分散(Ex Vivo)的毛骨球模型,去除了除位肌肉,用于在膀胱填充期间直接进入苏布罗氦

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Summary

无分泌物的膀胱模型允许直接进入亚尿层,以研究在尿液储存和排空期间调节亚尿层/拉米纳尿体中生物活性介质可用性的本地机制。制备与填充完整膀胱非常相似,允许在无系统影响的情况下进行压力体积研究。

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Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

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Abstract

先前的研究已经确定,在静水压力变化、拉伸、细胞肿胀或阻力时,在静水压力变化、拉伸、细胞肿胀或阻力时,以及气囊流明在填充结束时,从扁平膀胱粘液片中释放化学物质,暴露于静水压力或机械拉伸的变化中,并暴露于培养的泌尿细胞中。这些发现导致假设,这些介质也被释放在子尿层(SubU)/拉米纳丙酸(LP)在膀胱填充,其中他们影响细胞深在膀胱壁,最终调节膀胱兴奋性。此类研究中至少有两个明显的局限性:1) 这些方法均未提供有关子U/LP 中调解员存在的直接信息;2) 使用的刺激不是生理上的,并且不重述膀胱的真实填充。在这里,我们讨论一个程序,使直接访问膀胱粘液的亚尿道表面在膀胱填充过程中。我们创造的无鼠排骨制剂与完整膀胱的填充非常相似,允许在没有来自脊柱反射和分离肌的混淆信号的情况下,对膀胱进行压力体积研究。使用新型无分子膀胱模型,我们最近证明,在膀胱填充过程中,不能将介质的宫内测量用作 SubU/LP 中释放或存在的物的代理。该模型能够检查在膀胱填充过程中释放、代谢产生和/或输送到SubU/LP的泌尿衍生信号分子,以将信息传输到膀胱的神经元和平滑肌,并调节其在节制和气动过程中的兴奋性。

Introduction

此模型的目的是使膀胱粘膜在膀胱填充的不同阶段能够直接进入下粘膜侧。

膀胱在填充过程中必须避免过早收缩,当达到临界体积和压力时,膀胱必须避免过早收缩。尿液异常的失禁或空位经常与膀胱填充过程中分度平滑肌(DSM)的异常兴奋性有关。DSM 的可兴奋性由平滑肌细胞固有的因素和膀胱壁内不同细胞类型产生的影响决定。膀胱壁由尿道(粘液)、亚尿体(SubU)/拉米纳利普里亚(LP)、德特鲁索平滑肌(DSM)和塞罗萨(图1A)组成。尿体由伞状细胞(即尿体最外层)、中间细胞和基底细胞(即尿体最内层)组成。各种类型的细胞,包括间质细胞、成纤维细胞、神经终端、小血管和免疫细胞都驻留在SubU/LP中。人们普遍认为膀胱尿毒症是一种感觉器官,通过将介质释放到影响SubU/LP和DSM1、2、3的细胞的亚粘体中,启动反射性粘动和节制。在大多数情况下,这些假设基于已经证明释放介质的研究:从暴露于静水压力变化的粘液片4,5;从培养的尿毒细胞暴露到拉伸6,7,低度引起的细胞肿胀7阻力8;从分离的膀胱壁条受体或神经激活9,10,11,12,13,14;并在膀胱流明在膀胱填充结束15,16,17,18,19。虽然这些研究有助于证明在机械刺激膀胱壁段或培养的泌尿细胞时释放介质,但它们需要有直接证据支持,以释放通过复制膀胱填充的生理刺激引起的子粘膜中介质的释放。这是一项具有挑战性的任务,因为 SubU/LP 位于膀胱壁深处,妨碍在膀胱填充过程中直接进入 SubU/LP 附近。

在这里,我们演示一个分散(前体)鼠膀胱模型与去皮肌肉去除13,这是开发,以促进研究局部机制的中导转导,参与膀胱尿,DSM和膀胱壁的其他细胞类型之间的信号。这种方法优于使用扁平膀胱壁片、膀胱壁带或培养的泌尿细胞,因为它允许在SubU/LP附近直接测量尿毒源介质,这些介质是因膀胱中的生理压力和体积而释放或形成的,并避免细胞培养中潜在的表型变化。它可用于测量子U/LP中调解员在膀胱填充的不同阶段的可用性、释放、代谢和横射物传输(图1B)。该制剂还可用于检查过度活跃和不足的膀胱综合征模型中的泌尿信号和中导转导。

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Protocol

本手稿中描述的涉及动物的所有程序均按照国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》和内华达大学机构动物使用与护理委员会进行。

注:此处介绍的模型包括去除除精肌肉,而尿道和SubU/LP保持完好(图1B),使调查人员在膀胱填充过程中直接访问SubU/LP。

1. 解剖无除气囊准备

  1. 将分离的膀胱放入充满冷 (10 °C) 的解剖盘中,用 5% CO2/95 % O2克雷布斯碳酸氢盐溶液 (KBS) 进行氧化,具有以下组合物 (mM): 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2,23.8 NaHCO3,1.2 KH2PO4,11.0 分丝蔗, 1.8钙2 (pH 7.4)13.
  2. 将隔离膀胱圆顶的一小部分固定到塞加德覆盖的充满 KBS 的解剖盘中。确保销穿过一块 serosa 或离子/LP 的肌肉最内侧远离的肌肉的最内边缘最外边缘。
  3. 使用显微镜,识别尿道和输尿管,并将其分别固定在解剖盘的底部。
  4. 去除多余的脂肪和结缔组织,以便显示膀胱的整个主体、尿道和两个输尿管。
  5. 用6-0尼龙缝合线连接输尿管。然后,将输尿管的开端固定到解剖盘的底部,以确保准备。
  6. 使用细尖钳子,轻轻地拉一块塞罗萨在输尿管和膀胱体之间的角落。
  7. 调整显微镜的光线以增加透明度,并区分下半角肌的底数。
  8. 开始切割 (不剥! ) 沿装饰肌肉层的内表面用细尖剪刀切割 (不剥!) 膀胱壁,同时轻轻地将切段从准备中拉开。在任何时候,确保可以看到粘巴的侧边,避免接触它。
  9. 通过转动解剖盘完全去除分离肌,使准备的位置舒适,继续解剖出分离肌。
  10. 在膀胱圆顶顶部留下一小块除位肌,以确保在协议的剩余步骤中固定制剂的能力。
  11. 做一个6-0尼龙线的双环,放在膀胱准备的脖子上,让环松弛。
  12. 加入6-0丝线的第二双环,将其放在膀胱准备的脖子上,让循环丢失。有两个缝合线可以防止缝合线周围泄漏。
  13. 切割约 2 厘米的 20 PE 管(导管),通过缓慢移动接近火焰的尖端来燃起尖端。
  14. 用热 (37 °C) 含氧 KBS 填充导管。
  15. 将导管插入膀胱尿道的孔中,轻轻推导管,直到导管尖端大约到达膀胱中间。
  16. 将缝合线系在导管和膀胱颈部周围组织周围。
  17. 缓慢地向膀胱填充约 50-100 μL 的加热 (37°C) 含氧 KBS,将其短暂提升(+lt;10 s)以上,并监测缝合线和膀胱体有无泄漏。
  18. 如果未发现泄漏,则准备进行实验。如果观察到缝合线周围有泄漏,则取出缝合线并更换。如果发现膀胱体孔泄漏,请丢弃制剂。

2. 填充脱阴囊准备

  1. 将 KBS (37 °C) 注入具有 Sylgard 底部的水 (37 °C) 夹套器官盘的 3 mL 腔室中。
  2. 调整氧气和吸入管路。
  3. 将脱损膀胱制剂放入腔室中。
  4. 将导管固定在腔室的一侧,使制备物不会浮在灌注溶液表面上方。
  5. 使用相同尺寸的接头将膀胱导管连接到连接到三向止油管的较长 PE20 管(输液管)。
  6. 确保输液泵、压力传感器和气囊之间的管路打开。
  7. 在输液注射器中填充新鲜、温暖(37°C)和含氧KBS。
  8. 调整泵参数:注射器的类型/体积(即1 mL)、操作(即注入)、流量(即常数)和流速(即15 μL/min)。
  9. 按注射器泵上的"开始"按钮以填充膀胱。
  10. 在膀胱填充过程中监测填充量和静脉内压力。

3. 检测脱阴囊制剂的子U/LP方面中的调解员

  1. 将沐浴溶液的等分收集到冰冷的微离心管或高性能液相色谱 (HPLC) 刀片中。
  2. 根据适当的检测应用准备和处理样品。在检测紫菜可用性的情况下,用荧光检测13、18处理HPLC的样品。

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Representative Results

无鼠排叶的膀胱制剂壁完好无损,包含除 DSM 和 Serosa 外的所有层。原理证明研究表明,无DSM的膀胱壁包括尿道和SubU/LP,而图尼卡肌肉和serosa则不存在(图2)13。

无分子膀胱的填充近似于正常膀胱填充。图3显示了以不同填充速率、体积和宫内压力填充体外膀胱制剂的实验设置原理图。鼠前活体完整和脱光膀胱制剂需要广泛的填充量达到空压13。压力-体积关系在完整和脱色的准备中非常相似(电影1,电影2图4)。因此,无DSM制剂适用于泌尿和SubU/LP在膀胱美感和中导转导中的作用的功能研究。

可能使用无除板模型
测量膀胱流明和SubU/LP在膀胱填充过程中的介质的可用性
图5显示了在填充膀胱制剂期间收集超光(EL;例如沐浴SubU/LP)和宫内(IL)样品的实验设置,同时监测膀胱压力。通过测量紫皮介质的释放(例如,例如,: 腺苷 5' - 三磷酸, ATP; 腺苷 5'- 二磷酸盐, ADP; 烟酰胺腺苷二核苷二核苷, NAD; 腺苷 5' - 单磷酸盐, AMP; 和腺苷, ADO) 在溶液中沐浴下U/LP的脱脂制剂。如图6 A所示,在含有完整DSM的分离膀胱制剂的浴液中检测到可忽略的紫杉醇,而从含有脱血膀胱制剂的沐浴中采集的样本中,这些紫杉醇的含量明显较高(图6B)。值得注意的是,从流明和子U/LP在填充结束时收集的样品中,紫杉醇和代谢物的分布差异很大(图6C)。

在膀胱填充过程中检查子U/LP中介质的细胞外代谢
将ATP、1、N6-etheno-ATP([ATP))的高荧光模拟物添加到无分泌物制剂的亚尿层侧,导致βATP的减少和βATP产品[ADP、+AMP和+ADO'(图7Aa图7Ab)的增加。同样,在制备流明中添加 _ATP 会导致 μATP 的减少,并且流明中的 _ADP、_AMP 和 _ADO 增加(图 7Ba图 7Bb)。因此,该模型适用于膀胱填充过程中泌尿体两侧生物活性介质的代谢研究。

在膀胱填充过程中检查介质的跨尿传递
在脱模制剂的SubU/LP侧添加βATP,导致流明中出现βAMP、[ADO和某些ΜADP》,这表明紫杉醇可以从SubU/LP输送到流明13(图7Ac)。同样,在流明中添加 _ATP 会导致在 SubU/LP13中出现 _AMP 和 _ADO(图 7Db)。请注意,在 _ATP 应用程序的另一侧未观察到 _ATP。这些观察结果共同强烈表明,无分泌物膀胱制剂适用于在填充过程中对介质的双边横皮传输的研究。

Figure 1
图1:无阴囊模型原理。A)膀胱壁由尿道、亚尿石/拉米纳螺旋体(SubU/LP)、德特鲁索肌肉和serosa组成。每一层都含有各种细胞类型,这些细胞类型对尿液储存和排空期间的膀胱功能非常重要。在膀胱填充过程中,生物活性介质从尿道释放到膀胱流明和SubU/LP中,以影响膀胱壁深处的细胞,包括分泌体肌肉。虽然进入膀胱流明相对简单,但在填充过程中没有直接访问 SubU/LP 来检测可能影响膀胱壁细胞的泌尿体衍生介质,并控制切除肌肉的兴奋性。(B) 去除除草体肌肉层以及 serosa 暴露 SubU/LP 的整个表面,从而能够直接进入 SubU/LP,在膀胱填充的不同阶段可以测量泌尿衍生信号分子。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:鼠原无缺损无分体膀胱壁的法学。马森的三色染色填充完好 (A) 和无脱毛剂 (B) 膀胱壁表明,脱毛制剂包含完整的尿毒症 (U) 和 SubU/LP, 但不是脱毛肌 (D) 和 s.L,流明。这个数字已由上一份刊物13转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:用于填充前体膀胱制剂的实验设置的原理图表示。外体完整或脱光膀胱 (UB) 制剂被放置在一个温暖的 (37 °C) 水套器官室中,该器官室中充满了含氧的 Krebs-碳酸氢盐溶液(KBS,37°C,pH 7.4)。膀胱制剂以不同的填充速率和体积注入KBS,并且整个实验过程中记录着宫内膀胱压力(BP) 这个数字从以前的出版物13中转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:完整和无损性制剂中的压力-体积关系。A) 和 (B) 是体外完整和脱脂膀胱制剂的体内体积和压力的代表性记录,在 15 μL/min 时填充了克雷布斯-碳酸氢盐溶液。正如预期的那样,由于存在解构器,完整制剂出现瞬态收缩 (TC)。相比之下,脱脂制剂缺乏TC.(C)和(D)显示完整和脱脂膀胱制剂的压力-体积关系汇总数据,这些制剂适应>250 μL溶液。请注意,填充体积和静脉内压力在完整和脱损的膀胱制剂中非常相似。这个数字已由上一份刊物13转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:用于评估子U/LP和流明中泌尿衍生介质在填充过程中的分离膀胱模型的原理图。膀胱制备被放置在水套室中,并超含含氧克雷布斯碳酸氢盐溶液(KBS)。膀胱 (UB) 制剂通过连接到输液泵的尿道中的导管充满热氧 KBS。在膀胱填充过程中,通过输注管的三向接头监测膀胱压力 (BP)。根据检测应用,处理来自超发光(EL、器官浴)和中光(IL)溶液的样品,用于检测介质(m)。这个数字已由上一份刊物13转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:无分子膀胱制剂适用于在填充过程中测量SubU/LP中介质的可用性。代表性色谱图,证明在完整 (A) 和无分度 (B) 膀胱制剂的超光样品中纯度的可用性.请注意,在脱皮制剂中,与完整制剂相比,在紫皮介质中检测出更好的介质。(C) 在流明和 SubU/LP 中检测到的紫杉醇池的相对贡献显著不同。这个数字已由上一份刊物13转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:无分泌物膀胱制剂适用于在膀胱填充过程中检查介质的代谢和横贯物的传递。A,B)显示 [ATP 基质 (Aa, Ba) 的代表性色谱图 。当基板应用于SubU/LP(Ab)或流明(Bb)时,降低产品[ADP、+AMP和+ADO'。因此,在应用的任意一端都降级了 _ATP;因此,在应用的任意一端都降级了 _ATP。然而,在子U/LP和流明中,αATP产物的形成是不对称的。请注意,[ATP 产品 [AMP 和 _ADO,但不是基板 _ATP,出现在 _ATP 应用(Ac, Bc) 的另一侧。因此,在提交过程中,纯度似乎通过无分物制剂的墙运输。这个数字已由13修改为13。请点击此处查看此图的较大版本。

Video 1
视频 1:完整膀胱填充的代表性记录。膀胱以15μL/min填充。视频使用带带电耦合装置(CCD)的变焦立体显微镜在5Hz下录制;当达到25 mmHg的内光压力时,记录停止。图像的完整持续时间为 64 倍实时。这段视频是从13日转载的。请点击此处查看此视频(右键单击下载)。

Video 1
视频 2: 无排他膀胱填充的代表性记录。膀胱以15μl/min填充。视频使用变焦立体显微镜与CCD相机在5赫兹;当达到25毫米汞柱的内光压力时,记录停止。图像的完整持续时间是实时的 64 倍。这段视频是从13日转载的。请点击此处查看此视频(右键单击下载)。

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Discussion

膀胱有两个功能:尿液的储存和排空。这些功能的正常运行需要通过膀胱壁中的细胞对宫内体积和压力和信号进行适当的机械感应,以调节突生肌肉的兴奋性。膀胱粘液(尿毒症)被认为通过释放SubU/LP中影响膀胱壁中多种细胞类型的多种信号分子来调节膀胱兴奋性。目前,大多数对泌尿原介质的表征尝试涉及使用不繁殖生理膀胱填充的膀胱制剂(例如,扁平膀胱壁片、膀胱壁条或培养细胞)。膀胱充填末端释放的中子的测量经常用作从泌尿体对立面释放这些介质的指示。然而,最近的研究表明,调解员的内光含量不能代表膀胱壁深处的13。需要采用新的实验方法,在膀胱填充过程中访问SubU/LP,以进一步了解膀胱尿毒症、SubU/LP和DSM之间的局部信号机制。

在这里,我们演示了一种新的动物膀胱模型,其中分离出的分离肌,以提供直接访问从SubU/LP的尿液释放的介质在填充13。脱毛制剂与完整膀胱13、18的填充非常类似,表明缺乏脱毛肌不会改变膀胱填充过程中尿毒症的美能特性。该制剂允许在没有来自脊柱反射和脱糖肌的混淆信号的情况下,对膀胱进行压力体积研究。因此,在SubU/LP中释放的介质可以测量,没有系统的影响或来自其他来源的污染。在膀胱填充过程中,能够以不同的体积和压力直接进入SubU/LP附近,使得该模型适合研究在膀胱填充的储存和预空阶段生物活性介质的释放、代谢和横皮运输。

该协议中最关键的步骤是去除分泌器平滑肌,同时保持尿液和SubU/LP完好无损。由于分离肌和SubU/LP之间的松散连接,在小鼠膀胱中,该过程特别简单。制剂表现出优异的可重复性,与完整的膀胱13具有非常相似的压力体积特性。该模型在大型动物的膀胱中也是可行的,在膀胱中,可部分或完全切除分离肌。例如,我们之前已经证明,该模型可以从Cynomolgus猴子马卡丝猴的膀胱中复制,并证明在制备填充13期间,调解员可以在SubU/LP中测量。

这种前体模型的潜在局限性正是制备强度的问题,实质上,中枢神经系统和循环缺乏系统性效应,使得在膀胱填充过程中对粘囊-分体连接的地方机制进行彻底检查。缺乏系统效应与许多前体方法共享,包括孤立的膀胱壁板或条状或培养的泌尿细胞。然而,无排异子膀胱模型优于上述泌尿学研究方法,因为它允许在膀胱填充过程中直接进入SubU/LP。因此,使用这种方法将增进对在膀胱填充过程中起源于泌尿道的对肌敏感性中导诱导机制的理解。

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Disclosures

这项工作的部分内容曾发表在《生理学杂志》(PMCID:PMC6418748);DOI:10.1113/JP27692413.Wiley 和 Sons, Inc. 已批准使用本出版物的材料。提交人没有财务或其他冲突要披露。

Acknowledgments

这项工作得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所资助DK41315的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

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References

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