방광 충진 중 수부에 직접 접근할 수 있도록 제거된 분리기 근육이 있는 분권화된(Ex Vivo) 뮤린 방광 모델

Medicine

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Summary

detrusor-free 방광 모형은 소변의 저장 그리고 무효화 도중 suburothem/lamina propria에 있는 생물학적으로 활성 매개체 가용성의 규칙에 대한 지역 기계장치를 공부하기 위하여 suburothem에 직접 접근할 수 있습니다. 준비는 밀접하게 손상되지 않은 방광의 채우기를 닮은 및 압력 볼륨 연구는 전신 영향없이 수행 할 수 있습니다.

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Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

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Abstract

이전 연구는 Ussing 챔버에 부착 된 평평한 방광 점막 시트에서 화학 물질의 방출을 확립하고 정수압 변화, 스트레칭, 세포 부종 또는 항력, 충전 말기의 방광 루멘에 따라 정수압 또는 기계적 스트레칭 및 배양 된 비뇨기 세포에서 변화에 노출되었습니다. 그 같은 사실 인정은 이 매개체가 또한 방광 충전 도중 suburothelium (SubU)/lamina propria (LP)에서 풀어 놓인다는 가정으로 이끌어 냈습니다, 어디 그(것)들은 궁극적으로 방광 흥분성을 통제하기 위하여 방광 벽에 깊은 세포에 영향을 미칩니다. 그러한 연구 결과에 있는 적어도 2개의 명백한 한계가 있습니다: 1) 이 접근의 아무도는 SubU/LP에 있는 중재자의 존재에 관하여 직접적인 정보를 제공하지 않으며, 2) 사용된 자극은 생리적이지 않으며 방광의 본격적인 충진을 되풀이하지 않습니다. 여기에서는 방광 을 채우는 과정에서 방광 점막의 지하 표면에 직접 접근 할 수있는 절차에 대해 논의합니다. 우리가 만든 뮤린 detrusor-free 준비는 그대로 방광의 채우기와 밀접하게 유사하고 척추 반사 및 detrusor 평활근에서 혼란스러운 신호가없는 방광에 압력 볼륨 연구를 수행 할 수 있습니다. 새로운 detrusor 자유로운 방광 모형을 사용하여, 우리는 최근에 방광 충전 도중 SubU/LP에서 풀어 놓인 무슨에 대리인으로 중재자의 내측정을 사용할 수 없다는 것을 보여주었습니다. 이 모델은 방광 충전 과정에서 신진 대사에 의해 생성되거나 SubU/LP로 이송되어 방광의 뉴런과 평활근에 정보를 전달하고 요실금 및 분뇨 중 흥분성을 조절하는 비뇨생식기 유래 신호 분자를 검사할 수 있습니다.

Introduction

이 모형의 목적은 방광 충진의 다른 단계 도중 방광 점막의 점막 측에 직접 접근을 가능하게 하기 위한 것입니다.

방광은 중요한 부피와 압력에 도달할 때 충전하는 동안 조기 수축을 자제하고 비어 있어야합니다. 소변의 이상한 요실금 또는 무효화는 방광 충진 의 과정에서 분리 평활근 (DSM)의 비정상적인 흥분성과 자주 연관됩니다. DSM의 흥분성은 평활근 세포에 내재된 요인과 방광 벽 내의 다른 세포 유형에 의해 생성된 영향에 의해 결정됩니다. 오줌 방광의 벽은 요로 외(점막), suburi(SubU)/라미나 프로피아(LP), 방파제 평활근(DSM) 및 세로사(그림1A)로구성됩니다. 요로 테륨은 우산 세포 (즉, 요로 류의 가장 바깥쪽 층), 중간 세포 및 기저 세포 (즉, 요로 의 가장 안쪽 층)로 구성됩니다. 간질 세포, 섬유아세포, 구심성 신경 말단, 작은 혈관 및 면역 세포를 포함한 다양한 유형의 세포가 SubU/LP에 있습니다. 방광 요로는 SubU/LP 및 DSM1,2,3의세포에 영향을 미치는 점막내로 매개체를 방출함으로써 반사 배뇨 및 요실금을 개시하는 감각 기관이라고 널리 가정됩니다. 대부분의 경우, 이러한 가정은 중재자의 방출을 입증 한 연구를 기반으로합니다 : 점막의 조각에서 정수압의 변화에 노출4,5; 배양 된 비뇨기 세포에서 스트레칭 에 노출6,7,hypotonicity 유도 세포 팽윤7 또는 드래그 힘8; 수용체 또는 신경 활성화 시 고립 된 방광 벽 스트립에서9,10,11,12,13,14; 그리고 방광 의 끝에 루멘15,16,17,18,19. 그 같은 연구 결과는 방광 벽 세그먼트 또는 배양된 비뇨기과 세포의 기계적인 자극에 중재자의 방출을 설명하는 중요한 동안, 방광 충전을 재생하는 생리적 자극에 의해 유도되는 submucosa에 있는 중재자의 방출을 위한 직접적인 증거에 의해 지원될 필요가 있습니다. 이것은 SubU/LP가 방광 충전 도중 SubU/LP의 부근에 간단한 접근을 방해하는 방광 벽의 깊은 곳에 있다는 것을 주어진 도전적인 작업입니다.

여기서, 우리는 방광 요로, DSM 및 방광 벽에 있는 그밖 세포 모형 사이 신호에 참여하는 메카노트랜스덕션의 국소 기계장치에 대한 연구를 촉진하기 위하여 개발된 detrusor 근육제거된 13를 가진 분권화된 (ex vivo) 뮤린 방광 모형을 예시합니다. 이 접근법은 방광의 생리적 압력 과 부피에 반응하여 방출되거나 형성되는 비뇨기과 유래 매개체의 SubU/LP 부근에서 직접 측정을 허용하고 세포 배양에서 잠재적인 현상학적 변화를 피하기 때문에 평평한 방광 벽 시트, 방광 벽 스트립 또는 배양 된 비뇨 기 세포를 사용하는 것이 우수합니다. 방광 충진의 상이한 단계에서 SubU/LP의 중재자의 가용성, 방출, 대사 및 경부 수송을 측정하는데 사용될 수있다(그림 1B). 준비는 또한 과민성 및 저활동 방광 증후군의 모형에 있는 비뇨기과 신호 및 mechanotransduction를 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다.

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Protocol

이 원고에 기술 된 동물과 관련된 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소와 네바다 대학의 기관 동물 사용 및 관리위원회에 따라 수행되었습니다.

참고: 여기에 제시 된 모델은 비뇨기와 SubU / LP가 그대로 남아있는 동안 detrusor 근육의 제거로 구성되어 있습니다(그림 1B)연구원은 방광 충전 과정에서 SubU / LP에 직접 액세스 할 수 있도록.

1. 분리되지 않거나 방광 제제의 해부

  1. 분리된 방광을 차가운(10°C)로 채워진 해부 접시에 놓고 5% CO 2/95%O2 크렙스 중탄산염 용액(KBS)으로 산소를 공급하고 다음 조성물(mM)을 사용한다: 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2,23.8 NaHCO3,1.2 KH2PO4,11.0 덱스트로스, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
  2. 고립된 방광의 돔의 작은 부분을 KBS로 채워진 실가드 덮인 해부 접시에 고정합니다. 핀이 SubU/LP를 마주보고 있는 근육의 가장 안쪽 가장자리에서 멀리 떨어진 분리기 근육의 세로사 조각 또는 가장 바깥쪽 가장자리를 통과해야 합니다.
  3. 현미경을 사용하여 요도 및 요관을 식별하고 해부 접시의 바닥에 각각 고정합니다.
  4. 방광의 전체 본체, 요도 및 두 요관이 표시되도록 과도한 지방 및 결합 조직을 제거하십시오.
  5. 요관에 6-0 나일론 봉합사를 묶습니다. 그런 다음, 제조를 확보하기 위해 해부 접시의 바닥으로 요관의 열린 끝을 고정.
  6. 미세 팁 집게를 사용하여 요관과 방광 몸 사이의 모서리에있는 세로사의 조각을 부드럽게 당깁니다.
  7. 투명도를 높이고 detrusor 근육 아래 의 점막의 마진을 구별하기 위해 현미경의 빛을 조정합니다.
  8. 절단을 시작(박리하지 않음!) 방광 벽을 분지 근육 층의 안쪽 표면을 따라 미세 한 팁 가위로 가볍게 절단 부분을 준비에서 멀리 당깁니다. 항상 점막의 측면 가장자리를 볼 수 있는지 확인하고 만지지 마십시오.
  9. 해부 접시를 돌리면 배뇨기 근육을 완전히 제거하여 준비의 위치가 편해지므로 제거기 근육을 계속 해부하십시오.
  10. 프로토콜의 나머지 단계 동안 준비를 고정 할 수있는 능력을 보장하기 위해 방광 돔의 상단에 detrusor 근육의 작은 조각을 둡니다.
  11. 6-0 나일론 스레드의 이중 루프를 만들고 방광 준비의 목 주위에 놓고 루프를 느슨하게 둡니다.
  12. 6-0 실크 스레드의 두 번째 이중 루프를 추가하고 방광 준비의 목 주위에 놓고 루프를 잃어 버리십시오. 두 개의 봉합사를 사용하면 봉합사 주위의 누출을 방지할 수 있습니다.
  13. 20 PE 튜브 (카테터)의 약 2cm를 잘라, 불꽃에 가까운 팁을 천천히 이동하여 팁을 플레어.
  14. 카테터를 따뜻한(37°C)로 채우고 KBS에 산소를 공급합니다.
  15. 방광 요도의 오리피스에 카테터를 삽입하고 카테터 팁이 방광의 약 중간에 도달 할 때까지 카테터를 부드럽게 밀어 넣습니다.
  16. 카테터와 방광 목의 주변 조직 주위에 봉합사를 묶습니다.
  17. 약 50-100 μL의 따뜻한 (37 °C) 산소 로 방광을 천천히 채우고, KBS의 표면 위로 짧게 들어 올리고 봉합사및 방광 체에서 누출을 모니터링하십시오.
  18. 누출이 관찰되지 않으면 실험을 위한 준비가 완료됩니다. 봉합사 주위의 누출이 관찰되면 봉합사를 제거하고 교체하십시오. 방광 체의 구멍에서 누출이 발견되면 준비를 폐기하십시오.

2. 방광 제제 의 충진

  1. KBS(37°C)를 실가드 바닥을 가진 3 mL 챔버(37°C)의 자켓 오르간 접시에 퍼퓨즈한다.
  2. 산소와 흡입 선을 조정합니다.
  3. 방광 준비를 챔버에 놓습니다.
  4. 카테터를 챔버 의 측면에 고정하여 전재가 관류 용액의 표면 위에 떠오르지 않도록하십시오.
  5. 방광 카테터를 동일한 크기의 피팅을 사용하여 3방향 스톱콕에 연결된 더 긴 PE20 튜브(주입 선)에 연결합니다.
  6. 주입 펌프, 압력 변환기 및 방광 사이의 선이 열려 있는지 확인하십시오.
  7. 주입 주사기를 신선하고 따뜻한 (37 °C)와 산소화 된 KBS로 채웁니다.
  8. 펌프 파라미터 를 조정합니다: 주사기의 유형/부피(즉, 1mL), 작동(즉, 주입), 유량(즉, 상수) 및 유량(즉, 15μL/min).
  9. 주사기 펌프의 시작 버튼을 눌러 방광을 채웁니다.
  10. 방광 충진 중 충진량과 내압력을 모니터링합니다.

3. 디누디 방광 제제의 SubU/LP 측면의 중재자 검출

  1. 얼음 차가운 미세 원심 분리튜브 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 인서트에 목욕 용액의 알리쿼트를 수집합니다.
  2. 적절한 검출 어플리케이션에 따라 샘플을 준비하고 처리합니다. purine 가용성을 검출하는 경우 형광 검출13,18로HPLC에 의해 샘플을 처리합니다.

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Representative Results

뮤린 detrusor 없는 방광 준비의 벽은 손상되지 않으며 DSM과 serosa를 제외한 모든 층을 포함합니다. 원리 증명 연구는 DSM이없는 방광 벽이 투로 신경과 수U / LP를 포함하고 튜니카 근육질및 혈청이 없는 것으로 입증되었습니다(그림 2)13.

방광이 없는 방광을 채우는 것은 정상적인 방광 충진에 가착됩니다. 도 3은 상이한 충진속도, 부피 및 내발광압력에서 생체내 방광 제제를 충진하기 위한 실험 적 설정의 회로도를 나타낸다. 뮤린 ex vivo 그대로 및 디누이드 방광 제제는 무효 압력13에도달하기 위해 충진 부피의 넓은 범위를 필요로한다. 압력-볼륨 관계는 손상되지 않은준비(Movie 1, Movie 2및 그림 4)에서현저하게 유사합니다. 따라서, DSM 프리 제제는 방광 메카노센세이션 및 메카노트랜스덕션에서 요로및 SubU/LP의 역할에 대한 기능적 연구에 적합하다.

Detrusor 없는 방광 모델의 사용 가능
방광 충진 중 방광 루멘 및 SubU/LP의 중재자의 가용성 측정
방광 압력을 모니터링하는 동안 방광 제제를 채우는 동안 초발광(EL; 예를 들어, 입욕 SubU/LP) 및 내발 루미널(IL) 샘플을 수집하기 위한 실험 설정은 도 5에예시되어 있다. 충전 중에 SubU/LP 측에서 방출되는 요로측뇨 유래 매개체를 측정하기 위한 모델의 적합성은 퓨린 중재자의 방출을 측정하여 테스트했습니다(예를 들어, 아데노신 5'-트리포스페이트, ATP; 아데노신 5'-디포스페이트, ADP; 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, NAD; 아데노신 5'-모노포스페이트, AMP 및 아데노신, ADO)를 수U/LP를 목욕시키는 용액에. 6A에기수된 바와 같이, 손상된 DSM을 함유하는 분리된 방광 제제를 함유하는 목욕에서 무시할 수 있는 양의 퓨린이 검출된 반면, 이들 퓨린의 양은 디누데이드 방광 제제를 함유하는 목욕에서 채취한 샘플에서 상당히 높았다(도6B). 특히, 충전의 끝에 루멘과 SubU / LP에서 수집 된 샘플에서 퓨린 및 대사 산물의 분포는 크게 달랐다(그림 6C).

방광 충진 중 SubU/LP의 중재자의 세포외 대사 검사
ATP, 1,N6-에테노-ATP(θATP)의 고형형 유사체를 첨가하여, 방뇨없는 제제의 지하측에 σATP의 감소 및 θATP 생성물의 증가를 초래하였다(그림7Aa Ab). 마찬가지로, 제제 루멘에 θATP를 첨가하면 루멘에서 θATP, θAMP 및 θADO의 증가가 초래하였다(도7Ba도 7Bb). 따라서, 모델은 방광 충전 동안 요로의 양쪽에 생리 활성 매개체의 대사의 연구에 적합하다.

방광 충진 중 중재자의 경외성 수송 검사
디누데된 제제의 SubU/LP 측에 θATP를 첨가하면 루멘에서 θAMP, θADO 및 일부 θADP가 출현하여, 퓨린이 수부/LP로부터루멘(13)으로 이송될 수 있음을시사한다(도 7Ac). 마찬가지로, 루멘에 θATP를 추가하면 SubU/LP13(그림 7Db)에서θAMP 및 θADO가 나타나는 결과를 낳았습니다. θATP 응용 프로그램의 반대쪽에서는 θATP가 관찰되지 않았습니다. 함께, 이러한 관찰은 강하게 박리제없는 방광 준비는 충전하는 동안 중재자의 양측 경부 수송의 연구에 적합하다는 것을 건의합니다.

Figure 1
그림 1: 방광이 없는 방광 모델의 원리. (A) 방광 벽은 요로, suburothelium/lamina propria (SubU/LP), detrusor 근육 및 serosa로 구성됩니다. 이 층의 각각은 소변의 저장 그리고 무효화 도중 방광 기능을 위해 중요한 각종 세포 모형을 포함합니다. 방광 충전 도중, 생물학활성 매개체는 방광 루멘으로 그리고 SubU/LP에 있는 비뇨기근에서 분리기 근육을 포함하여 방광 벽에 깊은 세포에 영향을 미치기 위하여 풀어 놓입니다. 방광 루멘에 대한 접근은 비교적 간단하지만, 방광 벽의 세포에 영향을 미칠 수있는 요로 계수 유래 매개체를 감지하고 detrusor 근육 흥분을 제어하기 위해 채우는 동안 SubU / LP에 직접 액세스 할 수 없습니다. (B)세로사와 함께 detrusor 근육 층의 제거는 SubU / LP의 전체 표면을 노출하여 요로 유래 신호 분자가 방광 충진의 다른 단계에서 측정 될 수있는 SubU / LP에 직접 액세스 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 뮤린의 이골학은 손상되지 않고 방광벽이 없는 방광벽. 마슨의 삼조 염색은 그대로 채워진(A)및 방광(B)방광 벽은 방진 된 제제는 그대로 비뇨기과 (U) 및 SubU / LP를 포함하지만, detrusor 근육 (D) 및 세로사 (S)를 포함하지 않음을 보여줍니다. L, 루멘. 이 수치는 이전 출판물13에서재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 생체 내 방광 제제의 충진에 사용되는 실험 적 설정의 개략적 표현. 생체내 비옥한 방광(UB) 제제는 산소화 된 크렙스 중탄산염 용액 (KBS, 37 °C, pH 7.4)과 함께 관류되는 따뜻한 (37°C) 물 자켓 오르간 챔버에 배치된다. 방광 제제는 KBS와 상이한 충진속도 및 부피및 실험 전반에 걸쳐 기록된 내방압(BP)에 주입되어 이전간행물13에서재현된 수치이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 손상되지 않은 압력-체적 관계 및 탈지 없는 준비. (A)(B)는15 μL/min에서 크렙스-중탄산염 용액으로 채워진 생체 내 부피 및 압력의 대표적인 기록이다. 예상대로, 그대로 준비는 detrusor의 존재로 인해 과도 수축 (TC)를 개발했다. 대조적으로, 디누데된 제제는 TC가 부족하였다.(C)(D)용액의 >250 μL을 수용한 온전하고 디누이드 방광 제제의 압력 부피 관계의 요약된 데이터를 보여준다. 충진 부피와 내압은 방광 의 손상및 방광 제제에서 현저하게 유사했습니다. 이 수치는 이전 출판물13에서재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 충전 시 SubU/LP 및 루멘에서 요로열 유래 매개체의 가용성을 평가하는 데 활용된 단리방 모델의 회로도. 방광 제제는 물 자켓 챔버에 배치되고 산소 크렙스 중탄산염 용액 (KBS)으로 대체됩니다. 오줌 방광 (UB) 준비는 주입 펌프에 연결된 요도에 있는 카테터를 통해 온난하게 산소화된 KBS로 채워져 있습니다. 방광 압력 (BP)은 방광 충전 중에 주입 라인을 통해 3 방향 커넥터를 통해 모니터링됩니다. 외광(EL, 오르간 목욕) 및 내발 광내(IL) 용액의 샘플은 검출 애플리케이션에 따라 중재자(m)의 검출을 위해 처리됩니다. 이 수치는 이전 출판물13에서재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 방광 방지 제형은 충전 중에 SubU/LP의 중재자의 가용성을 측정하는 데 적합합니다. 대표적인 크로마토그램은그대로(A)및 방광 제형(B)의 방광 제제에서 초반간 샘플에서 퓨린의 가용성을 입증한다. 퓨린 중재자는 손상되지 않은 제제보다 디누데된 제제에서 더 잘 검출된다는 점에 유의하십시오. (C)루멘및 수부/LP에서 검출된 퓨린 풀에 대한 개별 퓨린의 상대적 기여도는 현저하게 다르다. 이 수치는 이전 출판물13에서재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 방광 충전 중 중재자의 대사 및 경외도 수송을 검사하는 데 적합한 방광 제비. (A, B) θATP 기판을 나타내는 대표적인크로마토그램(Aa,Ba). 기판이 SubU/LP(Ab) 또는 루멘(Bb) θATP에 적용될 때 σADP, θAMP 및 θADO가 증가하였다. 따라서, θATP는 응용 프로그램의 양쪽에서 저하된다; 그러나, θATP 제품의 형성은 SubU/LP 및 루멘에서 비대칭이다. θATP 제품은 θATP 제품 θAMP 및 θADO가 아니지만 기판 θATP는, θATP어플리케이션(Ac,Bc)의반대쪽에 나타났다. 따라서, 퓨리네스는 출원 중에 분리기 없는 제제의 벽을 통해 수송되는 것으로 보인다. 이 그림은13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Video 1
비디오 1: 방광 충전의 대표적인 기록. 방광을 15 μL/min. 비디오 5Hz에서 충전된 결합 장치(CCD) 카메라로 줌 입체 현미경을 사용하여 기록하였다; 기록은 25 mmHg 내압력에 도달하면 중단되었다. 이미지의 전체 지속 시간은 64배 의 실시간 입니다. 이 비디오는13에서재현되었습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).

Video 1
비디오 2: 방광 이없는 방광 충전의 대표 기록. 방광은 15 μl/min. 비디오 5Hz에서 CCD 카메라로 줌 스테레오현미경을 사용하여 기록하였습니다. 기록은 25mm Hg 내압력에 도달하면 중단되었다. 이미지의 전체 지속 시간은 실시간 64배입니다. 이 비디오는13에서재현되었습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).

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Discussion

방광에는 소변의 저장 그리고 무효화의 2개의 기능이 있습니다. 이러한 기능의 정상적인 작동은 방광 벽에 있는 세포를 통해 신호의 내발량 및 압력 및 전달의 적절한 기계적 감지를 필요로 하여 분리기 근육 흥분성을 조절합니다. 방광 점막 (urothelium)는 방광 벽에 있는 수많은 세포 모형에 영향을 미치는 SubU/LP에 있는 신호 분자의 다양한 방출해서 방광 흥분성을 통제하는 것으로 믿어집니다. 현재, 요로 테르륨 유래 매개체의 특성화에 대부분의 시도는 생리적인 방광 충진을 재생하지 않는 방광 준비 (예를 들면, 편평한 방광 벽 시트, 방광 벽 지구, 또는 배양된 세포)의 사용을 관련시킵니다. 방광 충전의 끝에 방광 루멘에서 풀어 놓이는 중재자의 측정은 비뇨기외의 반대측에서 이 매개체의 방출을 위한 표시로 자주 이용됩니다. 그러나, 최근 연구는 중재자의 내발 광 함량이 방광 벽(13)에서깊은 사용할 수있는 것을 대표하지 않는다는 것을 시사한다. 방광 충전 도중 SubU/LP에 접근을 가능하게 하는 새로운 실험적인 접근은 방광 요로, SubU/LP 및 DSM 사이 신호의 현지 기계장치의 우리의 이해를 더 하기 위하여 필요합니다.

여기서, 우리는13을채우는 동안 SubU/LP의 요로에서 방출된 중재자에 직접 접근을 제공하기 위해 제거기 근육이 제거되는 새로운 동물 방광 모델을 시연한다. denuded 준비는 밀접하게 방광13,18의충전과 유사하며, 방광 충전 중에 비뇨기과 의 성질이 변하지 않는다는 것을 시사합니다. 준비를 통해 척추 반사 및 탈지 근육에서 혼란스러운 신호가없는 방광에서 압력 볼륨 연구를 수행 할 수 있습니다. 따라서 SubU/LP에 출시된 중재자는 전신 영향이나 다른 소스의 오염 없이 측정할 수 있습니다. 방광 충전 중 다양한 부피와 압력으로 SubU/LP 부근에 직접 접근할 수 있는 능력은 방광 충진의 저장 및 사전 비공 처리 단계에서 생물학적 활성 매개체의 방출, 대사 및 경부 수송을 연구하기에 적합한 모델입니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 요로 와 SubU / LP를 그대로 유지하면서 제거평활근을 제거하는 것입니다. 절차는 편차 근육과 SubU/LP 사이 느슨한 연결 때문에 마우스 방광에서 특히 간단합니다. 본 제제는방광(13)과현저하게 유사한 압력-부피 특성을 가진 우수한 재현성을 보였다. 이 모델은 또한 편파기 근육이 부분적으로 또는 완전히 제거 될 수있는 더 큰 동물의 방광에서도 가능합니다. 예를 들어, 우리는 이전에 모델이 Cynomolgus 원숭이 마카카 근막염에서 방광에서 재생될 수 있음을 입증하고 준비 충전 시 SubU/LP에서 중재자가 측정될 수 있음을입증했습니다 13.

이 생체 내 모델의 잠재적 인 한계는 제제의 강도, 본질적으로 중추 신경계및 순환의 전신 효과의 부족이 방광 충전중에 점막 제거기 연결의 국소 메커니즘을 철저히 검사 할 수있는 문제입니다. 전신 효과의 부족은 수많은 ex vivo 접근과 공유됩니다, 고립된 방광 벽 시트 또는 스트립 또는 배양된 비뇨기과 세포를 포함하여. 그러나 방광이 없는 방광 모델은 방광 충진 과정에서 SubU/LP에 직접 접근할 수 있다는 점에서 비뇨기과 연구에서 앞서 언급한 접근법보다 우수합니다. 따라서,이 접근법의 사용은 방광을 채우는 동안 요로 에서 발생하는 메카노 민감성 메카노 트랜스 덕션 메커니즘에 대한 이해를 향상시킬 것입니다.

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Disclosures

이 작품의 일부는 이전에 생리학의 저널에 발표 되었다 (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). 이 출판물의 자료 사용에 대한 와일리와 Sons, Inc.의 허가가 부여되었습니다. 저자는 공개 할 재정적 또는 기타 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 당뇨병과 소화 및 신장 질환 보조금 DK41315의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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