मूत्राशय भरने के दौरान सुब्रुरोथलियम तक सीधी पहुंच के लिए डिट्रूसेर मांसपेशी के साथ एक विकेंद्रीकृत (पूर्व वीनो) मूत्राशय मॉडल हटाया गया

Medicine

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Summary

डिट्रूसर-मुक्त मूत्राशय मॉडल मूत्र के भंडारण और शून्य के दौरान सुबूरोथेलियम/लैमिना प्रोपेरिया में जैविक रूप से सक्रिय मध्यस्थ उपलब्धता के नियमन के लिए स्थानीय तंत्र ों का अध्ययन करने के लिए सुबूरोथेलियम तक सीधी पहुंच सक्षम बनाता है । तैयारी बारीकी से एक बरकरार मूत्राशय के भरने जैसा दिखता है और दबाव की मात्रा अध्ययन प्रणालीगत प्रभावों के बिना प्रदर्शन करने की अनुमति देता है ।

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Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

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Abstract

पिछले अध्ययनों ने यूएसएसिंग कक्षों में चिपका फ्लैट मूत्राशय म्यूकोसा शीट से रासायनिक पदार्थों की रिहाई की स्थापना की है और हाइड्रोस्टैटिक दबाव या यांत्रिक खंड में परिवर्तन के संपर्क में है और हाइड्रोस्टैटिक दबाव परिवर्तन, खिंचाव, सेल सूजन, या ड्रैग बलों पर सुसंस्कृत यूरोथेलियाल कोशिकाओं से, और भरने के अंत में मूत्राशय लुमेन में। इस तरह के निष्कर्षों से यह धारणा बनी कि इन मध्यस्थों को मूत्राशय भरने के दौरान सुबूरोथेलियम (SubU)/लैमिना प्रोपरिया (एलपी) में भी जारी किया जाता है, जहां वे मूत्राशय की दीवार में गहरी कोशिकाओं को अंततः मूत्राशय की स्थिरता को विनियमित करने के लिए प्रभावित करते हैं । ऐसे अध्ययनों में कम से कम दो स्पष्ट सीमाएं हैं: 1) इनमें से कोई भी दृष्टिकोण सुबू/एलपी में मध्यस्थों की उपस्थिति के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान नहीं करता है, और 2) उपयोग की जाने वाली उत्तेजनाएं शारीरिक नहीं हैं और मूत्राशय के प्रामाणिक भरने को फिर से दोहराती नहीं हैं। यहां, हम एक प्रक्रिया पर चर्चा करते हैं जो मूत्राशय भरने के दौरान मूत्राशय म्यूकोसा की सुबेरोथेल सतह तक सीधी पहुंच को सक्षम बनाती है। मूत्र detrusor मुक्त तैयारी हम बारीकी से बनाए बरकरार मूत्राशय के भरने जैसा दिखता है और दबाव की मात्रा अध्ययन रीढ़ की हड्डी सजगता और detrusor चिकनी मांसपेशियों से संकेत confounding की अनुपस्थिति में मूत्राशय पर प्रदर्शन करने की अनुमति देता है । उपन्यास detrusor मुक्त मूत्राशय मॉडल का उपयोग करना, हम हाल ही में प्रदर्शन किया है कि मध्यस्थों के इंट्राव्सिक माप क्या जारी किया गया है या मूत्राशय भरने के दौरान SubU/एलपी में मौजूद करने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । यह मॉडल मूत्राशय भरने के दौरान मूत्राशय भरने के दौरान उपरू/एलपी में ले जाए गए यूरोथेलियम-व्युत्पन्न सिग्नलिंग अणुओं की जांच में सक्षम बनाता है ताकि मूत्राशय की चिकनी मांसपेशी को जानकारी प्रसारित की जा सके और संयम और micturition के दौरान इसकी उत्तेजनीयता को विनियमित किया जा सके ।

Introduction

इस मॉडल का उद्देश्य मूत्राशय भरने के विभिन्न चरणों के दौरान मूत्राशय म्यूकोसा के उपमुकोसल पक्ष तक सीधी पहुंच को सक्षम करना है।

मूत्राशय को भरने के दौरान समय से पहले संकुचन से बचना चाहिए और जब महत्वपूर्ण मात्रा और दबाव तक पहुंच जाता है तो खाली होना चाहिए। मूत्राशय भरने के दौरान असामान्य स्थिरता या मूत्र की शून्यता अक्सर डिट्रूसर चिकनी मांसपेशियों (डीएसएम) की असामान्य स्थिरता से जुड़ी होती है। डीएसएम की एकाधिकता चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए आंतरिक कारकों और मूत्राशय की दीवार के भीतर विभिन्न कोशिका प्रकारों द्वारा उत्पन्न प्रभावों द्वारा निर्धारित की जाती है। मूत्राशय की दीवार में यूरोथेलियम (म्यूकोसा), सुबूरोथेलियम (सुबू)/लेमिना प्रोपेरिया (एलपी), डिट्रूसर चिकनी मांसपेशी (डीएसएम) और सेरोसा(चित्रा 1A)होते हैं। यूरोथेलियम में छाता कोशिकाएं (यानी, यूरोथेलियम की सबसे बाहरी परत), मध्यवर्ती कोशिकाएं और बेसल कोशिकाएं (यानी, यूरोथेलियम की अंतरतम परत) होती हैं। विभिन्न प्रकार की कोशिकाएं, जिनमें इंटरस्टिशियल कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट, असंबद्ध तंत्रिका टर्मिनल, छोटी रक्त वाहिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं सुबू/एलपी में रहती हैं । यह व्यापक रूप से माना जाता है कि मूत्राशय एक संवेदी अंग है जो मध्यस्थों को उपमुकोसा में छोड़कर पलटा मिटूराइटिस और संयम शुरू करता है जो सुबू /एलपी और डीएसएम1,2,3में कोशिकाओं को प्रभावित करता है । अधिकांश भाग के लिए, ऐसी धारणाएं उन अध्ययनों पर आधारित हैं जिन्होंने मध्यस्थों की रिहाई का प्रदर्शन किया है: हाइड्रोस्टैटिक दबाव4,5में परिवर्तन के संपर्क में म्यूकोसा के टुकड़ों से ; 6,7,हाइपोटॉनिसिटी-प्रेरित कोशिका सूजन7 या ड्रैगफोर्स्स 8केसंपर्क में आने वाली सुसंस्कृत यूरोथेलियाल कोशिकाओं से । पृथक मूत्राशय की दीवार से रिसेप्टर या तंत्रिका सक्रियण9,10,11,12,13,14पर स्ट्रिप्स से । और मूत्राशय लुमेन में15, 16,17,18,19भरने के अंत में . जबकि इस तरह के अध्ययनमूत्र दीवार खंडों या सुसंस्कृत यूरोथेलियल कोशिकाओं की यांत्रिक उत्तेजना पर मध्यस्थों की रिहाई को प्रदर्शित करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाते थे, उन्हें उपमुकोसा में मध्यस्थों की रिहाई के लिए प्रत्यक्ष सबूतद्वारा समर्थित होना चाहिए जो मूत्राशय भरने को पुन: पेश करने वाले शारीरिक उत्तेजनाओं द्वारा प्राप्त किया जाता है। यह एक चुनौतीपूर्ण कार्य है कि सुबू/एलपी मूत्राशय भरने के दौरान सुबू/एलपी के आसपास के क्षेत्र तक सीधी पहुंच में बाधा डालने वाली मूत्राशय की दीवार में गहरा स्थित है ।

यहां, हम डिट्रूपर मांसपेशियों के साथ एक विकेंद्रीकृत (पूर्व वीनो) मूत्राशय मॉडल को चित्रित करते हैं13 को हटा दिया गया था जिसे मूत्राशय की दीवार में मूत्राशय यूरोथेलियम, डीएसएम और अन्य कोशिका प्रकारों के बीच सिग्नलिंग में भाग लेने वाले मेचनोट्रांसडुक्शन के स्थानीय तंत्र पर अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए विकसित किया गया था। यह दृष्टिकोण फ्लैट मूत्राशय की दीवार चादरें, मूत्राशय की दीवार स्ट्रिप्स या सुसंस्कृत यूरोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए बेहतर है क्योंकि यह मूत्राशय में शारीरिक दबावों और मात्राओं के जवाब में जारी या गठित किए गए यूरोथियम-व्युत्पन्न मध्यस्थों के SubU/एलपी के आसपास के क्षेत्र में प्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है और सेल संस्कृति में संभावित फेनोटिपिक परिवर्तनों से बचा जाता है । इसका उपयोग मूत्राशय भरने के विभिन्न चरणों में सुबू/एलपी में मध्यस्थों की उपलब्धता, रिहाई, चयापचय और ट्रांसरोथेलल परिवहन को मापनेकेलिए किया जा सकता है । तैयारी का उपयोग अति सक्रिय और असक्रिय मूत्राशय सिंड्रोम के मॉडल में यूरोथेलियासिग्नलिंग और मेचनोट्रांसक्शन की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Protocol

इस पांडुलिपि में वर्णित पशुओं से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों और नेवादा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति के अनुसार आयोजित की गई थीं ।

नोट:यहां प्रस्तुत मॉडल detrusor मांसपेशी को हटाने के होते हैं, जबकि urothelium और SubU/एलपी बरकरार रहते है(चित्रा 1बी)जांचकर्ताओं मूत्राशय भरने के पाठ्यक्रम में SubU/एलपी के लिए सीधी पहुंच सक्षम करने के लिए ।

1. Detrusor मुक्त मूत्राशय तैयारी का विच्छेदन

  1. अलग मूत्राशय को ठंड (10 डिग्री सेल्सियस) से भरे एक विच्छेदन पकवान में रखें और निम्नलिखित संरचना (एमएम) के साथ 5% सीओ 2/95% ओ2 क्रेब्स बाइकार्बोनेट समाधान (केबीएस) के साथ ऑक्सीजनयुक्त करें: 118.5 NaCl, 4.2 केसीएल, 1.2 एमजीसीएल2,23.8 नाहको3,1.2 KH2पीओ4,11.0 डेक्सट्रोस, 1.8 सीएसीएल2 (पीएच 7.4)13.
  2. अलग मूत्राशय के गुंबद का एक छोटा सा हिस्सा केबीएस से भरे सिल्गार्ड-कवर विच्छेदन पकवान में पिन करें। सुनिश्चित करें कि पिन सेरोसा के एक टुकड़े या detrusor मांसपेशी के सबसे बाहरी किनारे के माध्यम से चला जाता है कि मांसपेशी के अंतरतम किनारे से दूर है कि SubU/
  3. माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, मूत्रमार्ग और मूत्रवर्धक की पहचान करें और उनमें से प्रत्येक को विच्छेदन पकवान के नीचे पिन करें।
  4. अतिरिक्त एडिपोज और कनेक्टिव ऊतकों को हटा दें ताकि मूत्राशय, मूत्रमार्ग और दोनों मूत्रमार्गों का पूरा मुख्य शरीर प्रदर्शित हो।
  5. यूरिनर को 6-0 नायलॉन टांके से बांधें। फिर, तैयारी को सुरक्षित करने के लिए विच्छेदन पकवान के नीचे की ओर यूरेटर के खुले सिरों को पिन करें।
  6. ठीक टिप संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे मूत्राशय और मूत्राशय शरीर के बीच कोने में सेरोसा का एक टुकड़ा खींचें।
  7. पारदर्शिता बढ़ाने के लिए माइक्रोस्कोप के प्रकाश को समायोजित करें और डिट्रूपर मांसपेशियों के नीचे सबम्यूकोसा के मार्जिन को अलग करें।
  8. काटना शुरू करें(छीलने नहीं!)डिट्रूसर मांसपेशी परत की भीतरी सतह के साथ ठीक टिप कैंची के साथ मूत्राशय की दीवार जबकि धीरे से कट सेगमेंट को तैयारी से दूर खींच रही है। हर समय यह सुनिश्चित करें कि म्यूकोसा का पार्श्व किनारा देखा जा सके और उसे छूने से बचा जा सके।
  9. विच्छेदन पकवान के चारों ओर मोड़ करके पूरी तरह से डिट्रूपर मांसपेशियों को हटा दें ताकि तैयारी की स्थिति डिट्रूपर मांसपेशियों को विच्छेदन जारी रखने में आरामदायक हो।
  10. प्रोटोकॉल के शेष चरणों के दौरान तैयारी को स्थिर करने की क्षमता सुनिश्चित करने के लिए मूत्राशय गुंबद के शीर्ष पर डिट्रूज़र मांसपेशी का एक छोटा सा टुकड़ा छोड़ दें।
  11. 6-0 नायलॉन धागे का डबल लूप बनाएं, इसे मूत्राशय तैयार करने की गर्दन के चारों ओर रखें, और लूप को ढीला छोड़ दें।
  12. 6-0 रेशम धागे का दूसरा डबल लूप जोड़ें, इसे मूत्राशय की तैयारी की गर्दन के चारों ओर रखें, और लूप को खो दें। दो टांके होने टांके के आसपास लीक रोकता है।
  13. 20 पीई ट्यूबिंग (कैथेटर) के बारे में 2 सेमी काटें, धीरे-धीरे टिप को एक लौ के करीब ले जाकर टिप को भड़कें।
  14. कैथेटर को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) ऑक्सीजनयुक्त केबीएस से भरें।
  15. मूत्राशय मूत्रमार्ग के छिद्र में कैथेटर डालें और कैथेटर को धीरे से तब तक पुश करें जब तक कैथेटर टिप मूत्राशय के लगभग मध्य तक न पहुंच जाए।
  16. कैथेटर और मूत्राशय गर्दन के आसपास के ऊतकों के आसपास सीवन टाई।
  17. धीरे-धीरे मूत्राशय को लगभग 50-100 माइक्रोन के साथ भरें गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) ऑक्सीजनयुक्त केबीएस, इसे केबीएस की सतह से ऊपर संक्षेप में (<10 s) उठाएं, और टांके और मूत्राशय शरीर पर लीक के लिए निगरानी करें।
  18. यदि कोई रिसाव नहीं देखा जाता है, तो प्रयोग के लिए तैयारी की जाती है। यदि सीवन के चारों ओर रिसाव देखा जाता है, तो सीवन निकालें और इसे बदलें। यदि मूत्राशय के शरीर में छेद से रिसाव देखा जाता है, तो तैयारी को त्याग दें।

2. डेन्ड मूत्राशय तैयारी का भरना

  1. एक सिलगार्ड नीचे के साथ एक पानी (37 डिग्री सेल्सियस) जैकेट अंग पकवान के एक 3 मिलील कक्ष में परफ्यूज KBS (37 डिग्री सेल्सियस)।
  2. ऑक्सीजन और सक्शन लाइनों को समायोजित करें।
  3. डेन्ड ब्लैडर तैयार करने को कक्ष में रखें।
  4. कैथेटर को कक्ष के किनारे सुरक्षित करें ताकि तैयारी परफ्यूजन समाधान की सतह से ऊपर न तैर सके।
  5. एक ही आकार फिटिंग का उपयोग कर तीन तरह से स्टॉपकॉक से जुड़े एक लंबे PE20 ट्यूबिंग (जलसेक लाइन) के लिए मूत्राशय कैथेटर कनेक्ट ।
  6. सुनिश्चित करें कि जलसेक पंप, दबाव ट्रांसड्यूसर और मूत्राशय के बीच की रेखाएं खुली हैं।
  7. जलसेक सिरिंज को ताजा, गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) और ऑक्सीजनयुक्त केबीएस से भरें।
  8. पंप मापदंडों को समायोजित करें: सिरिंज का प्रकार/मात्रा (यानी, 1 mL), ऑपरेशन (यानी इनफ्यूज), फ्लो (यानी, स्थिर), और प्रवाह दर (यानी, 15 μL/min)।
  9. ब्लैडर को भरने के लिए सिरिंज पंप पर स्टार्ट बटन दबाएं।
  10. मूत्राशय भरने के दौरान मात्रा और इंट्राव्सिक दबाव भरने की निगरानी करें।

3. Denuded मूत्राशय तैयारी के SubU/एलपी पहलू में मध्यस्थों का पता लगाने

  1. बर्फ-ठंडे माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब या उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) आवेषण में स्नान समाधान के एलिकोस एकत्र करें।
  2. उचित पता लगाने वाले आवेदन के अनुसार नमूनों को तैयार करें और संसाधित करें। प्यूरीन उपलब्धता का पता लगाने के मामले में, फ्लोरेसेंस डिटेक्शन13,18के साथ एचपीएलसी द्वारा नमूनों को संसाधित करें।

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Representative Results

मूत्र विचरण मुक्त मूत्राशय तैयार करने की दीवार बरकरार है और इसमें डीएसएम और सेरोसा को छोड़कर सभी परतें शामिल हैं। सबूत के सिद्धांत अध्ययनों से पता चला है कि DSM मुक्त मूत्राशय की दीवार urothelium और SubU/एलपी शामिल है, जबकि ट्यूनिका मांसपेशियों और सेरोसा अनुपस्थित है(चित्रा 2)13

डिट्रसर-मुक्त मूत्राशय को भरना सामान्य मूत्राशय भरने का अनुमान है। चित्रा 3 विभिन्न भरने की दरों, संस्करणों और इंट्राल्यूमिनल दबाव ों पर पूर्व वीवो मूत्राशय की तैयारी भरने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप की योजनाबद्ध दिखाता है। मूत्राशय पूर्व वीवो बरकरार और डेन्ड मूत्राशय की तैयारी के लिए13के दबाव को शून्य तक पहुंचने के लिए भरने की मात्रा की एक विस्तृत श्रृंखला की आवश्यकता होती है । दबाव-मात्रा संबंधों को बरकरार है और denuded तैयारी में उल्लेखनीय समान है(फिल्म 1, फिल्म 2,और चित्रा 4)। इसलिए, डीएसएम-मुक्त तैयारी मूत्राशय मेचनोसेनोसनसनी और मेचनोट्रांसडुक्शन में यूरोथेलियम और सुबू/एलपी की भूमिका के कार्यात्मक अध्ययनों के लिए उपयुक्त है।

Detrusor मुक्त मूत्राशय मॉडल का संभावित उपयोग
मूत्राशय भरने के दौरान मूत्राशय लुमेन और SubU/एलपी में मध्यस्थों की उपलब्धता को मापने
मूत्राशय की तैयारी भरने के दौरान बाह्य (ईएल; जैसे, स्नान SubU/LP) और इंट्राल्यूमिनल (आईएल) नमूनों को इकट्ठा करने के लिए प्रायोगिक सेटअप चित्रा 5में सचित्र है । भरने के दौरान SubU/LP पक्ष में जारी किए गए यूरोथेलियम-व्युत्पन्न मध्यस्थों को मापने के लिए मॉडल की उपयुक्तता का परीक्षण प्यूरीन मध्यस्थों की रिहाई को मापने के द्वारा किया गया था (उदाहरण के लिए, एडेनोसाइन 5'-ट्राइफोस्फेट, एटीपी; एडेनोसाइन 5'-डिफॉस्फेट, एडीपी; निकोटीनेमाइड एडेनाइन डिन्यूक्लियोटाइड, नाद; एडेनोसाइन 5'-मोनोफॉस्फेट, एएमपी; और एडेनोसाइन, एडीओ) ने डेन्ड तैयारी के सुबू/एलपी को स्नान करने वाले समाधान में । जैसा कि चित्र 6में प्रदर्शित किया गया था, स्नान में प्यूरीन की नगण्य मात्रा का पता लगाया गया था जिसमें बरकरार डीएसएम के साथ एक अलग मूत्राशय तैयार करना था जबकि स्नान से एकत्र किए गए नमूनों में इन प्यूरीन की मात्रा काफी अधिक थी जिसमें एक डेन्ड मूत्राशय तैयारी(चित्रा 6बी)शामिल थी। विशेष रूप से, भरने के अंत में ल्यूमेन और सुबू/एलपी से एकत्र नमूनों में प्यूरीन और मेटाबोलाइट्स का वितरण काफी भिन्न था(चित्र6सी)।

मूत्राशय भरने के दौरान SubU/एलपी में मध्यस्थों के बाह्य चयापचय की जांच करें
एटीपी, 1,एन6-एथेनो-एटीपी (εएटीपी) के अत्यधिक फ्लोरोसेंट एनालॉग के अलावा, डिट्रूज़र-मुक्त तैयारी के सुबेरोथेल पक्ष के परिणामस्वरूप εएटीपी की कमी हुई और εएटी उत्पादों में वृद्धि हुई, εएडीपी, εएएमपी, और εएडो(चित्रा 7एए और फिगर 7एबी)। इसी तरह, तैयारी लुमेन में εएएटीपी के अलावा εएएटीपी की कमी और ल्यूमेन में εएडीपी, εएएमपी और εएडो में वृद्धि हुई(चित्रा 7बीए और चित्रा 7बीबी)। इसलिए, मॉडल मूत्राशय भरने के दौरान यूरोथेलियम के दोनों किनारों पर बायोएक्टिव मध्यस्थों के मेटाबोलिज्म के अध्ययन के लिए उपयुक्त है।

मूत्राशय भरने के दौरान मध्यस्थों के ट्रांसरोथेल परिवहन की जांच करें
डेन्ड तैयारी के सुबू/एलपी पक्ष में εएटीपी के अलावा, लुमेन में εएपी, εएडो और कुछ εएडीपी की उपस्थिति हुई, जिससे यह सुझाव दिया गया कि प्यूरिनों को सुबू/एलपी से लुमेन13 (चित्रा 7एसी)तक ले जाया जा सकता है । इसी तरह, ल्यूमेन में εएटीपी जोड़ने के परिणामस्वरूप सुबू/एलपी13 (चित्रा 7डीबी)में εएएमपी और εएडो की उपस्थिति हुई । ध्यान दें कि εएटीपी आवेदन के विपरीत दिशा में कोई εएटीपी नहीं देखा गया था। एक साथ, इन टिप्पणियों दृढ़ता से सुझाव है कि detrusor मुक्त मूत्राशय तैयारी भरने के दौरान मध्यस्थों के द्विपक्षीय ट्रांसरोथेलियल परिवहन के अध्ययन के लिए उपयुक्त है ।

Figure 1
चित्रा 1: डिट्रूपर-मुक्त मूत्राशय मॉडल का सिद्धांत। (A) मूत्राशय की दीवार यूरोथेलियम, सुबूरोथेलियम/लेमिना प्रोपेरिया (SubU/LP), डिट्रूसेर मांसपेशी और सेरोसा से बना है । इनमें से प्रत्येक परत में विभिन्न कोशिका प्रकार होते हैं जो मूत्र के भंडारण और शून्य के दौरान मूत्राशय के कार्यों के लिए महत्वपूर्ण होते हैं। मूत्राशय भरने के दौरान, जैविक रूप से सक्रिय मध्यस्थों को मूत्राशय के लुमेन में और सुबू/एलपी में मूत्राशय की दीवार में गहरी कोशिकाओं को प्रभावित करने के लिए यूरोथेलियम से जारी किया जाता है, जिसमें डिट्रूज़र मांसपेशी भी शामिल है । जबकि मूत्राशय ल्यूमेन तक पहुंच अपेक्षाकृत सरल है, यूरोथेलियम-व्युत्पन्न मध्यस्थों का पता लगाने के लिए भरने के दौरान SubU/एलपी तक कोई सीधी पहुंच नहीं है जो मूत्राशय की दीवार में कोशिकाओं को प्रभावित कर सकती है और डिट्रूज़र मांसपेशियों की एकता को नियंत्रित कर सकती है । (ख)सेरोसा के साथ डिट्रसर मांसपेशी परतों को हटाना सुबू/एलपी की पूरी सतह को उजागर करता है जिससे सुबू/एलपी तक सीधी पहुंच सक्षम होती है जहां मूत्राशय भरने के विभिन्न चरणों में यूरोथेलियम-व्युत्पन्न सिग्नलिंग अणुओं को मापा जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मूत्र की हिटोलॉजी बरकरार है और detrusor मुक्त मूत्राशय की दीवारों। मैसन के ट्राइक्रोम को भरा हुआ बरकरार(ए)और डिट्रूपर-फ्री(बी)मूत्राशय की दीवारें दर्शाती हैं कि डेन्ड तैयारी में बरकरार यूरोथेलियम (यू) और सुबू/एलपी शामिल हैं, लेकिन डिट्रूसेर मांसपेशी (डी) और सेरोसा (एस) नहीं । एल, लुमेन। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन13से पुन: पेश किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पूर्व वीवो मूत्राशय की तैयारी को भरने में उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। पूर्व वीवो बरकरार या डेन्ड मूत्राशय (यूबी) तैयारी को एक गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पानी-जैकेट वाले अंग कक्ष में रखा गया है जो ऑक्सीजनयुक्त क्रेब्स-बाइकार्बोनेट समाधान (केबीएस, 37 डिग्री सेल्सियस, पीएच 7.4) के साथ परिच्छित है। मूत्राशय की तैयारी विभिन्न भरने की दरों और मात्राओं पर केबीएस के साथ संचार किया जाता है और इंट्राल्यूमिनल ब्लैडर प्रेशर (बीपी) प्रयोग के दौरान दर्ज किया जाता है यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन13से पुन: पेश किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: दबाव-प्रभाव मुक्त तैयारी में संबंधों । (क)और(बी)इंट्रावेकल वॉल्यूम और पूर्व वीवो बरकरार और डेन्ड मूत्राशय की तैयारी के दबाव की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग हैं जो 15 μL/min पर क्रेब्स-बाइकार्बोनेट समाधान से भरे हुए हैं । जैसा कि प्रत्याशित है, डेट्रसर की उपस्थिति के कारण अक्षुण्ण तैयारी ने क्षणिक संकुचन (टीसी) विकसित किया। इसके विपरीत, डेन्ड तैयारी में टीसी(सी)और (डी) में टीसी (सी) और(डी)के प्रभाव-मात्रा संबंधों के संक्षेप वाले डेटा का पता चलता है जो स्थिर और 250 माइक्रोन समाधान के स्थिर और नित्दुड मूत्राशय की तैयारी करते हैं। ध्यान दें कि भरने की मात्रा और इंट्राव्सिक दबाव उल्लेखनीय बरकरार और denuded मूत्राशय की तैयारी में समान थे । इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन13से पुन: पेश किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अलग मूत्राशय मॉडल के योजनाबद्ध आरेख भरने के दौरान SubU/LP और lumen में urothelium-व्युत्पन्न मध्यस्थों की उपलब्धता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया । मूत्राशय की तैयारी को पानी के जैकेट वाले कक्ष में रखा जाता है और ऑक्सीजनयुक्त क्रेब्स बाइकार्बोनेट समाधान (केबीएस) के साथ सुपरफ्यूज किया जाता है। मूत्रमूत्र (यूबी) तैयारी एक जलसेक पंप से जुड़े मूत्रमार्ग में कैथेटर के माध्यम से गर्म ऑक्सीजनयुक्त केबीएस से भर जाता है। मूत्राशय के दबाव (बीपी) मूत्राशय भरने के दौरान जलसेक लाइन के माध्यम से एक तीन तरह से कनेक्टर के माध्यम से निगरानी की है । पता लगाने वाले अनुप्रयोगों के अनुसार मध्यस्थों (एम) का पता लगाने के लिए बाहाहिर्मेदार (ईएल, अंग स्नान) और इंट्राल्यूमिनल (आईएल) समाधानों के नमूनों पर कार्रवाई की जाती है। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन13से पुन: पेश किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: डिट्रसर-फ्री मूत्राशय तैयार करना भरने के दौरान सुबू/एलपी में मध्यस्थों की उपलब्धता को मापने के लिए उपयुक्त है । प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम बाह्य नमूनों में प्यूरीन की उपलब्धता का प्रदर्शन करते हुए बरकरार(ए)और डिट्रूपर्स-फ्री(बी)मूत्राशय की तैयारी में। ध्यान दें कि प्यूरीन मध्यस्थों को बरकरार तैयारी की तुलना में डेन्ड तैयारी में बेहतर तरीके से पता लगाया जाता है। (ग)लुमेन में पाए गए प्यूरीन पूल और सुबू/एलपी में खोजे गए प्यूरीन पूल में व्यक्तिगत प्यूरीन का सापेक्ष योगदान काफी अलग है । इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन13से पुन: पेश किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: डिट्रसर-फ्री मूत्राशय तैयारकरना मूत्राशय भरने के दौरान मेटाबोलिज्म और मध्यस्थों के ट्रांसरोथेलल परिवहन की जांच करने के लिए उपयुक्त है। (ए, बी) प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम दिखा εATP सब्सट्रेट(एए, बीए)। जब सब्सट्रेट को या तो सुबू/एलपी(एबी)या ल्यूमेन(बीबी)εएटी पर लागू किया जाता है और उत्पादों में वृद्धि की गई थी । इसलिए, आवेदन के दोनों ओर εएटीपी को अपमानित किया जाता है; हालांकि, ΕATP उत्पादों का गठन SubU/एलपी और ल्यूमेन में विषम है । ध्यान दें कि εएटीपी उत्पाद εAMP और εएडीओ, लेकिन सब्सट्रेट εएटीपी नहीं, εएएटीपी एप्लिकेशन(एसी, बीसी)के विपरीत दिशा में दिखाई दिए। इसलिए, प्यूरिन दाखिल करने के दौरान डिटर्टर-फ्री तैयारी की दीवार के माध्यम से ले जाया जाता दिखाई देता है। इस आंकड़े को13से संशोधित किया गया है . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 1
वीडियो 1: बरकरार मूत्राशय भरने के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग । मूत्राशय 15 μL/मिनट में भरा गया था । वीडियो 5 हर्ट्ज में एक आवेशित युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे के साथ एक ज़ूम स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज किया गया था; 25 एमएमएचजी इंट्राल्यूमिनल प्रेशर तक पहुंचने पर रिकॉर्डिंग रोक दी गई। छवि की पूरी अवधि 64x वास्तविक समय है। इस वीडियो को13से पुन: पेश किया गया है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Video 1
वीडियो 2: डिट्रूपर-फ्री ब्लैडर फिलिंग की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। मूत्राशय 15 μl/min पर भरा गया था । वीडियो 5 हर्ट्ज पर एक सीसीडी कैमरे के साथ एक ज़ूम स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज की गई थी; 25 एमएम एचजी इंट्राल्यूमिनल प्रेशर तक पहुंचने पर रिकॉर्डिंग रोक दी गई। छवि की पूरी अवधि 64 गुना वास्तविक समय है। इस वीडियो को13से पुन: पेश किया गया है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

मूत्राशय में दो कार्य होते हैं: मूत्र का भंडारण और शून्य। इन कार्यों के सामान्य संचालन के लिए मूत्राशय की दीवार में कोशिकाओं के माध्यम से इंट्राल्यूमिनल मात्रा और दबाव और संकेतों के ट्रांसड्यूक्शन के उचित यांत्रिक संवेदन की आवश्यकता होती है ताकि डिट्रूज़र मांसपेशी एक्सिबिलिटी को विनियमित किया जा सके। मूत्राशय म्यूकोसा (urothelium) को सुबू/एलपी में विभिन्न प्रकार के संकेत अणुओं को जारी करके मूत्राशय एक्साइटीबिलिटी को विनियमित करने के लिए माना जाता है जो मूत्राशय की दीवार में कई कोशिका प्रकारों को प्रभावित करते हैं । वर्तमान में, मूत्राशय-व्युत्पन्न मध्यस्थों के लक्षण वर्णन के अधिकांश प्रयासों में मूत्राशय की तैयारी (जैसे, फ्लैट मूत्राशय की दीवार शीट, मूत्राशय की दीवार स्ट्रिप्स, या सुसंस्कृत कोशिकाओं) का उपयोग शामिल है जो शारीरिक मूत्राशय भरने को पुन: पेश नहीं करते हैं। मूत्राशय भरने के अंत में मूत्राशय लुमेन में जारी किए जाने वाले मध्यस्थों के मापकों का उपयोग अक्सर यूरोथेलियम के विपरीत दिशा से इन मध्यस्थों की रिहाई के लिए संकेत के रूप में किया जाता है। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि मध्यस्थों की इंट्राल्यूमिनल सामग्री मूत्राशय की दीवार13में गहरी उपलब्ध है का प्रतिनिधि नहीं है । मूत्राशय भरने के दौरान SubU/एलपी तक पहुंच को सक्षम करने वाले उपन्यास प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की आवश्यकता है ताकि मूत्राशय के उरोथेलियम, सुबू/एलपी और डीएसएम के बीच सिग्नलिंग के स्थानीय तंत्रों के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाया जा सके ।

यहां, हम एक उपन्यास पशु मूत्राशय मॉडल का प्रदर्शन करते हैं जिसमें डेट्रसर मांसपेशी को13भरने के दौरान सुबू/एलपी में यूरोथेलियम से जारी मध्यस्थों तक सीधी पहुंच प्रदान करने के लिए हटा दिया जाता है । डेन्ड तैयारी बरकरार मूत्राशय13,18को भरने जैसा दिखता है, यह सुझाव देता है कि डिट्रूपर मांसपेशियों की कमी मूत्राशय भरने के दौरान मूत्राशय के मेकोलियम के मेचनोसेंसिटिव गुणों को नहीं बदलती है। तैयारी रीढ़ की हड्डी सजगता और detrusor मांसपेशियों से confounding संकेत के अभाव में मूत्राशय पर किया जा करने के लिए दबाव मात्रा अध्ययन की अनुमति देता है । इसलिए, सुबू/एलपी में जारी मध्यस्थों को अन्य स्त्रोतों से प्रणालीगत प्रभावों या संदूषण के बिना मापा जा सकता है । मूत्राशय भरने के दौरान विभिन्न खंडों और दबावों पर SubU/एलपी के आसपास सीधे पहुंचने की क्षमता मॉडल को मूत्राशय भरने के भंडारण और पूर्व-शून्य चरणों के दौरान जैविक रूप से सक्रिय मध्यस्थों के रिलीज, चयापचय और ट्रांसरोथेल परिवहन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त बनाती है ।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यूरोथेलियम और सुबू/एलपी को बरकरार रखते हुए डिट्रूपर चिकनी मांसपेशी को हटाना है । प्रक्रिया विशेष रूप से माउस मूत्राशय में detrusor मांसपेशी और SubU/एलपी के बीच ढीला संबंध के कारण सीधा है । तैयारी ने13को बरकरार मूत्राशय के लिए उल्लेखनीय समान दबाव-मात्रा विशेषताओं के साथ उत्कृष्ट प्रजनन क्षमता दिखाई । मॉडल बड़े जानवरों से मूत्राशय में भी संभव है जिसमें डिट्रूजर मांसपेशी आंशिक रूप से या पूरी तरह से हटाई जा सकती है। उदाहरण के लिए, हमने पहले यह दर्शाया है कि मॉडल को साइनोमोलगस बंदर मैकका फासिकुलिस से मूत्राशय में पुन: पेश किया जा सकता है और यह दर्शाया जा सकता है कि13को भरने के दौरान मध्यस्थों को SubU/LP में मापा जा सकता है ।

इस पूर्व वीवो मॉडल की संभावित सीमा बहुत मुद्दा है जो तैयारी की ताकत है, संक्षेप में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और परिसंचरण के प्रणालीगत प्रभावों की कमी मूत्राशय भरनेके दौरान म्यूकोसा-डिट्रसर कनेक्टिविटी के स्थानीय तंत्र की पूरी तरह से जांच की अनुमति देती है। प्रणालीगत प्रभावों की कमी कई पूर्व वीवो दृष्टिकोणों के साथ साझा की जाती है, जिसमें अलग मूत्राशय की दीवार शीट या स्ट्रिप्स या सुसंस्कृत यूरोथियल कोशिकाएं शामिल हैं। हालांकि, डिट्रूपर-फ्री ब्लैडर मॉडल यूरोथेलियाल रिसर्च में उपरोक्त दृष्टिकोणों से बेहतर है कि यह मूत्राशय भरने के दौरान सुबू/एलपी तक सीधी पहुंच की अनुमति देता है । इसलिए, इस दृष्टिकोण के उपयोग से मेचनोसेंसिटिव मेचनोट्रांसडुक्शन तंत्र की समझ बढ़ेगी जो मूत्राशय को भरने के दौरान यूरोथेलियम में उत्पन्न होती है।

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Disclosures

इस काम के कुछ हिस्सों को पहले जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी (PMCID: PMC6418748) में प्रकाशित किया गया था; DOI:10.1113/JP27692413)। इस प्रकाशन से सामग्री के उपयोग के लिए विले एंड संस, इंक द्वारा अनुमति प्रदान की गई है। लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई वित्तीय या अन्य संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज ग्रांट DK41315 ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

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References

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