संयुक्त दवा जलसेक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए माइक्रोइंजेक्टेड सिस्टम

Neuroscience
 

Summary

हम वैकल्पिक दवा जलसेक के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और प्रायोगिक जांच (यानी नैनोसेंसर, माइक्रोइलेक्ट्रोड) की सहायक डिलीवरी के लिए डिज़ाइन किया गया एक माइक्रोइंजेक्टेड सिस्टम पेश करते हैं। व्यापक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लूइडिक घटकों को जांच युक्त एक कैनुला के साथ मिलकर किया जाता है। मकाक कॉर्टेक्स में मस्सिमोल जलसेक के दौरान परिणामों के साथ माइक्रोइंजेक्टेड निर्माण के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल शामिल है।

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Vanegas, M. I., Hubbard, K. R., Esfandyarpour, R., Noudoost, B. Microinjectrode System for Combined Drug Infusion and Electrophysiology. J. Vis. Exp. (153), e60365, doi:10.3791/60365 (2019).

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Abstract

यह माइक्रोइंजेक्टरोड सिस्टम दवा जलसेक, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और डिलीवरी और प्रायोगिक जांच के वितरण और पुनर्प्राप्ति के लिए डिज़ाइन किया गया है, जैसे माइक्रोइलेक्ट्रोड और नैनोसेंसर, जागमें बार-बार उपयोग के लिए अनुकूलित, जानवरों का व्यवहार। माइक्रोइंजेक्टेड सिस्टम को कई उद्देश्यों के लिए कॉन्फ़िगर किया जा सकता है: (1) एक प्रयोगात्मक जांच के प्लेसमेंट के लिए कैनुला की सरल व्यवस्था जो अन्यथा ड्यूरा मेटर को भेदने के लिए बहुत नाजुक होगी, (2) दवा का माइक्रोफ्लूइडिक अर्क, या तो स्वतंत्र रूप से या एक प्रयोगात्मक जांच (यानी, माइक्रोइलेक्ट्रोड, नैनोसेंसर) युक्त एक कैनुला के साथ मिलकर। इस प्रोटोकॉल में हम माइक्रोइंजेक्टेड के कदम से कदम निर्माण, माइक्रोफ्लूइडिक घटकों के लिए इसके युग्मन, और वीवो में प्रणाली के उपयोग के लिए प्रोटोकॉल की व्याख्या करते हैं। इस प्रणाली के माइक्रोफ्लूइडिक घटक नैनोलीटर पैमाने पर वॉल्यूम की डिलीवरी की अनुमति देते हैं, जिसमें न्यूनतम प्रवेश क्षति होती है। दवा जलसेक स्वतंत्र रूप से या एक साथ प्रयोगात्मक जांच के साथ किया जा सकता है जैसे कि एक जाग में माइक्रोइलेक्ट्रोड या नैनोसेंसर, जानवर का व्यवहार। इस प्रणाली के अनुप्रयोगों की जांच या नैनोसेंसर माप के आधार पर व्यवहार प्रदर्शन के संदर्भ में प्रांतस्था के एक विशिष्ट क्षेत्र के कार्य को समझने के लिए, कॉर्टिकल विद्युत गतिविधि और व्यवहार पर एक दवा के प्रभाव को मापने से लेकर । इस प्रणाली की कुछ क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, हम एक कामकाजी स्मृति कार्य के दौरान रीसस मकाक में ललाट नेत्र क्षेत्र (एफईएफ) के रिवर्सिबल असक्रियणाचार के लिए मस्सिमोल इन्फ्यूजन का एक उदाहरण पेश करते हैं।

Introduction

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और दवा इंजेक्शन विधियों का व्यापक रूप से न्यूरोसाइंस में न्यूरोसाइंस में उपयोग किया जाता है, विवो में, कृंतक और वानरों में न्यूरोलॉजी का अध्ययन करने के लिए। पिछले तीन दशकों में, शुरुआती इंजेक्टरोड मॉडलों में सुधार ने अधिक सटीक और कम आक्रामक तकनीक की अनुमति दी, और विशिष्ट मस्तिष्क साइटों1,2,3पर एक साथ रिकॉर्डिंग और दवा इंजेक्शन। विशेष रूप से वानरों के लिए, न्यूनतम ऊतक क्षति के साथ छोटे वॉल्यूम को ठीक से वितरित करने की क्षमता महत्वपूर्ण है यदि तकनीक का उपयोग उन्नत संज्ञानात्मक कार्यों के अध्ययन के लिए किया जाना है जिसके लिए अत्यधिक प्रशिक्षित जानवरों की आवश्यकता होती है। हाल की प्रगति में प्रत्यारोपित जांच4का उपयोग करउत्तेजना के संयोजन में पुरानी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और रासायनिक माप शामिल हैं, और संयुक्त रिकॉर्डिंग और माइक्रोफ्लूइडिक दवा वितरण हाल ही में कृंतक5में संचालित किया गया है । यहां वर्णित इंजेक्टरोड सिस्टम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग, उत्तेजना और सटीक दवा वितरण की अनुमति देता है, और इसे पहले से ही कई रहनुमा प्रयोगशालाओं6,7,8में सफलतापूर्वक लागू किया जा चुका है।

न्यूरोसाइंस अनुप्रयोगों के साथ नैनोसेंसर9,10 जैसे नाजुक, विशेष सेंसरों की बढ़ती उपलब्धता, नाजुक नैनोस्केल उपकरणों या माइक्रोइलेक्ट्रोड युक्तियों को नुकसान पहुंचाए बिना ड्यूरा मेटर के माध्यम से जांच प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय विधि की मांग करती है।

हमने एक माइक्रोइंजेक्टेड सिस्टम तैयार किया है जो आसानी से उपलब्ध, कम लागत वाले घटकों का उपयोग करके इन तरीकों के संयोजन की तकनीकी चुनौतियों पर काबू पा लेते हैं, और दो मुख्य कार्यों की सुविधा प्रदान करते हैं: (i) नाजुक प्रयोगात्मक जांच रखने की क्षमता, जैसे कि एक ड्यूरा मेटर और तंत्रिका ऊतक के माध्यम से माइक्रोइलेक्ट्रोड या नैनोसेंसर, किसी भी क्षति से सुरक्षित है। यह कार्यक्षमता लक्षित स्थानों पर प्रायोगिक जांच के प्लेसमेंट की अनुमति देती है, जो तंत्रिका ऊतक के माध्यम से एक गाइड के रूप में कैनुला का उपयोग करके दिया जाता है। (ii) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग और नशीली दवाओं के इंजेक्शन के साथ विद्युत उत्तेजना के संयोजन प्रयोगकरने के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करने की क्षमता।

हमारी प्रणाली ड्यूरा में प्रवेश करने के लिए एक गाइड ट्यूब का उपयोग करती है, साथ ही एक कैनुला जो दवा वितरण के लिए दोनों कार्य करता है (माइक्रोइन्फ्यूजन के लिए सिस्टम का उपयोग करते समय) और माइक्रोइलेक्ट्रोड या नैनोसेंसर के लिए अतिरिक्त सुरक्षा प्रदान करता है (दोनों ड्यूरा से गुजरते समय और तंत्रिका ऊतक)। इस प्रणाली को आसानी से व्यापक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों के साथ बनाया जा सकता है, जो सस्ती और खोजने में आसान हैं। हम एक छोटे व्यास कैनुला (बाहरी व्यास ओडी = 235 माइक्रोन, आंतरिक व्यास आईडी = 108 माइक्रोन) का उपयोग करके प्रवेश क्षति को कम करते हैं।

यहां हम माइक्रोइंजेक्टेड निर्माण और माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली के विन्यास के लिए कदम-दर-कदम निर्देश प्रस्तुत करते हैं। हम माइक्रोइंजेक्टेड के उपयोग के लिए आवश्यक कदमों की व्याख्या करते हैं, या तो स्वतंत्र रूप से या दवा इंजेक्शन के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली के साथ मिलकर। इसी तरह का दृष्टिकोण किसी भी नाजुक प्रयोगात्मक जांच के साथ लागू किया जा सकता है, जैसे कि नैनोसेंसर9,10। जांच सामने या वापस कैनुला में भरी हुई हो सकता है (डिजाइन के आधार पर), और नुकसान से संरक्षित किया जाएगा जब ड्यूरा और तंत्रिका ऊतक मर्मज्ञ । हम गैर-मानव वानरों के साथ वीवो प्रयोग में से उदाहरण डेटा प्रदान करते हैं, जिसमें हमने विद्युत उत्तेजना करने के लिए टंगस्टन माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग किया, और बाद में ललाट नेत्र क्षेत्र (एफईएफ) में मस्सिमोल इंजेक्ट किया, जबकि जानवर ने मेमोरी गाइडेड सैकडे (एमजीएस) कार्य किया।

Protocol

प्रायोगिक प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं और तंत्रिका विज्ञान दिशा निर्देशों और नीतियों के लिए सोसायटी के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों का पालन किया । प्रायोगिक और व्यवहार प्रक्रियाओं के लिए प्रोटोकॉल यूटा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए माइक्रोइंजेक्टेड का निर्माण(चित्रा 1ए)

  1. कैनुला और जांच की लंबाई को मापें (इस उदाहरण में एक नैनोसेंसर)। जांच लंबाई से कैनुला से अधिक समय तक होना चाहिए यह कैनुला टिप (जांच डिजाइन के आधार पर) प्लस लगभग 2 सेमी से फैलना है ।
  2. एक मैग्नीफायर या माइक्रोस्कोप (~ 10x आवर्धन) के तहत, कैनुला में जांच लोड करें; यदि संभव हो तो जांच की नोक की रक्षा के लिए बैक-लोडिंग बेहतर है।
    नोट: मैन्युअल रूप से किया गया यह कदम चुनौतीपूर्ण है। वास्तविक प्रायोगिक जांच के प्रयास से पहले एक आवर्धक ग्लास के नीचे माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है।
  3. शीर्ष फेरूल, टी-जंक्शन और बॉटम फेरूल के माध्यम से कैनुला (जांच युक्त) पास करें।
    1. यदि जांच किसी भी अनुलग्नकों के बिना सिर्फ एक तार है, तो इसे कैनुला में वापस लोड करें और नीचे फेरूल से टी-जंक्शन में असेंबली डालें। कैनुला के ऊपर (फ्लैट-एंड साइड) को टी-जंक्शन के बीच में तैनात किया जाना चाहिए, नीचे के भीतर लेकिन शीर्ष फेरूल नहीं। प्रायोगिक जांच या बायोसेंसर शीर्ष ferrule के ऊपर फैलाना चाहिए ।
      नोट: कस्टम निर्मित ferrules भी माइक्रो ड्रिल बिट्स का उपयोग कर ferrule प्लग में एक छेद ड्रिलिंग द्वारा किया जा सकता है, छेद के आकार टी जंक्शन के लिए cannula कस के लिए आवश्यक व्यास पर आधारित किया जा रहा है ।
  4. टी-जंक्शन के ऊपर और नीचे पर फेनियम को कसने के लिए फेरूल रिंच का इस्तेमाल करें। ज्यादा सख्ती न करें। शीर्ष फेरूल के भीतर इलेक्ट्रोड समर्थन को मजबूत करने के लिए ट्यूबिंग का एक छोटा सा टुकड़ा जोड़ा जा सकता है।
  5. जांच के विनिर्देशों के अनुसार, प्रत्येक जांच टर्मिनल (सिग्नल, ग्राउंड, आदि) के लिए मिलाप सोने की पिन।
  6. जांच और कैनुला की सापेक्ष स्थिति को समायोजित करना। दूरी है कि जांच आवर्धन के तहत cannula से फैला हुआ है उपाय, और शीर्ष अंत से मैन्युअल रूप से समायोजित (जांच ferrules के भीतर स्वतंत्र रूप से स्लाइड कर सकते हैं) ।
  7. फेररूल को जांच संलग्न करने के लिए सोने के पिन और शीर्ष फेरूल के बीच एपॉक्सी गोंद जोड़ें।
  8. कैनुला के अंदर जांच को वापस लेने के लिए शीर्ष फेरूल को खोलना। नेत्रहीन पुष्टि करते है कि जांच आवर्धन के तहत cannula के भीतर पूरी तरह से है ।
  9. माइक्रोड्राइव के लिए इंजेक्शन संलग्न करें।

2. दवा जलसेक के लिए माइक्रोइंजेक्टेड का निर्माण(चित्रा 1बी)

  1. एक फेररूल का उपयोग करके टी-जंक्शन के नीचे कैनुला के "गैर-बेवल्ड" या फ्लैट-अंत को संलग्न करें। फेरूल को कसने के लिए फेरूल रिंच का इस्तेमाल करें।
  2. केशिका ट्यूबिंग (~ 1.5 सेमी) का एक छोटा सा टुकड़ा मानक फेरूल के माध्यम से गुजरकर टी-जंक्शन के शीर्ष पर संलग्न करें। एक फेरूल रिंच के साथ कसें।
  3. केशिका ट्यूबिंग, टी-जंक्शन, कैनुला और इसी फेरनियम के माध्यम से माइक्रोइलेक्ट्रोड को बैक-लोड करें।
  4. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड का पिछला अंत केशिका ट्यूबिंग के पीछे से 1 सेमी से कम फैलता है, और इलेक्ट्रोड की नोक नीचे की ओर वांछित दूरी पर कैनुला से फैलती है। इलेक्ट्रोड स्थिति को शीर्ष-अंत से मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है।
  5. माइक्रोइलेक्ट्रोड टर्मिनल के लिए एक सोने का पिन मिलाप।
  6. फेरूल को माइक्रोइलेक्ट्रोड संलग्न करने के लिए गोल्ड पिन और शीर्ष फेरूल के बीच एपॉक्सी गोंद जोड़ें।
  7. कैनुला के अंदर जांच को वापस लेने के लिए शीर्ष फेरूल को खोलना। नेत्रहीन पुष्टि करते हैं कि माइक्रोइलेक्ट्रोड पूरी तरह से कैनुला में मुकर गया है।

3. माइक्रोफ्लूइडिक सर्किट का निर्माण(चित्रा 2)

  1. एक स्थिर सतह पर एक ब्रेडबोर्ड रखें। ब्रेडबोर्ड के सबसे लंबे किनारों के समानांतर दो तीन तरह के वाल्व रखें, लगभग 6 इंच। एक बंदरगाह (जो हमेशा खुला रहता है) के साथ एक दूसरे का सामना करना पड़ रहा है। वाल्व को ब्रेडबोर्ड तक ठीक करने के लिए शिकंजा का उपयोग करें।
  2. वाल्व के बगल में एक शासक रखें (केशिका ट्यूबिंग के अंदर तरल पदार्थों की आवाजाही को मापने और ट्रैक करने के लिए)।
  3. 1:1 कम चिपचिपाहट तेल और खाद्य रंग (मार्कर) का मिश्रण गैसटाइट सिरिंज में लोड करें और मार्कर पंप में रखें। केशिका ट्यूबिंग का एक टुकड़ा काटें, और इनपुट वाल्व पर बंदरगाहों में से एक से सिरिंज को जोड़ने के लिए मानक ferrules और Luer-लॉक कनेक्टर का उपयोग करें। यह "मार्कर लाइन" है।
  4. "शासक रेखा" के लिए केशिका ट्यूबिंग का एक छोटा टुकड़ा काटें। वाल्व के सामना बंदरगाहों को कसने के लिए मानक ferrules का उपयोग करें।
  5. आउटपुट वाल्व को माइक्रोइंजेक्टेड से जोड़ने के लिए केशिका ट्यूबिंग के दो लंबे टुकड़े काटें, और दवा पंप को इनपुट वाल्व (मानक ferrules का उपयोग करें) से कनेक्ट करने के लिए।
    नोट: इन दो पंक्तियों की लंबाई प्रायोगिक सेटअप पर निर्भर करती है, एक को जलसेक उपकरण से जानवर तक पहुंचने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, और दूसरा ड्रग पंप से इनपुट वाल्व तक पहुंचना चाहिए। केशिका ट्यूबिंग को काटने के लिए एक क्लीविंग स्टोन का उपयोग करें।

4. माइक्रोड्राइव के लिए माइक्रोइंजेक्टेड बढ़ते(चित्रा 3)

  1. सुनिश्चित करें कि माइक्रोइलेक्ट्रोड/प्रायोगिक जांच बढ़ते से पहले कैनुला में मुकर जाती है ।
    नोट: गाइड ट्यूब माइक्रोड्राइव में स्थिति में होना चाहिए।
  2. माइक्रोइंजेक्टेड में कस्टम-मेड एडाप्टर संलग्न करें।
  3. गाइड ट्यूब के माध्यम से माइक्रोइंजेक्टरोड को टॉप-लोड करें और शिकंजा का उपयोग करके एडाप्टर को सुरक्षित करें।
  4. माइक्रोड्राइव स्थिति (गहराई) को मापें जिस पर माइक्रोइंजेक्टेड गाइड ट्यूब से फैलता है, फिर प्रविष्टि के लिए तैयार करने के लिए इसे ~ 1 सेमी वापस ले लें।
  5. माइक्रोइन्फ्यूजन प्रयोगों के लिए, माइक्रोइंजेक्टेड के अप्रयुक्त टी-जंक्शन उद्घाटन के लिए "मस्तिष्क रेखा" को कनेक्ट करें। एक मानक फेरूल का उपयोग करें और फेरूल रिंच के साथ कसें।

5. फ्लशिंग और माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम की तैयारी

  1. एक अपशिष्ट बीकर पर माइक्रोइंजेक्टेड के साथ माइक्रोड्राइव की स्थिति।
  2. लोड क्लोरहेक्सिडीन (जैसे, नोल्वेसान; 20 ग्राम/एल पर भंग) 1 एमएल गैसटाइट सिरिंज में और इसे ड्रग पंप में रखें । वाल्व के प्रवाह की दिशा को इस तरह चालू करें कि तरल पदार्थ वाल्व के माध्यम से दवा पंप से वाल्व लाइन तक जाता है और "मस्तिष्क रेखा" से बाहर हो जाता है।
  3. कम से कम 10 मिन के लिए कम प्रवाह दर (50-200 माइक्रोन/मिन) का उपयोग करके क्लोरहेक्सिडीन के साथ सर्किट को फ्लश करें। 5.2 से 5.3 के माध्यम से बाँझ खारा और फिर हवा के साथ कदम दोहराएं।
    नोट: इस स्तर पर लीक की जांच करना महत्वपूर्ण है । धीरे-धीरे जंक्शनों पर लिंट-मुक्त पोंछे लागू करें ताकि फर्नियम के माध्यम से किसी भी तरल लीक को प्रकट करने में मदद मिल सके।
  4. दवा को 500 माइक्रोन गैसटाइट सिरिंज में लोड करें, हवा सेक करें और फिर ड्रग पंप में रखें। ५० μL/मिन पर प्रवाह जब तक कुछ बूंदें माइक्रोइंजेक्टेड से प्रवाह ।
  5. गाइड ट्यूब को क्लोरहेक्सिडीन (20 जी/एल पर भंग) में 15 मिन के लिए भिगो दें।
  6. आउटपुट वाल्व की दिशा को "फ्लशिंग लाइन" की ओर मोड़ें। मार्कर पंप अग्रिम जब तक रंग और तेल का एक स्पष्ट किनारे शासक लाइन पर मनाया जाता है। सुनिश्चित करें कि दवा और रंग के बीच हमेशा तेल होता है ताकि दो पानी में घुलनशील सामग्री को न मिलाया जा सके और उनके बीच तेज धार खो दी जा सके। इस तेल की शुरुआती स्थिति को चिह्नित करें/(टेप या मार्कर के टुकड़े के साथ) ।
  7. आउटपुट वाल्व की दिशा को मस्तिष्क रेखा की ओर मोड़ें।

6. रिकॉर्डिंग या जलसेक प्रयोग करना

नोट: लैब और प्रयोग के आधार पर पशु हैंडलिंग चरण भिन्न होंगे। आवश्यक शल्य चिकित्सा सेट अप के बाद निम्नलिखित कदम ों को अंजाम दिया जाना है और ड्यूरा को बेनकाब करने के लिए तैयारी की गई है। प्रयोग के बाद, सभी आवश्यक प्रक्रिया के बाद कदम संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाना चाहिए ।

  1. रिकॉर्डिंग कक्ष में माइक्रोड्राइव संलग्न करें। ड्यूरा में प्रवेश करने के लिए गाइड ट्यूब को कम करें।
    नोट: कॉर्टेक्स को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए गाइड ट्यूब को ड्यूरा से आगे नहीं घुसना चाहिए।
  2. मस्तिष्क में रिकॉर्डिंग/इंजेक्शन के लिए साइट के ऊपर माइक्रोइंजेक्टरोड को लगभग 2 मिमी तक कम करें।
  3. टॉप फेरूल (फैला हुआ माइक्रोइलेक्ट्रोड/बायोसेंसर) को कस लें और गोल्ड पिल्स को रिकॉर्डिंग सिस्टम से कनेक्ट करें । लक्ष्य स्थल पर माइक्रोइंजेक्टरोड को आगे बढ़ाते रहें।
    नोट: गणना में माइक्रोइलेक्ट्रोड कैनुला से परे फैली दूरी को शामिल करना याद रखें।
  4. जलसेक प्रयोगों के लिए, मैनुअल माइक्रोसिरिंग पंप का उपयोग करने के लिए 1 सेमी हर 3 मिन (~ 60 nL/min) द्वारा तेल के कॉलम ले जाने के लिए । एक बार वांछित मात्रा का संचार किया गया है, फ्लशिंग लाइन की ओर आउटपुट वाल्व स्विच।
    नोट: संचार की मात्रा मॉडल प्रजातियों और मस्तिष्क क्षेत्र लक्षित के आधार पर भिन्न होगी। तेज प्रवाह दर तंत्रिका ऊतक को नुकसान पहुंचा सकती है।
  5. जब प्रयोग पूरे हो जाएं, तो गाइड ट्यूब के भीतर माइक्रोइंजेक्टरोड को वापस ले (जांच को फैला हुआ छोड़ दें)। इसके बाद फ्लशिंग के लिए माइक्रोड्राइव निकाल ें। 5.1-5.5 चरणों में वर्णित माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम को फ्लश करें। पुन: उपयोग के लिए तैयार करने के लिए।
    नोट: हमारे अनुभव में, माइक्रोइंजेक्टेड कई उपयोगों के लिए पिछले अगर उचित देखभाल की जाती है । इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग गुणवत्ता इंजेक्शन की क्षमता की तुलना में तेजी से गिरती है।

Representative Results

हमने ललाट आई फील्ड (एफईएफ) के रिवर्सेबल निष्क्रियता के लिए गाबा एगोनिस्ट (मस्सिमोल) का इंजेक्शन किया, जबकि जानवर ने एक मेमोरी गाइडेड सैकडे टास्क11का प्रदर्शन किया। इस कार्य में, पशु फिक्सेट और एक परिधीय दृश्य लक्ष्य प्रस्तुत किया जाता है। जानवर लक्ष्य स्थान को याद करते हुए निर्धारण रखता है, और एक बार निर्धारण बिंदु गायब हो जाता है, एक पुरस्कार प्राप्त करने के लिए याद किए गए स्थान पर एक सैकडिक आंख आंदोलन को निष्पादित करता है। माइक्रोइंजेक्टेड का निर्माण चित्रा 1बीमें दिए गए निर्देशों के अनुसार किया गया था । उदाहरण प्रयोग के लिए जलसेक की मात्रा 850 एनएम थी। विभिन्न स्थानों पर मेमोरी गाइडेड सैकडे (एमजीएस) कार्य पर व्यवहार प्रदर्शन और मस्सिमोल जलसेक के सापेक्ष समय चित्र4में दिखाया गया है। सबसे बड़ा प्रदर्शन घाटा 2 से 3 घंटे के बाद जलसेक पर देखा गया ।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोइंजेक्टेड के कदम से कदम निर्माण। (क)माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम से स्वतंत्र उपयोग के लिए विन्यास। कैनुला और जांच को इस बात की पुष्टि करने के लिए मापा जाता है कि जांच की नोक वांछित लंबाई (जैसे, 150 माइक्रोन) पर फैला जा सकता है। जांच सामने कैनुला में भरी हुई है । कैनुला टी-जंक्शन के माध्यम से पारित किया जाता है और नीचे की ओर जुड़ा हुआ है, टी-जंक्शन के बीच में फ्लैट अंत के साथ; जांच के पीछे के अंत शीर्ष ferrule के माध्यम से जारी है । माइक्रोइंजेक्टेड को प्रत्येक जांच टर्मिनल पर सोने के पिन को टांका लगाकर और उनके बीच गोंद और स्थिरता के लिए शीर्ष फेरूल जोड़कर अंतिम रूप दिया जाता है। अधिग्रहण प्रणाली से कनेक्शन जांच के डिजाइन पर निर्भर करता है। इस उदाहरण में, हमारी जांच तीन लीड के साथ एक नैनोसेंसर है। (ख)माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम के साथ उपयोग के लिए विन्यास। माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम के लिए माइक्रोइंजेक्टेड को जोड़ेरखने के लिए, टी-जंक्शन के शीर्ष हिस्से के लिए केशिका ट्यूबिंग का एक टुकड़ा उपयोग किया जाता है। जांच सामने या पीछे लोड की जा सकती है। इसके बाद माइक्रोफ्लूइडिक लाइन को तीसरे टी-जंक्शन ओपनिंग में प्लग किया जाता है । इस उदाहरण में हमने माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग किया। एक कैनुला की नोक की ज़ूम की तस्वीर देखें जिसमें शीर्ष फेरूल को कसकर माइक्रोइलेक्ट्रोड फैला हुआ था। निर्माण में उपयोग की जाने वाली वस्तुओं की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम। दो वाल्व विन्यास माइक्रोइंजेक्टरोड की ओर या समस्या निवारण के लिए फ्लशिंग लाइन की ओर प्रवाह दिशा के नियंत्रण की अनुमति देता है। सर्किट केशिका ट्यूबिंग और मानक ferrules का उपयोग कर जुड़े दो 3 बंदरगाह वाल्व पर निर्भर करता है । गैसटाइट सीरिंज का उपयोग जलसेक दवा और मार्कर को ले जाने और इंजेक्ट करने के लिए किया जाता है। एक प्रोग्रामकरने योग्य सिरिंज पंप सिस्टम के स्वचालित फ्लशिंग और दवा के लोड होने की अनुमति देता है। एक मैनुअल माइक्रोसिरिंग पंप नियंत्रित इंजेक्शन और दृश्य के लिए अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: इंजेक्शन क्षमता के साथ और बिना हाइड्रोलिक माइक्रोड्राइव के लिए माइक्रोइंजेक्टरोड का बढ़ते। चरण 4.1: एक कस्टम-निर्मित एडाप्टर माइक्रोड्राइव के लिए माइक्रोइंजेक्टेड के लगाव के लिए अनुमति देता है। एक भी पेंच माइक्रोड्राइव के लिए एडाप्टर देता है; दो शिकंजा एडाप्टर के लिए माइक्रोइंजेक्टेड सुरक्षित। माइक्रोड्राइव के गाइड ट्यूब में माइक्रोइंजेक्टेड लोड करते समय माइक्रोइलेक्ट्रोड/प्रायोगिक जांच की नोक की रक्षा के लिए शीर्ष फेरूल को कम से कम 2 मोड़ों को खराब किया जाना चाहिए । चरण 4.3: ऊपर से गाइड ट्यूब में माइक्रोइंजेक्टेड डालें। चरण 4.4: यदि माइक्रोइन्फ्यूजन का प्रदर्शन कर रहे हैं, तो प्लास्टिक फेरूल का उपयोग करके दवा लाइन को तीसरे टी-जंक्शन खोलने के लिए प्लग करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एफईएफ में मस्सिमोल जलसेक के दौरान मेमोरी गाइडेड सैकड टास्क। (क)माइक्रोइंजेक्टेड को दाएं गोलार्द्ध, एफईएफ क्षेत्र में रखा गया था । (ख)एक एमजीएस कार्य के दौरान व्यवहार प्रदर्शन जिसमें आठ लक्ष्यपरिरैली रखे जाते हैं । हम एमजीएस कार्य के 4 ब्लॉकों, पहले और इंजेक्शन के बाद तीन बार में भाग गया । ध्रुवीय साजिश इन समय (रंग) में से प्रत्येक पर प्रदर्शन (सनक) से पता चलता है, फिक्सेशन बिंदु (ध्रुवीय साजिश पर कोण) के सापेक्ष विभिन्न स्थानों के लिए। इंजेक्शन के बाद बाएं दृश्य हेमीफील्ड 2 एच में प्रदर्शन स्पष्ट रूप से कम हो गया (नीला ट्रेस, ध्रुवीय भूखंड का आधा हिस्सा)। (ग)सैकड से पहले (बाएं) और एफईएफ (दाएं, 1 और 3 एच पोस्ट-अर्क) में मस्सिमोल इंजेक्शन के बाद 8 परिधीय स्मृति स्थानों के लिए निशान हैं। मस्सिमोल इंजेक्शन के बाद बाएं दृश्य हेमीफील्ड (ध्रुवीय भूखंडों का आधा हिस्सा) में सैकड सटीकता में कमी आई। दृश्य कोण (डीवीए) की डिग्री में स्केल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

वर्तमान में एक साथ दवा वितरण और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी करने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। हमारी प्रणाली का उद्देश्य रिकॉर्डिंग के लिए या तो स्वतंत्र रूप से या दवा इंजेक्शन के संयोजन में उपयोग किया जाना है, और ड्यूरा मेटर और तंत्रिका ऊतक के माध्यम से किसी भी नुकसान से संरक्षित नैनोसेंसर या माइक्रोइलेक्ट्रोड जैसे किसी भी नाजुक प्रयोगात्मक जांच को ठीक से रखने की क्षमता है। सिस्टम नग्न आंखों के साथ दवा जलसेक की मात्रा के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है (हमारी प्रयोगशाला3में पिछले अध्ययनों में दिखाया गया 17 nL परिशुद्धता)।

दबाव इंजेक्शन के लिए अधिक विशेष प्रणालियां हैं जिनका उपयोग छोटे व्यास12के साथ है । वे प्रणालियां कई रिकॉर्डिंग साइटों के लिए अनुमति देती हैं, लेकिन सिस्टम के नियंत्रण के लिए आवश्यक सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर के जटिल सेटअप में प्रत्येक घटक के लिए उच्च लागत होती है, और प्रयोगात्मक जांच के साथ इंटरफेस करने के लिए कम लचीलापन होता है जो अभी तक बड़े पैमाने पर व्यावसायीकरण नहीं कर ते हैं। इसके अलावा, हमारे इंजेक्टरोड को एक पुरानी प्रत्यारोपण की आवश्यकता नहीं होती है और बहुत अधिक लचीलापन प्रदान करता है: रासायनिक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों को मापने के लिए बायोसेंसर के साथ संगत, और इन प्रतिक्रियाओं पर स्थानीयकृत दवा इन्फ्यूजन के प्रभाव को मापने की क्षमता के साथ दवाओं को भी संक्रमित करने में सक्षम।

डिजाइन प्रायोगिक जांच को ड्यूरा प्रवेश के बाद फैला हुआ होने की अनुमति देता है ताकि जांच की संरचना को नुकसान से बचा जा सके। यह सुविधा डिवाइस की बहुकार्यशीलता के लिए अनुमति देती है, नैनोमीटर-स्केल नैनोसेंसर10जैसे किसी भी प्रयोगात्मक जांच के नुकसान को खतरे में डालने के बिना ड्यूरा में प्रवेश करने के लिए। हालांकि, लंबाई की एक सीमा है जिसे फैलाया जा सकता है, जो फेरूल के मोड़ों की संख्या से प्रतिबंधित हो सकता है, जो मानक फेरूल्स के लिए ~ 1 मिमी तक सीमित है। छोटे कैनुला व्यास (228 माइक्रोन) के कारण न्यूनतम ऊतक क्षति होती है।

प्रयोग में हमने दिखाया, सिस्टम का उपयोग करके बिजली की उत्तेजना या एक्सट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग (एकल न्यूरॉन, स्थानीय क्षेत्र क्षमता) के साथ, एफईएफ के रिवर्सेबल निष्क्रियता के लिए मस्सिमोल की नियंत्रित डिलीवरी करने के लिए किया गया था। माइक्रोइलेक्ट्रोड। FEF में इस प्रयोग के लिए निष्क्रियहोने से पहले सैकडे वेक्टर की पुष्टि करने के लिए FEF के माइक्रोस्टिमुलेशन की आवश्यकता होती है, और दवा को रिवर्सिबल एफईएफ निष्क्रियता के दौरान काम करने वाली स्मृति का अध्ययन करने के लिए संचार किया गया था। यह संभावना नहीं है कि दवा इंजेक्शन से पहले और बाद में एक ही अलग एकल न्यूरॉन से एक रिकॉर्डिंग बनाए रखी जा सकती है; हालांकि, हम जलसेक से पहले और बाद में स्थानीय क्षेत्र क्षमता रिकॉर्ड करने में सक्षम थे । यहां, हम इंजेक्शन, रिकॉर्डिंग और विद्युत उत्तेजना के संयोजन का प्रयोग दिखाते हैं।

एक बार यह स्थापित हो जाने के बाद, विधि बहुत विश्वसनीय और मजबूत है। हालांकि, छोटी ट्यूब और बंदरगाहों के भीतर छोटे अणुओं (जैसे, नमक) की वर्षा के कारण, माइक्रोफ्लूइडिक्स को अवरोधों और लीक से मुक्त रखने के लिए प्रत्येक प्रयोग के बाद पूरी तरह से फ्लशिंग की आवश्यकता होती है। पूरे सर्किट की सादगी के कारण, प्रत्येक घटक को आसान समस्या निवारण के लिए स्वतंत्र रूप से प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

यद्यपि विधि को एफईएफ क्षेत्र में गैर-मानव रहनुमा में प्रदर्शित किया गया था, सिद्धांत को किसी भी अन्य मस्तिष्क क्षेत्र में लागू किया जा सकता है जहां कृंतक आकार या बड़े की प्रजातियों में विद्युत उत्तेजना, रिकॉर्डिंग और दवा इंजेक्शन के कुछ संयोजन वांछित हैं।

Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था, EY026924 और EY014800 (बीएन के लिए), अनुसंधान से एक अप्रतिबंधित अनुदान अंधापन को रोकने के लिए अनुदान, इंक, ंयूयॉर्क, नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान, विश्वविद्यालय के विभाग के लिए हिंदी अनुवाद यूटा के, और स्टार्ट-अप हेनरी सैमुएली स्कूल ऑफ इंजीनियरिंग और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग विभाग द्वारा आरई को प्रदान की गई धन। यह विधि डॉ तिरिन मूर की प्रयोगशाला में विकसित एक ऐसी ही विधि की पिछली रिपोर्ट पर आधारित है, जो नूडूस्ट एंड मूर 2011, जर्नल ऑफ न्यूरोसाइंस मेथड्स में प्रकाशित हुई थी। लेखक पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणी के लिए डॉ केल्सी क्लार्क का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-port manual valves LabSmith Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
Cannulae Vita Needle Company 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm Vita Needle Master Tubing Gauge Chart
Cleaving stone Molex Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
Clorhexidine diacetate Walmart Nolvasan solution disinfectant (AAP311) Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L
Custom adapter Custom provider - Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive
Driver LabSmith T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
Epoxy glue LabSmith Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
Ferrule LabSmith One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24
Ferrule plug LabSmith One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24
Ferrule wrench LabSmith 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24
Gastight syringe Hamilton Company 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top
Gold pins Aim-Cambridge Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
Lint-free wipes Kimberly Clark Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Lint-free wipes, used to identify leaks in the system
Liquid food color McCormick & Co. Water based, black liquid food color (52100581873) https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
Low viscosity oil Clearco Products Co. Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
Luer-Lock connector LabSmith Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
Micro drill bits Grainger Micro drill bit, 0.23mm (414H85) https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
Microelectrode FHC Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
Oil hydraulic micromanipulator Narishige Group Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
Polymicro Capillary Tubing Molex Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm Polymicro Capillary Tubing
Programmable syringe pump Harvard Apparatus Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html
Ruler Empire Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) http://www.empirelevel.com/rulers.php
Screw set LabSmith Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
Standard Breadboard LabSmith 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24
Sterile saline (sodium chloride) 0.9% Baxter 0.9% Sodium Chloride sterile Sterile Intravenous Infusion
Sterile syringe filters Millipore Sigma MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs
Stoelting manual microsyringe pump Stoelting Company Manual infusion/withdrawal pump (51222) https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
T-junction LabSmith Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24

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References

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