Tissue-Engineered Graft voor circumferential slokdarmreconstructie bij ratten

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Slokdarmreconstructie is een uitdagende procedure, en de ontwikkeling van een weefsel-engineered slokdarm die regeneratie van slokdarmslijmvlies en spier mogelijk maakt en die kan worden geïmplanteerd als een kunstmatige graft is noodzakelijk. Hier presenteren we ons protocol om een kunstmatige slokdarm te genereren, inclusief steigerproductie, bioreactorteelt en verschillende chirurgische technieken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kim, I. G., Wu, Y., Park, S. A., Cho, H., Shin, J. W., Chung, E. J. Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats. J. Vis. Exp. (156), e60349, doi:10.3791/60349 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het gebruik van biocompatibele materialen voor circumferential eesofagereconstructie is een technisch uitdagende taak bij ratten en vereist een optimale implantaattechniek met voedingsondersteuning. Onlangs zijn er vele pogingen tot slokdarmweefsel engineering, maar het slagingspercentage is beperkt als gevolg van moeilijkheden in de vroege epithelisatie in de speciale omgeving van peristalis. Hier ontwikkelden we een kunstmatige slokdarm die de regeneratie van het slokdarmslijmvlies en spierlagen kan verbeteren door middel van een tweelaags buisvormig schavot, een mesenchymale stamcelgebaseerd bioreactorsysteem en een bypassvoedingtechniek met aangepaste Gastrostomy. Het schavot is gemaakt van polyurethaan (PU) nanovezels in een cilindrische vorm met een driedimensionale (3D) geprinte polycaprolactone streng gewikkeld rond de buitenmuur. Voorafgaand aan de transplantatie werden mesenchymale stamcellen van menselijke afkomst in het lumen van het schavot gezaaid en werd de bioreactorteelt uitgevoerd om de cellulaire reactiviteit te verbeteren. We verbeterden de overlevingsgraad van graft door chirurgische anastomose toe te passen en de geïmplanteerde prothese te bedekken met een schildklierflap, gevolgd door tijdelijke nonorale gastrostomievoeding. Deze grafts waren in staat om de bevindingen van de eerste epitheelalisatie en spierregeneratie rond de geïmplanteerde sites, zoals blijkt uit histologische analyse, te recapituleren. Bovendien werden verhoogde elastinevezels en neovascularisatie waargenomen in de periferie van de graft. Daarom presenteert dit model een potentiële nieuwe techniek voor circumferential eesofageale reconstructie.

Introduction

De behandeling van slokdarmaandoeningen, zoals aangeboren misvormingen en slokdarmcarcinomen, kan leiden tot structureel segmentverlies van de slokdarm. In de meeste gevallen zijn autologe vervangende grafts uitgevoerd, zoals maagophaalleidingen of darminterposities,1,2. Echter, deze slokdarmvervangingen hebben een verscheidenheid aan chirurgische complicaties en heroperatie risico's3. Zo kan het gebruik van weefsel-engineered slokdarm steigers nabootsen van de inheemse slokdarm een veelbelovende alternatieve strategie voor uiteindelijk regenereren verloren weefsels4,5,6.

Hoewel een weefsel-engineered slokdarm potentieel biedt een alternatief voor de huidige behandelingen van slokdarmafwijkingen, er zijn aanzienlijke barrières voor de in vivo toepassing. Postoperatieve anastomotische lekkage en necrose van de geïmplanteerde slokdarmsteiger leiden onvermijdelijk tot een dodelijke infectie van de omliggende aseptische ruimte, zoals het mediastinum7. Daarom is het uiterst belangrijk om voedsel- of speekselbesmetting in de wond en nasogastrische buis te voorkomen. Gastrostomie of intraveneuze voeding moet worden overwogen totdat de primaire wondgenezing is voltooid. Tot op heden, slokdarmweefsel engineering is uitgevoerd in grote diermodellen, omdat grote dieren kunnen alleen worden gevoed door intraveneuze hyperalimentatie gedurende 2-4 weken na implantatie van de steiger8. Een dergelijk niet-oraal voedingsmodel is echter niet vastgesteld voor vroegtijdige overleving na slokdarmtransplantatie bij kleine dieren. Dit komt omdat de dieren waren zeer actief en oncontroleerbaar, zodat ze niet konden houden van de voedingssonde in hun magen voor een langere periode van tijd. Om deze reden zijn er weinig gevallen van succesvolle slokdarmtransplantatie bij kleine dieren.

Gezien de omstandigheden van slokdarmweefseltechniek, ontwierpen we een tweelaags buisvormig schavot bestaande uit elektrogesponnen nanovezels (binnenlaag; Figuur 1A) en een 3D-geprinte streng (buitenlaag; Figuur 1B) met inbegrip van een gewijzigde gastrostomietechniek. De interne nanovezel is gemaakt van PU, een niet-afbreekbaar polymeer, en voorkomt de lekkage van voedsel en speeksel. De externe 3D-geprinte strengen zijn gemaakt van biologisch afbreekbare polycaprolacton (PCL), die mechanische flexibiliteit kan bieden en zich kan aanpassen aan peristaltische beweging. Menselijke vet-afgeleide mesenchymale stamcellen (hAD-MSCs) werden gezaaid op de binnenste laag van het schavot om re-epithelisatie te bevorderen. De nanovezelstructuur kan de initiële regeneratie van slijm vergemakkelijken door een structurele extracellulaire matrix (ECM) omgeving te bieden voor celmigratie.

We hebben ook de overlevingskans en de bioactiviteit van de ingeënte cellen verhoogd door middel van bioreactorteelt. De geïmplanteerde steiger was bedekt met een schildklier flap om meer stabiele regeneratie van de slokdarm slijmvlies en spierlaag mogelijk te maken. In dit rapport beschrijven we protocollen voor slokdarmweefseltechnieken, waaronder steigerproductie, mesenchymale stamcelgebaseerde bioreactorteelt, een bypassvoedingstechniek met gemodificeerde gastrostomie en een gemodificeerde chirurgische anastomose techniek voor circumferential slokdarmreconstructie in een rattenmodel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC nr. 17-0164-S1A0) van het Seoul National University Hospital.

1. Steigerproductie

OPMERKING: Tweelaagse slokdarmsteigers worden vervaardigd door elektrospinning en 3D-printen te combineren. Het binnenste membraan van de buisvormige steiger werd vervaardigd door elektrospinenpolyurethaan (PU) met roterende roestvrijstalen mandrels als de collectoren9.

  1. Voor de bereiding van buisvormige PU nanovezels, bereiden een 20% (w / v) oplossing van PU polymeer door roeren in N,N-dimethylformamide (DMF) voor 8 uur bij kamertemperatuur.
  2. Plaats de PU-oplossing op de spuit met een stompe metalen naald (22 G) en elektrospin op roterende roestvrijstalen mandrelen (diameter = 2 mm) op een afstand van 30 cm tussen de naaldpunt en de roterende collector.
    LET OP: De voeding is ingesteld op een hoogspanningsstroom van 15 kV potentieel. De voersnelheid van de oplossing wordt vastgesteld op 0,5 mL/h met behulp van een spuitpomp.
  3. Maak een buisvormige nanovezellaag op het oppervlak van de mandrel die 3,14 m/s draait.
  4. Droog de PU nanovezel 's nachts in een vacuümoven op 40 °C om het resterende oplosmiddel volledig te verwijderen.
    OPMERKING: De 3D-geprinte buitenwand van het slokdarmsteiger wordt voorbereid met behulp van een rapid prototyping systeem. De 3D-printapparatuur bestaat uit een dispenser, een sproeier, compressie/warmtecontroller, een 3-assige conversiefase en een softwaresysteem.
  5. PCL-pellets worden opgelost bij 100 °C in een verwarmingscilinder en vervolgens afgedrukt op het oppervlak van de nanovezels bij hoge druk (7 bar) onder controle van een bioplottingsysteem. De nozzle grootte is 300 μm en de streng afstand is 700 μm.
  6. Na het verwijderen van de twee-gelaagde steiger uit de mandrel, steriliseren door te weken in 70% ethanol onder ultraviolet licht.
    OPMERKING: Meer gedetailleerde kenmerken van het schavot zijn gemeld in eerdere studies10.

2. Celzaaien op de grafts en bioreactor teelt

OPMERKING: Menselijke vet-afgeleide mesenchymale stamcellen (hMSCs) gekocht bij een bedrijf werden gebruikt zonder wijziging.

  1. Steriliseer voorafgaand aan de celtransplantatie het 3D-geprinte slokdarmsteiger gedurende 1 uur onder ultraviolet licht, nat het gedurende 10 minuten met ethanol en was het 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Cultuur en uitbreiding van de hMSC's in groeimedium (basale medium/growth supplement). Twee-gelaagde buisvormige steigers werden overgebracht naar niet-aanhangende 24 goed weefsel cultuur platen.
  3. Om de cellen aan het binnenoppervlak van het schavot te bevestigen, voegt u de hMSC-suspensie met een dichtheid van 1 x 106 cellen/mL voorzichtig toe in de matrix van het keldermembraan met het groeimedium.
  4. Gelijkmatig deponeren van de kelder membraan matrix suspensie op het binnenoppervlak van de twee-laags buisvormige steiger.
  5. Bevestig de hMSC-geplaatste buisvormige steiger stevig aan de acrylhouder in de kweekkamer van de bioreactor met behulp van een pulsatile flow bioreactor systeem.
    OPMERKING: Het op maat ontworpen bioreactorsysteem bestaat uit een pomp, bellenval, stroomkamer, drukmeter, regelbare klep en een gemiddeld reservoir. Bij het aanbrengen van afschuifstress in de kweekkamer, laat een rusttijd van 1-2 min11.
  6. Voeg groeimedium toe aan de kweekkamer en breng 0,1 dyne/cm2 door stroming veroorzaakte schuifspanning aan onder een bevochtigde atmosfeer met 5% CO210.
    OPMERKING: De waarde van door de stroming veroorzaakte afschuifstress werd berekend door het simuleren van de peristalsis van het slokdarmweefsel afkomstig van het menselijk lichaam uit eerdere studies10.
  7. Bepaal de celreacties op de binnenoppervlakken van de tweelaagse buisvormige steigers zonder bioreactorteelt na 5 dagen met behulp van een LIVE/DEAD Viability Assay Kit volgens de instructies van de fabrikant. Verkrijg beelden via confocale microscopie met behulp van de Z-stack tool.
  8. Op de derde dag, observeer oppervlakte morfologie van de hMSC-gezaaide buissteiger door middel van een scanning elektronenmicroscoop (SEM).
    1. Bevestig het schavot dat werd geïncubeerd met hMSC met 2,5% glutaraldehyde en OsO4 voor 24 uur en dehydrateer met ethanol.
    2. Coat de vaste hMSCs met platina met behulp van een sputter coater onder argon atmosferische omstandigheden en verkrijgen SEM beelden bij een versnellende spanning van 25 kV.

3. Chirurgische voorbereiding voor dierchirurgie

OPMERKING: Chirurgische preparaten worden toegepast vóór zowel gastrostomie als slokdarmtransplantatie.

  1. Het opzetten van de steriele chirurgische instrumenten: Scalpel blad, Weitlaner oprolmechanisme, micronaald houder, microsuture tangen, microtissue tangen, microschaar, Mayo-Hegar naaldhouder, werkende schaar, iris schaar, dressing forceps, weefsel tangen, splintertangen, iristangen, 5 mL spuit (21 G naald), 10 mL spuit (22 G naald), 9-0 polyamide hechting, 4-0 polyglactine hechting.
  2. Verdoven het dier met een intramusculaire injectie van tiletamine/zolazepam (dosis 50 mg/g) en 2% xylazinehydrochloride (dosis 2 mg/kg).
    OPMERKING: Volwassen Sprague-Dawley (SD) ratten met een gewicht van 398-420 g werden gebruikt voor slokdarmtransplantatie.
  3. Controleer voordat u overgaat naar het chirurgische gordijn de juiste verdoving van het dier door de staart met de tangen te knijpen.
  4. Plaats het dier in een supine positie op het steriele laken en gebruik tondeuse om het haar te verwijderen uit de nek (voor slokdarmtransplantatie) of buik (voor gastrostomie). Scrub vervolgens de chirurgische site met betadine en 70% ethanol.
  5. Vóór incisie injecteert u onderhuids een pijnstiller zoals buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg) voor pijnbestrijding.

4. Gastrostomie chirurgie met behulp van een T-buis in Ratten

OPMERKING: Bij alle proefdieren werd een gemodificeerde gastrostomie uitgevoerd om tijdelijke bypass nonorale sondevoeding (n = 5) mogelijk te maken.

  1. Laat ratten snel de dag voor de operatie. Bereid de operatie voor zoals in sectie 3.
  2. Stel de maag bloot door middel van een middellijn incisie van de huid en buikspieren van de verdoofde ratten.
  3. Maak een 3 mm opening in de voorste maagwand met een scalpelmes.
  4. Plaats de punt van de siliconen T-buis in de defectplaats om deze aan de maagwand te bevestigen.
  5. Hecht goed zodat de T-buis zich niet losmaakt van de maagwand.
  6. Haal het distale uiteinde van de geïmplanteerde T-buis door de onderhuidse tunnel in de achterkant van de nek.
  7. Plaats de heparined op het einde van de T-buis om te voorkomen dat de maaginhoud naar achteren stroomt.
    OPMERKING: Gebruik een angiokatheter om het uiteinde van de T-buis te verbinden met de heparined.
  8. Hecht alle lagen van de buikwand en huid met behulp van 4-0 polyglactine hechtingen.
  9. Houd alle experimentele ratten gescheiden in een metabole kooi nadat de gastrostomie is voltooid.

5. Slokdarmtransplantatie

OPMERKING: De slokdarmtransplantatie van het tweelaagse buisvormige schavot wordt 1 week na de gastrostomie (n = 5) uitgevoerd. Voorafgaand aan de transplantatie, inenten hMSCs (celdichtheid: 1 x 106 cellen/mL in keldermembraanmatrix) in de binnenwand van elke steiger en broedgedurende 3 dagen in het bioreactorsysteem. De chirurgische ingreep is als volgt.

  1. Verwijder het nekhaar van de modeldieren en voer standaard draperen van de chirurgische plaats uit voor aseptische chirurgie.
    OPMERKING: Maak een groot scheergebied wordt aanbevolen om asceptische chirurgie op het dier te handhaven.
  2. Na voorste mediane incisie van de nek, scheid de riemspieren en bloot de tracheoesophageal structuur.
  3. Botweg ontleden van de nervus vagus van de slokdarm voor het resecteren van het segment, anders is de ademhaling van het dier aangetast.
  4. Onder vergroting, isoleer de linkerkant van de slokdarm van de luchtpijp en zorgvuldig scheiden van het bovenste deel van de schildklier.
  5. Maak een 5 mm lang volledig omtrekdefect met alle lagen van de slokdarm met behulp van een chirurgische schaar.
    OPMERKING: Snijd voorafgaand aan slokdarmtransplantatie de voorbereide steigers met behulp van een chirurgische schaar om de lengte van de transplantatieplaats te evenaren.
  6. Onder een microscoop, uitvoeren van microanastomose aan beide uiteinden van de distale slokdarm defect met behulp van een 9-0 hechting draad. Plaats de eerste hechting tussen de rechter inferoposterior marge van de bovenste slokdarm overblijfsel en steiger. Blijf van rechts naar links tussen het bovenste slokdarmrestant en het schavot. Anastomose het schavot op dezelfde manier als de bovenste marge van de onderste slokdarm rest.
    OPMERKING: Voer microvasculaire anastomose uit zoals gebruikt in klinische chirurgie voor slokdarmtransplantatie. Werk met een microscoop voor nauwkeurige, waterdichte hechting van de implantaatplaats.
  7. Leg daarna de omliggende schildklierflap over de getransplanteerde plaats om een stabiel onderhoud van en vasculaire toevoer naar de grafts te garanderen.
  8. Na transplantatie, steek de onderhuidse spier en huidweefsel met een 4-0 vicryl hechting.
  9. Houd alle experimentele ratten individueel in metabole kooien.

6. Postoperatieve procedures

OPMERKING: Postoperatieve procedures worden uitgevoerd na zowel gastrostomie als slokdarmtransplantatie.

  1. Na sluiting van de buikwond, zet de ratten in individuele metabole kooien en plaats de kooien op infrarood opwarming apparaten om onderkoeling te voorkomen.
  2. Houd de dieren in de gaten totdat ze sternale recumbency bereiken en behouden (d.w.z. rechtop op de borst liggen).
  3. Om ontstekingop de chirurgische plaats te minimaliseren, dient u het antibioticum gentamicin (20 mg/kg) dagelijks toe aan de ratten.
  4. Begin orale vloeistofvoeding op de derde postoperatieve dag tot het eindpunt van het onderzoek. Lever de hele voedingsformule (20,6 g/100 ml [g%] koolhydraten, 3,8 g% eiwit, 0,2 g% vet) door de heparined 3x per dag vanaf de dag na de operatie.
  5. Controleer dagelijks het uiterlijk en het lichaamsgewicht van de dieren. Controleer om gedrag te beheren, zoals zelfbeschadigende incisieplaats of weerstand tegen de buisinname, evenals verschillende chirurgische complicaties. Wanneer het lichaamsgewicht van de rattenmodellen snel met 20% of meer afneemt, voert u euthanasie uit door CO 2-inademing.

7. Histologie en immunohistochemie

OPMERKING: Voor histologische analyse wordt al het slokdarmweefsel van de geëuthanaseerde dieren geëxtraheerd met behulp van een chirurgische schaar. Hematoxyline en eosine kleuring en Masson's trichrome kleuring werden uitgevoerd met behulp van standaard histologische technieken. Immunohistochemie werd uitgevoerd volgens het volgende protocol.

  1. Fix de hele slokdarm met de getransplanteerde sites in 4% paraformaldehyde. Maak een paraffineblok en snijd 4 μm dikke secties.
  2. Deparaffinize de weefselsecties en dehydrateer ze in een ethanol serie. Dompel de weefselglijbanen onder in de citrate buffer en verwarm gedurende 10 min in de magnetron. Koel de cellen met koude PBS voor 20 min. Dompel onder in 3% waterstofperoxide gedurende 6 min, en was met PBS gedurende 10 min.
  3. Incubeer in 3% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke reacties van weefselsecties te blokkeren.
  4. Was 3x met PBS gedurende 5 min. Incubeer met primaire antilichamen tegen Desmin (verdund tot 1:200), keratine 13 (verdund tot 1:100) en von Willebrand Factor (vWF; verdund tot 1:100) 's nachts bij 4 °C.
  5. Was 3x met PBS gedurende 15 min. Incubeer met het juiste secundaire antilichaam bij een concentratie van 1:500 voor Desmin en Keratine 13 bij kamertemperatuur. Was vervolgens de glijbanen twee keer met PBS gedurende 10 min.
    OPMERKING: Weefselsecties voor vWF werden geïncubeerd met behulp van een mierikswortel peroxidase-geconjugeerde kit (zie Tabel met materialen) en vervolgens gevisualiseerd met behulp van 3,3'-diaminobenzidine (DAB).
  6. Monteer met behulp van een glazen coverslip en 4',6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) met montagemedium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont een schematisch diagram van het productieproces van de PU-PCL tweelaagse buisvormige steiger. De PU-oplossing werd geëlektrospun van een naald van 18 G om een cilindrische interne structuur te maken met een dikte van 200 μm. Vervolgens werd de gesmolten PCL op regelmatige tijdstippen op de buitenwand van de PU nanovezel gedrukt. De oppervlaktemorfologie van de binnen- en buitenwanden van de voltooide buisvormige steiger is te zien in de scanning elektronenmicroscopiebeelden.

Figuur 2 toont het proces van het inbrengen van een gastrostomiebuis in een rat voor externe nutriëntenvoorziening(figuur 2A). De T-vormige siliconen buis werd ingebracht in de maagwand en gehecht(figuur 2B). De buis werd vervolgens verplaatst door de onderhuidse tunnel naar de achterkant van de nek en verbonden met een heparine cap (Figuur 2C). De buis vergemakkelijkt de injectie van vloeibaar voedsel. Het verbiedt ook de omgekeerde stroom van de maaginhoud door de buizen.

Figuur 3 toont het proces van celinenting op de binnenwand van het schavot, de bioreactorteelt en de slokdarmtransplantatie. De hMSC-embedded kelder membraan matrix werd gelijkmatig toegepast op de binnenwand van het schavot via injectie(figuur 3A). De SEM-afbeelding toont de morfologie van het cel-aangehechte binnenoppervlak. Levende / dode vlekken om de levensvatbaarheid van de cel te analyseren op de twee-laagsbuis steiger (luminair oppervlak) aangegeven dat de meeste cellen levensvatbaar waren, en ze verspreid goed op de nanovezel structuur in 5 dagen. Het schavot ingeënt met de cellen werd bevestigd aan de bioreactor, en de schuifspanning werd toegepast door de pomp (Figuur 3B). De hMSC-ingezaaide buisvormige steigers, met inbegrip van bioreactor teelt, werden getransplanteerd in ratten met volledige omtrek slokdarmdefecten via microsuture technieken. Het transplantaat was bedekt met een schildklierflap voor stabiele fixatie en vasculaire toevoer van de geïmplanteerde plaats(figuur 3C). De gewichtsverandering van de ratten na transplantatie werd waargenomen tot het einde van het experiment. Slokdarmgetransplanteerde ratten bleven op 340 g tot de 9e dag, maar vervolgens snel daalde in gewicht als gevolg van verschillende oorzaken (Figuur 3D). Als gevolg daarvan stierven de meeste dieren binnen 15 dagen.

Figuur 4 toont slokdarmregeneratie na implantaatatie van graft. Hoewel de meeste ratten neooviale obstructie ontwikkelden veroorzaakt door haarballen, was er geen bruto bewijs van perforatie, anastomoselekkage met fistel, seromaaccumulatie, abcesvorming of omringende weke delen necrose bij een experimentele rat. Re-epitheelisatie van de transplantatiesite werd bevestigd door immunofluorescentiekleuring voor keratine 13. De morfologie van de collageenlaag en de elastinevezels werd duidelijk bevestigd op de regeneratielocatie. De aanwezigheid van overvloedige elastine en collageenvezels kan bijdragen aan betere mechanische eigenschappen. Regeneratie van de slokdarmspierlaag werd tentoongesteld door desmin immunohistochemie, en overvloedige neovascularisatie werd waargenomen op deze site.

Figure 1
Figuur 1: Schematische illustratie van het proces dat wordt gebruikt om 2-gelaagde buisvormige steigers te fabriceren. Na het fabriceren van het binnenste membraan door elektrospinning met behulp van PU (A), werd de structurele sterkte van de buisvormige steiger versterkt door het toevoegen van strengen aan het buitenoppervlak van het membraan met behulp van een 3D-printsysteem zonder oplosmiddel(B). Het SEM-beeld toont de morfologie van de binnenste en buitenste lagen van het 2-laagsbuissteiger. (Afkortingen: PU = polyurethaan). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Gastrostomie. (A) Een schematisch diagram met gastrostomietechnieken door t-tube inbrengen in de maagwand. (B) Een punctiegat wordt gemaakt in het midden van de voormaag, en de T-buis tip wordt ingevoegd in de voormaag. (C) Het inlaatgedeelte van de T-buis bevindt zich met de heparinekap in het midden van de occiput. De figuur hieronder presenteert een T-tube gastrostomie apparaat met verschillende componenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Slokdarmtransplantatie. (A) De hMSCs ingekapseld in kelder membraan matrix werden gezaaid op de binnenste lagen van de twee-laags buisvormige steiger. De SEM-afbeelding toont de morfologie van de hMSCs op de binnenwand. Levensvatbaarheid van de ingeënte cellen werd ook bevestigd door levend-dode vlekken (groen = levende cellen). De hMSC-ingezaaide steigers werden onmiddellijk geïncubeerd in een bioreactor systeem (B), en vervolgens de weefsel-engineered slokdarm werden geïmplanteerd in de cervicale slokdarm (C). De geïmplanteerde site was bedekt met een schildklier flap voor stabiele slokdarmreconstructie (pijlen). (D) Gewichtsverlies studies na slokdarmtransplantatie. Gewichtsverlies werd bepaald als absolute verandering van het oorspronkelijke gewicht van de ratten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Hele histologie van de gereconstrueerde slokdarm 2 weken na orthotopische steigerimplantatie. Masson's trichrome kleuring toont de collageen afzetting rond de geïmplanteerde sites. Regeneratie van de slokdarmspier en slijmlagen werd bevestigd door respectievelijk desmin (groen) en keratine 13 (rode) immunovlekken. Bovendien werd neovascularisatie (pijlen) duidelijk waargenomen rond de geregenereerde slijmlaag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bestaande dierstudies over kunstmatige slokdarm worden nog steeds beperkt door verschillende kritische factoren. De ideale kunstmatige slokdarm steiger moet biocompatibel zijn en hebben uitstekende fysieke eigenschappen. Het moet in staat zijn om het mucosale epitheel in de vroege postoperatieve periode te regenereren om anastomotische lekkage te voorkomen. Regeneratie van de binnenste cirkelvormige en buitenste longitudinale spierlagen is ook belangrijk voor functionele peristalse12,13.

De mechanische kenmerken van de slokdarm zijn essentieel omdat de slokdarm instort tijdens de ademhaling en opent tijdens het slikken, met constante blootstelling aan maximale stretching met een terugslag fenomeen14. Het geïmplanteerde schavot moet deze mechanische kenmerken ook hebben. De viscoelasticiteit van de geïmplanteerde slokdarm moet voldoende zijn voor repetitieve hellingsontspanning van de peristaltische beweging door de slokdarm. Steigers die te zwak zijn, kunnen scheuren of lekken en ernstige aandoeningen veroorzaken (bijvoorbeeld mediastinitis) bij de ontvanger. In tegenstelling, een steiger die te stijf is zou kunnen uitpuilen in de slokdarm lumen en voedsel passage te voorkomen. Elektrogesponnen nanovezels hebben zeer gunstige fysieke eigenschappen voor slokdarmreconstructie. De topografische aard van de ECM biedt een omgeving die gunstig is voor de migratie en differentiatie van epitheelcellen in slokdarmlagen15. Het heeft ook een nanoporie structuur die lekkage van speeksel en verschillende ziekteverwekkersvoorkomt 16. Echter, steigers gemaakt van elektrospun nanovezels hebben beperkt gebruik als gevolg van hun zachte mechanische eigenschappen. Om dit probleem op te lossen, verbeterden we hun mechanische sterkte met behulp van 3D-printtechnologie. De 3D-geprinte streng op de buitenste laag van de nanovezel heeft een breedte van 780 μm en de binnenste poriestructuur is vrij breed. Het biedt fysieke ondersteuning voor slokdarminterventies in plaats van het begeleiden van de regeneratie van het omliggende weefsel.

In deze studie werden indirecte slokdarmafwijkingen volledig genezen in de bioreactorgekweekte grafts gedurende maximaal 2 weken, maar alle experimentele ratten stierven binnen 15 dagen na de operatie. De meeste sterfgevallen werden veroorzaakt door peritonitis en ondervoeding veroorzaakt door voedsel en speeksel lekken proximale naar de anastomosis site. Alle dieren verbruikten vrij een vloeibaar dieet voor maximaal een week, maar naarmate de wondgenezing vorderde, trad onbedoelde mechanische obstructie op in de gereconstrueerde slokdarm als gevolg van haarbalslikken. Dit fenomeen is aangetoond dat het volledige spijsverteringsstoornis veroorzaken binnen de geïmplanteerde niet-dynamische steigers. Er zijn verschillende opties om deze technische problemen op te lossen. Ten eerste, de ontwikkeling van een zeer elastisch slokdarmimplantaat dat slokdarmperistalse kan nabootsen. Ten tweede, dierlijke studies met behulp van haarloze ratten om haar slikken te voorkomen. Ten derde kan de galstent gelijktijdig met het schavot worden aangebracht om instorting van het implantaat en anastomoseschade te minimaliseren. Bovendien is de toepassing van microvasculaire anastomose op slokdarmsteigerimplantatie belangrijk om de lekkage van speeksel volledig te voorkomen. De conventionele hechtingtechniek met behulp van de naakte ogen is uiterst moeilijk waterdicht te maken in rattenmodellen.

Een betrouwbaar vaatvoertuig is essentieel voor voedingsstoffen, groeifactoren en zuurstoftoevoer in de vroege stadia van regeneratie. De schildklier is vasculair weefsel gelegen in de buurt van de slokdarm. We gebruikten de schildklier flap na circumferential slokdarmectomie vanwege de gemakkelijke toegankelijkheid in de rat model. Tot slot stellen we verschillende preklinische technieken voor om de moeilijkheden van slokdarmreconstructie in het rattenmodel te overwinnen. Deze studie biedt een goed alternatief om de beperkingen van conventionele kleine dierslokdarmtransplantatie te overwinnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Het bioreactorsysteem dat voor deze studie is ontworpen, is gecommercialiseerd (modelnummer: ACBF-100).

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI16C0362) en Basic Science Research Programma via de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van Onderwijs (2017R1C1B2011132). De biospecimens en gegevens die in deze studie werden gebruikt, werden verstrekt door de Biobank van seoul National University Hospital, een lid van Korea Biobank Network.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic cage TEUNGDO BIO & PLANT JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose) Virbac 1000000188
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
1 mL Syringe BD 309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun) Byely Q-0615-035
4% paraformaldehyde BIOSOLUTION BP031
4-0 Vicryl ETHICON W9443
9-0 Vicryl ETHICON W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal). Septopal 0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X Sigma C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT VECTOR SK4100
Desmin Santa Cruz sc-23879
Elastic stain kit ScyTeK ETS-1
Ethanol Merck 100983
Ethanol Merck 64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS) Gibco 16000-044
Glutaraldehyde Sigma 354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A-11001
Heparin cap Hyupsung Medical HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium
(MesenPRO RSTM)
Invitrogen R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) VECTOR PK7800
Hydrogen peroxide JUNSEI 7722-84-1
Keratin13 Novus NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit Molecular Probes L3224
Matrigel Corning 354262
N,N-dimethylformamide (DMF) Sigma 227056
Nonadherent
24-well tissue culture plates.
Corning 3738
OsO4 Sigma O5500
Petri dish Eppendorf 3072115
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X BIOSOLUTION BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer Sigma 440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer Lubrizol 2363-80AE
Power Supply NanoNC HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931
Rumpun Bayer Q-0615-035
Silicone T-tube Sewoon Medical 2206-005
Terramycin Eye Ointment Pfizer Pharmaceutical Korea W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) Virbac Laboratories Q-0042-058
Trichrome stain kit ScyTeK TRM-1
von Willebrand Factor (vWF) Santa Cruz sc 14014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30, (12), 1-11 (2017).
  2. Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36, (1), 107-121 (2016).
  3. Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96, (21), e6942 (2017).
  4. Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
  5. Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503, (1), 271-277 (2018).
  6. La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8, (1), 4123 (2018).
  7. Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5, (2), E58-E60 (2013).
  8. Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26, (12), 1831-1839 (2017).
  9. Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, (5), 2996-2999 (2015).
  10. Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. (2019).
  11. Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
  12. Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468, (18), 30685-30687 (2018).
  13. Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136, (4), 850-859 (2008).
  14. Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140, (1), 82-90 (2011).
  15. Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7, (1), 10291 (2017).
  16. Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9, (9), 1540-1555 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics