wie hier beschrieben, kann zu einer Unterschätzung von Endotoxin auf der Materialoberfläche11,12führen. Daher wird empfohlen, bei der Entwicklung eines Polymerbeschichtungsprotokolls die Endotoxin-Assay-Reaktion (d. h. die Schritte 2.5.4-2.5.6 für Prüfmuster [Reagenzwasser] oder Spike-Kontrollen) direkt in Brunnen durchzuführen, die die beschichtete Probe enthalten, um sicherzustellen, dass während des Beschichtungsprozesses versehentlich keine Endotoxinquellen in das System eingeführt werden.
    1. Alle Testproben (d. h. Extrakte) und Endotoxin-Assay-Reagenzien zu RT bringen. Chromogenes Reagenz im Testpuffer und Endotoxinstandard in Reagenzwasser rekonstituieren, 5 min auflösen lassen und vor der Verwendung sanft wirbeln. Bedecken Sie alle Flaschen mit Paraffinfolie, wenn sie nicht verwendet werden.
    2. Erstellen Sie eine Standardverdünnungskurve von 5 x 8 Punkten des Endotoxinstandards, die von der unteren bis zur oberen Grenze des Assays reicht, indem Sie eine serielle Verdünnung des Endotoxinstandards in Reagenzwasser durchführen.
    3. Zur Kontrolle der Verbesserung oder Hemmung des Endotoxin-Assays in Testproben, bereiten Sie eine positive Kontrolle (auch spike Control oder Spike-Probe genannt) durch Verdünnung einer bekannten Menge an Endotoxin in nicht verwendeten Testprobenlösung.
      HINWEIS: Die Konzentration der Positivkontrolle sollte die gleiche Konzentration wie bei einem Standard in der Mitte der Standardkurve sein. Liegt die wiedergewonnene Menge des Endotoxin-Spikes (d. h. die Konzentration der Positivkontrolle abzüglich der Konzentration der nicht gespickten Testprobe) innerhalb von 50 bis 200 % der Nominalkonzentration des Endotoxin-Spikes, kann davon ausgegangen werden, dass die Extraktionslösung den Test nicht wesentlich beeinträchtigt.
    4. Fügen Sie jedem Bohrwert einer 96-Well-Platte in doppelter oder dreifacher Ausführung 50 L Standards, Proben oder Spike-Steuerelemente hinzu. Verwenden Sie Reagenzwasser als Negativkontrolle.
    5. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l chromogenes Reagenz hinzu. Reagenz schnell in alle Brunnen geben. Verwenden Sie einen Timer, um die Zeit aufzuzeichnen, die zum Hinzufügen von Reagenz zu allen Brunnen benötigt wird. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebedichtung und brüten Sie bei 37 °C (die Inkubationszeit ist losabhängig und wird auf dem im chromogenen Reagenz-Kit enthaltenen Analysezertifikat angegeben). Alternativ können Sie die Platte während der Inkubation alle 15 min überprüfen, bis in allen Standardbrunnen ein Farbwechsel beobachtet wird.
    6. Nach der Inkubation 25 l 50 % Essigsäure in jeden Brunnen (Endkonzentration von 10 % Essigsäure pro Brunnen) hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Fügen Sie Essigsäure in der gleichen Reihenfolge hinzu, in der das chromogene Reagenz zugegeben wurde. Leseabsorption der Platte mit einem Plattenleser bei 405 nm. Anspirieren Flüssigkeit und Entsorgen Platte.
      HINWEIS: Essigsäure-Zugabe sollte die gleiche Zeit dauern, um zu jedem Brunnen hinzuzufügen, wie das chromogene Reagenz genommen (ca. 30 s).
  7. Ultraviolett (UV) sterilisieren die Dias 30 min vor Zellkulturexperimenten.

3. Beschichtung von Zellkulturoberflächen mit Polydimethylsiloxan

  1. Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 (Basis: Härtungsmittel) mischen. In einem biologischen Sicherheitsschrank, Pipette ca. 10 ml Polydimethylsiloxan Basis in ein steriles Rohr. Wiegen Sie das Rohr und fügen Sie langsam Aushärtungsmittel hinzu, bis 10% hinzugefügt wurde.
    ACHTUNG: Verwenden Sie PDMS-Reagenzien in einem gut belüfteten Bereich und vermeiden Sie Augenkontakt durch das Tragen einer Schutzbrille.
  2. Mischen Sie das Elastomer gründlich, indem Sie es mit einer sterilen serologischen Pipettenspitze rühren und nach oben und unten pfeifen. Fügen Sie ca. 200 l der Lösung zu jedem Brunnen einer 48-Well-Platte hinzu. Neigen Sie die Brunnenplatte langsam, um eine vollständige Abdeckung der Brunnen mit Elastomerlösung zu gewährleisten.
  3. Die Brunnenplatte mit Elastomer in einen Vakuumofen auf 50 cmHg, 40 °C legen. Entfernen Sie den Deckel und decken Sie ihn mit einem einpolsterigen Wischabbild ab, um zu verhindern, dass andere Trümmer in die Brunnen fallen. Mindestens 48 h inkubieren lassen.
    1. Bestätigen Sie, dass die Brunnen durch Sichtprüfung vollständig beschichtet sind. Stellen Sie sicher, dass das Elastomer vollständig gehärtet ist, indem Sie es vor dem Entfernen vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze antreiben.
  4. Fügen Sie 300 l 70% Ethanol (hergestellt mit absolutem Ethanol und Endotoxin-freiem Wasser) hinzu und brüten bei RT für 1 h. Entfernen Sie das Ethanol und führen Sie Endotoxin-freie Wasserwashes durch, indem Sie jedem Brunnen 300 l Endotoxin-freies Wasser hinzufügen und 1 h (dreimal), 12 h, 12 h inkubieren. und 24 h vor der Verwendung, um alle verbleibenden Lösungsmittel zu entfernen.
    1. Inkubieren Sie 200 l Endotoxinfreies Wasser in drei Brunnen jeder Platte für 1 h. Messen Sie die Endotoxinkonzentration der Wasserextrakte mit einem Endpunkt chromogenen Endotoxin-Assay (Schritte 2.5.1-2.5.6).

4. Beschichtung von Zellkulturoberflächen mit fluoriertem Poly (Tetrafluorethylen)

  1. Machen Sie eine 1 mg/ml Lösung aus fluoriertem Poly (Tetrafluorethylen) (fPTFE) (z. B. 10 mg fPTFE zu 10 ml fluoriertem Lösungsmittel [Materialtabelle]) in einer 20 ml Glasszintillationsdurchstechflasche hinzufügen. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in die Durchstechflasche und lassen Sie sie mindestens 24 h rühren, bis sich alle Feststoffe aufgelöst haben.
  2. Fügen Sie ca. 150 l der Polymerlösung zu jedem Brunnen einer Polystyrol-48-Well-Platte hinzu (d. h. nicht gewebekultur behandelt). Neigen Sie die Wellplatte langsam, um eine vollständige Abdeckung aller Brunnen mit Polymerlösung zu gewährleisten. Deckel ersetzen.
    1. Um eine effektive fPTFE-Beschichtung von Brunnen zu gewährleisten, sollten Glasabdeckungen in fPTFE beschichtet und für die Wasserkontaktwinkelmessung verwendet werden (Schritt 4.3.1). Legen Sie Deckellippen in die Brunnen einer 24-Well-Platte. Fügen Sie ca. 400 l der Polymerlösung zu jedem Brunnen hinzu, der einen Abdeckschlupf enthält. Drücken Sie die Abdeckungen mit sterilen Zangen nach unten, um sicherzustellen, dass sie vollständig mit Polymerlösung bedeckt sind, und bedecken Sie die Wellplatte mit einem Deckel.
  3. Die Wellplatte mit Polymerlösung und/oder Decklippen in einen Vakuumofen auf 50 cmHg, 40 °C legen. Entfernen Sie den Deckel und decken Sie ihn mit einem einpolsterigen Wischabbild ab, um zu verhindern, dass andere Trümmer in die Brunnen fallen. Mindestens 48 h inkubieren lassen.
    1. Messen Sie den Wasserkontaktwinkel von fPTFE-beschichteten Abdeckungen mit einem Goniometer, um eine effektive Beschichtung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Für Wasserkontaktwinkelmessungen sollte nur Wasser mit höchster Reinheit (z.B. Glas dreifach destilliert) verwendet werden.
  4. Fügen Sie 300 l 70% Ethanol (hergestellt mit absolutem Ethanol und Endotoxin-freiem Wasser) hinzu und brüten bei RT für 1 h. Entfernen Sie das Ethanol und führen Sie Endotoxin-freie Wasserwashes durch, indem Sie jedem Brunnen 300 l Endotoxin-freies Wasser hinzufügen und 1 h (dreimal), 12 h, 12 h inkubieren. und 24 h vor der Verwendung, um alle verbleibenden Lösungsmittel zu entfernen.
    1. Inkubieren Sie 200 l Endotoxinfreies Wasser in drei Brunnen jeder Platte für 1 h. Messen Sie die Endotoxinkonzentration von Wasserextrakten mit einem Endpunkt chromogenen Endotoxin-Assay (Schritte 2.5.1-2.5.6).
  5. UV sterilisieren die Brunnenplatten für 30 min vor Zellkulturexperimenten.

5. Lysat aus 3T3-Zellen herstellen

  1. Wachsen Sie 3T3-Zellen in mehreren T150-Flaschen zu 70% Zusammenfluss. Um Zellen zu lösen, aspirieren Sie Medien, waschen Sie die Oberfläche mit 5 ml PBS und aspirieren PBS. 5 ml tierursprungsfreies, rekombinantes Zelldissoziationsenzym (Materialtabelle) hinzufügen und bei 37 °C für 3 x 5 min inkubieren.
  2. Lösen Sie Zellen, indem Sie den Kolben sanft hin und her kippen. Fügen Sie 5 ml PBS hinzu, um das rekombinante Enzym zu neutralisieren, das für die Zelldissoziation verwendet wird. Die abgetrennten Zellen aus den Kolben in ein Zentrifugenrohr übertragen und über Pipettieren mischen. Führen Sie eine Live-Zellzahl mit einem Hämozytometer und zelllebensfähigkeitsfärben.
    HINWEIS: Ein Zelldissoziationsenzym, das durch Verdünnung in PBS neutralisiert werden kann, wurde ausgewählt, um die Einführung von serumbasierten Proteinen in die Lysatzubereitung zu vermeiden. Wenn Trypsin verwendet wird, um Zellen zu dissoziieren, sollte es mit einer serumhaltigen Lösung neutralisiert werden, und eine zusätzliche PBS-Wäsche sollte durchgeführt werden, um die Menge an Serumproteinen zu reduzieren, die in die Lysatzubereitung übertragen werden.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen im ursprünglichen Volumen (d. h. 10 ml x Anzahl der Kolben) von PBS ab, um alle verbleibenden Medien abzuwaschen. Wiederholen.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min wieder bei 200 x g und aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie das Volumen von PBS hinzu, das erforderlich ist, um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Legen Sie die Zelllösung in einen -80 °C-Gefrierschrank, bis die Probe vollständig eingefroren ist (mindestens 2 h).
  5. Zelllösung in einem 37 °C-Wasserbad auftauen. Nach dem vollständigen Auftauen die Lösung wieder in den -80 °C-Gefrierschrank geben, bis sie vollständig gefroren ist. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Gefrier-Tau-Zyklen.
  6. Führen Sie einen Mikro-Bicinchoninsäure-Assay (BCA) auf die Zelle Lysat bei einer Vielzahl von Verdünnungen (z. B. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) durch, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Das Zelllysat auf eine Proteinkonzentration von 468,75 g/ml, aliquot verdünnen und bei -80 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
    HINWEIS: Die endgültige Proteinkonzentration in einer 48-Well-Platte beträgt 125 g/cm2 (basierend auf der Oberfläche eines Brunnens, 0,75 cm2).
  7. Führen Sie einen Western-Blot durch, um das Vorhandensein von DAMPs in Lysat (z. B. Hitzeschockprotein 60 [HSP60], Gruppe mit hoher Mobilität 1 [HMGB1]) zu bewerten, indem Sie 40 bis 60 g Lysatprotein im Ladepuffer auf ein 1,5 mm dickes 10% Polyacrylamid-Gel laden und dem Standard-Western-Blot folgen. Verfahren.

6. Bewertung der Wirkung von adsorbierten Proteinschichten und gebührenähnlichen Rezeptoren auf die NF-B-Aktivität von Makrophagen

HINWEIS: Einen Schaltplan des experimentellen Workflows und des Plattenlayouts finden Sie in Abbildung 1A bzw. In Ergänzungsabbildung 1.

  1. Wachsen Sie Reporter-Makrophagen in einem entsprechend großen Kolben zu 70% Zusammenfluss. Aspirate-Medien, Waschfläche mit PBS und Aspirieren PBS. Fügen Sie das rekombinante Zelldissoziationsenzym hinzu und brüten Bei 37 °C für 8 min.
  2. Lösen Sie Zellen, indem Sie fest auf die Seiten des Kolbens tippen. Inaktivieren Sie das rekombinante Zelldissoziationsenzym, indem Sie ein gleiches Volumen an Wachstumsmedien (mit 10% FBS) hinzufügen. Führen Sie eine Live-Zellzahl mit einem Hämozytometer und zelllebensfähigkeitsfärben.
    HINWEIS: Die erwartete Lebensfähigkeit des Reporters Makrophagen nach einer 8 min Inkubation im Zelldissoziationsenzym beträgt 90%.
  3. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Überstand und resuspendieren im ursprünglichen Volumen von PBS, um Zellen zu waschen. Zentrifugieren und wieder zusetzen Zellen bei 7,3 x 105 Zellen/ml in Assay-Medien (mit wärmeinaktiviertem FBS).
  4. Separate Zellsuspension in 3 verschiedene Röhren: TLR4-Hemmer, Anti-TLR2, und unbehandelt. Inkubationszellen mit 1 g/ml TLR4-Inhibitor für 60 min bei RT oder mit 50 g/ml Anti-TLR2 für 30 min bei RT.
  5. Fügen Sie 200 l Lysat, 10% FBS, 10% kommerzielles Mausplasma(Materialtabelle) oder eine Mischung der Proteinlösungen zu einer 48-Well-Platte (oder gleichwertig) hinzu und lassen Protein emittieren bei 37 °C für die gewünschte Zeit (d. h. 30 min, 60 min oder 24 h). Saugen Sie Proteinlösungen aus Brunnen, mit einer frischen Pasteur Pipette für jede Proteinlösung, und waschen Sie Oberflächen mit 250 l PBS für 5 min. Aspirate PBS. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Wähbe.
    HINWEIS: Dieser Schritt muss möglicherweise früher im Protokoll gestartet werden, abhängig von der gewünschten Adsorptionszeit. Passen Sie das Protokoll entsprechend an.
  6. Nach der Inkubationszeit mit dem TLR4-Inhibitor oder Anti-TLR2, Pipettenzellen wieder aussetzen. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L Zelllösung hinzu.
  7. Fügen Sie für die TLR2-Positivkontrollbedingung Pam3CSK4 zu einer Endkonzentration von 150 ng/ml hinzu. Für TLR4-Positivkontrollzustand lipopolysaccharid (LPS) zu einer Endkonzentration von 1,5 g/ml hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C für 20 h.
  8. Probe 20 l Überstand aus jedem Brunnen und Platte in Duplikat in eine 96-Well-Platte. Schließen Sie drei Bohrungen von 20 L Assay-Medien als Hintergrundsteuerung ein. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L SEAP-Reporter-Assay-Reagenz hinzu. Die Platte mit einer Klebedichtung bedecken und 2,5 h bei 37 °C bebrüten.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Versuchsbedingungen variieren und sollte für einen starken Unterschied in der Absorption zwischen positiven und negativen Kontrollbrunnen optimiert werden.
    1. Übertragen Sie den Rest des Überstandes auf ein 1,5 ml Rohr (pro Brunnen). Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min, um Schmutz zu pellet. Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr übertragen und bei -80 °C lagern. Analysieren Sie Überstand auf das Vorhandensein von proinflammatorischen Zytokinen (z. B. TNF-, Interleukin 6) über enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA).
  9. Entfernen Sie die Klebeplattendichtung. Leseabsorption der Platte mit einem Plattenleser bei 635 nm. Anspirieren Flüssigkeit und Entsorgen Platte.

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Representative Results

Die Reinigungsverfahren für die polymerbeschichteten Oberflächen wurden getestet, um sicherzustellen, dass es keine Unterbrechung der Beschichtung gibt, was als Änderung des Wasserkontaktwinkels zu einem unbeschichteten Glasdeckel angesehen werden würde (Abbildung 2). Einweichende PMMA-beschichtete Mikroskopschlitten in 70% Ethanol für 1 h wurden gefunden, um die PMMA-Beschichtung zu entfernen(Abbildung 2, linke s)), wahrscheinlich aufgrund der Löslichkeit von PMMA in 80 Gew. Ethanol13, daher wurden PMMA-beschichtete Oberflächen allein mit 30 min UV-Sterilisation gereinigt. Die Konzentration von PMMA für die Beschichtung wurde zuvor optimiert5. Zur Reinigung von PDMS wurde ein Ethanoleinweichen von 1 h 70% verwendet, und die UV-Sterilisation wurde vernachlässigt, da UV-Licht Kettensprosssion verursachen und die Oberflächenbenetzungseigenschaften von PDMS14beeinflussen kann. Sowohl die 70%-Ethanol-Einweichung als auch die UV-Sterilisation hatten keinen Einfluss auf den Wasserkontaktwinkel von fPTFE-beschichteten Abdeckungen(Abbildung 2, rechte Stellweite), daher wurden die beiden Methoden nacheinander zur Reinigung von fPTFE-Beschichtungen eingesetzt. Das Verfahren der fPTFE-Beschichtung wurde zuvor von der Grainger-Gruppe15beschrieben.

Ein Western-Blot wurde auf dem 3T3-Lysat durchgeführt, um sicherzustellen, dass DAMP-Arten in der komplexen molekularen Mischung vorhanden waren. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl HMGB1 als auch HSP60, zwei gut dokumentierte DAMPs16,17, im Lysat vorhanden waren (Abbildung 1B). Die Adsorption von TLR-Liganden aus dem Lysat auf die Polymeroberflächen wurde durch kultivierende Reportermakrophagen (unbehandelt, TLR2 neutralisiert oder TLR4 gehemmt) für 20 h auf proteinadsorbierten Polymeroberflächen (d. h. gewebekulturbehandeltes Polystyrol [TCPS], PMMA, PDMS, fPTFE) und anschließend indirekt die NF-B/AP-1-Aktivität anhand einer seaP-Produktion anhand eines enzymatischen Assays(Abbildung 1C und Abbildung 3) zu bewerten. Darüber hinaus hatten die Reportermakrophagen die NF-B/AP-1-Aktivität auf adsorbiertem Lysat im Vergleich zu adsorbiertem FBS oder Plasma signifikant erhöht und kein voradsorbiertes Protein (Medien)(Abbildung 4). TLR Liganden synthetische triacylierte Sobpeptid (Pam3CSK4, TLR2 Ligand) und Lipopolysaccharid (LPS, TLR4 Ligand) wurden als positive Kontrollen zur Bestätigung des Antikörpers oder Inhibitors enthalten und der Assay funktionierte ordnungsgemäß. Die TLR2-Neutralisation hatte eine deutlich stärkere Reduktion der NF-B/AP-1-Antwort von Reportermakrophagen auf adsorbiertes Lysat im Vergleich zur TLR4-Hemmung. Außerdem induzierten kleine Mengen lysatverdünnt in Serum (basierend auf dem Gesamtprotein) signifikant erhöhte NF-B/AP-1-Antwort im Vergleich zu Serum allein, wobei die niedrigste effektive Verdünnung von der Polymeroberfläche abhängt (Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit der adsorbierten Lysat-abgeleiteten Moleküle bei der Induktion der TLR-abhängigen NF-B/AP-1-Aktivität in Reportermakrophagen auf einer Vielzahl von polymeren Oberflächen.

Figure 1
Abbildung 1: Methoden und Ergebnisse für den alkalischen Phosphatase-Assay von NF-B/AP-1-Reportermakrophagen auf TCPS, PMMA, PDMS und fPTFE. (A) Diagramm des Arbeitsablaufs für den Reporter Makrophagen alkalische Phosphatase Assay. (B) Western-Blot Lysat, der das Vorhandensein der DAMP-Arten HMGB1 und HSP60 bestätigt, wobei die Ladekontrolle von A-Actin ist. (C) NF-B/AP-1-Aktivität (dargestellt durch Absorption) von Reportermakrophagen, die auf Medien kultiviert wurden (negative Kontrolle), 10% FBS, Lysat und Pam3CSK4 (TLR2-Liganden, Positivkontrolle) für 20 h. Die Daten zeigen die Ergebnisse eines Experiments und sind repräsentativ für die Ergebnisse von mindestens 2 separaten Experimenten, die als mittlere Standardabweichung (SD) dargestellt werden. Jedes Experiment verwendet n = 3 separate Brunnen pro Bedingung, und jeder Brunnen wurde in Duplikat für den enzymatischen Assay plattiert. Analysiert mit einwegigem ANOVA- und Tukey-Test. p < 0,001. Diese Figur wurde mit Genehmigung von McKiel und Fitzpatrick5angepasst. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Optimierung der Reinigungsmethoden für PMMA- und fPTFE-beschichtete Oberflächen, bewertet anhand des Wasserkontaktwinkels (WCA). Die Messungen wurden an 2 separaten Stellen mit mindestens 3 Abdeckungen durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert sD dargestellt. Analysiert mit einwegigem ANOVA- und Tukey-Post-hoc-Test. * p < 0,05. Diese Figur wurde mit Genehmigung von McKiel und Fitzpatrick5angepasst. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: TLR-vermittelte NF-B/AP-1-Aktivität (dargestellt durch Absorption) von Reportermakrophagen, die auf 10% FBS (Kontrolle), Lysat und Positiverkontrolle für 20 h kultiviert werden. (A) Einfluss der TLR2-Neutralisation auf Diek-Makrophagen-Antworten auf adsorbiertes Lysat. Positivkontrolle ist Pam (Pam3CSK4, TLR2 Ligand). (B) Einfluss der TLR4-Hemmung auf die Reaktion der Reportermakrophagen auf adsorbiertes Lysat. Positivkontrolle ist LPS (TLR4 Ligand). Die Daten zeigen die Ergebnisse eines Experiments und sind repräsentativ für die Ergebnisse von mindestens 2 separaten Experimenten, die als mittelwert -SD dargestellt werden. Jedes Experiment verwendet n = 3 separate Brunnen pro Bedingung, und jeder Brunnen wurde in Duplikat für den enzymatischen Assay plattiert. Analysiert mit einwegigem ANOVA- und Tukey-Test. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Diese Figur wurde mit Genehmigung von McKiel und Fitzpatrick5angepasst. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: NF-B/AP-1-Aktivität (dargestellt durch Absorption) von Reportermakrophagen, die auf Medien kultiviert werden (negative Kontrolle), 30 min und 24 h adsorbierten Proteinschichten und Pam3CSK4 (positive Kontrolle) auf TCPS für 20 h. Die Daten werden aus 3 separaten Experimenten kombiniert und als mittelwerter SD dargestellt. Jedes Experiment verwendet n = 3 separate Brunnen pro Bedingung, und jeder Brunnen wurde in Duplikat für den enzymatischen Assay plattiert (d.h. n = 9 nicht-unabhängige ZellkulturBrunnen und n = 18 nicht-unabhängige enzymatische Assay-Brunnen). Analysiert mit einwegigem ANOVA- und Tukey-Test. p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Reportermakrophage-NF-B/AP-1-Aktivität (dargestellt durch Absorption) nach 20 h als Reaktion auf Verdünnungen von Lysat in FBS (Gesamtprotein = 280 g/well), die 30 min lang auf Polymeroberflächen adsorbiert werden. (A) TCPS. (B) PMMA. (C) PDMS. (D) fPTFE. Die Daten zeigen die Ergebnisse eines Experiments und sind repräsentativ für die Ergebnisse von mindestens 2 separaten Experimenten, die als mittelwert -SD dargestellt werden. Jedes Experiment verwendet n = 3 separate Brunnen pro Bedingung, und jeder Brunnen wurde in Duplikat für den enzymatischen Assay plattiert. Analysiert mit einwegigem ANOVA- und Tukey-Test. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Diese Figur wurde mit Genehmigung von McKiel und Fitzpatrick5angepasst. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplemental Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Beispiellayouts für NF--B/AP-1-Reporter-Makrophagenzellkultur-Assay in 8-Kammer- und 48-Well-Plattenformaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Ein Schwerpunkt unseres Labors ist die Wirtsreaktion auf Feststoff-Weichteilimplantate und insbesondere, wie sich die zellulären Schäden, die während des Implantationsverfahrens entstehen, auf die Wirtsreaktion auswirken. Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt vorläufige Experimente mit einer Reporter-Makrophagen-Zelllinie und in vitro-generiertem DAMP-haltigem Zelllysat, um den Einfluss von Molekülen zu untersuchen, die während zellulärer Schäden (d. h. aus der Implantatchirurgie) auf Makrophagenreaktionen auf Biomaterialien freigesetzt werden. Fibroblastenzelllysat wurde verwendet, um die zellulären Schäden und Freisetzung von DAMPs aufgrund der Biomaterialplatzierung zu modellieren. Fibroblasten wurden ausgewählt, um das Lysat wegen der Prävalenz von Fibroblasten in Weichgewebe zu erstellen, sowie ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen zu sezernieren, einschließlich Fibronectin18. Freeze-Thaw-Zyklus wurde als Die Methode der Lyse gewählt, um sowohl intrazelluläre als auch ECM-abgeleitete DAMPs zu produzieren, ähnlich wie in der Implantatumgebung. Protease-Inhibitoren wurden nicht verwendet, um dieses Lysat zu machen. Während unkontrollierte Zelllyse wie Gefriertau-Zyklus zur Freisetzung von Proteasen führen kann, die DAMPs abbauen können, würden diese Enzyme wahrscheinlich auch in der Biomaterialimplantat-Umgebung vorhanden sein, wenn Zellen während des Implantationsverfahrens geschädigt werden. Das Vorhandensein von DAMPs in der komplexen molekularen Mischung des Lysats wurde durch Western Blot bestätigt (Abbildung 1B; HMGB1 und HSP60) und SEAP-Reporter-Assay (Abbildung 1C; NF-B/AP-1-Aktivität als Reaktion auf adsorbiertes Lysat). Wir haben auch Assays durchgeführt, bei denen Lysat in FBS auf der Grundlage der Gesamtproteinkonzentration verdünnt und auf Zellkulturoberflächen adsorbiert wurde (Abbildung 5), um die Komplexität der Implantatumgebung besser widerzuspiegeln, da es eine Fülle von Blutproteinen sowie DAMPs6enthalten wird. Die NF-B/AP-1-Aktivität des Reporters blieb bei adsorbierten Schichten aus lysatverdünntem Lysat in FBS signifikant erhöht, und die niedrigste Verdünnung, um eine signifikante Aktivierung zu erzielen, war oberflächenabhängig, von 0,1% (TCPS) bis 10% (PDMS und fPTFE).

Die Polymere PMMA, PDMS und PTFE wurden für diese Arbeit ausgewählt, weil sie nicht abbaubar sind und in der Literatur ausgiebig verwendet wurden, um die Proteinadsorption und Makrophagenreaktion auf Biomaterialien19,20,21,22,23,24,25zu bewerten. TCPS wurde auch für den Vergleich verwendet, da es ein gemeinsames Substrat für In-vitro-Makrophagen und TLR-Signalarbeit21,26,27,28verwendet wird. Die in unserer Arbeit verwendeten Materialien sind repräsentative Beispiele für nicht abbaubare, feste Biomaterialien. Allerdings könnten viele andere Materialien mit diesem Modell verwendet werden, vorausgesetzt, das Material kann auf Zellkulturplatten oder Mikroskopschlitten beschichtet und ordnungsgemäß dekontaminiert werden. Die Makrophagen-Zelllinie des NF-B/AP-1-Reporters wurde für dieses In-vitro-Modell ausgewählt, da sie eine schnelle, indirekte Messung der NF-B/AP-1-Aktivität durch die induzierbare Expression von SEAP durch NF-B/AP-1 ermöglicht. NF-B/AP-1-Reportermakrophagen erfordern die Verwendung von Phleomycin D1 in den Kulturmedien als selektives Antibiotikum, um sicherzustellen, dass nur Zellen mit dem induzierbaren SEAP-Gen NF-B/AP-1 vorhanden sind29. Für den alkalischen Phosphatase-Assay ist es wichtig, HI-FBS in den Zellkulturmedien zu verwenden, um potenzielle falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, die durch alkalische Phosphatasen im Serum erzeugt werden. Unsere bisherigen Untersuchungen legen nahe, dass FBS-adsorbierte Oberflächen kein nachweisbares falsch positives Ergebnis erzeugen, wahrscheinlich weil die Serummoleküle stark an die Kulturoberfläche adsorbiert werden und nicht in den Überstand freigesetzt werden. Der Kulturzeitpunkt für die Reportermakrophagen (20 h), der Assay-Inkubationszeitpunkt (2,5 h) und die Absorptions-Lesewellenlänge (635 nm) für den alkalischen Phosphatase-Assay wurden mit diesem System optimiert, um robuste und reproduzierbare Messungen für alle Bedingungen zu gewährleisten.

Ein anfänglicher Proteinadsorptionszeitpunkt von 30 min wurde für diese Arbeit aufgrund seiner häufigen Verwendung in der Proteinadsorptionsliteratur gewählt (Abbildung 1C)30,31,32,33,34. Wir haben jedoch auch längere Adsorptionszeiten (d. h. 60 min und 24 h, Abbildung 4) untersucht, um die adsorbierte Proteinschicht besser darzustellen, die Makrophagen mit in vivo interagieren würden, was wahrscheinlich 4 bis 24 h nach der Implantation1auftreten wird. Es wurde postuliert, dass die Mehrheit der Proteinadsorption und des Austauschs in den ersten 60 min der Exposition gegenüber einer Oberfläche26,35,36auftritt, daher kann eine 60 min Adsorptionszeit ein relevanterer Zeitpunkt sein. Wir haben auch von der Verwendung von FBS als Negativkontrolle für das Vorhandensein von DAMPs in der adsorbierten Proteinschicht zu kommerziellem Mausplasma übergegangen. Die Begründung für die Verwendung von Plasma anstelle von Serum ist, dass Plasmaproteine bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der Proteinadsorption und Makrophagenreaktion1spielen und dass Plasma eine bessere Darstellung der Proteine in der Wundumgebung bietet. Plasma, das in Proteinadsorptionsexperimenten verwendet wird, wird üblicherweise als 1-10%ige Verdünnung26,36,37, hergestellt, was unsere Verwendung von 10% Plasma motivierte. Menschliches Plasma wird häufigverwendet 26,36, da es einfacher ist, in großen Mengen zu erhalten und klinisch relevanter, im Vergleich zu Mausplasma. Wir haben uns jedoch dafür entschieden, kommerzielles Mausplasma in diesem Modell zu verwenden, um die Art der Proteinlösungen mit der der Reporterzellen in Einklang zu halten.

Die Verwendung der Reporter-Makrophagen-Zelllinie führte zu einigen Einschränkungen innerhalb der Studie. Erstens hat die Verwendung einer murinen leukämischen Makrophagenzelllinie inhärente Einschränkungen, da der Phänotyp und das Verhalten von primären Makrophagenkulturen abweichen können. Während diese Einschränkung in zukünftigen Arbeiten mit primären Makrophagen behandelt wird, wurde gezeigt, dass die elterliche Makrophagenzelllinie die von Knochenmark abgeleiteten Makrophagen der Maus in Bezug auf ihre Zelloberflächenrezeptoren und die Reaktion auf mikrobielle Liganden für TLRs 2, 3 und 438genau imitiert. Darüber hinaus lieferten die NF-B/AP-1-Reportermakrophagen ähnliche Ergebnisse als Reaktion auf HMGB1- und LPS-Stimulation im Vergleich zu peritonealen primären murinen Makrophagen39. Es sollte beachtet werden, dass die NF--B/AP-1 Reporter-Makrophagen und ihre elterliche Belastung Nicht TLR540ausdrücken. Forscher haben gezeigt, dass HMGB1 in der Lage war, NF-B-Transkriptionsfaktoren über die TLR5-Signalwege in HEK-293-Zellen stabil mit dem menschlichen TLR541transfiziert zu aktivieren. Daher wurde der Beitrag der HMGB1-TLR5-Signalisierung zur Gesamtaktivität von NF-B auf lysatbeschichteten Oberflächen in diesem Modell vernachlässigt. Darüber hinaus drücken die Reportermakrophagen und ihre elterliche Belastung das ASC-Adapterprotein nicht aus und bilden daher nicht die meisten Arten von Entzündungsflözen und können inaktive IL-1" oder inaktive IL-18 nicht zu ihren reifen Formen verarbeiten42. Daher berücksichtigt das modell, das wir verwendet haben, nicht den Beitrag der ASC-abhängigen Entzündungsaktivität und der nachfolgenden autokrinen IL-1- und IL-18-Signalisierung in Makrophagenreaktionen auf Lysat-adsorbierten Oberflächen. Folglich ist dieser Test als eine vorläufige Untersuchung der TLR-abhängigen NF-B-Aktivierung gedacht, und nachfolgende Forschung mit primären Makrophagen wird empfohlen, um ein vollständigeres und repräsentativeres Verständnis der Makrophagenaktivierung und des Phänotyps auf materialbasierten Oberflächen von Interesse zu vermitteln.

Der alkalische Phosphatase-Assay misst indirekt die NF-B/AP-1-Aktivität der Reportermakrophagen. Es gibt jedoch viele andere Signalwege als TLRs, die NF-B/AP-1 beinhalten (z. B. Interleukin-1-Rezeptor [IL-1R]43 und Tumornekrosefaktorrezeptor [TNFR]44). Daher war es notwendig, den Beitrag der TLR2- und TLR4-Signalisierung in der erhöhten NF-B/AP-1-Antwort auf Lysat-adsorbierte Oberflächen mit Inhibitionstests zu bewerten (Abbildung 3). Die Begründung für die Auswahl dieser beiden Oberflächen-TLRs war, dass mindestens 23 DAMPs, die nachweislich über TLR2 und TLR445signalisieren, einschließlich des gut charakterisierten HMGB1, und beide Rezeptoren auf der Zelloberfläche exprimiert werden und direkt mit der Biomaterialoberfläche6interagieren können. Die TLR2- und TLR4-Hemmungstests zeigten, dass bei blockierter TLR2- oder TLR4-Signalisierung die NF-B/AP-1-Antwort des Reportermakrophagens auf adsorbiertes Lysat reduziert wurde, was darauf hindeutet, dass beide Wege beteiligt sind. Allerdings gab es eine deutlich größere Verringerung der NF-B/AP-1-Aktivität, wenn die TLR2-Signalisierung neutralisiert wurde, was darauf hindeutet, dass TLR2 eine primäre Rolle bei der Reaktion von Reportermakrophagen auf adsorbiertes Lysat spielen könnte. Wir erkennen an, dass es eine gewisse Off-Target-Hemmung mit dem TLR-Signalweg zur Neutralisierung von Antikörpern und Inhibitoren geben kann. Ein neutralisierender Antikörper wurde verwendet, um den TLR2-Signalweg zu hemmen, da es zum Zeitpunkt dieser Arbeit keine kommerziell erhältlichen TLR2-Inhibitormoleküle gab.

Die hier vorgestellten Methoden verwenden Lysat als komplexe Quelle von DAMPs und NF-B/AP-1-Reportermakrophagen als In-vitro-Modell für Makrophagenreaktionen auf DAMPs und andere Proteine, die auf polymere Biomaterialien adsorbiert wurden (Abbildung 1). Wir gehen davon aus, dass unser Protokoll verwendet werden kann, um Schnell NF-B/AP-1-Antworten und vorgelagerte TLR-Signalisierung von Reportermakrophagen auf eine Vielzahl von Materialien (einschließlich abbaubarer Materialien, poröse Gerüste oder Hydrogele) und adsorbierten Proteinschichten(Abbildung 3) zu analysieren. Die Verwendung von porösen Materialien und Hydrogelen wird jedoch zu Komplexität innerhalb des Systems führen, da es schwierig sein kann, zwischen adsorbierten Molekülen und eingeschlossenen Molekülen zu unterscheiden. Wir gehen auch davon aus, dass dieses Protokoll leicht angepasst werden kann, um den Beitrag anderer Signalwege vor NF-B/AP-1 (z. B. C-Typ-Lektinrezeptoren46 und Nukleotid-bindende Oligomerisierungsdomäne (NOD)-ähnliche Rezeptoren47) mit den entsprechenden Inhibitoren zu untersuchen. Darüber hinaus könnte die NF-B/AP-1-Antwort von Reportermakrophagen zwischen verschiedenen Materialien verglichen werden, vorausgesetzt, die Reaktionen werden auf die Basiszellaktivität normalisiert (d. h. Zellen in Medien auf jeder Oberfläche ohne voradsorbiertes Protein) und alle Materialien haben nicht nachweisbare Endotoxinspiegel.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren würdigen die operative Finanzierung durch das Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), das Queen es University Senate Advisory Research Committee und die Infrastrukturunterstützung durch den Leadership Fund der Canadian Foundation for Innovation John Evan (Projekt 34137) und den Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Projekt 34137). L.A.M. wurde von einem Queen es University R. Samuel McLaughlin Fellowship, einem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Canadian Graduate Scholarship Master es Award und einem Ontario Graduate Scholarship unterstützt. Die Autoren danken Dr. Myron Szewczuk für sein großzügiges Geschenk der NF-B/AP-1 Reporter Makrophagenzelllinie und Drs. Michael Blennerhassett und Sandra Lourenssen für den Einsatz ihres Gel-Bildgebungssystems und Plattenlesers.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48

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