쥐의 원주 식도 재건을 위한 조직 공학 이식편

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Bioengineering

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Summary

식도 재건은 도전적인 절차이며, 식도 점막과 근육의 재생을 가능하게하고 인공 이식으로 이식 할 수있는 조직 공학 식도의 개발이 필요합니다. 여기에서는 스캐폴드 제조, 생물 반응기 재배 및 다양한 수술 기법을 포함한 인공 식도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

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Kim, I. G., Wu, Y., Park, S. A., Cho, H., Shin, J. W., Chung, E. J. Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats. J. Vis. Exp. (156), e60349, doi:10.3791/60349 (2020).

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Abstract

원주 식도 재건을 위한 생체 적합성 물질의 사용은 쥐에서 기술적으로 도전적인 작업이며 영양 지원을 지원하는 최적의 임플란트 기술이 필요합니다. 최근에는 식도 조직 공학에 많은 시도가 있었지만 연석의 특별한 환경에서 초기 상피화의 어려움으로 인해 성공률이 제한되었습니다. 여기서, 우리는 2층 관 성 비계, 중간 엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 시스템 및 변형된 바이패스 공급 기술을 통해 식도 점막과 근육 층의 재생을 향상시킬 수 있는 인공 식도를 개발했습니다. 위장관 절제술. 스캐폴드는 외벽을 감싸는 3차원(3D) 인쇄 폴리카프롤락톤 가닥을 가진 원통형 형태의 폴리우레탄(PU) 나노섬유로 이루어진다. 이식에 앞서, 인간 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드의 내루에 파종하고, 세포 반응성을 향상시키기 위해 생물반응기 재배를 수행하였다. 우리는 외과 적 해부학을 적용하고 갑상선 플랩으로 이식 된 보철을 덮고 일시적인 비내구 위절제술 을 통해 이식 생존율을 향상시켰습니다. 이 접목은 조직학 분석에 의해 입증된 바와 같이 이식된 부위 의 주위에 초기 상피화 그리고 근육 재생의 사실 인정을 되풀이할 수 있었습니다. 또한, 엘라스틴 섬유 증가 및 혈관 신생은 이식편 주변에서 관찰되었다. 따라서,이 모델은 원주 식도 재건을위한 잠재적 인 새로운 기술을 제시한다.

Introduction

선천성 기형 및 식도 암과 같은 식도 장애의 치료는 식도의 구조적 세그먼트 손실로 이어질 수 있습니다. 대부분의 경우, 위 풀업 도관 또는 결장 간과 같은 자가 대체 이식편이1,2로수행되었습니다. 그러나, 이러한 식도 교체는 다양한 외과적 합병증 및 재수술 위험이3. 따라서, 네이티브 식도를 모방한 조직 공학식도 비계의 사용은 궁극적으로 손실된 조직을 재생하기 위한 유망한 대안 전략이 될 수 있다4,5,6.

조직 공학식도 잠재적으로 식도 결함의 현재 치료에 대 한 대안을 제공 하지만, 그것의 생체 내 응용 프로그램에 대 한 중요 한 장벽이 있다. 이식된 식도 비계의 수술 후 해부학 적 누설 및 괴사는 필연적으로 매질7과같은 주변 무균 공간의 치명적인 감염으로 이어질 수 있습니다. 따라서 상처 및 비위 관의 음식이나 타액 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 위장관 절제술 또는 정맥 영양은 1 차적인 상처 치유가 완료될 때까지 고려되어야 합니다. 현재까지, 식도 조직 공학은 큰 동물이 스캐폴드8의이식 후 2-4 주 동안 정맥 과충에 의해서만 공급될 수 있기 때문에 큰 동물 모델에서 수행되었다. 그러나, 이러한 비oral 공급 모델은 작은 동물에서 식도 이식 후 조기 생존을 위해 확립되지 않았다. 이것은 동물이 매우 활동적이고 통제 할 수 없었기 때문에 장기간 동안 수유 튜브를 위장에 보관 할 수 없었기 때문입니다. 이러한 이유로, 작은 동물에 성공적인 식도 이식의 몇 가지 경우가 되었습니다.

식도 조직 공학의 상황을 고려하여, 우리는 전기 스펀 나노 섬유 (내부 층)로 구성된 2 층 관 형 스캐폴드를 설계했습니다. 도 1A)및 3D 프린팅 가닥(외부 층; 도 1B)변형된 위절제술 기법을 포함한다. 내부 나노 섬유는 분해되지 않는 폴리머 인 PU로 만들어졌으며 음식과 타액의 누출을 방지합니다. 외부 3D 프린팅 가닥은 기계적 유연성을 제공하고 연동 운동에 적응할 수 있는 생분해성 폴리카프로롤락톤(PCL)으로 만들어집니다. 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(hAD-MSCs)는 스캐폴드의 내부 층에 씨를 뿌리고 상피화를 촉진하였다. 나노섬유 구조는 세포 이동을 위한 구조적 세포외 매트릭스(ECM) 환경을 제공함으로써 초기 점막 재생을 용이하게 할 수 있다.

우리는 또한 생물 반응기 재배를 통해 접종 된 세포의 생존율과 생체 활성을 증가시켰습니다. 이식된 스캐폴드는 식도 점막과 근육 층의 보다 안정적인 재생을 가능하게 하기 위해 갑상선 플랩으로 덮여 있었다. 이 보고서에서는 스캐폴드 제조, 중간엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 재배, 변형 된 위절제술을 사용한 우회 공급 기술 및 수정 된 수술을 포함한 식도 조직 공학 기술에 대한 프로토콜을 설명합니다. 쥐 모형에 있는 원주 식도 재건을 위한 해부학 기술.

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Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 서울대학교병원의 기관동물관리및사용위원회(IACUC No. 17-0164-S1A0)의 승인을 받았습니다.

1. 비계 제조

참고 : 2 층 식도 스캐폴드는 전기 방사 및 3D 프린팅을 결합하여 제조됩니다. 관형 스캐폴드의 내부 멤브레인은 컬렉터로서 회전하는 스테인리스 스틸 만드렐로전기방사 폴리우레탄(PU)에 의해 제조되었다.

  1. 관형 PU 나노 섬유의 제조를 위해, 실온에서 8 시간 동안 N,N-디메틸 포름 아미드 (DMF)에서 교반하여 PU 폴리머의 20 % (w / v) 용액을 준비하십시오.
  2. PU 용액을 무딘 금속 바늘(22G)으로 주사기 에 놓고, 바늘 끝과 회전 수집기 사이의 30cm 거리에서 회전스테인리스 맨드릴(직경 = 2 mm)에 전기 스핀을 놓습니다.
    참고: 전원 공급 장치는 15kV 전위가 되는 고전압 직전류로 설정됩니다. 용액의 공급 속도는 주사기 펌프를 사용하여 0.5 mL/h로 고정됩니다.
  3. 3.14 m/s에서 회전 하는 맨드렐의 표면에 관 형 나노 섬유 층을 확인 합니다.
  4. PU 나노섬유를 진공 오븐에서 40°C에서 하룻밤 동안 건조하여 잔류 용매를 완전히 제거합니다.
    참고: 식도 스캐폴드의 3D 프린팅 외벽은 신속한 프로토타이핑 시스템을 사용하여 제조됩니다. 3D 프린팅 장비는 디스펜서, 노즐, 압축/열 컨트롤러, 3축 변환 단계 및 소프트웨어 시스템으로 구성됩니다.
  5. PCL 펠릿은 가열 실린더에서 100°C에서 용해된 다음 바이오플로팅 시스템의 제어 하에 고압(7 bar)에서 나노섬유의 표면에 인쇄됩니다. 노즐 크기는 300 μm이고 가닥 거리는 700 μm입니다.
  6. 맨드렐에서 2층 스캐폴드를 제거한 후, 자외선 하에서 70% 에탄올을 담가 살균하였다.
    참고 : 스캐폴드의 더 자세한 특성은 이전 연구에서 보고되었습니다10.

2. 이식편 및 생물반응기 재배에 대한 세포 파종

참고: 회사에서 구입한 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(hMSCs)를 수정 없이 사용하였다.

  1. 세포 이식에 앞서 자외선 아래에서 1 시간 동안 3D 인쇄 식도 스캐폴드를 살균하고 에탄올로 10 분 동안 적시고 인산완충 식염수 (PBS)로 3 x 씻어 내다.
  2. 배양 및 성장 매체에서 hMSC를 확장 (기초 매체/성장 보충). 2층 관형 스캐폴드는 비부착24웰 조직 배양판으로 옮겼다.
  3. 스캐폴드의 내부 표면에 세포를 부착하려면 성장 배지를 포함하는 지하 막 매트릭스에서 1 x 106 셀/mL의 밀도로 hMSC 현탁액을 부드럽게 추가합니다.
  4. 2층 관형 스캐폴드의 내부 표면에 지하 멤브레인 매트릭스 현탁액을 균일하게 증착한다.
  5. hMSC-시드 관형 스캐폴드를 맥동유동 생물반응기 시스템을 이용하여 생물반응기의 배양챔버 내아크릴 홀더에 단단히 고정한다.
    참고: 맞춤형 바이오리액터 시스템은 펌프, 버블 트랩, 유량 챔버, 압력 게이지, 제어 밸브 및 중간 저수지로 구성됩니다. 배양실에서 전단 응력 적용시, 1-2분11의휴식 시간을 허용한다.
  6. 배양 챔버에 성장 배지를 추가하고 5%CO210을포함하는 가습 된 분위기 하에서 0.1 dyne /cm2 유동 유도 전단 응력적용.
    참고: 유동 유도 전단 응력의 값은 이전 연구10으로부터인체로부터 유래된 식도 조직의 연동동을 시뮬레이션하여 계산되었다.
  7. 제조업체의 지침에 따라 LIVE/DEAD 생존 율 분석 키트를 사용하여 5일 후에 생물 반응기 재배없이 2층 관 형 스캐폴드의 내부 표면에 세포 반응을 결정합니다. Z 스택 도구를 사용하여 공초점 현미경을 통해 이미지를 가져옵니다.
  8. 셋째 날에는 주사 전자 현미경 (SEM)을 통해 hMSC 시드 관 비계의 표면 형태를 관찰하십시오.
    1. hMSC로 배양된 스캐폴드를 2.5% 글루타랄데히드 및 OsO4로 24시간 동안 고정하고 에탄올로 탈수합니다.
    2. 아르곤 대기 조건에서 스퍼터 코터를 사용하여 고정 된 hMSC를 백금으로 코팅하고 25 kV의 가속 전압에서 SEM 이미지를 얻습니다.

3. 동물 수술을위한 외과 준비

참고 : 외과 준비는 위절제술과 식도 이식 전에 적용됩니다.

  1. 멸균 수술 기구 설정: 메스 블레이드, Weitlaner 리트랙터, 마이크로니들 홀더, 미세수압 집게, 마이크로조직 집게, 마이크로사이저, 마요-헤거 니들 홀더, 작동 가위, 홍채 가위, 드레싱 집게, 조직 집게, 스플린터 집게, 홍채 집게, 5 mL 주사기 (21 G 바늘), 10 mL 주사기 (22 G 바늘), 9-0 폴리 아미드 봉합사, 4-0 폴리 글락틴 봉합사.
  2. 타일타민/졸라제팜(50 mg/g 용량)과 2% 자일라진 염산염(2 mg/kg 용량)의 근육 내 주사로 동물을 마취시다.
    참고: 398-420 g의 성인 스프라그-Dawley(SD) 랫트는 식도 이식에 사용하였다.
  3. 외과 용 커튼으로 옮기기 전에 꼬리를 집게로 꼬집어 동물의 적절한 마취 상태를 확인하십시오.
  4. 동물을 멸균 드레이프 위에 놓고 클리퍼를 사용하여 목에서 머리카락을 제거하십시오 (식도 이식용) 또는 복부 (위장관 절제술). 그런 다음 베타딘과 70 % 에탄올로 수술 부위를 문지하십시오.
  5. 절개 전에, 피하 통증 완화를 위해 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)와 같은 진통을 주입하십시오.

4. 쥐에 있는 T 관을 사용하여 위장 절제술

참고: 수정된 위장관 절제술은 모든 실험 동물에서 일시적으로 비경구 관 공급을 허용하도록 수행하였다(n=5).

  1. 수술 전날 쥐를 빨리 지내게 하십시오. 섹션 3에서와 같이 수술을 준비하십시오.
  2. 마취 된 쥐의 피부와 복부 근육의 중간 절개를 통해 위를 노출하십시오.
  3. 메스 블레이드로 전방 위벽에 3mm 오리피스를 만듭니다.
  4. 실리콘 T-튜브의 팁을 결함 부위에 삽입하여 위벽에 고정시십시오.
  5. T-튜브가 위 벽에서 분리되지 않도록 제대로 봉합사.
  6. 이식된 T-튜브의 말단을 피하 터널을 통해 목 뒤쪽으로 빼냅니다.
  7. 헤파린 캡을 T-튜브 끝에 삽입하여 위 내용물이 뒤로 흐르는 것을 방지합니다.
    참고: 협심증을 사용하여 T-튜브의 끝을 헤파린 캡과 연결합니다.
  8. 4-0 폴리글락틴 봉합사를 사용하여 복벽과 피부의 모든 층을 봉합하십시오.
  9. 위절제술이 완료된 후 모든 실험 쥐를 대사 케이지에 분리하십시오.

5. 식도 이식

참고: 2층 관 성 스캐폴드의 식도 이식은 위장관 절제술 후 1 주일 후에 수행됩니다 (n = 5). 이식에 앞서, hMSCs(세포 밀도: 지하 막 매트릭스에서 1 x 106 세포/mL)를 각 스캐폴드의 내벽에 접종하고 생물 반응기 시스템에서 3 일 동안 배양합니다. 외과 적 절차는 다음과 같습니다.

  1. 모형 동물의 목털을 제거하고 무균 수술을 위한 수술 부위의 표준 드레이프를 수행한다.
    참고: 동물에 대한 수술을 유지하기 위해 큰 면도 부위를 만드는 것이 좋습니다.
  2. 목의 전방 중앙 절개 후, 스트랩 근육을 분리하고 기관식도 구조를 노출.
  3. 세그먼트를 절제하기 전에 식도에서 미주 신경을 무뚝뚝하게 해부하면 동물의 호흡이 손상됩니다.
  4. 배율하에서 식도의 왼쪽을 기관에서 분리하고 갑상선에서 상부를 조심스럽게 분리합니다.
  5. 외과 용 가위를 사용하여 식도의 모든 층을 포함하는 5mm 길이의 전체 둘레 결함을 만듭니다.
    참고 : 식도 이식 전에 수술 용 가위를 사용하여 준비된 스캐폴드를 이식 부위의 길이와 일치시킵니다.
  6. 현미경으로, 9-0 봉합사 를 사용하여 말단 식도 결함의 양 단부에서 미세 아나스토모시스를 수행합니다. 상부 식도 잔재와 비계의 오른쪽 후추 마진 사이에 첫 번째 봉합사를 놓습니다. 상부 식도 잔해와 비계 사이에 오른쪽에서 왼쪽으로 봉합을 계속합니다. 하부 식도 잔재의 상부 마진과 동일한 방식으로 스캐폴드를 아나스토모제.
    참고 : 식도 이식에 대한 임상 수술에 사용되는 미세 혈관 안합을 수행합니다. 임플란트 부위의 정밀하고 방수 봉합을 위해 현미경으로 작업하십시오.
  7. 그 후, 이식 부위에 주변 갑상선 플랩을 놓고 이식 부위에 혈관 공급을 안정적으로 유지관리하십시오.
  8. 이식 후 피하 근육과 피부 조직을 4-0 비릴 봉합사로 바느질하십시오.
  9. 모든 실험 쥐를 신진 대사 케이지에 개별적으로 보관하십시오.

6. 수술 후 절차

참고 : 수술 후 절차는 위절제술과 식도 이식 후 수행됩니다.

  1. 복부 상처의 폐쇄 후, 개별 대사 케이지에 쥐를 넣고 저체온증을 방지하기 위해 적외선 온난화 장치에 케이지를 배치합니다.
  2. 동물들이 흉골 의식을 달성하고 유지할 때까지 동물을 모니터링하십시오 (즉, 가슴에 똑바로 누워 있음).
  3. 수술 부위의 염증을 최소화하려면 항생제 젠타미신(20 mg/kg)을 쥐에게 매일 투여하십시오.
  4. 연구의 끝점까지 세 번째 수술 후 날에 경구 액체 공급을 시작합니다. 전체 영양 포뮬러(20.6 g/100 ml [g%] 탄수화물, 3.8 g% 단백질, 0.2 g% 지방)을 수술 후 하루 3배의 헤파린 캡을 통해 공급하십시오.
  5. 매일 동물의 외모와 체중을 확인하십시오. 자기 해의 절개 부위 또는 튜브 섭취에 대한 저항, 다양한 수술 합병증과 같은 행동을 관리하십시오. 쥐 모델의 체중이 20% 이상 급격히 감소하면CO2 흡입에 의해 안락사를 수행합니다.

7. 반학과 면역화학

참고 : 조직 학적 분석을 위해 안락사 된 동물의 모든 식도 조직은 외과 용 가위를 사용하여 추출됩니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 마슨의 삼색 염색은 표준 조직학적 기법을 사용하여 수행되었다. 면역성화학은 다음 프로토콜에 따라 수행되었다.

  1. 이식 부위를 포함하는 전체 식도를 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오. 파라핀 블록을 만들고 4 μm 두께의 단면을 잘라냅니다.
  2. 조직 단면을 분리하고 에탄올 시리즈에서 탈수시. 티슈 슬라이드를 구연산완충에 담그고 전자레인지에서 10분간 가열합니다. 차가운 PBS로 세포를 20 분 동안 식히고 3 % 과산화수소에 6 분 동안 담그고 PBS로 10 분 동안 씻으십시오.
  3. 3% 소 혈청 알부민 (BSA)에서 배양 1 시간 동안 실온에서 조직 섹션의 비특이적 반응을 차단합니다.
  4. 5 분 동안 PBS로 3x를 씻으십시오. Desmin에 대한 기본 항체로 인큐베이션 (1 :200으로 희석), 각질 13 (1 : 100으로 희석), 폰 윌레브란트 인자 (vWF; 1 :100로 희석) 4 °C에서 밤새.
  5. 15 분 동안 PBS로 3x를 씻습니다. 실온에서 Desmin 및 Keratin 13에 대해 1:500의 농도로 적절한 이차 항체로 인큐베이션합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 10 분 동안 두 번 씻습니다.
    참고: vWF용 티슈 섹션은 고추냉이 과산화아제-컨쥬게이션 키트(재료 표참조)를 사용하여 배양한 다음 3,3'-다미노벤지딘(DAB)을 사용하여 시각화하였다.
  6. 유리 커버 슬립 및 4',6-디아미디노-2-페놀린돌레(DAPI)를 사용하여 장착 매체를 포함합니다.

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Representative Results

도 1은 PU-PCL 2층 관형 스캐폴드의 제조 공정에 대한 개략적 도표를 나타낸다. 상기 PU 용액은 두께 200 μm의 원통형 내부 구조를 만들기 위해 18 G 바늘로부터 전기스펀을 하였다. 이어서, 용융된 PCL을 PU 나노섬유의 외벽에 일정한 간격으로 인쇄하였다. 완성된 관성 스캐폴드의 내벽및 외벽의 표면 형태는 주사 전자 현미경 이미지에서 볼 수 있다.

도 2는 외부 영양 공급을 위해 쥐에 위장관튜브를 삽입하는 과정을나타낸다(도 2A). T자형 실리콘 튜브를 위벽에 삽입하고 봉합하였다(도2B). 튜브를 목 뒤쪽으로 피하 터널을 통해 이동하고 헤파린 캡으로 연결하였다(도2C). 튜브는 액체 식품의 주입을 용이하게합니다. 또한 튜브를 통해 위 내용물의 역류를 금지합니다.

도 3은 스캐폴드의 내벽상세포 접종, 생물반응기 재배, 식도 이식 과정을 나타낸다. hMSC 내장 된 지하 멤브레인 매트릭스는 주입을 통해 스캐폴드의 내벽에 고르게 적용되었습니다(도 3A). SEM 이미지는 셀 부착 내부 표면의 형태를 보여줍니다. 2층 관성 스캐폴드(발광면)에서 세포 생존가능성을 분석하기 위한 살아있는/죽은 염색은 대부분의 세포가 실행 가능하다는 것을 나타내었고, 5일 만에 나노섬유 구조에 잘 퍼졌다. 세포와 함께 접종된 스캐폴드를 생물반응기에 고정시키고, 전단 응력을 펌프에 의해 인가하였다(도3B). 생물 반응기 재배를 포함한 hMSC 시드 관 형 비계는 미세 수화 기술을 통해 전체 원주 식도 결함을 가진 쥐로 이식되었습니다. 이식편은 이식부위의 안정된 고정 및 혈관 공급을 위해 갑상선 플랩으로 덮여있었다(도 3C). 이식 후 쥐의 체중 변화는 실험이 끝날 때까지 관찰되었다. 식도 이식 된 쥐는 9 일까지 340g에 머물렀지만 여러 가지 원인으로 인해 체중이 급격히 감소했습니다(도 3D). 그 결과, 대부분의 동물은 15 일 이내에 사망했다.

도 4는 이식 이식 후 식도 재생을 나타낸다. 대부분의 쥐는 털에 의한 신식도 폐색을 개발했지만, 천공의 총 증거가 없었다, 누공과 해부학 누설, 혈증 축적, 농양 형성, 또는 어떤 실험 쥐에서 주변 연조직 괴사. 이식 부위의 재상피질은 각질(13)에 대한 면역형광 염색에 의해 확인되었다. 콜라겐 층과 엘라스틴 섬유의 형태는 재생 부위에서 명확하게 확인되었다. 풍부한 엘라스틴과 콜라겐 섬유의 존재는 더 나은 기계적 특성에 기여할 수 있습니다. 식도 근육 층의 재생은 데스민 면역 조직 화학에 의해 나타내었으며, 풍부한 신생 혈관이이 부위에서 관찰되었다.

Figure 1
그림 1: 2층 관형 비계를 제작하는 데 사용되는 공정의 개략적 그림. PU(A)를이용하여 전기방사하여 내부 막을 제조한 후, 튜브형 스캐폴드의 구조적 강도는 용매 없이 3D 프린팅시스템을 이용하여 멤브레인의 외부 표면에 가닥을 첨가함으로써 보강하였다. SEM 이미지는 2층 관 식 스캐폴드의 내부 및 외부 층의 형태를 보여줍니다. (약어: PU = 폴리우레탄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 위장관. (A)위벽에 T-튜브 삽입을 통해 위절제술 기술을 보여주는 개략도. (B)전위 중간에 구멍이 뚫리고, T-튜브 팁이 위판에 삽입됩니다. (C)T-튜브의 입구 부분은 서양의 중간에 헤파린 캡이 있습니다. 아래 그림은 다른 구성 요소와 T 튜브 위절제술 장치를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 식도 이식. (a)지하 막 매트릭스에 캡슐화된 hMSCs를 2층 관형 스캐폴드의 내부 층에 시드하였다. SEM 이미지는 내벽에 있는 hMSC의 형태를 보여줍니다. 접종된 세포의 생존가능성도 살아있는 죽은 염색(녹색=살아있는 세포)에 의해 확인되었다. hMSC-시드 스캐폴드는 생물반응기시스템(B)에서즉시 배양한 다음, 조직 공학식도를 자궁경부 식도(C)에이식하였다. 이식 된 부위는 안정적인 식도 재건 (화살표)을 위해 갑상선 플랩으로 덮여있었습니다. (D)식도 이식 후 체중 감량 연구. 체중 감소는 쥐의 초기 체중으로부터 절대적인 변화로 결정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 정형외과 성 스캐폴드 이식 후 2주 후에 재건된 식도의 전체 골반학. Masson의 삼조 염색은 이식된 부위 주위의 콜라겐 침착을 보여줍니다. 식도 근육 및 점액층의 재생은 각각 데스민(녹색)과 케라틴(13)(적색) 면역염색에 의해 확인되었다. 추가적으로, 신생혈관(화살표)은 재생된 점막 층 주위에서 명확하게 관찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

인공 식도에 기존 동물 연구는 여전히 몇 가지 중요 한 요인에 의해 제한. 이상적인 인공 식도 스캐폴드는 생체 적합성이어야하며 우수한 물리적 특성을 가져야합니다. 그것은 해부학 누설을 방지하기 위해 초기 수술 후 기간에 점막 상피를 재생할 수 있어야합니다. 내측 원형 및 외측 세로 근육층의 재생은 기능연동동동사12,13에도중요하다.

식도의 기계적 특성은 식도가 호흡 중에 붕괴되고 삼키는 동안 열리기 때문에 필수적이며, 반동현상14와최대 스트레칭에 지속적으로 노출됩니다. 이식된 스캐폴드는 이러한 기계적 특성도 가져야 합니다. 이식된 식도의 점탄성은 식도를 통해 연동 운동의 반복적 인 램프 - 이완에 적합해야합니다. 너무 약한 스캐폴드는 파열되거나 누출되어 수령인의 심각한 상태(예: 매만염)를 유발할 수 있습니다. 대조적으로, 너무 뻣뻣한 비계는 식도 루멘으로 부풀어 오르고 음식 통로를 방지할 수 있었습니다. 전기 나노 섬유는 식도 재건을위한 매우 유리한 물리적 특성을 갖는다. ECM의 지형 특성은 식도층(15)에서상피 세포의 이동 및 분화에 유리한 환경을 제공한다. 또한 타액 및 각종병원균(16)의누설을 방지하는 나노기공 구조를 갖는다. 그러나, 전기 스펀 나노 섬유로 만든 스캐폴드는 부드러운 기계적 특성으로 인해 사용이 제한되어 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 3D 프린팅 기술을 사용하여 기계적 강도를 향상시켰습니다. 나노섬유의 외부 층에 3D 인쇄 가닥은 780 μm의 폭을 가지며 내부 기공 구조는 상당히 넓습니다. 그것은 주변 조직의 재생을 안내하는 것보다 식도 개입에 대한 물리적 지원을 제공합니다.

본 연구에서, 원주 식도 결함은 최대 2주 동안 생물반응기 배양 이식편에서 완전히 치유되었지만, 모든 실험쥐는 수술 후 15일 이내에 사망했다. 대부분의 죽음은 해부학 사이트에 근접 한 음식과 타액 누출에 기인한 복박염과 영양실조에 기인했습니다. 모든 동물은 최대 1 주일 동안 자유롭게 액체 식단을 섭취했지만 상처 치유가 진행됨에 따라 헤어볼 삼키기로 인해 재구성 된 식도에서 의도하지 않은 기계적 방해가 발생했습니다. 이 현상은 이식된 비동적 스캐폴드 내에서 완전한 소화 장애를 일으키는 것으로 나타났다. 이러한 기술적 문제를 극복하기 위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 첫째, 식도 연석을 모방 할 수있는 고탄성 식도 임플란트의 개발. 둘째, 털이 없는 쥐를 사용하여 모발을 삼키는 것을 방지하는 동물 연구. 셋째, 담즙 스텐트는 임플란트 붕괴 및 해부학 손상을 최소화하기 위해 스캐폴드와 동시에 적용 될 수 있습니다. 또한, 식도 스캐폴드 이식에 미세 혈관 안압증을 적용하여 타액의 누출을 완전히 방지하는 것이 중요하다. 육안으로 사용하는 기존의 봉합사 기술은 쥐 모델에서 방수를 만들기가 매우 어렵습니다.

신뢰할 수 있는 혈관 비히클은 재생 초기 단계에서 영양소, 성장 인자 및 산소 공급에 필수적입니다. 갑상선은 식도 근처에 있는 혈관 조직입니다. 우리는 쥐 모형에 있는 그것의 쉬운 접근성 때문에 원추형 식도 절제술 후에 갑상선 플랩을 이용했습니다. 결론적으로, 우리는 쥐 모형에 있는 식도 재건의 어려움을 극복하기 위하여 각종 전임상 기술을 제안합니다. 본 연구는 기존의 작은 동물 식도 이식의 한계를 극복하기 위한 좋은 대안을 제시한다.

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Disclosures

본 연구를 위해 설계된 바이오리액터 시스템이 상용화되었습니다(모델 번호: ACBF-100).

Acknowledgments

이 연구는 한국보건산업진흥원(KHIDI)을 통해 한국보건기술R&D 사업지원, 보건복지부(보조금 번호: HI16C0362) 및 기초과학연구 교육부의 지원을 받는 국립연구재단(NRF)을 통한 프로그램(2017R1B2011132). 이 연구에 사용된 생물표본및 데이터는 한국바이오뱅크 네트워크 회원인 서울대학교병원 바이오뱅크가 제공했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic cage TEUNGDO BIO & PLANT JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose) Virbac 1000000188
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
1 mL Syringe BD 309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun) Byely Q-0615-035
4% paraformaldehyde BIOSOLUTION BP031
4-0 Vicryl ETHICON W9443
9-0 Vicryl ETHICON W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal). Septopal 0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X Sigma C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT VECTOR SK4100
Desmin Santa Cruz sc-23879
Elastic stain kit ScyTeK ETS-1
Ethanol Merck 100983
Ethanol Merck 64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS) Gibco 16000-044
Glutaraldehyde Sigma 354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A-11001
Heparin cap Hyupsung Medical HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium
(MesenPRO RSTM)
Invitrogen R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) VECTOR PK7800
Hydrogen peroxide JUNSEI 7722-84-1
Keratin13 Novus NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit Molecular Probes L3224
Matrigel Corning 354262
N,N-dimethylformamide (DMF) Sigma 227056
Nonadherent
24-well tissue culture plates.
Corning 3738
OsO4 Sigma O5500
Petri dish Eppendorf 3072115
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X BIOSOLUTION BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer Sigma 440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer Lubrizol 2363-80AE
Power Supply NanoNC HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931
Rumpun Bayer Q-0615-035
Silicone T-tube Sewoon Medical 2206-005
Terramycin Eye Ointment Pfizer Pharmaceutical Korea W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) Virbac Laboratories Q-0042-058
Trichrome stain kit ScyTeK TRM-1
von Willebrand Factor (vWF) Santa Cruz sc 14014

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References

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