氯乙烯和高脂肪饮食作为环境与肥胖相互作用的典范

Medicine
 

Summary

该协议的目标是开发一种低水平毒性暴露的鼠模型,不会造成公开肝损伤,反而会加剧先前存在的肝损伤。这种模式更好地概括了人类接触和接触被认为是安全的毒物浓度时发生的微妙变化。

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Lang, A. L., Goldsmith, W. T., Schnegelberger, R. D., Arteel, G. E., Beier, J. I. Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction. J. Vis. Exp. (155), e60351, doi:10.3791/60351 (2020).

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Abstract

氯乙烯(VC)是一种丰富的环境污染物,在高浓度下导致性肝炎,但在较低水平被认为是安全的。虽然一些研究已经研究了VC作为直接肝毒剂的作用,VC修改肝脏对其他因素的敏感性的概念,如高脂肪饮食(HFD)引起的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。该协议描述了一种接触模式,以评估长期、低水平接触VC的影响。小鼠在吸入接触开始前一周适应低脂或高脂肪饮食,并在整个实验中保持这些饮食。小鼠暴露于VC(亚OSHA水平:<1 ppm)或吸入室中6小时/天、5天/周、长达12周的室内空气。每周对动物进行体重增加和食物消耗的监测。这种VC暴露模型不会单独引起VC吸入的肝脏损伤。然而,VC和HFD的组合显著增强肝脏疾病。这种共暴露模式的技术优势是全身曝光,不受约束。此外,这些情况更类似于人类非常常见的情况,即与潜在的非酒精性脂肪性肝病联合接触VC,因此支持新的假设,即VC是肝脏损伤作为肥胖并发症(即NAFLD)发展的环境风险因素。这项工作挑战了VC(职业和环境)目前暴露极限安全的范例。该模型的使用可以揭示VC暴露的风险。因此,该模型的运用,可以揭示出新的风险。这种毒性引起的肝损伤模型可用于其他挥发性有机化合物,并研究可能影响肝脏和其他器官系统的其他相互作用。

Introduction

大量有毒物质存在于我们呼吸的空气中,其含量非常低。氯乙烯(VC)是工业用来制造聚氯乙烯(PVC)塑料制品的单色气体1。它是一种常见的环境肝毒剂,已知致癌物,在毒物和疾病登记署有害物质优先清单2#4。为了更好地了解对人类健康的毒性影响和与现有共病的相互作用,建立模仿人类接触的暴露模型至关重要。这个群体的主要兴趣是研究低浓度慢性VC暴露的肝效应。VC对肝脏的主要影响,它已被证明(在高浓度)导致脂肪中毒,和毒性相关的脂肪性肝炎(TASH)与坏死,纤维化,肝硬化3,4,以及肝细胞癌(HCC)和否则极其罕见的肝血栓肉瘤5。TASH在人群中已经存在了几十年,但调查人员仍然没有描述和低估由于研究证明VC暴露的直接毒性问题,职业安全与健康管理局(OSHA)在7小时工作日将可接受的暴露阈值降至1ppm。虽然接触阈值已经降低,但VC的这种集中对人类健康的影响尚不明确此外,VC暴露对现有合并症的影响,如肝病,在很大程度上是未知的8。由于非酒精性脂肪性肝病(NALFD)4、6、7、9、10、11、12等全球患病率上升,这种知识差距在今天尤为重要。重要的是,VC最近已被证明是肝脏疾病的一个独立危险因素,从其他原因13。因此,本议定书的目的是开发一种相关的吸入模型,用于在深层肝损伤的情况下接触挥发性环境毒性物VC,以模拟人类接触,并确定VC诱导或VC增强肝损伤的潜在、新机制。

许多环境有毒物质和污染物的主要接触途径是通过吸入。一旦被吸入,该化合物可以进入全身循环通过肺部,传播到肝脏,并成为代谢激活的肝酶之前排泄14,15,16。往往是这些活性代谢物在体内引起毒性和损伤。该小组和其他人以前的研究已经使用VC代谢物作为代理物,暴露于VC气体17,18。其他群体使用VC的吸入模型;然而,超高暴露水平(>50 ppm)被实施诱导急性毒性,严重的肝损伤,和肿瘤的发展19。虽然这些研究提供了VC引起的致癌性的关键信息和机制,但它们并不概括其与其他促成因素的微妙影响和复杂相互作用,因此与人类接触的相关性较低。

此处描述的VC吸入加高脂肪饮食(HFD)模型(见图1,用于时间线),是慢性低剂量VC暴露(即亚OSHA浓度)的第一个模型,在模拟人类暴露的条件下,小鼠接触有毒物质。事实上,来自该模型的数据重述了在暴露于VC的人类身上观察到的结果,如对代谢途径20的影响,氧化应激和线粒体功能障碍4。其他吸入的小鼠模型,如仅头部和仅鼻子的模型21,要求限制动物,给动物造成压力。在这里,这种全身暴露方法不需要给动物注射或不需要的压力。这些动物可以获得食物和水,并放置在较大的吸入室中,每天和每周几天的确定时间。此外,VC改变对另一种肝毒性的敏感性的概念是一个新的发现,首先由该组12证明,并且对风投暴露的影响,其浓度远低于直接肝毒性所需的浓度。

这种吸入接触方法可用于模拟接触环境中存在的各种气体毒性物质,包括其他挥发性有机化合物。事实上,挥发性有机化合物是一大群环境有毒物质,在工业化地区更为普遍,导致某些人群长期接触的风险较高该协议可以修改,以适应不同的实验问题。施用化合物的时间长度和浓度可以改变。虽然最初开发用于确定肝损伤,其他器官系统可以并且已经研究与这个模型23。旨在研究长期接触动物,但希望尽量减少动物压力的研究者应考虑使用这个模型。

Protocol

所有动物/VC实验均获得环境卫生部、实验室动物护理评估和认证安全协会的批准,程序由当地机构动物护理和使用委员会批准。

1. 实验性设置和适应纯化、实验饮食

  1. 确定C56Bl/6J小鼠的总数(每组最少6~8只小鼠)。
    注:每个饮食组的动物将进一步细分为接触组。在规划研究时,一定要考虑所需的动物总数。
  2. 识别和称量动物。记录这些数据。
  3. 在开始吸入实验前一周,将饮食从常规饮食切换到纯低脂肪(LFD)或高脂肪饮食(HFD),使小鼠适应新的饮食(有关时间表如图1所示)。
  4. 提供食物和水。通过称重和记录每个笼子提供的食物,并在每个喂食日称重和记录食物的剩余部分,来监测食物的消耗情况。如果每个笼子容纳4只老鼠,每周提供两次50克的食物。如果每个笼子容纳5只老鼠,每周提供两次60克的食物。
    注:在纯化饮食的喂养过程中,应每天检查食物量,以确保小鼠有足够的颗粒。如果颗粒不足,小鼠往往会"囤积"食物并增加摄入量。此外,特别是HFD往往比LFD崩溃更多,造成类似的效果。
  5. 在整个实验中监测动物,确保动物健康得到维护。
    注:每周体重增加和食物消耗,以及代谢监测可以提供整体动物健康的指数。

2. 氯乙烯吸入暴露系统

注: 市售有多种吸入暴露系统,从"仅鼻子"到"全身"暴露,再到手动暴露,再到自动系统。该小组先前公布的数据来自全身手动系统12、23、24。描述自动吸入暴露系统的图表如图2所示。

  1. 在进入各自的流量测量装置(质量流量控制器 +MFC)之前,确保实验室和控制室中的稀释空气为高效颗粒空气 (HEPA) 和活性炭过滤、干燥和压力调节[实验室,旋转计+控制室)。
    注:在控制室中,旋转计调节小鼠的气流。空气进入腔室的顶部,经过老鼠,然后在小鼠下排出,然后通过HEPA过滤器,然后进入化学罩。温度和相对湿度 (RH) 在造型室内测量。在实验室中,稀释空气与来自VC罐的空气混合。这两种流程都由 MMC 进行监管。两种混合物的比例决定了实验室中VC的浓度。VC 通过分散器进入曝光室的顶部,该分散器带有七个射流,指向不同的方向。VC 通过鼠标,然后通过位于网架下方的 12 个独立端口排出。这个腔室设计已被证明提供同质毒性浓度之前25。
  2. 确保从实验室和控制室内监控压力、温度和 RH。
  3. 在进入化学罩的排气区域之前,确认腔室排气通过 HEPA 过滤器、CO2探头和活性炭过滤器,并监控 CO2水平以确保小鼠获得可接受的通风。
  4. 使用自定义软件在吸入暴露期间更改、监控和记录环境变量。
    注:如果使用手动系统,应在整个暴露期间定期监控和校准步骤 2.1_2.4 中所述的变量。

3. 曝光前设置

  1. 关闭实验和控制室中的所有气流,提高技术人员的安全。
  2. 对于每个腔室,打开腔室门,将吸水性床上用品(吸收侧向上)放在排泄锅顶部。湿湿吸水材料,在整个暴露期间提供舒适的湿度水平(40–60% RH)。
  3. 在造型室中设置所需的 VC 曝光水平。对于亚OSHA限值,使用0.85 ppm的VC。使用软件管理的、基于检测器的反馈控制将 VC 传递到造型室,或者对系统进行手动调整。
    注:后一种方法要求了解库存供应中的 VC 气体的腔室体积、腔室刷新率、气流和输送速率;这些计算随后必须通过在稳定状态12、24的腔室中的VC浓度测量进行验证和校准。测量腔室VC的最常见技术是通过对样品空气12、24的气度度分析。在VC交付的准确性和精度方面,软件驱动方法的优点显而易见。然而,已经表明,手动方法也是准确和一致的12,24。
    注意:VC是一种已知的有毒物质和致癌物质,在高水平。在打开和关闭腔室时,使用适当的个人防护设备并处理气体。

4. 暴露笼和动物制备

  1. 将小鼠从其壳体中取出,并将其放入吸入室笼架的单独笼子(控制小鼠的一个笼架,一个用于暴露小鼠的网架)。每天随机化每只鼠标在笼架内的位置,以确保每只鼠标在暴露室中均匀地暴露。在实验室笔记本中标记每个动物的数量和笼子放置位置。
  2. 将每个保持架放入其各自的造型室,并关闭造型室门。

5. 进行曝光

  1. 确保 VC 油箱的阀处于打开位置。确保实验室的稀释剂流量设置为 25 L/min。
  2. 在实验室中启动稀释剂流动。确保控制室上的旋转计设置为 25 L/min。
  3. 确保所有传感器(流量、温度、湿度、腔室压力、CO2级别)工作正常,并在实验室和控制室中显示预期结果。
    注:VC流是根据稀释度流和所需的VC浓度计算和设置的。
  4. 确保在整个暴露过程中,在实验室中显示暴露时间、稀释液流、VC流、温度、湿度、腔室压力、CO2水平和理论 VC 浓度,并进行图形和记录。确认控制室的温度和湿度也显示、图形和记录。
    注:如果使用手动系统,则应在必要时在整个曝光期间检查和调整 VC 流。
  5. 如果在曝光过程中出现任何问题,将 VC 流设置为零,并将稀释剂流量增加到其最大值,以快速清除造型室。
  6. 一旦达到曝光持续时间(即 6 小时/天),软件将自动关闭 VC 流。然后,15 分钟安全计时器在实验室清除 VC 的持续时间后开始。一旦可以安全地删除动物,请单击对话框中的"确定"按钮。系统将停止记录到文件的测量值,并且曝光结束。
    注:如果使用手动系统,用户必须在曝光持续时间结束时手动关闭 VC 流,并且必须计算曝光结束时的 VC 间隙时间。

6. 暴露后

  1. 将 VC 气罐阀上的止动孔转向关闭位置,并关闭暴露室中的所有气流。转动旋转计,直到没有气流流过控制室。
  2. 从每个腔室中取下门,为小鼠提供通风。从腔室中取出保持架。在引擎盖下,将老鼠从暴露的笼子里取出,然后放回它们的笼子里。所有老鼠送回他们的住房室过夜住房在常规的笼子里。
  3. 将排泄物锅中的任何废物放入环境健康与安全部 (DEHS) 批准的生物危害容器中,因为这些废物可能被视为机构环境卫生服务机构的化学危害。清洁实验和控制系统的造型室门、排泄物盘、曝光笼架和暴露室。

7. 在暴露期间对腔室内VC浓度的验证

  1. 在每次曝光(3小时)中途对实验室内的VC浓度进行测量。
  2. 打破 VC 探测器管和预处理管上的玻璃尖端。将 VC 检测管的流出端连接到检测器管泵。使用短管将 VC 检测管的流入端连接到预处理管的流出端。将一小片管子连接到预处理管的流入端。
  3. 从靠近小鼠呼吸区的采样端口之一上拔下插头。将油管从预处理管的流入端连接到取样口。
  4. 从完全位置,将检测器管泵活塞上的手柄伸出至完全伸出位置。这将在 90 s 的时间段内将 100 mL 的采样气体从腔室拉入 VC 检测管。等待 90 后,将手柄推回。
  5. 重复步骤7.4三次,使VC检测管共拉入400 mL。
  6. 从造型室的取样口拆下管,然后将插头重新插入端口。检查 VC 检测管的颜色变化,以确定腔室内的 VC 浓度。
  7. 在实验室笔记本中记录VC检测管读数,并比较理论值。将 VC 检测管和预处理管处理在合适的容器中。

8. 终止吸入暴露实验

注:在所需的暴露时间点后,例如,6、8 和/或吸入接触开始后 12 周,实验终止,动物将被安乐死(有关时间表如图1 所示)。

  1. 在安乐死前4小时快速将小鼠快速体内。
    注:此程序允许确定腹血糖和胰岛素水平,用于代谢分析。
  2. 使用符合美国兽医医学协会 (AVMA) 指南的安乐死方法,例如麻醉后进行外泄。
  3. 通过向每只小鼠注射腹内注射,以诱导麻醉,施用氯胺酮/西他津(100/15 mg/kg)。
    注意:避免五巴比妥钠作为安乐死前的麻醉剂,因为氯乙烯暴露可能会妨碍其有效性。
  4. 从劣质的vena卡瓦中收集血液到柠酸钠溶液中(最终,0.38%),以防止血液凝固和保存样品。
  5. 切除肝脏和/或任何其他所需的器官。在液氮中分离肝脏和扣冻部分,嵌入冷冻标本培养基中,并固定在10%缓冲形式中,用于成科学。
  6. 通过离心将血浆从血液中分离出来,并将Citita转移到合适的管中,并储存在-80°C,直到需要进行分析。
  7. 为了评价肝损伤的组织学指标,使用5μM形式-石蜡嵌入肝部分进行血氧林和eosin(H&E)染色,用明场显微镜获取图像。
  8. 为了获得血浆转氨酶水平,使用市售试剂盒在锡化血浆上同时执行丙氨酸氨基转移酶(ALT)和阿斯巴氨转移酶(AST)动力学测定。
    注:对于质量控制,C57Bl/6J小鼠的血浆转氨热剂应处于LFD+VC组的正常范围(35~45 IU/L),而HFD+VC组(3C)的值应升高(+150 IU/L)。

Representative Results

在实验过程中,每周对动物体重和食物消耗进行监测,以确保动物健康并评估体内代谢。图3A描述了12周实验的体重和食物消耗。体重每周测量一次,所有组每周测量两次食物消耗。在整个研究过程中,所有的老鼠都增加了体重。虽然正如预期的那样,HFD组的小鼠体重增加,因为LFD组小鼠体重增加,但接触VC的小鼠体重没有超过对照组小鼠的体重。食物消费在12、24组之间没有差别。

图3B描绘了用H&E染色的肝部分的代表性显微照片,用于分析一般形态。在LFD组中,VC没有引起任何常见的病理变化。HFD喂养显著增加性脂肪增(脂肪积累)和VC暴露增加这种效果。此外,VC在HFD组暴露导致一些炎症的foci12,24。

血浆转氨酶(ALT和AST)水平被测量为肝损伤指标,转氨酶水平升高是肝损伤的指标。在LFD组中,VC没有增加转氨酶水平。仅HFD就略微提高了转氨酶水平,重要的是VC显著增强了这种效应(3C)12,24。

计算每组肝脏重量与体重的比率。HFD显著增加肝脏与体重的比率。然而,VC并没有显著增加这种效应(3D)12。

Figure 1
图1:吸入模型程序概述。老鼠在1周内喂食各自的低脂肪(13%饱和脂肪)或高脂肪(42%饱和脂肪)饮食,以使它们适应纯化饮食。一周后,小鼠被引入吸入方案。为此,小鼠被放置在最先进的全身吸入室中,以暴露于<1 ppm(0.85 ppm = 0.1 ppm)的亚OSHA水平VC浓度或室内空气(控制)6小时/天、5天/周、12周。在吸入过程中,允许小鼠自由获得食物和水。在12周时,老鼠在早上被安乐死。此模型可以扩展到较长的慢性暴露期。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:吸入室设计。图中显示了提供同质毒性浓度的自动吸入暴露系统。自定义软件允许用户在吸入暴露期间更改、监控和记录环境变量。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:仅氯乙烯不会引起肝损伤,但会增强饮食引起的肝病。A) 每周监测体重和食物消耗.(B) 显示H&E染色的一般肝脏形态的代表性显微图(放大倍数 = 200倍)。(C) 在暴露期结束时收集酸化血浆,并分析转氨酶酶活性作为肝损伤指数。(D) 肝脏重量在不同的实验时间点确定,并相对于全身重量进行比较.结果以平均值 = SEM.a,p < 0.05 表示,与相应的 LFD 控制相比;b, p < 0.05 与没有 VC 相比.每个组 n = 8×10 的样本大小。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

该模型VC增强NAFLD是评估亚OSHA极限VC暴露在全身吸入范式中效果的新方法。该模型允许研究人员仅通过低水平的VC来研究亚肝毒性和敏化效应。事实上,这种共暴露模型达到增强的肝损伤,血浆ALT和AST的升高和中度炎症,而基本上不影响其他器官系统,如心脏,在此浓度23。这种慢性模型需要全身吸入室,但尽量减少压力和暴露浓度。虽然这里介绍的协议是一种软件驱动的方法,但我们的经验表明,手动方法也是一种准确和一致的暴露方法12,24。此外,它很容易适用于多个研究领域,包括其他器官损伤23引起的挥发性有机化合物暴露22。值得注意的是,这种模式可能更类似于人类共同接触环境化学品和潜在疾病5的发病机制。

为了获得类似的结果,必须实现协议优化的某些关键步骤。例如,调查人员必须确定腔内VC或其他毒物的浓度在所需的接触范围内(即低水平、亚OSHA或急性水平)。优化吸入室的这一步骤对于人类接触兴趣的成功模型至关重要。其次,还可以修改每天的暴露时间和实验持续时间。根据这一群体的兴趣,实现了职业接触设置,并研究了饮食的另一个参数。然而,环境和急性暴露也可以模拟与该协议。

这项工作挑战了VC(职业和环境)目前暴露极限是安全的模式。事实上,虽然目前VC的OSHA暴露限值为1ppm,但该模型已经证明,低于此限值的VC浓度足以增强小鼠HFD引起的肝损伤。该协议允许调查人员研究和描述一种新的毒物暴露模型,并模拟TASH。

这是慢性低剂量VC暴露的第一个模型。以前的工作使用非常高的bolus浓度,急性暴露或活性代谢物作为VC暴露的代理物。所有这些方法都降低了研究结果与人类接触的相关性。因此,这种新型的TASH-NAFLD交互模型为研究者研究低层VC暴露的复杂相互作用提供了必要的平台。

这种毒性引起的肝损伤模型可用于其他挥发性有机化合物,也可用于研究可能影响肝脏和其他器官系统的其他相互作用8,22,23。此外,这种模式已经,而且可以进一步用于研究干预疗法和深入的机械研究作用模式的这种流行的毒剂24。由于VC是已知的致癌物质26,27,28,这种暴露范式也可以修改为VC诱发癌症的研究。其他共同疾病,如酒精性肝病,也可能通过VC共同暴露而增强。此外,研究不同类型的脂肪,如多不饱和脂肪18,29,30,或不同类型的碳水化合物31和它们与VC在此模型中共同暴露,也有兴趣。事实上,所有这些因素都知道对肝损伤的发展有差异的影响,并可能在VC引起的肝病中发挥作用。

总之,这是环境毒物引起的肝损伤的一种新型吸入模型,为慢性低水平VC暴露建立了暴露范式。该模型中使用的VC浓度本身是亚肝毒性的,同时它增强了另一个因子(HFD)在小鼠中引起的肝损伤。该模型将允许调查人员研究慢性VC毒性的机制和干预措施,并可能有助于研究暴露的人类受试者和接触风险最高的转化研究。

Disclosures

WT Goldsmith 对 IEStechno 拥有财务利益,这是所述系统的模板。其余作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究由美国国家卫生研究院(K01 DK096042和R03 DK107912)授予朱利安·比尔的资助。研究还得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所颁发的机构发展奖(IDeA)的支持,该奖的拨款号为P20GM113226,国家酒精滥用和酒精中毒研究所国家卫生研究院奖号为P50AA024337。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALT/AST reagents Thermo Fisher TR70121, TR71121
C57Bl/6J mice The Jackson Laboratory 000664 Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the
appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age.
CO2 Monitor IEStechno Ex-Sens
Eosin Sigma E6003
Hematoxylin Sigma HHS16
Inhalation exposure chamber system IEStechno GasExpo The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs
Saturated fat (13%) control diet Teklad Diets TD.120336
Saturated fat (42%) diet Teklad Diets TD.07511
Sodium citrate Sigma 71497
Vinyl Chloride MATHESON TRI-GAS Series 3590-CGA* Handle gas with caution

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