En decentraliseret (ex vivo) murine blære model med detrusor musklen fjernet for direkte adgang til Suburothelium under blære fyldning

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den detrusor-fri blære model giver direkte adgang til suburothelium at studere lokale mekanismer til regulering af biologisk aktive mediator tilgængelighed i suburothelium/lamina propria under oplagring og tømning af urin. Præparatet minder meget om påfyldning af en intakt blære og tillader, at der udføres tryk volumen undersøgelser uden systemisk påvirkning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tidligere undersøgelser har etableret frigivelse af kemiske stoffer fra flade blære slimhinde ark anbragt i Ussing kamre og udsat for ændringer i hydrostatisk tryk eller mekanisk strækning og fra dyrkede urotheliale celler ved hydrostatiske trykændringer, stræk, celle hævelse, eller trække kræfter, og i blæren lumen ved slutningen af påfyldning. Sådanne fund førte til den antagelse, at disse mæglere også frigives i suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) under blære fyldning, hvor de påvirker celler dybt i blære væggen til i sidste ende regulere blære ophidelse. Der er mindst to indlysende begrænsninger i sådanne undersøgelser: 1) ingen af disse tilgange giver direkte oplysninger om tilstedeværelsen af mæglere i SubU/LP, og 2) de anvendte stimuli er ikke fysiologiske og ikke rekapitulere autentisk fyldning af blæren. Her diskuterer vi en procedure, der giver direkte adgang til suburothelial overflade af blære slimhinden i løbet af blære fyldningen. Den murine detrusor-fri forberedelse vi skabt tæt ligner påfyldning af den intakte blære og tillader tryk-volumen undersøgelser, der skal udføres på blæren i fravær af forstyrrende signalering fra spinal reflekser og detrusor glatte muskler. Ved hjælp af romanen detrusor-fri blære model, vi for nylig påvist, at intravesikal målinger af mæglere ikke kan bruges som en proxy til, hvad der er blevet frigivet eller til stede i SUBU/lp under blære fyldning. Modellen muliggør undersøgelse af urothelium-afledte signalerings molekyler, der frigives, genereres ved metabolisme og/eller transporteres ind i SubU/LP i løbet af blære fyldning for at transmittere oplysninger til neuroner og glat muskulatur i blæren og regulere dens ophidelighed under kontinens og vandladning.

Introduction

Formålet med denne model er at give direkte adgang til submucosavævet side af blære slimhinde under forskellige faser af blære påfyldning.

Blæren skal afstå fra for tidlig sammentrækning under påfyldning og tomt, når kritisk volumen og tryk er nået. Unormal kontinens eller tømning af urin er ofte forbundet med unormal ophidning af detrusor glatte muskulatur (DSM) i løbet af blære fyldning. Excitabilitet af DSM bestemmes af faktorer iboende til de glatte muskelceller og af påvirkninger genereret af forskellige celletyper i blære væggen. Væggen af urinblæren består af har (slimhinde), suburothelium (SUBU)/lamina propria (LP), detrusor glatte muskulatur (DSM) og serøse hinder (figur 1a). Har består af paraply celler (dvs. det yderste lag af har), mellemliggende celler og basal celler (dvs. det inderste lag af har). Forskellige typer af celler, herunder interstitiel celler, fibroblaster, afferent nerve terminaler, små blodkar, og immunceller bor i SubU/LP. Det er almindeligt antaget, at blæren har er et sensorisk organ, der indleder refleks vandladning og kontinens ved at frigive mæglere i submucosa, der påvirker cellerne i SUBU/lp og DSM1,2,3. For det meste er sådanne antagelser baseret på undersøgelser, der har påvist frigivelse af mæglere: fra stykker af slimhinder udsat for ændringer i hydrostatisk tryk4,5; fra dyrkede urotheliale celler udsat for stretch6,7, hypotonicity-induceret celle hævelse7 eller trække kræfter8; fra isolerede blære væg strimler ved receptor eller nerve aktivering9,10,11,12,13,14; og i blæren lumen i slutningen af blæren påfyldning15,16,17,18,19. Mens sådanne undersøgelser var medvirkende til at demonstrere frigivelse af mæglere på mekanisk stimulering af blære væg segmenter eller dyrkede urotheliale celler, de har brug for at blive understøttet af direkte beviser for frigivelse af mæglere i submucosa, der er fremkaldt af fysiologiske stimuli, der gengiver blære påfyldning. Dette er en udfordrende opgave, da SubU/LP er placeret dybt i blære væggen hæmmer den ligetil adgang til nærheden af SubU/LP under blære fyldning.

Her illustrerer vi en decentraliseret (ex vivo) murine blære model med detrusor muskel fjernet13 , der blev udviklet for at lette undersøgelser af lokale mekanismer af mekanisotransduktion, der deltager i signalering mellem blæren UROTHELIUM, DSM og andre celletyper i blære væggen. Denne fremgangsmåde er bedre end at bruge flad blære Vægplader, blære væg strimler eller kulturperler urotheliale celler, fordi det giver mulighed for direkte målinger i nærheden af SubU/LP af urothelium-afledte mediatorer, der frigives eller dannes som reaktion på fysiologiske belastninger og volumener i blæren og undgår potentielle fænotypiske ændringer i cellekultur. Det kan bruges til at måle tilgængelighed, frigivelse, metabolisme og transurothelial transport af mæglere i SubU/LP på forskellige stadier af blære fyldning (figur 1b). Præparatet kan også anvendes til at undersøge urothelialt signalering og mekanisotransduktion i modeller af overaktiv og under aktiv blære syndromer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr beskrevet i dette manuskript blev gennemført i henhold til National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr og den institutionelle dyr brug og pleje udvalg på University of Nevada.

Bemærk: den model, der præsenteres her, består af fjernelsen af detrusor-musklen, mens har og SUBU/lp forbliver intakt (figur 1B) for at gøre det muligt for investigatorerne at få direkte adgang til SUBU/lp i løbet af blære fyldningen.

1. dissektion af detrusor-fri blære præparat

  1. Placer den isolerede blære i en dissekere skål fyldt med kulde (10 °c) og oxygeneret med 5% Co2/95% O2 Krebs bicarbonat opløsning (KBS) med følgende sammensætning (mm): 118,5 NaCl, 4,2 KCl, 1,2 mgcl2, 23,8 NaHCO3, 1,2 KH2po4, 11,0 dextrose, 1,8 CaCl2 (pH 7,4)13.
  2. Fastgør en lille del af kuplen af den isolerede blære til en Sylgard-dækket dissekting skål fyldt med KBS. Sørg for, at nålen går gennem et stykke af serøse hinder eller den yderste kant af detrusor musklen langt fra den inderste kant af musklen, der vender mod SUBU/lp.
  3. Ved hjælp af et mikroskop, identificere urinrøret og urinlederne og fastgør hver af dem til bunden af dissekere skålen.
  4. Fjern den overskydende fedtvæv og bindevæv, således at hele hoveddelen af blæren, urinrøret og begge urinlederne vises.
  5. Binde urinlederne med 6-0 nylon suturer. Derefter Fastgør de åbne ender af urinlederne mod bunden af dissekere skålen for at sikre præparatet.
  6. Brug fine-tip pincet, forsigtigt trække et stykke af serøse hinder i hjørnet mellem ureter og blære kroppen.
  7. Juster lyset af mikroskopet for at øge gennemsigtigheden og skelne margenen af submucosa under detrusor musklen.
  8. Begynd at skære (ikke skrælle!) blære væggen med fine-tip saks langs den indvendige overflade af detrusor muskellag, mens forsigtigt trække det afskårne segment væk fra præparatet. På alle tidspunkter, sikre, at den laterale kant af slimhinden kan ses og undgå at røre den.
  9. Fjern detrusor musklen helt ved at dreje rundt om dissekere skålen, så placeringen af præparatet er behageligt at fortsætte dissekere ud detrusor musklen.
  10. Efterlad et lille stykke af detrusor muskel på toppen af blæren kuppel for at sikre evnen til at imholde præparatet under de resterende trin i protokollen.
  11. Lav en dobbelt løkke af 6-0 nylon tråd, Placer den omkring halsen af blæren forberedelse, og lad løkken løs.
  12. Tilsæt en anden dobbelt løkke af 6-0 silketråd, Placer den omkring halsen af blæren forberedelse, og lad løkken tabe. At have to suturer forhindrer lækager omkring suturerne.
  13. Skær omkring 2 cm af 20 PE slanger (kateter), blusser op spidsen ved at bevæge sig langsomt spidsen tæt på en flamme.
  14. Fyld kateteret med varme (37 °C) oxygenerede KB'ER.
  15. Indsæt kateteret i blæren urinrøret og skub forsigtigt kateteret, indtil kateterspidsen når omtrent midt i blæren.
  16. Binde suturen omkring kateteret og det omgivende væv i blære halsen.
  17. Fyld langsomt blæren med ca. 50-100 μL varme (37 °C) oxygenerede KB'ER, løft den kortvarigt (< 10 s) over overfladen af KBS, og Overvåg for lækager ved suturer og blære krop.
  18. Hvis der ikke observeres lækage, er præparatet klar til forsøget. Hvis der observeres en lækage omkring suturen, skal du fjerne suturen og udskifte den. Hvis en lækage fra et hul i blære kroppen er bemærket, kassere præparatet.

2. fyldning af den udledte blære forberedelse

  1. Perfuse KBS (37 °C) i et 3 mL kammer af vand (37 °C) med sjal orgel skål med en Sylgard bund.
  2. Justér oxygen-og sugeledningerne.
  3. Placer den udledte blære forberedelse i kammeret.
  4. Fastgør kateteret til siden af kammeret, så præparatet ikke flyder over overfladen af perfusions opløsningen.
  5. Tilslut blærekateteret til en længere PE20 slange (infusionsslange) forbundet til tre vejs stophane ved hjælp af samme størrelse montering.
  6. Sørg for, at linjerne mellem infusionspumpen, tryk transduceren og blæren er åbne.
  7. Fyld infusions sprøjten med friske, varme (37 °C) og oxygenerede KB'ER.
  8. Juster pumpe parametrene: sprøjte type/-volumen (dvs. 1 mL), drift (dvs. Infuse), flow (dvs. konstant) og strømningshastighed (dvs. 15 μL/min).
  9. Tryk på Start knappen på sprøjtepumpen for at fylde blæren.
  10. Overvåg påfyldningsvolumen og intravesikal tryk under fyldning af blæren.

3. påvisning af mediatorer i SubU/LP-aspektet af den udledte blære tilberedning

  1. Saml aliquoter af badet opløsning i iskold mikrocentrifuge rør eller højtydende væskekromatografi (HPLC) skær.
  2. Forbered og Behandl prøverne i overensstemmelse med den relevante detekterings applikation. I tilfælde af påvisning af purin-tilgængelighed, Behandl prøverne med HPLC med fluorescens detektering13,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Væggen af murine detrusor-fri blære præparat er intakt og indeholder alle lag undtagen DSM og serosa. Proof-of-princip undersøgelser viste, at den DSM-fri blære væg omfatter har og SUBU/lp, mens tunika muscularis og serøse hinder er fraværende (figur 2)13.

Påfyldning af detrusor-fri blære tilnærme normal blære fyldning. Figur 3 viser skematisk opstilling af det eksperimentelle setup til påfyldning af ex vivo-blære præparater ved forskellige påfyldnings hastigheder, volumener og intraluminialt tryk. Murine ex vivo intakte og udledte blære præparater kræver en bred vifte af påfyldnings volumener for at nå det nedbrudte Tryk13. Forholdet mellem tryk og volumen er bemærkelsesværdigt ens i de intakte og denuderede præparater (film 1, film 2og figur 4). Derfor er det DSM-fri præparat egnet til funktionelle undersøgelser af den rolle, har og SUBU/lp i blære mekaniske fornemmelse og mekanisotransduktion.

Mulig brug af den detrusor-fri blære model
Mål tilgængeligheden af mæglere i blæren lumen og SubU/LP under blære fyldning
Den eksperimentelle opsætning til opsamling af ekstraluminial (EL; f. eks. bade SubU/LP) og intraluminal (IL) prøver under påfyldning af blære præparater under overvågning af blære trykket illustreres i figur 5. Egnetheden af modellen til måling af urothelium-afledte mediatorer, der frigives i SubU/LP side under påfyldning blev testet ved at måle frigivelsen af purin mediatorer (f. eks. adenosin 5 '-trifosfat, ATP; adenosin 5 '-diphosphat, ADP; nicotinamid-adenin dinucleotid, NAD; adenosin 5 '-monophosphat, AMP; og adenosin, ADO) i opløsningen badning SubU/LP af det udledte præparat. Som det fremgår af figur 6A, blev der påvist ubetydelige mængder puriner i badet, som indeholdt en isoleret BLÆRE tilberedning med intakt DSM, hvorimod mængderne af disse puriner var signifikant højere i prøver, der blev indsamlet fra badet, og som indeholdt en udbrudt blære tilberedning (figur 6B). Navnlig var fordelingen af puriner og metabolitter i prøver indsamlet fra lumen og SubU/LP i slutningen af fyldningen meget forskellig (figur 6C).

Undersøg ekstracellulær metabolisme af mediatorer i SubU/LP under blære fyldning
Tilsætning af den stærkt fluorescerende analog af ATP, 1, N6-Etheno-ATP (εatp), til den suburotheliale side af den detrusor-fri forberedelse resulterede i et fald i εatp og en stigning i Εatp-produkterne Εadp, Εamp, og εado (figur 7AA og figur 7AB). På samme måde resulterede tilføjelsen af εATP i forberedelsen af lumen i et fald i εATP og en stigning i εADP, εAMP og εADO i lumen (figur 7BA og figur 7BB). Derfor er modellen egnet til undersøgelser af metabolismen af bioaktive mediatorer på begge sider af urotheliumet under fyldning af blæren.

Undersøg transurothelial transport af mæglere under fyldning af blæren
Tilføjelsen af εatp til SUBU/lp siden af den udledte forberedelse resulterede i fremkomsten af εamp, εado og nogle εadp i lumen, hvilket tyder på, at puriner kan transporteres fra SUBU/lp til lumen13 (figur 7AC). På samme måde resulterede tilføjelsen af εATP i lumen i fremkomsten af εAMP og εADO i SubU/LP13 (figur 7DB). Bemærk, at der ikke blev observeret nogen εATP på den modsatte side af εATP-applikationen. Tilsammen tyder disse observationer på, at detrusor-frie blære præparat er egnet til studier af bilateral transurothelial transport af mæglere under påfyldning.

Figure 1
Figur 1: princippet i den detrusor-fri blære model. (A) Blæren væggen består af urothelium, suburothelium/lamina propria (SubU/LP), detrusor muskel og serosa. Hvert af disse lag indeholder forskellige celletyper, der er vigtige for blære funktioner under opbevaring og tømning af urin. Under påfyldning af blæren frigives biologisk aktive mediatorer fra urotheliumet i blæren lumen og i SubU/LP til at påvirke cellerne dybt i blære væggen, herunder detrusor-musklen. Mens adgangen til blæren lumen er relativt ligetil, er der ingen direkte adgang til SubU/LP under påfyldning for at detektere urothelium-afledte mediatorer, der kan påvirke celler i blære væggen og kontrol detrusor muskel excitabilitet. (B) fjernelse af detrusor muskellag sammen med serøse hinder udsætter hele overfladen af SUBU/lp giver direkte adgang til SUBU/lp hvor urothelium-afledte signalering molekyler kan måles i forskellige faser af blære fyldning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: histologi af murine intakt og detrusor-fri blære vægge. Masson-trikrom farvning af fyldt intakt (A) og detrusor-fri (B) blære vægge viser, at det udledte præparat indeholder intakt har (U) og SUBU/lp, men ikke detrusor-musklen (D) og serøse hinder (s). L, lumen. Dette tal er gengivet fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk gengivelse af forsøgs opsætning anvendt ved påfyldning af ex vivo-blære præparater. Den ex vivo intakte eller denuderede urinblære (UB) Præparat anbringes i et varmt (37 °C) vand-jacketed organ kammer, der er perfektioneret med oxygenerede Krebs-bicarbonat opløsning (KBS, 37 °C, pH 7,4). Blære præparatet inanvendes med KBS ved forskellige påfyldnings hastigheder og-volumener, og det intraluminale blære tryk (BP) registreres i hele eksperimentet dette tal er gengivet fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Tryk-volumen relationer i intakt og detrusor-frie præparater. A) ogB) er repræsentative optagelser af intravesikal volumen og tryk af ex vivo intakte og udledte blære præparater, der er fyldt med Krebs-bikarbonat opløsning ved 15 μl/min. Som forventet udviklede det intakte præparat forbigående sammentrækninger (TCs) på grund af tilstedeværelsen af detrusor. I modsætning hertil manglede det udledte præparat TCs. (C) og (D) viser opsummerede data for tryk-volumen forhold af intakte og udledte blære præparater, der imødekom > 250 μl opløsning. Bemærk, at påfyldnings volumener og intravesikal tryk var bemærkelsesværdigt ens i de intakte og denuderede blære præparater. Dette tal er gengivet fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: skematisk diagram over den isolerede blære model udnyttes til at evaluere tilgængeligheden af urothelium-afledte mediatorer i SubU/lp og lumen under påfyldning. Blæren præparat er placeret i et vand-kappe kammer og superfbrugt med oxygenerede Krebs bicarbonat opløsning (KBS). Tilberedningen af urinblæren (UB) er fyldt med varme oxygenerede KB'ER via et kateter i urinrøret forbundet med en infusionspumpe. Blære tryk (BP) overvåges via et trevejs stik gennem infusions linjen under fyldning af blæren. Prøver fra ekstraluminial (EL, orgel bad) og intraluminal (IL) opløsninger behandles til påvisning af mediatorer (m) i henhold til detekterings applikationer. Dette tal er gengivet fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: den detrusor-fri blære forberedelse er egnet til at måle tilgængeligheden af mæglere i SubU/lp under påfyldning. Repræsentative kromatogrammer, der viser tilgængeligheden af puriner i de ekstraluminiale prøver i intakte (A) og detrusor-frie (B) blære præparater. Bemærk, at purin mediatorer er bedre detekteret i den udledte præparat end i den intakte præparat. C) de enkelte puriner relative bidrag til de purin-puljer, der påvises i lumen, og i SUBU/lp af den udledte tilberedning er væsentligt anderledes. Dette tal er gengivet fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: den detrusor-fri blære forberedelse er egnet til at undersøge metabolisme og transurothelial transport af mæglere under blære fyldning. (A, B) Repræsentative kromatogrammer, der viser εATP-substrat (AA, BA). Når substratet påføres enten SubU/LP (AB) eller lumen (BB), faldt εatp, og produkterne Εadp, Εamp og εado blev forøget. Derfor nedbrydes εATP på hver side af ansøgningen; dannelsen af εATP-produkter er imidlertid asymmetrisk i SubU/LP og lumen. Bemærk, at εATP-produkterne εAMP og εADO, men ikke substratet εATP, optrådte på den modsatte side af εATP-applikationen (AC, BC). Derfor synes puriner at være transporteret gennem væggen af detrusor-fri forberedelse under indgivelsen. Dette tal er blevet ændret fra13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: repræsentativ optagelse af intakt blære fyldning. Blæren blev fyldt ved 15 μL/min. video blev indspillet ved hjælp af et zoom-stereomicroskop med et opladet enhed (CCD) ved 5 Hz; optagelsen blev stoppet, når man nåede op på 25 mmHg intraluminalt tryk. Den fulde varighed af billedet er 64x real-time. Denne video er blevet gengivet fra13. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).

Video 1
Video 2: repræsentativ optagelse af detrusor-fri blære fyldning. Blæren blev fyldt ved 15 μl/min. video blev indspillet ved hjælp af et zoom-stereomicroskop med et CCD-kamera ved 5 Hz; optagelsen blev stoppet efter at have nået 25 mm Hg intraluminalt tryk. Den fulde varighed af billedet er 64 gange i realtid. Denne video er blevet gengivet fra13. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Blæren har to funktioner: opbevaring og tømning af urin. Normal drift af disse funktioner kræver korrekt mekanisk sensing af intraluminal volumen og tryk og transduktion af signaler gennem celler i blære væggen til at regulere detrusor muskel excitabilitet. Blæren slimhinde (urothelium) menes at regulere blære ophidelse ved at frigive en række signalering molekyler i SubU/LP, der påvirker talrige celletyper i blære væggen. I øjeblikket er de fleste forsøg på karakterisering af urothelium-afledte mediatorer involverer brug af blære præparater (f. eks, flad blære Vægplader, blære væg strimler, eller dyrkede celler), der ikke gengiver fysiologiske blære påfyldning. Målinger af mediatorer, der frigives i blæren lumen i slutningen af blære fyldning bruges ofte som indikation for frigivelse af disse mæglere fra den modsatte side af urothelium. Men, nylige undersøgelser tyder på, at intraluminalt indhold af mæglere ikke er repræsentativ for, hvad der er til rådighed dybt i blæren væggen13. Nye eksperimentelle tilgange giver adgang til SubU/LP under blære påfyldning er nødvendige for at fremme vores forståelse af lokale mekanismer for signalering mellem blære urothelium, SubU/LP og DSM.

Her viser vi en ny dyre blære model, hvor detrusor musklen fjernes for at give direkte adgang til mediatorer frigivet fra har i SUBU/lp under påfyldning13. Den udledte præparat ligner nøje påfyldning af intakt blære13,18, hvilket tyder på, at manglen på detrusor musklen ikke ændrer de mekanisosensitive egenskaber af har under blære fyldning. Præparatet tillader tryk-volumen undersøgelser, der skal udføres på blæren i fravær af forstyrrende signalering fra spinal reflekser og detrusor muskel. Derfor kan mediatorer, der frigives i SubU/LP, måles uden systemiske påvirkninger eller kontaminering fra andre kilder. Evnen til at få direkte adgang til nærheden af SubU/LP ved forskellige volumener og tryk under fyldning af blæren gør modellen egnet til at studere frigivelse, metabolisme og transurothelial transport af biologisk aktive mediatorer under opbevaring og pre-voiding stadier af blære fyldning.

Det mest kritiske skridt i denne protokol er fjernelsen af detrusor glatte muskler samtidig holde har og SUBU/lp intakt. Proceduren er særlig ligetil i muse blæren på grund af den løse forbindelse mellem detrusor musklen og SubU/LP. Præparaterne viste fremragende reproducerbarhed med bemærkelsesværdigt lignende tryk volumen egenskaber til intakte blærer13. Modellen er også mulig i blærer fra større dyr, hvor detrusor musklen kan helt eller delvist fjernes. For eksempel har vi tidligere vist, at modellen kan gengives i blæren fra Cynomolgus Monkey Macaca fascicularis og viste, at mediatorer kan måles i SUBU/lp under klargøring påfyldning13.

Den potentielle begrænsning af denne ex vivo model er selve spørgsmålet, der er styrken af præparatet, i det væsentlige, manglen på systemiske virkninger af centralnervesystemet og cirkulation tillader grundig undersøgelse af lokale mekanismer af slimhinde-detrusor tilslutningsmuligheder under blære påfyldning. Mangel på systemiske virkninger deles med talrige ex vivo tilgange, herunder isolerede blære Vægplader eller strimler eller dyrkede urotheliale celler. Den detrusor-fri blære model, dog, er bedre end de førnævnte tilgange i urothelialt forskning i, at det giver direkte adgang til SubU/LP i løbet af blære påfyldning. Derfor vil brugen af denne fremgangsmåde øge forståelsen af mekanismefølsomme mekanismetransduktion mekanismer, der stammer i har under påfyldning af blæren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dele af dette arbejde blev tidligere offentliggjort i Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). Der er givet tilladelse af Wiley og Sons, Inc. til brug af materialer fra denne publikation. Forfatterne har ingen finansielle eller andre konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institute of diabetes og fordøjelses-og nyresygdomme Grant DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
  2. Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 57-62 (2016).
  3. Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
  4. Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
  5. Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
  6. Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
  7. Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
  8. McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
  9. Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
  10. Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
  11. Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
  12. Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
  13. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
  14. Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
  15. Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
  16. Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
  17. Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
  18. Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
  19. Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics