تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يوفر هذا البروتوكول إرشادات لتنفيذ الطباعة الحجرية متعددة الفوتونات لصنع صفائف ثلاثية الابعاد من علامات الإيماني الفلورية المضمنة في الهلام المائي القائم علي البولي إيثيلين غليكول لاستخدامه كاشاره خاليه ، مجهر قوه الجر منصات. باستخدام هذه التعليمات ، يتم تبسيط قياس السلالة المادية ثلاثية الابعاد وحساب عمليات التعقب الخلوية لتعزيز قياسات قوه الجر عاليه الانتاجيه.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يوفر القياس الكمي لتشوه المواد الناتج عن الخلايا معلومات مفيده تتعلق بكيفية تحسس الخلايا والاستجابة للخصائص الفيزيائية لبيئتها الصغرى. في حين توجد العديد من النهج لقياس السلالة المادية التي يسببها الخلايا ، وهنا نقدم منهجيه لرصد الضغط مع القرار الفرعي ميكرون بطريقه خاليه من الإشارات. باستخدام عمليه الزخرفة الضوئية المنشطة ثنائيه الفوتون ، فاننا نثبت كيفيه توليد ركائز تركيبيه قابله للتوقد ميكانيكيا وحيويا والتي تحتوي علي صفائف مدمجه من علامات ايماني الفلورسنت لقياس ثلاثي الابعاد بسهوله ( 3D) ملامح تشوه المواد استجابه لtractions السطح. باستخدام هذه الركائز ، يمكن تعيين ملفات تعريف توتر الخلية باستخدام كومه صور ثلاثية الابعاد واحده لخليه ذات اهتمام. هدفنا مع هذه المنهجية هو جعل المجهر قوه الجر أكثر سهوله وأسهل لتنفيذ أداه للباحثين دراسة عمليات الميكنة الخلوية ، وخاصه الوافدين الجدد إلى الميدان.

Introduction

المجهر قوه الجر (TFM) هي عمليه تقارب القصبات الخلوية باستخدام الحقول الازاحه محرف من علامات ايماني المتولدة من قبل الخلية الملتصقة ومقلص. باستخدام tfm ، وتاثير العظة الميكانيكية في البيئة خارج الخلية علي العمليات الخلوية الهامه مثل الانتشار ، والتمايز ، والهجرة يمكن التحقيق1،2،3،4 ،5،6،7،8،9،10،11،12. لسوء الحظ ، قد يكون من الصعب تنفيذ العديد من النهج الحالية أو تتطلب إلمام بالأداات التحليلية والحسابية عاليه التخصص مما يجعل TFM صعبه للباحثين عديمي الخبرة لاستخدام. ونحن نقدم وصفا لمنهجيه لتوليد منصة TFM التي تزيل بعض الصعوبة في التحليل في حين توفر أيضا الحصول علي البيانات عاليه الانتاجيه.

من النهج الحالية TFM ، والأكثر استخداما لقياس السلالة المادية ينطوي علي ادراج علامات الفلورسنت الصغيرة (عاده نانو أو ميكرومتر الحجم الخرز الفلورسنت) في هيدروجيل تشوه ، مثل بولياكرياميد (PAA) أو بولي (جلايكول الاثيلين) تشكيل (pegda)13،14،15. وتوفر هذه النهج القائمة علي الخرزات القدرة علي وضع علامات لايماني العنقودية الكثيفة حول خليه ذات اهميه لتعظيم أخذ عينات الازاحه. لسوء الحظ ، لا يمكن السيطرة علي توزيع الخرز في جميع انحاء هيدروجيل مباشره بحيث التنظيم المكاني عشوائي. هذا الوضع العشوائي يؤدي إلى مشاكل مثل الخرز التي هي قريبه جدا من بعضها البعض لحل بدقه ، أو حتى تنتشر ان بقع من الركيزة تسفر عن بيانات ذات جوده منخفضه. كما ان عدم القدرة علي التنبؤ بالمكان الذي تقع فيه علامات الإيماني في غياب الخلايا يخلق قيدا أيضا ، بالنسبة لكل مجموعه تجمع من بيانات جر الخلايا ، يجب أيضا التقاط صوره مرجعيه اضافيه للعلامات الاساسيه في حاله الاسترخاء. الصورة المرجعية مطلوبه بحيث يمكن تقريب الازاحه في الصورة المجهدة كالفرق بين الصور المجهدة وغير المجهدة. ولتحقيق حاله استرخاء ، فان الخلايا التي يجري قياسها اما ان تخفف كيميائيا أو ان تتم ازالتها بالبالكامل. هذه العملية غالبا ما تمنع الحصول علي المزيد من القياسات التجريبية ، ويمنع دراسات الخلايا علي المدى الطويل ، ويحد من الانتاجيه. كما تتطلب الصورة المرجعية تقنيات تسجيل الصور لاستيعاب الانحراف الذي قد يكون حدث اثناء التجريب ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى المطابقة اليدوية المرهقة لصور حاله الضغط للاشاره إلى الصور.

طرق tfm الأخرى التي تعتبر خاليه من المرجع ، وتنفيذ شكل من اشكال السيطرة علي توزيع علامات الإيماني ، اما عن طريق الطباعة الحجرية عاليه الدقة ، المطبوعة الاتصال المجهري ، أو ميكرومتر16،17،18 و19و20. ويتحقق TFM خاليه من المرجع من خلال افتراض ان حاله استرخاء لكل علامة ايماني يمكن التنبؤ بها استنادا إلى كيفيه وضع علامة وصفت خلال عمليه التصنيع. تسمح هذه الطرق بالتقاط الكامل لحاله التوتر في الخلية داخل التقاط صوره واحده يتم فيها قياس عمليات أزاحه العلامة ايماني بالمقارنة مع مرجع ضمني مما يمكن الاستدلال عليه من هندسه علامة الإيماني. وبينما يتحقق الاتساق في وضع العلامات عاده باستخدام هذه المنصات ، فانها تعاني عموما من أوجه القصور الخاصة بها مقارنه بالنهج القائمة علي الخرزة المستخدمة علي نطاق واسع ، بما في ذلك: 1) انخفاض قرار الجر ؛ 2) انخفاض دقه النزوح خارج الطائرة (في بعض الحالات عدم القدرة الكاملة علي قياس) ؛ و 3) انخفاض تفصيل من ركائز منصة والمواد (علي سبيل المثال ، يجند العرض ، والخواص الميكانيكية).

لمعالجه أوجه القصور هذه ، قمنا بتصميم منصة TFM الجديدة الخالية من الإشارات. تستخدم المنصة الكيمياء المنشطة متعددة الفوتونات للربط بين كميه صغيره من الفلوروفيمور في مواقع محدده ثلاثية الابعاد داخل هيدروجيل التي تعمل كعلامات ايماني لقياس السلالة المادية. وبهذه الطريقة ، قمنا بتصميم منصة تعمل بشكل مماثل للنهج القائمة علي الخرزة ولكن مع الفائدة الكبيرة التي يتم تنظيم علامات ايماني في صفائف الشواية مما يسمح لتتبع سلاله المواد الخالية من المرجع. توفر هذه الخاصية الخالية من الإشارات العديد من المزايا. أولا وقبل كل شيء ، فانه يسمح لرصد غير تدخليه من الدول الجر الخلوية (اي ، التفاف علي الحاجة إلى الاسترخاء أو أزاله الخلايا للحصول علي المواقع المرجعية من علامات ايماني النازحين). وكان هذا هو هدفنا الأساسي في تصميم هذا النظام ، ونحن عازمون علي دمج الأساليب التحليلية الأخرى المصب جنبا إلى جنب مع TFM ، والتي يمكن ان تكون صعبه مع النهج المدمرة TFM نقطه النهاية. ثانيا ، استخدام مرجع ضمني يستند إلى صفائف موزع جيس يسمح لاتمته شبه كامله من تحليل الازاحه. ويؤدي انتظام المصفوفات إلى إنشاء سير عمل يمكن التنبؤ به حيث يمكن الحفاظ علي الحد الأدنى من حالات الحالات الاستثنائية (اي ، نموذج بيانات الخلية التي تحتوي علي تحف غير متوقعه مثل تباعد العلامات دون الأمثل أو تفاوتات التسجيل). ثالثا ، التخلي عن الحاجة إلى الحصول علي صوره مرجعيه يوفر الحرية لرصد العديد من الخلايا علي عينه واحده علي مدي فترات طويلة من الزمن. وهذا يتناقض مع النهج التقليدية القائمة علي حبه ، حيث ، اعتمادا علي الإخلاص من الحركات المرحلة الألى المجهر ، يمكن ان تتراكم الأخطاء في تحديد المواقع وزيادة صعوبة تسجيل الصور المرجعية بشكل صحيح إلى توتر الخلية الصور. وعموما ، تسهل هذه المنصة إنتاجيه اعلي في جمع بيانات التوتر الخلوي.

مع هذا البروتوكول ، ونحن نامل في تعريف القراء مع اثنين من الفوتون ، ليزر المسح الحجري تقنيه الطباعة التي قمنا بتنفيذها لتوليد هذا منصة TFM خاليه من الإشارات لقياس مكونات الجر في الطائرة وخارج الطائرة التي تولدها الخلايا المصنفة علي السطح. غير مشمولة في هذا البروتوكول هو توليف بعض المكونات مونوميريك. وبصفه عامه ، تتضمن ردود الفعل هذه ما يكاد يكون مطابقا لمخططات التفاعل التوليفي "الواحد" الموصوفة سابقا بأنها21، ويمكن أيضا شراء بدائل لهذه المنتجات. ونحن نهدف أيضا إلى تعريف القراء بالأداات المستندة إلى البرامج التي قمنا بإنشاءها لتعزيز استخدام مجاهر المسح بالليزر المتاحة تجاريا كاداات طباعه ثلاثية الابعاد ولتسهيل تحليل عمليات أزاحه علامات الإيماني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. فوتوبوليميرينج قاعده الهيدروجيل

  1. جمع الكواشف
    1. جمع الليثيوم فينيل-2 ، 4 ، 6-تريميثيلالبنبيزيلفوسفونات (اللفة) ، 3.4 كدي بولي (الاثيلين) غليكول التشكيل (PEGDA) ، ن-الفينيل بيروليتم (NVP) ، اليكسافلور 488 المسمي PEGDA (PEG-488) ، اليكسافلور 633 المسمي PEGDA (PEG-633) ، و PEGylated RGDS الببتيد ( PEG-RGDS) من المجمدات الخاصة بهم وجلب كل إلى درجه حرارة الغرفة.
    2. في أنابيب الطرد المركزي العنبر منفصلة ، قياس 3 ملغ من اللفة ، 10 ملغ من PEGDA ، 5 ملغ من 488 ، 20 ملغ من PEG-633 ، و 6 ملغ من الببتيد RGDS.
  2. اعداد حلول ما قبل البوليمر
    1. حل اللفة في 1 مل من الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني ، pH 7.4). استخدام 200 μL من محلول اللفة المذاب لحل PEGDA. ثم ، استخدم 200 μL من الحل PEGDA لحل PEG-RGDS.
      ملاحظه: إذا كان من المرغوب فيه السيطرة علي شكل الخلية ، وتجاهل حل PEG-RGDS في المحلول الأساسي هيدروجيل قبل البوليمر ، كما سيتم اضافته عن طريق اثنين من الفوتون ، المسح الحجري الليزر في وقت لاحق في البروتوكول.
    2. استخدام 80 μL من تلفزيوني لحل PEG-488. أضافه 2.5 μL من هذا الحل إلى حل ما قبل البوليمر.
      ملاحظه: 488 سوف تعطي هيدروجيل النهائي اشاره الفلورسنت التي يمكن استخدامها للتنقل خلال زخرفه ويمكن تعديل تركيز لتغيير كثافة الاشاره.
    3. تصفيه الحل قبل البوليمر كامله من خلال 0.2 μm تترافلوروايثيلين (PTFE) فلتر لأزاله اي الجسيمات التي قد تكون موجودة في الحل. إذا تم توليف المواد المتفاعلة بشكل صحيح ، يجب ان لا يصبح الفلتر مسدودا.
  3. فوتوبوليميرينج قاعده هيدروجيل
    1. ضع 3 μL من محلول ما قبل البوليمر علي ورقه مسطحه رقيقه من بيرفلوروالكوكسي ان (PFA). وضع شقه 150 μm سميكه polydimethylsiloxane (PDMS) شرائط المحيطة بها ، ولكن ليس في اتصال مع ، وقطره من محلول ما قبل البوليمر. وضع كوفيرليب اكريليت-سيلانزيد21،22،23،24 علي pdms-مع قطره ما قبل البوليمر تركزت تحت كوفيرسليب-لتسطيح قطره ما قبل البوليمر إلى سمك فواصل PDMS.
    2. فضح حل ما قبل البوليمر تقع علي ضوء الاشعه فوق البنفسجية حتى يتم تشكيل هيدروجيل بشكل كامل (حوالي 1 دقيقه في 14 ميغاواط/سم2 من 370-400nm الضوء).
    3. افصل بعناية من الفواصل PDMS ونعلق علي طبق بيتري مفتوح القاع باستخدام عاليه الأداء ، لاصقه الأكريليك علي الوجهين. ضع الضغط علي سطح التلامس اللاصق لإنشاء ختم كامل بين المشبك اللاصق واللاصقة وطبق بيتري-مع الحرص علي عدم كسر الزجاج.
    4. شطف هيدروجيل في طبق بيتري باستخدام المعقمة التي تمت تصفيتها للحد من الملوثات البيولوجية والجسيمات.
    5. كرر الخطوات 1-3-1-1.3.4 حسب الحاجة لإنشاء العدد المطلوب من الهلام المائي.
    6. أضافه 8 μL من NVP إلى المتبقية 800 μL من الحل اللفة والحفاظ علي هذا الحل ، فضلا عن غير المنحلة PEG-633 حتى علي استعداد للنمط.
      ملاحظه: الحل اللفة مع NVP حساسة جدا للضوء وسوف تتبلمر إذا لم يتم الاحتفاظ بها في الظلام. التفاف الأنبوب في رقائق ألومنيوم يمكن ان تساعد علي تحسين الحياة الجرف.

2. إنشاء تعليمات زخرفه

  1. تصميم صوره ثنائيه
    1. لإنشاء قناع ظاهري لوصف صفائف ايماني ماركر ، استخدم معالجه الصور أو برامج الرسم لإنشاء صوره بنسبه عرض إلى الارتفاع 100:1 (علي سبيل المثال ، 2000 بكسل طويل x 20 بكسل).
    2. إنشاء صف من 100 بكسل ابيض متباعدة بالتساوي علي خلفيه سوداء تركزت علي طول المحور الطويل للصورة.
    3. حفظ هذه الصورة ك * .tif النموذج.
      ملاحظه: إذا كان المطلوب التحكم في شكل الخلية21،25،26،27،28، إنشاء قناع ظاهري اضافيه. استخدم لوحه قماشية علي شكل مربع وأنشئ ميزات بيضاء ايجابيه علي خلفيه سوداء. لتقريب حجم مناسب لميزات الأبيض (والتي سوف تدعم في نهاية المطاف التصاق الخلية) تفترض ان الحجم الكلي للصورة يعادل حجم مجال الرؤية المجهر المستخدمة للمسح الضوئي بالليزر الطباعة الحجرية.
  2. تحويل صوره ثنائيه إلى قناع رقمي
    1. قم بتنزيل وظائف مولد LSM-ROI المتوفرة مجانا في مستودع البرامج29.
    2. افتح Matlab واعثر علي دليل ملفات الوظائف التي تم تنزيلها. مره واحده في الدليل ، افتح البرنامج النصي run_script matlab وتشغيل البرنامج النصي.
    3. حدد الملف الثنائي * .tif للتحويل. ثم حدد مجلدا لحفظ ملفات المناطق.
    4. إدخال الحجم النهائي المطلوب ، في ميكرون ، من الصورة المحددة. سيتم تحجيم الصورة المدخلة وابعادها لمطابقه هذه المعلمات. للصورة بأكملها لتناسب في مجال العرض من المجهر ، يجب ان يكون الحجم الإجمالي للصورة اقل من أو مساويه لحجم المجهر المجال.
    5. إذا قمت بإنشاء صفيف بكسل واحد ، في خيارات مولد عائد الاستثمار ، تاكد من إلغاء تحديد أزاله خانه تحت المناطق الصغيرة/بكسل واحد، للتحقق من خانه المسمي المربعات، وللغاء استخدام تحت خطوط الفاصل الأفقي. ثم انقر فوق موافق.
      ملاحظه: إذا إنشاء ملف مناطق لإنشاء أنماط خليه واحده الخيارات الافتراضية المناسبة.
    6. ابحث عن الملف الناتج *. ovl في المجلد المحدد مسبقا. يجب ان يتم إحضار هذا الملف إلى المجهر لتحميل المناطق المطلوبة التي تتحكم في مصراع الليزر اثناء التصوير الحجري للطباعة بالليزر بالفوتونين.

3. افتعال صفائف ايماني ماركر

  1. نقع قاعده هيدروجيل
    1. تحت ظروف الاضاءه الخافتة ، أضافه 200 μL من الحل اللفة/NVP إلى AF633 (كلاهما أعد في الخطوة 1). اخلط جيدا مع الحماية من الضوء.
    2. أزاله كل حل تلفزيوني من طبق بيتري التي تحتوي علي هيدروجيل PEGDA من الخطوة 1.
    3. أضافه 633 الذائبة إلى هيدروجيل لتشكيل قطره التي تشمل تماما هيدروجيل قاعده.
      ملاحظه: إذا كان الثقب في طبق بيتري هو فقط أكبر قليلا من هيدروجيل ، فانه يمكن ان تكون بمثابه بئر لعقد الحل زخرفه. خلاف ذلك ، تاكد من ان كوفيرسليب جاف تماما قبل أضافه حل زخرفه أو انه قد تشغيل قباله هيدروجيل تسبب هيدروجيل لأزاله الهيدرات خلال زخرفه.
    4. تحميل طبق بيتري علي حامل العينة علي مرحله المجهر ووضع الغطاء علي طبق بيتري. السماح للحل زخرفه لنقع في هيدروجيل لمده 30 دقيقه علي الأقل في الظلام.
      ملاحظه: يمكن تشغيل المجهر وتكوينه اثناء هذا الوقت النقع. باستخدام الليزر 488 nm لصوره هيدروجيل خلال تمرغ علي ما يرام.
  2. تكوين المجهر
    1. باستخدام خط ليزر 488 nm والفلاتر المناسبة للصورة اليكسافلور 488 ، حدد موقع هيدروجيل باستخدام اشاره PEG-488. كتله مجموعه من أطوال موجية أطول الانبعاثات من الكاشف لان هذه سوف تكون مشبعه مع اشاره من 633.
    2. العثور علي مركز هيدروجيل في الطائرة XY باستخدام المسح العمودي والأفقي البلاط والصفر موقف المرحلة هنا.
    3. العثور علي سطح هيدروجيل باستخدام مسح الخط ووظيفة المكدس z. صفر مركز التركيز هنا. مستوي هيدروجيل عن طريق تكرار هذه مسح خط بعيدا عن مركز XY لتحديد موقف السطح وضبط مسامير مجموعه للمرحلة المجهر.
    4. ضمن مساحة عمل برنامج المجهر ، أنشئ ملف تجربه منفصل لفوتوباتيرنينج. تعيين الطاقة مولتيفوتون إلى 1.8 ٪ (15.5 mW في 740 nm كما تقاس في الفتحة الخلفية للهدف) ، وسرعه المسح إلى 6 (0.1 μm/μs). ضبط حجم اطار الصورة بالبكسل لتحقيق حجم بكسل 0.1 μm لكل بكسل ونسبه العرض إلى الارتفاع 100:1.
    5. قم بتحميل ملف المناطق (* .ovl) الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2.2 في علامة التبويب المناطق. استخدم ماكرو لتعيين كافة المناطق إلى الاكتساب.
    6. قم بتشغيل الدالة z-كومه وتعيين التباعد إلى 3.5 μm لعمق إجمالي 28 μm والعدد الإجمالي لل z-شرائح من 9.
    7. استخدم وظيفة المواضع لتعيين مواقع محدده علي هيدروجيل حيث سيتم فوتوباتيرنيد صفائف ايماني ماركر.
      ملاحظه: سيحدد الموقع z لهذه المواضع موضع مركز كل مكدس z; عند وضع المواقع ، تاكد من ان كل موقف سيضمن ان حجم منقوشة سوف تتداخل مع هيدروجيل في جميع المواقع السطحية.
    8. استخدم داله التجانب لتحديد صفوف وأعمده اضافيه في كل موضع. كن حذرا لتجنب تراكب المناطق منقوشة. من الناحية المثالية ، تاكد من ان المناطق المنقوشة قريبه بما يكفي لأزاله المواقع الفارغة وغير القابلة للاستخدام بين المواضع.
  3. فوتوباتيرنينج مصفوفات علامات الإيماني
    1. كما نقع الوقت يقترب من علامة 30 دقيقه ، واتخاذ المتعاقبة z-كومه مسح الخط من سطح هيدروجيل كل 5 دقائق للتحقق من وجود تورم علي أساس التغيرات في موقع السطح بالنسبة إلى موقف التركيز الصفري.
    2. إذا لم يحدث اي تغيير في موضع السطح خلال فتره 5 دقائق ، قم بتحميل وتشغيل إعدادات زخرفه التي تم إنشاؤها في الخطوة 3-2
    3. وبمجرد الانتهاء من التجربة زخرفه تشغيل ، واستخدام الليزر 488 nm للتحقق من ان سطح هيدروجيل لم تتحرك خلال زخرفه.
      ملاحظه: إذا كان سطح هيدروجيل ليس في نفس الموقف كما كان قبل زخرفه ، توجد العديد من السيناريوهات. وكان هيدروجيل لم تصل إلى تورم التوازن قبل زخرفه ، بدا هيدروجيل لتجف خلال زخرفه ، أو المجهر من ذوي الخبرة z-الانجراف. وينبغي تحديد مصدر هذه الترجمة السطحية وتصحيحه في الزخرفة اللاحقة.
    4. أزاله هيدروجيل من المجهر ويستنشق الحل PEG-633 من طبق بيتري.
      ملاحظه: هيدروجيل لا تزال حساسة للغاية للضوء. الحفاظ علي هيدروجيل في الظلام مهم جدا حتى يكتمل الشطف.
    5. شطف هيدروجيل 3 مرات مع المعقمة-المصفاة تلفزيوني ، والتاكد من أزاله تماما الrinsate بين كل شطف المتعاقبة. كرر هذا الشطف الثلاثي كل 15 دقيقه لمده 1 ساعة.
    6. السماح للهيدروجيل لشطف في تلفزيونيه بين عشيه وضحيها.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    7. الثلاثي شطف هيدروجيل مع تلفزيوني. ثم بسرعة الثلاثي شطف هيدروجيل مع محلول الايثانول 200-برهان ، تليها شطف ثلاثي آخر مع تلفزيوني. لا تسمح هيدروجيل للجلوس في 200 دليل الايثانول لفترات طويلة من الزمن.
      ملاحظه: بعض مكونات الحل زخرفه يمكن ان تتحطم من الحل والإيداع علي سطح هيدروجيل وتظهر كطبقه صلبه من مضان (~ 1-5 ميكرون سميكه) تحت الاضاءه 633 nm. وينبغي ان الشطف مع الايثانول دليل 200 أزاله هذه المكونات غير المرغوب فيها.
  4. استخدام الفوتوباتيرنينج المتتابعة لإنشاء أنماط خلايا مفرده (اختياري)
    ملاحظه: إذا كان من المرغوب فيه التحكم في مساحة انتشار الخلية والشكل ، يمكن اجراء جولات متعددة من زخرفه. يجب ان يكون جل قاعده PEG-RGDS حذفت من صياغته الاوليه. فمن المستحسن ان يتم تنفيذ زخرفه من صفائف علامة ايماني آخر لتجنب تبييض علامات ايماني الفلورسنت.
    1. تذوب 20 ملغ من PEG-RGDS في الحل لفه/NVP أعدت في الخطوة 1.
    2. كرر الخطوات 3.1 – 3.3 باستخدام الحل PEG-RGDS بدلا من الحل PEG-633. استخدم ملف المناطق المناسب الذي يعرف أنماط الخلية المفردة (راجع الخطوة 2 للحصول علي الإرشادات).
      ملاحظه: لتصور صفائف أنماط PEG-RGDS ، هناك العديد من الخيارات. ويمكن استخدام البديل الفلورسنت من peg-rgds21،30 أو شماعة-rgds يمكن ان يكون مخدر مع ربط الفلورسنت. موصي به: بدلا من ذلك ، يمكن تشغيل خط الليزر 488 nm بالترادف مع ليزر زخرفه متعدد الفوتونات لتبييض اشاره 488 في قاعده هيدروجيل ، وخلق المناطق غير الفلورية التي تتزامن مع التاسيس RGDS.

4. تصور صفائف ايماني ماركر

  1. الحصول علي صوره المكدس z من صفيف ملفقه
    1. استبدلت [ببس] في [بتري] طبق مع الخلية أوساط يستعمل لخليه ثقافة.
      ملاحظه: ينصح باستخدام وسائل الاعلام الحرة الفينول الأحمر للاستخدام اثناء اكتساب الصور لمنع السمية الضوئية.
    2. بعد 1 ساعة من نقع الوقت ، استخدم المجهر ويديفيلد مضان مجهزه وحده الاضاءه المهيكلة وعدسه الغمر المياه عاليه التكبير الهدف لتصور الهلام المائي باستخدام مجموعه مرشح المناسب لعلامات ايماني الفلورسنت.
    3. جمع عاليه الدقة z-كومه من الصور (متباعدة 0.4 μm في Z) تشمل علي الأقل 20 ميكرومتر من العمق من سطح هيدروجيل في هيدروجيل في منطقه منقوشة ، والتاكد من ان الحد الأعلى من المكدس z يتضمن ما لا يقل عن 1-2 الصور جسديا فوق منطقه منقوشة (اي ، حيث علامات ايماني الفلورسنت لم تعد مرئية والضوضاء فقط موجود).
      ملاحظه: الحصول علي مكدس الصور هذا ضروري للتحقق من صحة كافة المعلمات زخرفه ويمكن تحليلها إلى جانب بيانات الخلية في الخطوة 5.3.

5. أداء TFM باستخدام فوتوباتيرنيد الهيدروجيل

  1. خلايا البذر
    ملاحظه: للحفاظ علي العقم ، اتبع جميع ممارسات ثقافة الانسجه القياسية.
    1. قبل بذر الخلايا ، اتبع البروتوكولات القياسية لخط الخلية المعنية لثقافة الخلية والصيانة.
    2. اختياري إذا كان العقم من هيدروجيل مصدر قلق ، احتضان هيدروجيل ل 24 ساعة في وسائل الاعلام التي تحتوي علي المضادات الحيوية تليها الشطف مع وسائل الاعلام العادية.
    3. لبذور الخلايا ، أولا أعاده تعليق الخلايا التريسينزيد في الحجم النهائي من وسائل الاعلام لاستخدامها في طبق بيتري هيدروجيل.
    4. أزاله جميع الحلول من طبق هيدروجيل واستبدال مع وسائل الاعلام الخلية لادن.
    5. السماح للهيدروجيل الجلوس دون عائق في وسائل الاعلام الخلية لادن لمده 10 دقيقه.
    6. نقل بعناية طبق بيتري إلى حاضنه. الحفاظ علي الخلايا في الحاضنة لمده 4 ساعات أو حتى يتم التزام بشكل واضح الخلايا.
    7. استبدل الوسائط المحملة بالخلايا بوسائط خاليه من الخلايا لأزاله الخلايا غير الملتزم بها.
  2. الحصول علي صور من الخلايا وعلامات ايماني
    1. تعيين درجه الحرارة لغرفه الحضانة علي المجهر إلى 37 درجه مئوية و CO2 إلى 5 ٪ والسماح للغرفة للوصول إلى نقاط محدده.
    2. ضع طبق بيتري علي حامل العينة وحدد المناطق المنقوشة.
    3. تحديد موقع خليه الاهتمام (التابعة) والحصول علي صوره المنقولة أو الفلورية لل.
      ملاحظه: سيتم استخدام هذه الصورة لتقسيم حد الخلية اثناء التحليل ، لذا يجب ان تصور الصورة بوضوح الحدود الخلية.
    4. الحصول علي كومه z من الصفيف منقوشة تحت المتابعة كما في الخطوة 4-1.
    5. الحصول علي مجموعه ثانيه من الصور المنقولة أو الفلورية للخلية.
      ملاحظه: مقارنه الصورة الثانية تعيين إلى الأول لتحديد ما إذا كان يتم ملاحظه تلف الخلايا بسبب السمية الضوئية وما إذا كانت إعدادات الحصول علي صوره تحتاج إلى تعديل. ومن المرجح ان تكون الخلايا التي تتقلص بعد التعرض للاصابه قد عانت من اثار سميه ضوئيه كبيره ، مما قد يؤثر علي النتائج.
    6. كرر الخطوات 5.2.3-5.2.5 لكل المتابعة.

6. تحليل الصور

  1. اعداد ملفات الصور للتحليل
    1. باستخدام البيانات التي تم جمعها في الخطوة 5.2 ، أعد كومه صور مقتصة للمنطقة المحيطة بالمحيط الهندي بحيث تمثل الصورة السفلية (الصورة الاولي) من المكدس الإطار الأول: (1) > 80% من أعمده العلامات المنقوشة مرئية ، (2) الصورة العلوية في المكدس لم يعد يحتوي علي اي علامات ايماني مرئية (علي سبيل المثال ، فوق سطح هيدروجيل) ، و (3) هناك ما لا يقل عن 20 ميكرومتر من علامات ايماني غير المجهدة المحيطة بالشركة.
      ملاحظه: يؤدي اقتصاص الصور إلى تقليل وقت الحوسبة بشكل كبير اثناء التحليل. يمكن تشغيل التعليمه البرمجية التحليل في الخطوات اللاحقة دون اقتصاص الصور ولكن هذا غير مستحسن.
    2. إنشاء صوره مقتصة للصورة التي تم إرسالها و/أو الفلورسنت لمطابقه الاقتصاص XY من المكدس في الخطوة السابقة.
    3. استخدم الصورة التي تم اقتصاصها أو الصور الفلورية-أيهما أكثر تمثيلا لشكل الخلية-لتقسيم الصورة باليد (تتبع حدود الخلية) أو عن طريق أدوات معالجه الصور.
    4. تحويل هذه الصورة إلى صوره ثنائيه حيث الداخلية من الخلية هو اسود (اي كثافة = 0) والمنطقة المحيطة بالخلية بيضاء (اي كثافة ≠ 0). حفظ هذه الصورة كقناع ثنائي. tif.
    5. بالنسبة لكل وحده ، يمكنك تجميع ملف مكدس الصور وملف الصور المرسل وملف القناع الثنائي في مجلد واحد.
  2. تشغيل برامج التحليل النصية علي الصور
    1. استنساخ أو تحميل وظائف تحليل TFM المتاحة مجانا في مستودع البرامج29. يجب تحميل المستودع بأكمله لان هناك عددا كبيرا من التبعيات في المجلدات الفرعية.
    2. افتح Matlab وأضف الدليل وكافة المجلدات الفرعية للنسخ المحلي لمستودع التعليمات البرمجية إلى المسار.
    3. تعيين الدليل داخل مساحة عمل Matlab إلى موقع المجلد حيث تم تخزين الصور التي تم اعدادها في الخطوة 6.1.
    4. فتح وتشغيل البرنامج النصي. m التعقب . عند المطالبة ، اتبع الإرشادات لتحميل الصور المناسبة ، وتنفيذ الخطوات الاوليه للمعالجة المسبقة ، والتحقق من الأخطاء خوارزميه تتبع الكائن.
    5. بمجرد اكتمال البرنامج النصي ، فتح وتشغيل الدالة ديقص. m . يجب ان لا يتطلب هذا البرنامج النصي إدخال من المستخدم.
    6. بمجرد اكتمال البرنامج النصي ديقص. م ، فتح وتشغيل disp3D. إذا تمت مطالبتك بفتح إيه صور ، فاتبع الإرشادات.
      ملاحظه: اثناء وقت التشغيل ، قد يطلب البرنامج النصي من المستخدم رسم خط علي صوره صفيف منقوشة. وينبغي ان يمثل هذا الخط محور الحركة الاساسيه لليزر المسح الضوئي اثناء زخرفه وينبغي ان يصطف مع صف من علامات ايماني منقوشة. ترشد هذه العملية التعليمات البرمجية الخاصة بالاتجاه (اي الصفوف أو الاعمده من علامات ايماني) التي من المحتمل ان تؤدي إلى الصفوف الأكثر محاذاة من علامات الإيماني.
    7. بمجرد اكتمال التعليمات البرمجية الخاصة بالاستغناء عن القص ، تشغيل التعليمات البرمجية الخاصة ب interpFinal3D_2 متبوعه بالتعليمات البرمجية ل. m. يجب ان لا تتطلب هذه البرامج النصية إدخالات من المستخدم.
      ملاحظه: البرنامج النصي interpFinal3D_2 تحويل بيانات الازاحه إلى عمليات التعقب السطحية باستخدام البرامج التي تم الحصول عليها خارجيا والتي تم وصفها مسبقا31. لتطبيق هذه الدالات الخارجية ، interpFinal3D_2 الازاحه البيانات إلى شبكات موحده للعمل كمدخلات لوظائف التحويل. في حاله استخدام طريقه تحويل مختلفه ، أو في حاله عدم الحاجة إلى عمليات التعقب ، يمكن تخطي هذه الخطوة.
    8. بمجرد تشغيل كافة البرامج النصية ، تاكد من انه يمكن العثور علي كافة البيانات والمخرجات في الدليل الاولي.
    9. كرر الخطوات 6.2.3 – 6.2.8 لكل الخاصة.
      ملاحظه: داخل مستودع التعليمات البرمجية ، يوجد مجلد يحتوي علي البرامج النصية التي تسمح بتشغيل المجموعة التلقائية لكل من البرامج النصية في قائمه الدلائل. راجع البرامج النصية للتشغيل التلقائي نفسها (علي سبيل المثال ، التعليقات داخل التعليمات البرمجية) للحصول علي إرشادات حول كيفيه استخدامها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفي جميع مراحل البروتوكول ، هناك عدد من نقاط التفتيش التي توفر التغذية المرتدة لتقييم نوعيه الاجراء الزخرفة. ولتقديم بعض الأفكار بشان كيفيه تقييم التقدم المحرز في كل نقطه من نقاط التفتيش هذه ، نقدم نتائج تمثيليه للتجربة الفعلية. وتسلط النتائج الضوء علي تطبيق هذا البروتوكول الذي اجري علي هيدروجيل فوتوباتيرنيد المعد لتحليل TFM للخلايا المبطنة لوريد السرة البشرية (HUVECs). وتشمل النتائج بيانات الصور الخام وكذلك مخرجات البيانات المعالجة في كل خطوه حاسمه.

نقطه التفتيش الاولي يحدث في الخطوة 4 ، مره واحده تم فوتوباتيرنيد صفيف ايماني ماركر في هيدروجيل. عند جمع كومه صور ، يجب ان تعرض الصور الناتجة مجموعه عادية من الميزات المنقوشة (الشكل 1ا-ج) التي تتارجح في شدتها كداله لموضع z داخل مكدس الصور. إذا كان السطح منقوشة ليس تماما مستوي ، ومناطق مختلفه من كل شريحة صوره قد يبدو خارج المرحلة مع بعضها البعض فيما يتعلق بهذه التذبذبات. وهذا أمر متوقع ولا ينبغي ان يؤثر علي التحليل الا في الحالات القصوى.

وتستخدم نقاط التفتيش المتبقية مخرجات من كل من البرامج النصية التي يتم تشغيلها اثناء تحليل أحدي المجموعات المعينة. يوفر البرنامج النصي ايماني العديد من الصور التشخيصية بما في ذلك الإسقاط z من علامات الفلورسنت الفلورية (الشكل 2a) لتقييم جوده ما قبل المعالجة ، مؤامرة من الكشف عن اللون سينتيدس ترميز كداله z-الموقف ( الشكل 2 ب) لتقييم جوده الكشف عن الكائنات ، وقطعه من المسارات التي تمثل العلامات المكتشفة للمؤشرات التي تم ربطها باعمده في الاتجاه z (الشكل 2b) لتقييم جوده تتبع الكائن.

للكشف عن متمركز دقيقه 3d اللازمة لحساب الإحداثيات المرجعية والنزوح ، يجب ان تشبه علامات ايماني الفلورسنت الاشكال الاهليلجي مع كثافة تناقص شعاعي من المركز. يوفر البرنامج النصي disp3D قطعه من الكثافة كداله z-موقف لكل عمود من الميزات المكتشفة في كومه صوره معينه (الشكل 3ا ، ب) لتقييم نوعيه التشكيلات الجانبية كثافة علامة ايماني. ويوفر كل من disp3D والاستغناء عنه معا رسوما بيانيه لضوضاء الازاحه المقيسة في كل من ابعاد الإحداثيات الديكارتية (الشكل 4ا-ج) فضلا عن الخرائط الحرارية المحرفة للتشرد (الشكل 4 E, F). وأخيرا ، interpFinal3D_2 يوفر خرائط الحرارة من التعقب السطحية محسوبة باستخدام الاستعانة بمصادر خارجيه التعليمات البرمجية (الشكل 5)31.

Figure 1
الشكل 1: النتائج الزخرفته النموذجية.
(ا) الصور الفلورية للعلامات الايمانيه التي تعرض تقلبات الكثافة من خلال البعد Z من سطح هيدروجيل إلى 12.4 ميكرومتر داخل هيدروجيل. (ب) العرض الحجمي المجهز يكشف عن الشكل الاهليلجي للعلامات الايمانيه. (ج) طرق عرض الملف الشخصي للعرض الحجمي البيانات علامة الخام. A ، C: شريط مقياس = 5 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخرجات تشخيصيه من خوارزميه تتبع الجسيمات.
الكشف عن الكائن وتتبع البرمجيات مخرجات العديد من الصور التشخيصية بما في ذلك (ا) الإسقاط المرجح z من علامات ايماني الفلورسنت و (ب) مؤامرة مبعثر من المواقع علامة مع لون ترميز Z-الموقف. (ج) يعرض الناتج الإضافي إسقاطا مرجحا بالz ، كما هوالوضعفي (ا) ، مع الكشف عن الكشف ثنائي الابعاد من كل اطار مرتبط باعمده. (د) إلقاء نظره فاحصه علي (ب) يظهر بشكل أكثر وضوحا لون الكشف الفردي ثنائي الابعاد المرمز بالموضع z. A: شريط مقياس = 20 μm. C: شريط مقياس = 5 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخرجات تشخيصيه من خوارزميه الازاحه ثلاثية الابعاد.
(ا، ب) المؤامرات خط من شده علامة كداله للوضع الإطار عرض التذبذبات بين علامات مجمعه في الاتجاه العمودي. تسمح هذه القطع الخطية بالتقييم النوعي لمحاذاة الشبكة مع مستوي التصوير ، بالاضافه إلى الجودة الشاملة للعلامات ايماني المنقوشة. (ا) التذبذبات المتداخلة في شده العلامة تؤكد المحاذاة المقبولة لمستوي التصوير باستخدام صفائف علامات الإيماني المنقوشة. بما في ذلك إطارات فارغه في الأعلى من المكدس Z يسمح للحساب الألى لعتبه الضوضاء في برنامج المعالجة. (ب) كثيرا ما يدل ضعف التداخل بين الذبذبات علي ضعف المحاذاة بين الشبكات المنقوشة والطائرة التصويرية ، ولكنه قد يوحي أيضا بان الشبكة نفسها غير متوائمة وقد تسفر عن نتائج رديئه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مخرجات تشخيصيه من خوارزميات الازاحه ثنائيه الابعاد وثلاثية الابعاد.
(ا-ج) وتوفر الرسوم البيانية لحالات التشرد المقيسة في المناطق التي تعتبر "غير مشوه" (اي ضوضاء النزوح) تقييما كميا لدقه الخطوط المرجعية المحسوبة لتحديد المواضع المرجعية للمؤشرات التقريبية. توفر حقول الازاحه تمثيلا مرئيا لكل من (D) في الطائرة (القص) و (ه) الإزاحات المقيسة (العادية) غير المستوية. D: شريط مقياس = 20 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مخرجات تشخيصيه من خوارزميه تحويل الجر.
(ا-ج) ويمكن حساب ضغوط الجر استنادا إلى حقول الازاحه المحرفة لتحديد (B) الجر الكلي ، (ج) جر القص ، و (د) الجر العادي. A: شريط مقياس = 20 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير سير عمل يخفف كثيرا من الصعوبة المرتبطة بتوليد وتحليل بيانات TFM. وبمجرد الاعداد ، فان الفوتوباتيرنيد المائية سهله الاستخدام ، مما يتطلب معرفه الممارسات الثقافية القياسية للانسجه والمجهر الفلوري. ويتيح الجانب الخالي من الإشارات التنقل الحر علي الهلام المائي المحمل بالخلايا ويزيل الخطوات المرهقة لمعالجه الصور مثل تسجيل الصورة بين الصور المرجعية والمشوهة. التحليل الناتج هو تقريبا مؤتمتة تماما ويمكن تحليل البيانات من COIs الفردية من البداية إلى النهاية في اقل من 10 دقيقه.

التحديات الاساسيه في هذا البروتوكول تنبع من تصنيع هيدروجيل فوتوباتيرنيد. لان معظم الكواشف المستخدمة في البروتوكول يتم توليفها في المنزل ، ونحن نتوقع ان المستخدمين الذين لديهم خبره قليله باستخدام مواد هيدروجيل الاصطناعية قد تكون رادعه إلى حد ما من محاولة هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يتم توليف جميع المكونات PEGylated المستخدمة في هذا البروتوكول من بروتوكولات متطابقة تقريبا باستخدام تفاعلات وعاء واحد والعديد من المكونات يمكن شراؤها من الباعة التجاريين.

هذا البروتوكول يتطلب أيضا بعض الإتقان علي استخدام المجاهر المسح بالليزر. معلمات المسح بالليزر تحتاج إلى ان تكون الأمثل لكل مجهر مختلف ، كما كثافة الليزر ، والعدسات الموضوعية ، وغيرها من مكونات المجهر سوف تختلف ، حتى بين المجاهر من نفس النموذج. وهناك طريقه بسيطه لتحديد أفضل إعدادات المجهر للصور-زخرفه هو لأداء لوحه من المسح الضوئي مع إعدادات متنوعة. اي اعداد يؤثر علي التعرض الكلي لأشعه الليزر التي تتلقاها العينة سيؤثر علي حجم ونوعيه العلامات المنقوشة. وهذا يشمل: سرعه المسح الضوئي ، حجم بكسل ، متوسط عدد ، الليزر السلطة/كثافة/فلوانس ، التكبير ، والرقمية فتحه32،33. فمن الأسهل في كثير من الأحيان لضبط قوه الليزر وسرعه المسح الضوئي ولذا فمن المستحسن ان تبدا مع تلك المعلمات اثنين. وتجدر الاشاره أيضا إلى ان البرمجيات المستخدمة لتوليد الملفات المناطق تم تصميمها خصيصا للعلامة التجارية المجاهر التي نستخدمها ، وقد تحتاج إلى زيادة لاستيعاب غيرها من صنع المجهر والنماذج. مع الإعدادات المقدمة في البروتوكول ، يجب علي المستخدم ان نتوقع لتوليد علامات الاهليلجي مع 3D الجانبية مثل كثافة الملفات الشخصية من كامل العرض نصف اقصي الابعاد من 0.84 ± 0.11 μm في XY و 3.73 ± 0.30 μm في Z. تستخدم خوارزميه الكشف عن الكائنات مركز الكتلة من كثافة للتعرف علي العلامات المركزية للعلامات سيتم تنفيذ أفضل عندما علامات تقديم تدرج محدد من شده.

الشطف الصحيح للهيدروجيل وحمايته من الضوء ومن الملوثات أمر مهم للغاية بالنسبة للثقافة الخلوية. كما ذكر في البروتوكول ، قد تعطل بعض مكونات زخرفه من الحل والودائع علي سطح هيدروجيل. إذا لم يتم شطف هذه المكونات تماما من السطح ، قد يكون التصاق الخلايا يتاثر بشكل غير متوقع. إذا تعرضت للضوء الطيف الاشعه فوق البنفسجية ، حتى في جرعات صغيره ، في حين ان هيدروجيل تمرغ في الحل الزخرفة ، فان الحل الزخرفة سوف تبدا في تتبلمر وسوف تسفر عن نتائج سيئه. وأخيرا ، فان الجسيمات المحمولة جوا أو الجسيمات غير المصفاة ستعقد التحليل ، خاصه إذا كانت فلورية. وينبغي إيلاء عناية خاصه لمنع هذه الملوثات من دخول العينة في جميع الخطوات التي يتخذها البروتوكول.

وتتنبا التعليمه البرمجية التحليلية بالمواقع المرجعية للعلامات ايماني المشوهة عن طريق التنبؤ بالمصفوفة الاصليه من علامات غير مشوه في نفس الصف أو العمود كعلامة مشوه. وفي حين ان هذا يبسط التحليل إلى حد كبير ، فانه يفرض أيضا بعض القيود علي ما يمكن أو لا يمكن تحليله. وكحد ادني ، ينبغي ان يكون لكل علامة مشوه يجري تحليلها عضوان أو أكثر من كل من عمودها وصفها من العلامات التي لا تشوه بحيث يمكن اجراء تنبؤ دقيق. يتم تعريف صف بواسطة مجموعه من النقاط المطبوعة في مسح سطر واحد علي المجهر ، ويتم تعريف عمود بعلامات منقوشة علي محور عمودي واحد باستخدام داله المكدس z. وهذا يحد من التحليل إلى خلايا مفرده أو مجموعات خلايا صغيره استنادا إلى طول وعمق كل منطقه منقوشة. ومن المهم ان نلاحظ ان هذا لا يعالج من خلال وضع منطقتين منقوشة تماما بجانب بعضها البعض. وهذا لأنه علي الرغم من ان مكونات XY قد يصطف ، فانه ليس من الممكن ان يصطف تماما المكونات الموضعية Z من صفائف ، الا إذا كان سطح العينة هو مستوي تماما مع كل من الطائرة البؤرية والمرحلة. أفضل طريقه لتجنب هذا القيد هو استخدام جولات اضافيه من الزخرفة التي تملي تحديدا ربط التصاق. إذا محاذاة بشكل صحيح ، التصاق الخلية يمكن ان تقتصر علي المناطق القابلة للاستخدام علي الأنماط.

تم تحسين رمز التحليل لصفائف مربع حيث يتم تباعد علامات تقريبا 3.5 μm وبصرف النسبة في Z و 2.1 μm في X و Y. ستختلف التباعد النهائي استنادا إلى زخرفه الدقة والتورم ، ولكن هذا لا ينبغي ان يؤثر بشكل كبير علي الأداء إذا كان التباعد في الصف متناسقا (لن يؤثر تباين التباعد بين الصفوف علي التتبع). بينما قد تشغيل التعليمات البرمجية إلى الإكمال علي صفائف الموصوفة بشكل مختلف ، قد ينتج حالته الحالية نتائج رديئه إذا لم تتطابق الصفائف مع المعلمات المسرودة هنا. وتتمثل أهدافنا الحالية لشفره التحليل في تضمين الدعم للمسافات المتغيرة وكذلك المصفوفات الثلاثية ، الأمر الذي قد يحسن من دقه أعاده بناء الجر ويقلل من التحيز الإقليمي مقارنه بالمصفوفات المربعة.

في الختام ، نحن نقدم نهجا ل TFM الذي يسمح لجمع وتحليل البيانات TFM بدون التشويش علي وظيفة الخلوية. هدفنا مع هذا النهج هو توفير نهج TFM أكثر سهوله وغير تدخليه ، دون المساس بدقه ونوعيه البيانات TFM. ونحن نتوقع ان هذه المنهجية سوف تعزز تقارب المعرفة البيوكيميائية من الظواهر الخلوية مع الخصائص الفيزيائية الملحوظة للخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم السيد ا. باندا بتمويل من زمالة NSF IGERT SBE2 (1144726) ، وأموال بدء التشغيل التي قدمتها جامعه ديلاوير ، والمعهد الوطني للصحة/برنامج IMAT للمعهد الوطني للسرطان (R21CA214299). يتم دعم JHS من خلال التمويل من المعاهد الوطنية للصحة/المعهد الوطني للسرطان برنامج IMAT (R21CA214299) وبرنامج المؤسسة الوطنية للعلوم جائزه الحياة المهنية (1751797). تم دعم الوصول المجهري من قبل المنح من المعاهد الوطنية للصحة-NIGMS (P20 GM103446) ، NSF (1301765) وولاية ديلاوير. تم الحصول علي مجهر الاضاءه المهيكلة بأموال من برنامج منحه البحث والتطوير الفدرالي التابع لولاية ديلاوير (16A00471). وتم الحصول علي المجهر البؤري LSM880 المستخدم للطباعة الحجرية بالليزر الثنائي الفوتون بمنحه للاجهزه المشتركة (الإصدار OD016361).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158, (1), 143-156 (2014).
  2. Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9, (11), 3179-3193 (1998).
  3. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151, (7), 1513-1527 (2012).
  4. Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108, (4), 821-832 (2015).
  5. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124, (8), 1195-1205 (2011).
  6. Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43, (1), 55-62 (2010).
  7. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13, (10), 979-987 (2014).
  8. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  9. Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227, (6), 717-731 (2015).
  10. Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6, (1), 103 (2015).
  11. Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4, (9), 1399-1407 (2015).
  12. Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120, (9), 1624-1634 (2007).
  13. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (3), 881-886 (2013).
  14. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94, (1), 207-220 (2008).
  15. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80, (4), 1744-1757 (2001).
  16. Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2, (2), 124-137 (2018).
  17. Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
  18. Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23, (3), 387-394 (2003).
  19. Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, (4), 1484-1489 (2003).
  20. Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).
  21. Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, (20), 18233-18241 (2019).
  22. Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11, (1), 8-16 (2019).
  23. Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
  24. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5, (17), 2153-2160 (2016).
  25. Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21, (15), 2876-2888 (2011).
  26. Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9, (6), 6128-6138 (2015).
  27. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8, (34), 21883-21892 (2016).
  28. Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. 543-569 (2016).
  29. Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. Available from: https://github.com/SlaterLab (2019).
  30. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24, (17), 2344-2348 (2012).
  31. Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9, (4), 1-12 (2014).
  32. Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6, (24), 1-28 (2017).
  33. Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. 183-220 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics