ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

Neuroscience

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Summary

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。

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Zhou, L., Li, Q. Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (154), e60347, doi:10.3791/60347 (2019).

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Abstract

中枢神経系の常駐マクロファージとして、ミクログリアは脳の発達と恒常性を積極的に制御し、その機能不全がヒト疾患を駆動する可能性がある。恒静性ミクログリアの分子シグネチャや、環境刺激に応じた遺伝子発現の変化を明らかにするために、かなりの進歩が見られた。単一細胞ゲノム方法論の出現と成熟により、異種ミクログリアは、異なる発達および病理学的条件において果たす多様な役割の根底にある可能性がますます認識されています。このような不均一性のさらなる解剖は、目的の所定の領域からミクログリアを効率的に分離することによって達成され、続いて個々の細胞の敏感なプロファイリングが行われる。ここでは、単一の成人マウス脳半球における異なる脳領域からのミクログリアの迅速な分離のための詳細なプロトコルを提供する。また、プレートベースのディープシングルセルRNAシーケンシングにこれらのソートミクログリアを使用する方法も示します。この方法の適応性を他のシナリオに議論し、大規模な研究に対応するためのシステム改善のためのガイドラインを提供する。

Introduction

ミクログリアは、全神経細胞の5%−10%を表し、中枢神経系(CNS)1全体に散在するマクロファージである。血液脳関門の背後で保護され、健康な成人の脳の典型的なミクログリアは、急速に拡張し、毛陰腫のニューロンや他のグリア細胞と相互作用するために後退する多くの微細なプロセスを含んでいます。ミクログリアはまた、特定の発達段階の間、または傷害および疾患1、2、3、4における免疫上の課題に関連する貪食性形態を採用することができる。最近のエキサイティングな発見は、ミクログリアが脳由来または病理学的シグナルに対して決して受動的な傍観者ではなく、脳の発達と恒常性を制御する上で極めて重要な役割を果たすことを明らかに示している。ミクログリアのより多くの機能が解明されるにつれて、TREM2のような多くの神経変性疾患リスク遺伝子がミクログリア5、6、7によって主にまたは排他的に発現されることを示したヒト遺伝学研究によって興奮がさらに促進される。開発における彼らの意義ともっともらしい疾患駆動の役割を考えると、神経変性疾患1、8の新しい治療標的を見つけることを期待して、近年、微小グリア遺伝子の調節と機能の理解に向けて多大な努力が払われている。

RNAシーケンシング(RNA-seq)は、細胞型特異的遺伝子発現の偏りのない特徴付けを可能にし、これにより科学者が高密度細胞ネットワーク7における遺伝子機能を調査するよう導く。RNA-seqは、主にバルクサンプル上で行われていたが、他の神経細胞および免疫細胞9とそれらを区別する恒静性微小グリア遺伝子シグネチャの発見につながった。しかし、このようなアプローチは、ミクログリア、特に開発中に一過性に存在するミクログリア間の分子的および機能的な違いを見落とす可能性があり、老化や疾患に関連する。実際、単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)は、様々な文脈2、3、10においてミクログリアの不均一性を以前に過小評価したことを明らかにすることによって、フィールドに革命をもたらした感度と分解能を提供する。さらに、CNS循環界面に他の同様の免疫細胞が存在するため、scRNA-seqは、これらの関連細胞を分離し、機能的に解剖するための新しいツールの設計を助ける情報を提供する。

scRNA-seqプラットフォームの多様な配列が発明され、それぞれが特定のアプリケーション12に適しています。一般に、10xゲノミクスのような液滴ベースの方法は、各実行で配列された数千個の細胞とのスループットが高く、広範な分類を必要とする混合細胞集団を含む可能性のある入力に対する選択性が低くなります。プレートベースの方法は、より高い感度と読み取り深さ13、14を提供し、通常、微妙な違いやまれなトランスクリプトを明らかにするために、細胞ソートから特定の集団を対象とします。ミクログリア細胞の小さな割合、特に開発または疾患関連のサブ集団を考えると、すべてのCNS細胞型の中で、ミクログリアを特定の目的領域から単離し、それらの異質性を理解するために深く、全長の転写情報を得ることがしばしば望ましい。

ここでは、半自動化されたプレートベースのライブラリ調製手順に従って単一細胞(またはバルク)RNA-seqに使用される単一半球から解剖された異なるマウス脳領域からミクログリアを分離する方法について詳しく説明します。その後、他の半球を組織学的検証に使用できます。以前に公開された方法9から合理化されたこの絶縁プロトコルは、少量の出発物質からの歩留まりを最大化し、一方で内因性微小グリア遺伝子発現プロファイルを維持することを目的とする。蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、ミクログリア(または対象の他の関連免疫細胞)を96ウェルプレートに濃縮し、ライブラリ調製用試薬の量を小型化してスループットを向上させます。我々は、他のプレートベースの戦略が適用される可能性があるが、この敏感なscRNA-seqプラットフォームを強調する。この方法は、損傷や疾患病巣などの他の解剖組織からミクログリアを分離するために容易に適応することができ、マウスの年齢は、ほぼすべての出生後段階にわたって変化し得る。単一細胞トランストランスクリプトミクス研究のための局所ミクログリアの効率的な分離は、健康および疾患におけるその機能のより良い理解を促進する。

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Protocol

げっ歯類に関するすべての手順は、スタンフォード大学のガイドラインに準拠し、国および州の法律およびポリシーに準拠しています。すべての動物の手順は、スタンフォード大学の実験動物ケアに関する行政パネルによって承認されました.

注:すべてのソリューションおよびバッファー構成は、材料の表に記載されています。

1. 細胞分離の日の準備

  1. 培地A(50mL)、磁気活性化細胞選別(MCS)緩衝液(30mL)、FACS緩衝液(25mL)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;30mL)、DNase(320μL)、およびRNase阻害剤(30°L)の氷上で冷却します。
    注:ここで提供される体積は、単一のマウス脳半球の4つの脳領域(例えば、皮質、小脳、海馬および線条体)からミクログリアを分離するのに十分である。より多くの組織を使用する場合はスケールアップします。
  2. 4つのきれいな2 mLダウンスホモジナイザーを氷の上に置き、DNaseの80°L(12,500単位/mL)と5μLのRNase阻害剤を持つ培地Aの2 mLを各Dounceホモジナイザーに加えます。ピストンを15 mLチューブで冷やします。
  3. 組織採取のための脳領域を持つ4つの6 cmペトリ皿にラベルを付け、氷の上の各皿に冷たい媒体Aの200°Lを加える。解剖用の6cmペトリ皿に約5mLの培地Aを加えます。
    注:使用する前に、すべての試薬が無菌でRNA用途に適していることを確認してください。ベンチおよび解剖ツールは清潔で、RNase除染液(材料のテーブル)でスプレーする必要があります。

2. 脳領域解剖

注:この手順は、約 30 分かかります。

  1. 400-500 μLのケタミン/キシラジン(24 mg/mLケタミンおよび2.4 mg/mLキシラジン)を成人期マウス(>1ヶ月)の腹腹に注入する。
    注:ここでは男性マウスを使用してイラストを使用しますが、どちらかの性別が適しています。
  2. 5分待ってから後足をつまんで、引き込みの欠如を確認します。
  3. すぐに26 G x 3/8針を使用して、目に見える血液が無くなるまで20-30 mLの氷冷PBSで心筋灌流を行います。
  4. 外科的なはさみでマウスを切り落とす。小さなはさみを使って皮膚を切り開いて頭蓋骨の下を露出させ、矢状縫合糸、ラムドイダル縫合糸、冠状縫合糸を切ります。鉗子を使用して、組織を損傷することなく頭頂骨と頭頂骨の両側を引き抜き、脳を媒体Aで解剖ペトリ皿に慎重に移動させる。
  5. プレチルドブレードを使用して、中間線を通って脳を2つの半球に切断します。
    注:単一の半球からここで説明する4つの脳領域は、単一細胞またはバルクRNA-seqアプリケーションのための十分な数のミクログリアを生じる。他の半球は、その上の検証で免疫ヒストケミストリーまたはRNAに使用することができる。
  6. 皮質葉と脳幹から小脳を#55鉗子で分離し、組織をコレクションペトリ皿に移す。
  7. #55鉗子を使用して、海馬と線条体を皮質から慎重に解剖し、各組織をコレクションペトリ皿に移します。

3. 機械組織解離

注:細胞や試薬は、染色工程中以外は常に冷却してください。この手順は、約 30 分かかります。

  1. 各脳組織をカミソリの刃で切り刻み、<1 mm3の細かい部分に入れる。
  2. 1 mL ピペット (先端を切り取ったもの) を使用して、組織片を事前に冷却された Dounce ホモジナイザーに移し、それぞれに DNase および RNase 阻害剤を含む培地 A の 2 mL を含みます。
  3. 6-10フルストロークのためにピストンをゆっくりとねじり出して組織を均質化し、目に見える塊が存在しないまで。
    注:ドーピングは、ニューロンや他のほとんどのグリア細胞を殺すが、むしろそのままのミクログリア細胞を残します。不十分と過度の作業の両方が細胞の低収率につながることができます。.
  4. 解一解裂した組織を70μmのストレーナーを通して50 mLの管に移す。
  5. 各Dounceホモジナイザーとピストンを合計6mLのコールドミディアムAですすり、同じストレーナーを通してリンス溶液を対応するチューブに濾過します。
  6. 単一細胞懸濁液(各約8mL)を15mLの円錐管に移し、400 x gで遠心分離機を4°Cで4°Cで5分間、ブレーキ= 5で転送します。

4. ミエリン除去

注:この手順は、約 60 分かかります。

  1. 磁気セパレータ(材料表)に1つの大きな枯渇(LD)カラム(皮質の場合)と3つの大きな選択(LS)カラム(他の3つの領域の場合)を準備します。MCS バッファを 3 mL で各カラムにすすいでください。
  2. 遠心分離が終了したら、ピペットアウトし、ペレットを邪魔することなく上清を廃棄します。皮質および小脳組織の場合、1.8μLのRNase阻害剤を用いてMCS緩衝液の850μLで細胞を再中断する。海馬組織および線条体組織の場合、0.9 μLのRNase阻害剤を用いてMCS緩衝液の400μLで細胞を再サスペンドする。
    注:カラム(LD対LS)および懸濁液に使用される体積は、組織中に存在するミエリンの量に基づいて最適化される。他の脳領域がアッセイされた場合、これらの状態は、組織の大きさとミエリンがどれくらい存在するかについて調整する必要がある。ミエリン除去の有効性は、ステップ4.9で推定することができる。
  3. 皮質と小脳から細胞にそれぞれ100μLのミエリン除去ビーズを加え、海馬と線条体から細胞にそれぞれ50μLのミエリン除去ビーズを加えます。
  4. 細胞をビーズと軽く混ぜ、氷上のチューブを10分間インキュベートします。
  5. 皮質細胞を含むチューブの体積をMCSバッファーで2mLに、その他すべてのmLに持ち込みます(すなわち、皮質細胞に1mL、海馬細胞と生体細胞に500μLを加え、小脳細胞に緩衝液を追加する必要はありません)。
  6. カラムがリンスバッファを空になったら、各カラムの下に15 mLチューブを置きます。皮質細胞(2 mL)をLDカラムにロードし、他のすべての細胞(それぞれ1 mL)をLSカラムにロードします。直ちに1mLのMCSバッファーを使用して、元のチューブを洗浄し、対応するカラムに溶液をロードします。
  7. LD カラムを MCS バッファーの 1 mL で 1 回洗浄し、各洗浄を 1 mL の MCS バッファーで各 LS カラムを 2 回洗浄します。洗浄中にフロースルー溶液を収集し続けます。
  8. 35μmのストレーナーキャップを通して丸底FACSチューブにセルをフィルタリングします。
    注:各チューブは、ミエリンを枯渇させた単一細胞懸濁液の約4 mLを収集する必要があります。
  9. 必要に応じて、細胞懸濁液の10 μLを取り、0.4%トリパンブルー溶液の10°Lと混合します。10倍の明視野顕微鏡で細胞を調べ、収率、生存率、残留ミエリンのレベルを推定します。
    注:準備を成功させるには、ミエリンの破片をほとんどまたはまったく含めずに、90%以上の生細胞(形を丸くし、青色の染料を除く)を生成する必要があります。
  10. FACSチューブ内のペレットセルは400 x gで、ブレーキ= 5で5分間。ゆっくりと上清を注ぎ、ティッシュペーパーにチューブの端をダブします。FACSバッファーの300°Lで各チューブ内のセルを再サスペンドします。
    注:MCS選別が好ましい場合、CD11bビーズは、ミエリン除去後にミクログリアおよび他の骨髄細胞を選択するために使用することができる。これらの細胞は、その後、非プレートベースのscRNA-seqだけでなく、バルクRNA-セクに使用することができます。この代替アプローチの注意点は、CD11bビーズは、この抗原に対しても陽性である他の関連免疫細胞からミクログリアを分離しないことである。

5. 蛍光活性化細胞選別用染色

注:この手順は、約 40 分かかります。

  1. マウスFc受容体ブロック試薬(材料表)を各チューブに5μL添加します。氷の上で5分間インキュベートします。
  2. CD45-PE-Cy7 を 1 μL、CD11b-BV421 を各チューブに 1 μL 加えます。
    注:他の共役フルオロフォアを有する抗体が使用され得る。恒良性ミクログリア9の特定のマーカーであるTMEM119に対する抗体も含めることができますが、特定のミクログリア亜集団がTMEM119表面発現を失う可能性があるため、CD45およびCD11bと一緒に使用することをお勧めします。
  3. 室温(RT)で10分間シェーカーのチューブをインキュベートします。
  4. 2 mL の FACS バッファーを追加して洗浄します。
  5. ペレット細胞を4°、400 x gで5分間ゆっくりと流し出し、チューブの端をティッシュペーパーに取り付けます。RNase阻害剤の1μLとヨウ化プロピジウムの0.5 μL(PI、1:1,000希釈)を用いて、400μLのFACS緩衝液を使用して各チューブ内の細胞を再サスペンドします。

6. インデックス FACS ソート

注:この手順は~1時間かかるはずです。

  1. 標準的なFACS手順に従って、散乱(破片を除く)、単一細胞、生細胞(PI陰性)、ミクログリアおよび骨髄細胞(CD45+、CD11b+)に基づいてゲートを描画する。
    注:典型的なマイクログリア細胞は、血管周辺および髄度マクロファージなどの他の境界関連マクロファージと比較して低レベルでCD45を発現し、したがってCD45低CD11b+にゲーティングすることは、これらの古典的なミクログリア1、2における遺伝子発現プロファイルの焦点であるならば十分であるべきである。しかしながら、ミクログリアの特定のサブセットは、より高いCD45発現を有する可能性があり、これは発達中または疾患状態において特に当てはまる。微小グリア遺伝子発現の偏りのない分析を確実にするために、CD45高およびCD45低免疫フェノタイプは、インデックスソート設定とシーケンシングおよび下流解析のために収集された両方の集団を通じて記録することができる。さらに、TMEM119表面発現は、恒静性微小グリア集団を標的とするために使用され得る(ステップ5.2を参照)、CD45レベルおよびシーケンシング結果と共に分析する。
  2. 単一ミクログリア(100μmノズル付き)を96ウェルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プレートにソートし、それぞれ4μLのリシス緩衝液を含む(詳細は公開されたプロトコル14を参照)。
    注:外部RNA制御コンソーシアム(ERCC)RNAスパイクインミックス(材料テーブル)は、品質管理および正規化目的のために、lysisバッファに1:2.4 x 107で追加することができます。
  3. ベンチトップ遠心分離機を使用してプレートとスピンダウンを簡単にボルテックスします。
  4. すぐにドライアイスでサンプルを凍結します。プレートは、ライブラリの準備ができるまで-80°Cで保管してください。
    注:あるいは、バルクRNA-セクのRNA抽出バッファーを用いて、より多くの細胞を1.5mLチューブに回収することができる。著者の経験によると、3,000細胞は、公開されたプロトコル2、14に続く良質のライブラリを生成するのに十分です。

7. 単一細胞RNAシーケンシングライブラリの準備

注:ここで、公開されたプロトコル14は、液体処理ロボティクスおよびいくつかの改変を助けてscRNA-seqライブラリを生成するために続く。この記事では、手順について簡単に説明し、相違点を強調します。4枚のプレートを同時に処理するには約2.5日かかります。

  1. 氷上でプレートを解凍し、オリゴ-dT30VNプライマー(リシス緩衝液中)で逆転写を行い、サーマルサイクラーでcDNAを生成する(表1):42°C 90分;70 °C 5 分;4 °Cホールド。次に、PCRマスターミックスとin situ PCR(ISPCR)プライマー(材料テーブル)と次のPCR条件を使用して、最初に追加のエキソヌクレアーゼ消化ステップ(表2)でcDNAを増幅します。95 °C 3 分;98 °C 20 sの 23 サイクル, 67 °15 s, 72 °C 4 分;72 °5 分
  2. 井戸当たり18μLの磁気ビーズ(0.7:1比)を用いてcDNAを精製します。磁気スタンドでプレートを5分間インキュベートし、作りたての80%エタノール、毎回80°Lでサンプルを2回洗浄します。プレートを15〜20分間乾燥させた後、ウェルあたり20μLの溶出緩衝液でcDNAを溶出する。
    注:品質管理には、フラグメントアナライザ(高感度次世代シーケンシング[NGS]フラグメント分析、1-6,000 bp)を使用してcDNAのサイズ分布と濃度を確認し、さらに500~5,000 bpのスミアを持つサンプルのみを処理し、0.05 ng/μLを超えます。
  3. ライブラリを生成するには、ナノリットルピペットマシンの助けを借りて、384ウェルプレートのライブラリ調製キット(材料テーブル)からTn5タグメント試薬の1.2 μLを各cDNAサンプルの0.4μLを55°Cで10分で混合します。
    注:ここでは、推奨反応量の1/12.5(5μLサンプルおよび15μLのタグメント試薬)を添加し、コストを削減し、スループットを向上させる。ナノリットルピペットマシン(材料のテーブル)は、試薬(このと次のステップ)を384ウェルプレートとの間で転送するために使用されます。
  4. 0.4 μLの中和緩衝液を加えて、RTでのタグメント反応を5分間停止します。
  5. 384 個のインデックス (材料表、0.4 μL フォワード、0.4 μL リバース)、PCR ミックスの 1.2 μL をサンプルに追加し (それぞれ 2 μL)、次の条件を使用してライブラリを増幅します。95 °C 30 s;95°C 10s、55°30 s、72°1分の10サイクル;72 °5 分
  6. すべての個々のライブラリ(それぞれ1μLを取る)を同じ384ウェルプレートからプールし、磁気ビーズ(材料表、0.7:1比)を使用して最終的なプールされたライブラリを精製します。
  7. 蛍光計 (材料表)を使用して濃度を測定し、バイオアナライザ (材料表) を使用して、シーケンシングの前にプールされたライブラリのサイズ分布を調べます。シーケンスの深さをセルあたり 100 万の生の読み取り値に設定します。
  8. 標準的なバイオインフォマティクス手順に従って、シーケンシング読み取りをフィルタリングおよびトリムし、アライメント2を実行します。カウント テーブルとメタ データを入力として使用し、Seurat パッケージ15を使用してクラスタリング分析を実行します。

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Representative Results

このプロトコルは、1人の成人の浸透した脳半球において異なる脳領域からミクログリアを分離およびソートする方法を記述し、続いてscRNA-seqを行う。私たちは、単一の細胞懸濁液を作成するために、またミクログリアを豊かにするための最初のステップとして、ドーニングを使用しています。不十分または過度の実行は、収量を減少させます。さらに、大人のマウスの脳はミエリンの高レベルを含み、適切に除去されない場合は、並べ替え効率と収量を減らすこともできます。そこで、抗体染色を行う前に、トリパンブルーと血球計を用いて顕微鏡下で細胞懸濁液を調べ、ミエリン除去の収率、細胞生存率及び有効性(ステップ4.9)を推定した(図1)。この時点での総細胞数は、皮質の場合は 30,000 を超え、他の組織の場合は 5,000 を超える必要があります。細胞の90%以上は、ミエリンの破片をほとんど持って生きられるはずです。

私たちは、典型的にはCD45低およびCD11b陽性であるミクログリア(または骨髄細胞)をソートするためにFACSマシンを使用します。少なくとも皮質組織の場合、正常な単離は、すべての生きている単一細胞のうち80%以上のミクログリアを生成する必要があります(図2)。死亡/死亡人口は、調製物のほんの一部(約10%)に過ぎません。

個々のミクログリアがリシスバッファーに捕捉されると、RNAが放出され、その後cDNAに転写され、23サイクル増幅されます。ライブラリを作成する前に、これらのcDNAサンプルの品質(少なくとも一部)を確認することが重要です。キャピラリー電気泳動プラットフォームとして、フラグメントアナライザと高感度NGSフラグメントキット(1−6,000 bp)は、サイズ分布と96ウェルプレートの各ウェルに存在するcDNA分子の量に関する迅速かつ正確な情報を提供します(図3A)。スミア(500−5,000 bp)および特定の濃度閾値(例えば、0.05 ng/μL)を超えるサンプルを使用してライブラリを作ることができます。同様に、プールされたライブラリは、シーケンス処理の前にバイオアナライザでテストする必要があります (図 3B)。

我々は、このscRNA-seq方法論16の検出力を飽和する細胞当たり100万以上の生の読み取りの深さにサンプルを配列する。約60%のマッピング率で、マイクログリア細胞あたり2,000以上の遺伝子を検出できます。この単離方法17を用いて生成された公開データを得て、配列集団全体にわたるミクログリア特異的遺伝子を検出するための独立した実験と感度からその再現性を実証した(図4)。

Figure 1
図1:ミクログリア単離収率の推定、細胞生存率およびミエリン除去の効率左パネルは、ミエリン除去カラムを通過した後のトリパンブルー染色細胞(皮質から)の明視野画像(4倍倍)を示した。他の領域の結果は似ていますが、セルの数は少なくなります。細胞の大部分(すべてではないにしても)は、プロセスの損失のために明るく(非染色)と丸く見えました。右の画像は箱入り領域のズームイン(20x)で、ミエリンの破片はほとんど残っていました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ミクログリアのソートに使用されるゲート。データは皮質からミクログリアを選別するためのゲーティング戦略を示し、同じ戦略が他の領域に使用された。細胞破片はまず散布図から除外され、単一細胞は前方散乱面積(FSC-A)/前方散乱幅(FSC-W)によってゲートされた。生細胞はPI陰性染色によりゲートされ、これは全単一細胞の約90%からであった。マイクログリアは、生細胞のおよそ80%を表し、CD45低CD11b+ゲートから選別した。合計約30,000ミクログリアを単離し、皮質組織から選別することができる(3ヶ月前のマウスの1つの半球から)。インデックスの並べ替えが FACS マシンで実行されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3

Figure 3
図3:単一のマイクログリア細胞および最終的にプールされたライブラリーからの増幅cDNAの代表的な品質管理結果。(A) フラグメントアナライザを使用して、すべてのフラグメントがX軸上のサイズでプロットされ、Y軸上の相対蛍光強度が、所定のサイズのcDNAの存在量を示します。LM(下マーカー、1 bp)およびUM(上マーカー、6,000 bp)は、cDNA量の測定に使用される既知の濃度を有するローディングマーカーである。代表的なマイクログリア細胞からのcDNAの増幅に成功し、サイズ分布グラフ上に曲線(緑色の点線)を形成するか、ゲルグラフ上に500bp~5,000 bpの間のスミア(標識ブラケット)を形成します。他の標識ピークは、ERCCスパイクイン分子またはリボソームRNAから増幅された。500 bpと5,000 bpの間のcDNAの濃度を定量することができ、0.05ng/μLより高い濃度を有し、そのような典型的な曲線を示すサンプルは、ライブラリー調製のために保持されます。RFU、相対蛍光単位。(B)最終的なプールされたライブラリ(約380個の細胞)のサイズ分布を示すバイオアナライザ上の代表的な品質管理結果。通常、平均サイズは 400 ~ 600 bp の 200 bp ~ 2,000 bp です。2つの鋭いピークはマーカーをロードしていました。FU、蛍光ユニット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:2匹の雄マウスの4つの脳領域から単離されたミクログリアのscRNA-seq分析。(A)tSNEプロットは、局所微小グリアの混ざり合ったパターンを示す(マウス#1からの細胞のみが強調表示された)。tSNE プロット上の集中領域への微妙なシフトを超えて、領域の起源に応じて異なるクラスターを形成しません (バッチ効果が原因である可能性があります)。この観察は、成体マウスにおけるグローバル遺伝子発現に基づくミクログリアの限られた局所的不均一性と一致する(このトピックに関するさらなる議論については、最近の出版物2を参照)。(B)tSNEプロットは、独立して処理された2匹の個々のマウスからのミクログリアの重なりパターンを示す。小さなバッチ効果(プロットの特定の領域に集中する細胞)が存在する可能性がありますが、これらの細胞は動物の起源に応じて異なるクラスターを形成しません。この結果は、実験間でデータを比較するためのプロトコルの再現性を示唆している。(C)Tmem119およびP2ry12などの特定のマーカーに対する95%以上の検出率を示すscRNA-seqによって検出されたミクログリアシグネチャ遺伝子の発現、およびSall1およびPu.1などの既知の転写因子に対する検出率が80%以上である。データは、公開された文献17から再分析されました。(D)単離されたミクログリアの大部分は、Tubb3(ニューロン)、Aldh1l1(アストロサイト)、Gjb1(オリゴデンドロサイト)、Tie1(内皮細胞)などの他の細胞型に特異的な遺伝子の発現を欠いている。(E) 微小グリア活性化またはストレスに関連する遺伝子の発現古典的なマーカー、Tnf、Il1b、Nos2 、およびNfkb2は、低表現で上に表示されます。 初期応答遺伝子Egr1およびFosは、下部に示されている(議論を参照)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

試薬 体積(°L)
細胞リシス 4
逆転写酵素 (100 U/μL) 0.95
ルナーゼ阻害剤 0.25
5x 最初のストランド バッファ 2
ジチオトレイトール (DTT; 100 mM) 0.5
ベタイン (5 M) 2
MgCl2 (1 M) 0.06
テンプレートスイッチオリゴ(TSO;100μM) 0.1
H2O 0.14
合計 10

表1:逆転写条件。1回の逆転写反応に対する試薬体積が提供される。

試薬 体積(°L)
逆転写産物 10
2x PCRマスターミックス 12.5
ISPCR プライマー (10 μM) 0.25
ラムダエキサヌクレアーゼ 0.1125
H2O 2.1375
合計 25

表2:PCR増幅条件単一細胞からのcDNAの1つのPCR増幅のための試薬容積が提供される。

プレートベース(このプロトコル) 液滴ベース(10xゲノミクス)
感度 より多くの遺伝子が検出されました 検出される遺伝子の数が少ない
全長 はい いいえ (5' または 3' 終了)
セル数/母集団の柔軟性 小さなサブ人口または希少なサブ人口の特性評価に適しています 大きな細胞集団の広範な分類に適しています
スループット 数千個までのセル 数百から数万の細胞
一意分子識別子 いいえ はい
セルあたりのコスト $1−$5 $1 未満
実験難易度 より多くのステップと通常、液体処理ロボット工学を必要とします 製品化された機械で簡単に実行
細胞集団 FACS ソートの対象 公平

表3:プレートベースと液滴ベースのscRNA-seq法の比較この記事では、プレートベースの全長scRNA-seq手順を提供し、入力として少数の細胞に対して、より高い感度、全長シーケンシング、柔軟性の利点を有する。液滴ベースの方法は、スループットの向上、コストの削減、実行が容易なデータ、および一意の分子識別子のデータの利点を提供します。それらは実験の目的に応じて相補的である。

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Discussion

ミクログリアは、CNSの他の細胞タイプと積極的に相互作用し、環境刺激に非常に敏感です。単離過程における炎症反応および遺伝子発現の異常変化を最小限に抑えるために、このプロトコルは以前に公開された方法9から合理化され、ミクログリアを単一マウス脳半球の複数の領域から並列に分離するのに適している。組織および試薬は冷温に保たれ、実験は限られた組織サイズに基づいて少ないワッシュおよびより少ない試薬とタイムリーに(解剖から選別まで約3.5時間)行われる。機械的解離は、ミクログリア9、18にほとんど損傷や活性化を引き起こしながら、ニューロンや他のグリア細胞を除去することができるので、酵素消化などの他の均質化方法をドーニングすることを選択します。しかし、過度のドーニングはミクログリアの収率を低下させる可能性があるため、避けるべきです。機械的解離およびビーズベースのミエリン除去の後、FACSソートは、古典的な炎症遺伝子の最小発現に基づいてミクログリアへの活性化が少なく、例えば、Tnf、Il1b、Nos2、およびNfkb2 9(図4E)であることが以前に示されている。それにもかかわらず、ミクログリアは、通常生体内2、19でミクログリアによって通常発現されないFosやEgr1(図4E)などの早期応答遺伝子をアップレギュレーションすることによって解離およびソート中のex vivo条件に応答することができ、トランスクリプト研究からのそのような変化は常にヒストロジーセクションで検証されるべきである。

ここでは、成体マウス脳半球から皮質、小脳、海馬、線条体からミクログリアを分離する手順を提供し、このプロトコルを他の領域または段階に容易に適合させることができる。これは、例えば、疾患に罹患したミクログリアが解剖可能な脳の特定の領域に限定されている場合や、有意な個々のバリエーションのためにサンプルをプールすることが不適切な老化研究において有用である。ミクログリア(またはパン先免疫)エピトープに対する抗体の入手可能性により、このプロトコルは、ラットまたはヒト組織9におけるミクログリアを単分化するためにも適応することができる。大きな組織または古い組織を調整する場合は、ミエリン除去ビーズの体積と使用するカラムの種類を考慮し、テストすることが重要です。ミエリン除去のための代替アプローチは、市販の低粘度媒体20における密度勾配遠心分離によるものである。全体的にこれら2つの方法は、その効率において同等であり、密度勾配遠心分離法はわずかに高い収率を提供し得るが、一方、磁気ビーズ法は、ミクログリア21、22を活性化し得る内毒素を導入する可能性が低い。

全脳細胞の中でもミクログリアの割合が小さいため、単細胞転写学的研究を行う前にミクログリアを濃縮または精製することが不可欠であることが多い。FACSを感度の高いアプローチとして使用して、低発現の細胞タイプを捕捉し、CD11bおよびCD45表面発現に基づいてミクログリアを選択します。1つの半球から、皮質は~30,000ミクログリア、小脳、海馬、線条体では約5,000ミクログリアを日常的に取得します。これらの収率は、ほとんどの単一細胞アプリケーションだけでなく、バルクRNA-seq(3,000以上の細胞を使用することができます)に十分です。ミクログリアは、発達または疾患2の間にCD45免疫反応性をアップレギュレートする可能性があることに言及する価値があり、その場合、CD45の低レベルと高レベルの両方を有する細胞を記録し、分析のために指標をソートする必要があります。ミクログリアを濃縮するための別のオプションは、ミエリン除去後にCD11bビーズ媒介性磁気活性化細胞ソートを使用することですが、これはscRNA-seqを液滴法に制限します。

単一細胞分解能で微小グリア遺伝子発現を研究するために、通常、細胞をサンプルあたり少なくとも2−3 96ウェルプレートにソートし、液体ハンドリングマシンでライブラリ調製を行います。このプレートベースの全長ライブラリ調製アプローチは、検出限界において最も感度の高いscRNA-seq法の1つであり、転写因子13、14、16などの希少な転写物の正確な定量を可能にすることが示されている。全長シーケンスングのため、このアプローチは 5' または 3' バイアスの対象ではなく、スプライシングバリアントの分析に使用できます (表 3)。さらに、通常は反応に数百または数千の細胞を必要とする液滴ベースの方法とは異なり、このプレートベースのプロトコルは、各実験に少数の細胞を含め、後で計画にプレートを追加することで人口サイズを徐々に拡大する柔軟性を有する。これは、胚発生などの特定の条件でミクログリアの小さなサブセットを研究する場合に有利です。

このプロトコルは脳地域ミクログリア用の高品質なscRNA-seqライブラリを再現的に生成しますが、多くの場合、比較的高いコスト(ライブラリの準備のために約5ドル/セル、シェルフSmartSeq v4キットを使用する場合は$23/cellよりも安価)のために小規模な研究にのみ適しています。いくつかの戦略は、コストを削減し、スループットを向上させることができます。まず、細胞はわずか0.5μLのリシス緩衝液で384ウェルプレートにソートすることができ、これは最初の逆転写およびPCR増幅ステップのために1/8ボリュームの試薬を必要とします。第2に、市販のキット23と同様の品質を有する社内Tn5トランスポザーゼを製造することができる。これら 2 つの変更により、ライブラリの準備コストが $1/cell に削減される可能性があります。第三に、カスタマイズされたインデックスを使用して、シーケンスの深さ (>100 万読み取り/セル)17を犠牲にすることなく、システム上でシーケンス処理のために何千ものセルをプールできます。これらの改善は、自動液体ハンドリングロボットの組み込みに伴い、ほぼすべての定義された領域から分離されたミクログリアの高スループットディープscRNA-seqを可能にします。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

私たちは、このプロトコルの開発中に彼らの助けをマリコL.ベネット、リアナニコールボナンノ、およびスパイロスダルマニスに感謝します。また、スタンフォード・シェアドFACS施設、特にメレディス・ウェグラーツとリサ・ニコルズに感謝します。スタンフォード・プロテイン・アンド・核酸施設(PAN)のヤン・トラン、マイケル・エッカートが撮影を大いにサポート。この作品は、JPB財団とヴィンセント・J・コーツ財団が出資しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 M Betaine Sigma-Aldrich Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific Cat# 14185-052
1 M HEPES Thermo Fisher Scientific Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix Kapa Biosciences Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap Corning Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) Advanced Analytical Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A8806
DNase I Worthington Cat# LS002007 Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade Promega Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix Thermo Fisher Scientific Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl) New England BioLabs Cat# M0262S
Mouse Fc block BD Pharmingen Cat# 553142
Myelin removal beads Miltenyl Biotec Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit Illumina Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) Illumina Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific Cat# 70011044
PCRClean DX beads Aline Biosciences Cat# C-1003-50
Propidium Iodide Thermo Fisher Scientific Cat# P3566 Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermal Fisher Scientific Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) BioLegend Cat# 101236; RRID: AB_11203704 Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) Clontech Cat# 639538 Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'
(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'
(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)
(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific VWR 89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates Bio-Rad HSP9631
Others
Dumont #55 forceps Fine Science Tools 11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml Wheaton 357422
Large depletion column Miltenyi Biotec 130-042-901
Large selection column Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
RNAzap Thermo Fisher Scientific AM9780
Strainer (70 μm) Falcon 352350
Equipment
BD FACSAria II BD Biosciences http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer Agilent 2100
Fragment Analyzer Agilent 5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot TTP Labtech https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33226

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References

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