Un modelo de vejiga murina descentralizada (Ex Vivo) con el músculo detrusor eliminado para el acceso directo al suburotelio durante el llenado de la vejiga

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Summary

El modelo de vejiga libre de detrusores permite el acceso directo al suburotelio para estudiar los mecanismos locales para la regulación de la disponibilidad de mediadores biológicamente activos en suburothelium/lamina propria durante el almacenamiento y la anulación de la orina. La preparación se asemeja mucho al llenado de una vejiga intacta y permite realizar estudios de volumen de presión sin influencias sistémicas.

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Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

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Abstract

Estudios anteriores han establecido la liberación de sustancias químicas de las láminas de la mucosa de la vejiga plana colocadas en las cámaras ussing y expuestas a cambios en la presión hidrostática o el estiramiento mecánico y de las células uroteliales cultivadas tras cambios de presión hidrostática, estiramiento, hinchazón celular o fuerzas de arrastre, y en lumen vesical al final del llenado. Tales hallazgos llevaron a la suposición de que estos mediadores también se liberan en suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) durante el llenado de la vejiga, donde afectan a las células profundas de la pared de la vejiga para regular en última instancia la excitabilidad de la vejiga. Hay al menos dos limitaciones obvias en tales estudios: 1) ninguno de estos enfoques proporciona información directa sobre la presencia de mediadores en SubU/LP, y 2) los estímulos utilizados no son fisiológicos y no recapitulan el llenado auténtico de la vejiga. Aquí, discutimos un procedimiento que permite el acceso directo a la superficie suburotelial de la mucosa de la vejiga en el curso del llenado de la vejiga. La preparación libre de detrusores murinos que creamos se asemeja mucho al llenado de la vejiga intacta y permite realizar estudios de volumen de presión en la vejiga en ausencia de señalización de confunción a partir de reflejos espinales y músculo liso detrusor. Utilizando el nuevo modelo de vejiga libre de detrusores, recientemente demostramos que las mediciones intravesicales de los mediadores no se pueden utilizar como un proxy de lo que se ha liberado o está presente en la SubU/LP durante el llenado de la vejiga. El modelo permite el examen de moléculas de señalización derivadas del urotelio que se liberan, generadas por el metabolismo y/o transportadas a la SubU/LP durante el transcurso del llenado de la vejiga para transmitir información a las neuronas y el músculo liso de la vejiga y regular su excitabilidad durante la continencia y la micción.

Introduction

El propósito de este modelo es permitir el acceso directo al lado submucoso de la mucosa de la vejiga durante diferentes fases de llenado de la vejiga.

La vejiga debe abstenerse de contracción prematura durante el llenado y vaciarse cuando se alcanza el volumen crítico y la presión. La continencia anormal o el vaciado de orina se asocian con frecuencia con excitabilidad anormal del músculo liso del detrusor (DSM) en el curso del llenado de la vejiga. La excitabilidad de DSM está determinada por factores intrínsecos a las células musculares lisas y por influencias generadas por diferentes tipos de células dentro de la pared de la vejiga. La pared de la vejiga urinaria consiste en urotelio (mucosa), suburotelio (SubU)/lamina propria (LP), músculo liso detrusor (DSM) y serosa(Figura 1A). El urotelio consiste en células paraguas (es decir, la capa más externa del urotelio), células intermedias y células basales (es decir, la capa más interna del urotelio). Varios tipos de células, incluyendo células intersticiales, fibroblastos, terminales nerviosos aferentes, vasos sanguíneos pequeños y células inmunitarias residen en el SubU/LP. Se asume ampliamente que el urotelio vesical es un órgano sensorial que inicia la micción y la continencia reflejoliberando mediadores en la submucosa que afectan a las células de la SubU/LP y al DSM1,2,3. En su mayor parte, tales suposiciones se basan en estudios que han demostrado la liberación de mediadores: de piezas de mucosa expuestas a cambios en la presión hidrostática4,5; de células uroteliales cultivadas expuestas al estiramiento6,7, hinchazón celular inducida por hipotonía7 o fuerzas de arrastre8; de tiras aisladas de la pared de la vejiga tras la activación del receptor o del nervio9,10,11,12,13,14; y en el lumen de la vejiga al final del llenado de la vejiga15,16,17,18,19. Si bien estos estudios fueron fundamentales para demostrar la liberación de mediadores sobre la estimulación mecánica de segmentos de la pared de la vejiga o células uroteliales cultivadas, deben estar respaldados por evidencia directa para la liberación de mediadores en la submucosa que se provoca por estímulos fisiológicos que reproducen el llenado de la vejiga. Esta es una tarea difícil dado que el SubU/LP se encuentra en lo profundo de la pared de la vejiga, lo que dificulta el acceso directo a las proximidades de SubU/LP durante el llenado de la vejiga.

Aquí, ilustramos un modelo de vejiga murina descentralizado (ex vivo) con el músculo detrusor extirpado13 que fue desarrollado para facilitar estudios sobre los mecanismos locales de mecanotransducción que participan en la señalización entre el urotelio de la vejiga, DSM y otros tipos de células en la pared de la vejiga. Este enfoque es superior al uso de láminas planas de la pared de la vejiga, tiras de la pared de la vejiga o células uroteliales cultivadas porque permite mediciones directas en las proximidades de SubU/LP de mediadores derivados del urotelio que se liberan o se forman en respuesta a presiones fisiológicas y volúmenes en la vejiga y evita posibles cambios fenotípicos en el cultivo celular. Se puede utilizar para medir la disponibilidad, liberación, metabolismo y transporte transurotelial de mediadores en SubU/LP en diferentes etapas de llenado de la vejiga(Figura 1B). La preparación también se puede utilizar para examinar la señalización urotelial y la mecanotransducción en modelos de síndromes de vejiga hiperactivos y hipoactivos.

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Protocol

Todos los procedimientos relacionados con los animales descritos en este manuscrito fueron llevados a cabo de acuerdo con la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Nevada.

NOTA: El modelo presentado aquí consiste en la extracción del músculo detrusor mientras que el urotelio y SubU/LP permanecen intactos(Figura 1B)para permitir a los investigadores el acceso directo a SubU/LP en el curso del llenado de la vejiga.

1. Disección de la preparación de la vejiga libre de detrusores

  1. Colocar la vejiga aislada en una placa de disección llena de frío (10 oC) y oxigenada con 5% de CO2/95 % O2 Krebs solución de bicarbonato (KBS) con la siguiente composición (mM): 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dextrosa, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
  2. Ancle una pequeña porción de la cúpula de la vejiga aislada a un plato de diseción cubierto de Sylgard lleno de KBS. Asegúrese de que el pasador pasa a través de un pedazo de la serosa o el borde más externo del músculo detrusor lejos del borde más interno del músculo que se enfrenta a la SubU/LP.
  3. Con un microscopio, identifique la uretra y los uréteres y ancle cada uno de ellos en la parte inferior del plato de disección.
  4. Retire el exceso de tejidos adiposos y conectivos para que se muestre todo el cuerpo principal de la vejiga, la uretra y ambos uréteres.
  5. Ate los uréteres con suturas de nylon 6-0. A continuación, anclar los extremos abiertos de los uréteres hacia la parte inferior del plato de diseción para asegurar la preparación.
  6. Usando fórceps de punta fina, tire suavemente de un pedazo de la serosa en la esquina entre el uréter y el cuerpo de la vejiga.
  7. Ajuste la luz del microscopio para aumentar la transparencia y distinguir el margen de la submucosa debajo del músculo detrusor.
  8. Comience a cortar(¡no pelar!) la pared de la vejiga con tijeras de punta fina a lo largo de la superficie interna de la capa muscular detrusor mientras arrastra suavemente el segmento de corte lejos de la preparación. En todo momento, asegúrese de que se puede ver el borde lateral de la mucosa y evitar tocarla.
  9. Retire el músculo detrusor por completo girando alrededor del plato de diselación para que la posición de la preparación sea cómoda para continuar disedando el músculo detrusor.
  10. Deje un pequeño trozo de músculo detrusor en la parte superior de la cúpula de la vejiga para asegurar la capacidad de inmovilizar la preparación durante los pasos restantes del protocolo.
  11. Haga un doble lazo de hilo de nylon 6-0, colóquelo alrededor del cuello de la preparación de la vejiga y deje el lazo suelto.
  12. Agregue un segundo bucle doble de hilo de seda 6-0, colóquelo alrededor del cuello de la preparación de la vejiga y deje que el bucle pierda. Tener dos suturas evita fugas alrededor de las suturas.
  13. Cortar alrededor de 2 cm de tubos de 20 PE (catéter), arogar la punta moviendo lentamente la punta cerca de una llama.
  14. Llene el catéter con KBS oxigenados calientes (37 oC).
  15. Inserte el catéter en el orificio de la uretra de la vejiga y empuje suavemente el catéter hasta que la punta del catéter alcance aproximadamente el centro de la vejiga.
  16. Ate la sutura alrededor del catéter y el tejido circundante del cuello de la vejiga.
  17. Llene lentamente la vejiga con unos 50-100 ml de KBS oxigenados calientes (37 oC), levántela brevemente (<10 s) por encima de la superficie de KBS y monitoree si hay fugas en las suturas y el cuerpo de la vejiga.
  18. Si no se observa ninguna fuga, la preparación está lista para el experimento. Si se observa una fuga alrededor de la sutura, retire la sutura y reemplácela. Si se observa una fuga de un orificio en el cuerpo de la vejiga, deseche la preparación.

2. Relleno de la preparación de la vejiga denuded

  1. Perfundie KBS (37 oC) en una cámara de 3 ml de un plato de órgano con camisa de agua (37 oC) con un fondo Sylgard.
  2. Ajuste las líneas de oxígeno y succión.
  3. Coloque la preparación de la vejiga denuded en la cámara.
  4. Fije el catéter a un lado de la cámara para que la preparación no flote sobre la superficie de la solución de perfusión.
  5. Conecte el catéter de vejiga a un tubo PE20 (línea de infusión) más largo conectado a la línea de parada de tres vías utilizando el mismo tamaño de ajuste.
  6. Asegúrese de que las líneas entre la bomba de perfusión, el transductor de presión y la vejiga estén abiertas.
  7. Llene la jeringa de perfusión con KBS frescos, calientes (37 oC) y oxigenados.
  8. Ajuste los parámetros de la bomba: tipo/volumen de jeringa (es decir, 1 ml), operación (es decir, infusión), caudal (es decir, constante) y caudal (es decir, 15 ml/min).
  9. Pulse el botón Inicio de la bomba de la jeringa para llenar la vejiga.
  10. Supervise el volumen de llenado y la presión intravesical durante el llenado de la vejiga.

3. Detección de mediadores en el Aspecto SubU/LP de la Preparación de la Vejiga Denuded

  1. Recoja las alícuotas de la solución de baño en tubos de microcentrífuga heladas o inserciones de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
  2. Preparar y procesar las muestras de acuerdo con la aplicación de detección adecuada. En el caso de detectar la disponibilidad de purina, procesar las muestras por HPLC con detección de fluorescencia13,18.

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Representative Results

La pared de preparación de vejiga libre de detrusores murinas está intacta y contiene todas las capas excepto el DSM y la serosa. Los estudios de prueba de principio demostraron que la pared de la vejiga libre de DSM incluye urotelio y SubU/LP, mientras que la tunica muscular y la serosa están ausentes (Figura 2)13.

El llenado de la vejiga libre de detrusores se aproxima al llenado normal de la vejiga. La Figura 3 muestra los esquemas de la configuración experimental para el llenado de preparaciones de vejiga ex vivo a diferentes velocidades de llenado, volúmenes y presiones intraluminales. Las preparaciones de vejiga sin integridad y denuded de la muria están intactas y denuded requieren una amplia gama de volúmenes de llenado para alcanzar la presión de vacío13. Las relaciones presión-volumen son notablemente similares en los preparativos intactos y denuded(Película 1, Película 2y Figura 4). Por lo tanto, la preparación libre de DSM es adecuada para estudios funcionales del papel del urotelio y SubU/LP en la mecanosensation a la vejiga y la mecanotransducción.

Posible uso del modelo de vejiga libre de detrusores
Medir la disponibilidad de mediadores en el lumen de la vejiga y SubU/LP durante el llenado de la vejiga
La configuración experimental para la recogida de muestras extraluminales (EL; por ejemplo, el baño de SubU/LP) e intraluminal (IL) durante el llenado de los preparados de la vejiga mientras se controla la presión de la vejiga se ilustra en la Figura 5. La idoneidad del modelo para medir mediadores derivados del urotelio que se liberan en el lado SubU/LP durante el llenado se probó midiendo la liberación de mediadores de purina (por ejemplo, adenosina 5'-trifosfato, ATP; adenosina 5'-difosfato, ADP; ADP; nicotinamida adenina dinucleótido, NAD; adenosina 5'-monofosfato, AMP; y adenosina, ADO) en la solución de baño de la SubU /LP de la preparación denuded. Como se demuestra en la Figura 6A, se detectaron cantidades insignificantes de purinas en el baño que contiene una preparación de vejiga aislada con DSM intacto, mientras que las cantidades de estas purinas fueron significativamente más altas en las muestras recogidas del baño que contiene una preparación de vejiga denuded(Figura 6B). En particular, la distribución de purinas y metabolitos en muestras recogidas del lumen y de la SubU/LP al final del llenado diferió significativamente(Figura 6C).

Examinar el metabolismo extracelular de los mediadores en SubU/LP durante el llenado de la vejiga
La adición del análogo altamente fluorescente de ATP, 1,N6-etheno-ATP (ATP), al lado suburotelial de la preparación libre de detrusores dio lugar a una disminución de la ATP y un aumento en los productos de ATP a ADP, AMP y ADO(Figura 7Aa y Figura 7Ab). Del mismo modo, la adición de ATP al lumen de preparación dio lugar a una disminución de la ATP y a un aumento en el aDP, el AMP y el ADO en el lumen(Figura 7Ba y Figura 7Bb). Por lo tanto, el modelo es adecuado para estudios de metabolismo de mediadores bioactivos en ambos lados del urotelio durante el llenado de la vejiga.

Examinar el transporte transurotelial de mediadores durante el llenado de la vejiga
La adición de la ATP al lado SubU/LP de la preparación denuded dio como resultado la aparición de "AMP", "ADO" y algunos ADP en el lumen, lo que sugiere que las purinas pueden ser transportadas desde la SubU/LP al lumen13 (Figura 7Ac). Del mismo modo, la adición de ATP en el lumen dio lugar a la aparición de los resultados de la aplicación de los elementos de subU/LP13 (Figura 7Db). Tenga en cuenta que no se observó ningún áATP en el lado opuesto de la aplicación de ATP. En conjunto, estas observaciones sugieren fuertemente que la preparación de la vejiga libre de detrusores es adecuada para estudios de transporte transurotelial bilateral de mediadores durante el llenado.

Figure 1
Figura 1: Principio del modelo de vejiga libre de detrusores. (A) La pared de la vejiga se compone de urotelio, suburotelio/lamina propria (SubU/LP), músculo detrusor y serosa. Cada una de estas capas contiene varios tipos de células que son importantes para las funciones de la vejiga durante el almacenamiento y el vaciado de orina. Durante el llenado de la vejiga, los mediadores biológicamente activos se liberan del urotelio en el lumen de la vejiga y en la SubU/LP para afectar a las células profundas de la pared de la vejiga, incluido el músculo detrusor. Si bien el acceso al lumen de la vejiga es relativamente sencillo, no hay acceso directo a la SubU/LP durante el llenado para detectar mediadores derivados del urotelio que podrían afectar a las células de la pared de la vejiga y controlar la excitabilidad muscular detrustadora. (B) La eliminación de las capas musculares detrusor junto con la serosa expone toda la superficie de SubU/LP permitiendo el acceso directo a la SubU/LP donde las moléculas de señalización derivadas del urotelio se pueden medir en diferentes fases del llenado de la vejiga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Histología de la murinointacta intacta y las paredes de vejiga libres de detrusores. La tinción tricroma de Masson de paredes de vejiga intactas (A) y libres de detrusores (B) demuestra que la preparación denuded contiene urotelio intacto (U) y SubU/LP, pero no el músculo detrusor (D) y serosa (S). L, lumen. Esta cifra ha sido reproducida a partir de una publicación anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Representación esquemática de la configuración experimental utilizada en el llenado de preparaciones de vejiga ex vivo. La preparación de vejiga urinaria ex vivo intacta o denuded (UB) se coloca en una cámara orgánica caliente (37 oC) con camisa de agua que se perfunde con una solución oxigenada de Krebs-bicarbonato (KBS, 37 oC, pH 7,4). La preparación de la vejiga se infunde con KBS a diferentes tasas de llenado y volúmenes y la presión intraluminal de la vejiga (BP) se registra a lo largo del experimento Esta cifra se ha reproducido de una publicación anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Relaciones presión-volumen en preparaciones intactas y libres de detrusores. (A) y (B) son grabaciones representativas de volumen intravesical y presión de ex vivo intactos y preparados de vejiga denuded que se llenan con solución de Krebs-bicarbonato a 15 l/min. Como se preveía, la preparación intacta desarrolló contracciones transitorias (TCs) debido a la presencia del detrusor. Por el contrario, la preparación denuded carecía de tCs. (C) y (D) muestra datos resumidos de las relaciones presión-volumen de preparaciones de vejiga intactas y denuded que acomodaron >250 ml de solución. Tenga en cuenta que los volúmenes de llenado y las presiones intravesicales fueron notablemente similares en los preparados de vejiga intactos y denuded. Esta cifra ha sido reproducida a partir de una publicación anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Diagrama esquemático del modelo de vejiga aislada utilizado para evaluar la disponibilidad de mediadores derivados del urotelio en SubU/LP y lumen durante el llenado. La preparación de la vejiga se coloca en una cámara con camisa de agua y se superpone con una solución de bicarbonato Krebs oxigenado (KBS). La preparación de la vejiga urinaria (UB) se llena de KBS oxigenado caliente a través de un catéter en la uretra conectado a una bomba de perfusión. La presión de la vejiga (BP) se controla a través de un conector de tres vías a través de la línea de perfusión durante el llenado de la vejiga. Las muestras de soluciones extraluminales (EL, baño de órganos) e intraluminal (IL) se procesan para la detección de mediadores (m) según las aplicaciones de detección. Esta cifra ha sido reproducida a partir de una publicación anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: La preparación de la vejiga libre de detrusores es adecuada para medir la disponibilidad de mediadores en SubU/LP durante el llenado. Cromatógramas representativos que demuestran la disponibilidad de purinas en las muestras extralúcidas en preparaciones intactas (A) y sin detrusores (B) preparaciones de vejiga. Tenga en cuenta que los mediadores de purina se detectan mejor en la preparación denuded que en la preparación intacta. (C) La contribución relativa de las purinas individuales a las piscinas de purinas detectadas en el lumen y en la SubU/LP de la preparación denuded es significativamente diferente. Esta cifra ha sido reproducida a partir de una publicación anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: La preparación de la vejiga libre de detrusores es adecuada para examinar el metabolismo y el transporte transurotelial de mediadores durante el llenado de la vejiga. (A,B) Cromatogramas representativos que muestran el sustrato de LA ATP (Aa,Ba). Cuando el sustrato se aplica a la SubU/LP (Ab) o al lumen (Bb) se redujo la ATP y se incrementaron los productos aADP, AMP y ADO. Por lo tanto, el áATP se degrada a ambos lados de la aplicación; sin embargo, la formación de los productos de la ATP es asimétrica en SubU/LP y lumen. Tenga en cuenta que los productos de la ATP, el AMP y el ADO, pero no el sustrato de la ATP, aparecieron en el lado opuesto de la aplicación de la ATP (Ac,Bc). Por lo tanto, las purinas parecen ser transportadas a través de la pared de la preparación libre de detrusores durante la presentación. Esta cifra se ha modificado a partir de13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1
Vídeo 1: Grabación representativa del llenado intacto de la vejiga. La vejiga se llenó a 15 l/min. El vídeo se grabó utilizando un estereomicroscopio con zoom con una cámara de dispositivo acoplado (CCD) cargada a 5 Hz; la grabación se detuvo al alcanzar la presión intraluminal de 25 mmHg. La duración total de la imagen es de 64x en tiempo real. Este video ha sido reproducido a partir de13. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Video 1
Video 2: Grabación representativa del llenado de vejiga libre de detrusores. La vejiga se llenó a 15 l/min. El vídeo se grabó utilizando un estereomicroscopio con zoom con una cámara CCD a 5 Hz; la grabación se detuvo al alcanzar la presión intraluminal Hg de 25 mm. La duración total de la imagen es 64 veces en tiempo real. Este video ha sido reproducido a partir de13. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

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Discussion

La vejiga tiene dos funciones: almacenamiento y vaciado de orina. El funcionamiento normal de estas funciones requiere una correcta sensibilidad mecánica del volumen intraluminal y la presión y la transducción de las señales a través de las células en la pared de la vejiga para regular la excitabilidad muscular detrusor. Se cree que la mucosa de la vejiga (urothelium) regula la excitabilidad de la vejiga liberando una variedad de moléculas de señalización en el SubU/LP que afectan a numerosos tipos de células en la pared de la vejiga. Actualmente, la mayoría de los intentos de caracterización de mediadores derivados del urotelio implican el uso de preparaciones de vejiga (por ejemplo, hojas planas de la pared de la vejiga, tiras de pared de la vejiga o células cultivadas) que no reproducen el llenado fisiológico de la vejiga. Las mediciones de mediadores que se liberan en el lumen de la vejiga al final del llenado de la vejiga se utilizan con frecuencia como indicación para la liberación de estos mediadores desde el lado opuesto del urotelio. Sin embargo, estudios recientes sugieren que el contenido intraluminal de mediadores no es representativo de lo que está disponible en lo profundo de la pared de la vejiga13. Se necesitan nuevos enfoques experimentales que permitan el acceso a SubU/LP durante el llenado de la vejiga para facilitar nuestra comprensión de los mecanismos locales de señalización entre el urotelio vesical, SubU/LP y DSM.

Aquí, demostramos un nuevo modelo de vejiga animal en el que se extrae el músculo detrusor para proporcionar acceso directo a los mediadores liberados del urotelio en SubU/LP durante el llenado13. La preparación denuded se asemeja mucho al llenado de la vejiga intacta13,18, lo que sugiere que la falta del músculo detrusor no cambia las propiedades mecanosensibles del urótelio durante el llenado de la vejiga. La preparación permite realizar estudios de volumen de presión en la vejiga en ausencia de señalización de confunción de reflejos espinales y músculo detrusor. Por lo tanto, los mediadores liberados en SubU/LP se pueden medir sin influencias sistémicas o contaminación de otras fuentes. La capacidad de acceder directamente a las proximidades de SubU/LP a diferentes volúmenes y presiones durante el llenado de la vejiga hace que el modelo sea adecuado para estudiar la liberación, el metabolismo y el transporte transurotelial de mediadores biológicamente activos durante las etapas de almacenamiento y pre-vacío del llenado de la vejiga.

El paso más crítico en este protocolo es la eliminación del músculo liso del detrusor manteniendo intactos el urotelio y SubU/LP. El procedimiento es particularmente sencillo en la vejiga del ratón debido a la conexión suelta entre el músculo detrusor y SubU/LP. Las preparaciones mostraron una excelente reproducibilidad con características de volumen de presión notablemente similares a las vejigas intactas13. El modelo también es factible en vejigas de animales más grandes en los que el músculo detrusor se puede extirpar parcial o completamente. Por ejemplo, hemos demostrado previamente que el modelo se puede reproducir en la vejiga del mono Cynomolgus Macaca fascicularis y demostrado que los mediadores se pueden medir en SubU/LP durante la preparación13.

La limitación potencial de este modelo ex vivo es la misma cuestión que es la fuerza de la preparación, en esencia, la falta de efectos sistémicos del sistema nervioso central y la circulación permite un examen exhaustivo de los mecanismos locales de conectividad mucosa-detrusor durante el llenadode la vejiga. La falta de efectos sistémicos se comparte con numerosos enfoques ex vivo, incluyendo hojas o tiras aisladas de la pared de la vejiga o células uroteliales cultivadas. El modelo de vejiga libre de detrusores, sin embargo, es superior a los enfoques antes mencionados en la investigación urotelial en el que permite el acceso directo a la SubU/LP en el curso del llenado de la vejiga. Por lo tanto, el uso de este enfoque mejorará la comprensión de los mecanismos de mecanotransducción sensibles que se originan en el urotelio durante el llenado de la vejiga.

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Disclosures

Parte de este trabajo fue publicado previamente en el Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Wiley and Sons, Inc. ha otorgado permiso para el uso de materiales de esta publicación. Los autores no tienen conflictos financieros o de otro tipo que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Beca dk41315 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

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References

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